Summary
Lernen und Gedächtnis sind starke Metriken bei der Untersuchung von entwicklungsbedingten, krankheitsabhängigen oder umweltbedingten kognitiven Beeinträchtigungen. Die meisten kognitiven Bewertungen erfordern spezielle Ausrüstung und umfangreiche Zeitverpflichtungen. Der Shuttle-Box-Assay ist jedoch ein assoziatives Lernwerkzeug, das eine herkömmliche Gelbox zur schnellen und zuverlässigen Beurteilung der Kognition von erwachsenen Zebrafischen verwendet.
Abstract
Kognitive Defizite, einschließlich Lern- und Gedächtnisstörungen, sind ein Hauptsymptom für verschiedene entwicklungs- und altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen und traumatische Hirnverletzungen (TBI). Zebrafische sind aufgrund ihrer Transparenz bei der Entwicklung und robusten Regenerationsfähigkeiten nach Neurotrauma ein wichtiges neurowissenschaftliches Modell. Während es bei Zebrafischen verschiedene kognitive Tests gibt, untersuchen die meisten kognitiven Bewertungen, die schnell durchgeführt werden, nicht-assoziatives Lernen. Gleichzeitig benötigen assoziative Lernassays oft mehrere Tage oder Wochen. Hier beschreiben wir einen schnellen assoziativen Lerntest, der einen negativen Reiz (elektrischer Schlag) nutzt und nur minimale Vorbereitungszeit erfordert. Der hier vorgestellte Shuttle-Box-Assay ist einfach, ideal für Unerfahrene und erfordert nur minimale Ausrüstung. Wir zeigen, dass dieser Shuttle-Box-Test nach TBI das kognitive Defizit und die Erholung von jungen zu alten Zebrafischen reproduzierbar bewertet. Darüber hinaus ist der Assay anpassbar, um entweder das sofortige oder das verzögerte Gedächtnis zu untersuchen. Wir zeigen, dass sowohl ein einzelnes TBI als auch wiederholte TBI-Ereignisse das Lernen und das unmittelbare Gedächtnis negativ beeinflussen, aber nicht das verzögerte Gedächtnis. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass der Shuttle-Box-Assay das Fortschreiten und die Erholung kognitiver Beeinträchtigungen reproduzierbar verfolgt.
Introduction
Lernen und Gedächtnis werden routinemäßig als Metriken für kognitive Beeinträchtigungen verwendet, die aufgrund von Alterung, neurodegenerativen Erkrankungen oder Verletzungen auftreten. Traumatische Hirnverletzungen (TBIs) sind die häufigsten Verletzungen, die zu kognitiven Defiziten führen. TBIs sind aufgrund ihrer Assoziation mit mehreren neurodegenerativen Erkrankungen wie frontotemporaler Demenz und Parkinson-Krankheit1,2vonwachsender Besorgnis. Darüber hinaus deuten die erhöhten Beta-Amyloid-Aggregationen, die bei einigen TBI-Patienten beobachtet wurden, darauf hin, dass es auch mit der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht werden kann3,4. TBIs sind oft das Ergebnis eines stumpfen Gewalttraumas und umfassen eine Reihe von Schweregraden5, wobei leichte Hirnverletzungen (miTBI) am häufigsten sind. MiTBIs werden jedoch oft nicht gemeldet und falsch diagnostiziert, da sie nur für kurze Zeit zu geringfügigen kognitiven Beeinträchtigungen führen und die verletzten Personen sich in der Regel vollständig erholen6. Im Gegensatz dazu sind wiederholte miTBI-Ereignisse ein wachsendes Problem, da sie bei jungen und mittleren Erwachsenen weit verbreitet sind, sich im Laufe der Zeit ansammeln können7,die kognitive Entwicklung beeinträchtigen und neurodegenerative Erkrankungen verschlimmernkönnen 1,2,3,4,5, ähnlich wie Personen, die entweder einen moderaten oder schweren TBI8haben .
Zebrafisch (Danio rerio) ist ein nützliches Modell für die Erforschung einer Vielzahl von Themen in den Neurowissenschaften, einschließlich der Fähigkeit, verlorene oder beschädigte Neuronen im gesamten zentralen Nervensystem zu regenerieren9,10,11,12,13. Neuronale Regeneration wurde auch im Telencephalon nachgewiesen, das das Archipallium im dorsal-inneren Bereich enthält. Diese neuroanatomische Region ist analog zum Hippocampus und wird wahrscheinlich für die Kognition bei Fischen und für das Kurzzeitgedächtnis beim Menschen benötigt14,15,16. Darüber hinaus wurde das Verhalten von Zebrafischen umfassend charakterisiert und katalogisiert17. Das Lernen wurde durch verschiedene Techniken untersucht, einschließlich der Gewöhnung an die Schreckreaktion18, die eine schnelle Form des nicht-assoziativen Lernens darstellen kann, wenn sie in kurzen Blöcken und unter Berücksichtigung der schnellen Zerfallszeit durchgeführt wird19. Komplexere Tests des assoziativen Lernens, wie T-Boxen, Plus-Labyrinthe und visuelle Unterscheidung20,21 werden verwendet, sind aber oft zeitaufwendig, erfordern Tage oder Wochen der Vorbereitung und sind auf Untiefe oder positive Verstärkung angewiesen. Hier beschreiben wir ein schnelles Paradigma, um sowohl assoziatives Lernen als auch sofortiges oder verzögertes Gedächtnis zu bewerten. Dieser Shuttle-Box-Assay verwendet einen aversiven Reiz und eine negative Verstärkungskonditionierung, um kognitive Defizite und die Genesung nach stumpfem TBI zu beurteilen. Wir zeigen, dass unbeschädigte erwachsene Zebrafische (8-24 Monate) innerhalb von 20 Versuchen (<20 min Bewertung) in der Shuttle-Box reproduzierbar lernen, das rote Licht zu vermeiden, mit einem hohen Maß an Konsistenz über Beobachter hinweg. Darüber hinaus zeigen wir mit der Shuttle-Box, dass die Lern- und Gedächtnisfähigkeiten bei Erwachsenen (8-24 Monate alt) konsistent sind und nützlich sind, um Kognition mit signifikanten Beeinträchtigungen zwischen verschiedenen TBI-Schweregraden oder wiederholten TBI zu testen. Darüber hinaus könnte diese Methode schnell als Metrik eingesetzt werden, um eine breite Palette von Krankheitsverläufen oder die Wirksamkeit von Arzneimittelinterventionen zu verfolgen, die sich auf die Aufrechterhaltung oder Wiederherstellung der Kognition bei erwachsenen Zebrafischen auswirken.
Hier geben wir einen lehrmäßigen Überblick über eine schnelle kognitive Bewertung, die sowohl komplexes assoziatives Lernen (Abschnitt 1) als auch das Gedächtnis sowohl im Hinblick auf das unmittelbare als auch auf das verzögerte Gedächtnis untersuchen kann. Dieses Paradigma bietet eine Bewertung des Kurz- und Langzeitgedächtnisses einer erlernten assoziativen kognitiven Aufgabe (Abschnitt 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafische wurden in der Zebrafischanlage Notre Dame im Freimann Life Sciences Center gezüchtet und gepflegt. Die in diesem Manuskript beschriebenen Methoden wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Notre Dame genehmigt (Animal Welfare Assurance Number A3093-01).
1. Shuttle-Box-Lernparadigma (Abbildung 1A)
HINWEIS: Das Lernparadigma bietet eine schnelle Bewertung der Kognition in Bezug auf assoziatives Lernen.
- Bereiten Sie die Shuttle-Box vor, indem Sie eine 30,5 x 19 x 7,5 cm große Gelbox mit einem 5 x 19 cm großen Stück Plexiglas in Aquarienqualität in einem Winkel von 45 ° auf jeder Seite modifizieren. Machen Sie eine Linie, die die Hälfte des Tanks markiert, um zu beurteilen, wann Fische die Mitte des Tanks überquert haben (Abbildung 1B).
- Fügen Sie 800 ml Systemwasser in die Shuttle-Box hinzu. Machen Sie dieses Wasser, indem Sie 60 mg Instant Ocean in 1 L deionisiertem RO-Wasser auflösen. Füllen Sie das Wasser bis zur Mitte des Tanks bis zu einer Tiefe von 5 cm.
HINWEIS: Ersetzen Sie durch frisches Systemwasser bei 28 °C jede h oder nach dem Testen von 3 Fischen. - Legen Sie 2-3 Fische in ein Auffangbecken mit Systemwasser, das sich in einem dunklen Raum befindet, in dem der Shuttle-Box-Assay durchgeführt wird.
- Legen Sie im dunklen Raum 1 Fisch in die Mitte der Shuttle-Box, befestigen Sie den Deckel und befestigen Sie die Elektroden an einem Netzteil.
HINWEIS: Der Raum sollte während der Akklimatisierung und des Tests so dunkel wie möglich bleiben.
- Legen Sie im dunklen Raum 1 Fisch in die Mitte der Shuttle-Box, befestigen Sie den Deckel und befestigen Sie die Elektroden an einem Netzteil.
- Akklimatisieren Sie den Fisch in der Shuttle-Box für 15 min.
HINWEIS: Der Prüfer sollte während der Akklimatisierungsphase im Raum bleiben oder ruhig mit ausreichend Zeit vor dem Test in den Testraum zurückkehren, damit sich die Fische an die Anwesenheit des Prüfers anpassen können. Eine erfolgreiche Akklimatisierung kann in Betracht gezogen werden, wenn der Fisch das Aquarium frei erkundet.- Wenn der Fisch nicht erkundet, setzen Sie die Akklimatisierung für weitere 15 Minuten fort. Wenn sich der Fisch immer noch nicht an die Shuttle-Box gewöhnen kann, entfernen Sie den Fisch. Verwenden Sie diesen Fisch nicht zum Testen.
- Leuchten Sie manuell eine 800-Lumen-rote Linsen-Taschenlampe ~ 2 cm von der Gel-Box-Wand auf der seite, die vom Fisch besetzt ist, nach der Akklimatisierung.
HINWEIS: Starten Sie keinen Versuch, wenn der Fisch neben dem Platindraht an der Wand in der Nähe der tiefen Enden der Shuttle-Box ruht. - Leuchten Sie den Lichtreiz direkt auf den Fisch und verfolgen Sie manuell jede seitliche Bewegung des Fisches mit dem Licht, um eine kontinuierliche Visualisierung des Reizes zu gewährleisten (Abbildung 1C). Setzen Sie den Lichtreiz fort, bis eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist.
- Betrachten Sie den Weg als erfolgreich, wenn der Fisch innerhalb der 15 s der Lichteinstrahlung die Hälfte des Tanks überquert. Sobald der Fisch die Hälfte des Wegs überquert hat, stoppen Sie den Lichtreiz sofort (Abbildung 1D).
- Betrachten Sie den Weg als fehlgeschlagen, wenn der Fisch die Hälfte der Box nicht in 15 s überquert. Verwenden Sie in diesem Fall ein Elektrophorese-Netzteil, um einen negativen Schockreiz (20 mV: 1 A) anzuwenden, der abwechselnd 2 s ein, 2 s Aus für einen Zeitraum von 15 s (maximal 4 Schocks) oder bis der Fisch die Hälfte der Box passiert, wodurch sowohl der Licht- als auch der negative Reiz beendet werden.
- Lassen Sie den Fisch 30 s ruhen und wiederholen Sie Schritt(e) 1.5-1.6.2. Führen Sie eine detaillierte Aufzeichnung der Reihenfolge der erfolgreichen Versuche (1.6.1) und der fehlgeschlagenen Versuche (1.6.2).
HINWEIS: Hier haben wir Lernen als den Abschluss von 5 aufeinanderfolgenden erfolgreichen Studien definiert. Sobald das Lernen demonstriert wurde, sollten die Fische aus der Shuttle-Box entnommen und menschlich eingeschläfert werden.
2. Speicherparadigma (Abbildung 1A)
HINWEIS: Dieses Paradigma bietet eine Bewertung des Kurz- und Langzeitgedächtnisses einer erlernten assoziativen kognitiven Aufgabe.
- Einarbeitungszeit
- Fügen Sie 800 ml Systemwasser in die Shuttle-Box hinzu. Machen Sie dieses Wasser, indem Sie 60 mg Instant Ocean in 1 L deionisiertem RO-Wasser auflösen. Füllen Sie das Wasser bis zur Mitte des Tanks bis zu einer Tiefe von 5 cm.
HINWEIS: Wasser sollte jede h oder nach dem Testen von 3 Fischen bei 28 °C durch frisches Systemwasser ersetzt werden. - Legen Sie 2-3 Fische in ein Auffangbecken, das Systemwasser enthält, das sich in einem dunklen Raum befindet, in dem der Shuttle-Box-Assay durchgeführt wird.
- Legen Sie im dunklen Raum 1 Fisch in die Mitte der Shuttle-Box, befestigen Sie den Deckel und befestigen Sie die Elektroden an einem Netzteil.
HINWEIS: Der Raum sollte während der Akklimatisierung und des Tests so dunkel wie möglich bleiben. - Akklimatisieren Sie Fische in der Shuttle-Box für 15 min.
HINWEIS: Der Prüfer sollte während der Eingewöhnungszeit im Raum bleiben oder ruhig in den Testraum zurückkehren, wobei er vor dem Test genügend Zeit hat, damit sich die Fische an die Anwesenheit des Prüfers anpassen können. Bestimmen Sie die erfolgreiche Akklimatisierung, wenn der Fisch das Aquarium frei erkundet. - Wenn der Fisch nicht erkundet, setzen Sie die Akklimatisierung für weitere 15 Minuten fort. Wenn sich der Fisch immer noch nicht an die Shuttle-Box gewöhnt, entfernen Sie den Fisch und verwenden Sie ihn nicht zum Testen.
- Nach der erfolgreichen Akklimatisierung leuchten Sie manuell eine 800-Lumen-rote Linsen-Taschenlampe ~ 2 cm von der Gel-Box-Seitenwand auf der Seite der Shuttle-Box, die von den Fischen besetzt ist.
- Strahlen Sie den Lichtreiz direkt auf den Fisch und folgen Sie jeder seitlichen Bewegung des Fisches mit dem Licht, um eine kontinuierliche Visualisierung des Reizes durch die Fische zu gewährleisten.
- Während das Licht auf den Fisch scheint, gleichzeitig den nachteiligen Schockreiz (20 mV: 1 A) anwenden, abwechselnd 2 s Ein, 2 s Aus für 15 s (maximal 4 Stöße) oder bis der Fisch die Hälfte der Box passiert. Sobald dies erreicht ist, beenden Sie sowohl das Licht als auch den negativen Reiz.
HINWEIS: Lassen Sie den Fisch 30 s ruhen und wiederholen Sie dann Schritt 2.1.6-2.1.8 für 25 Iterationen (Abbildung 1A).
- Fügen Sie 800 ml Systemwasser in die Shuttle-Box hinzu. Machen Sie dieses Wasser, indem Sie 60 mg Instant Ocean in 1 L deionisiertem RO-Wasser auflösen. Füllen Sie das Wasser bis zur Mitte des Tanks bis zu einer Tiefe von 5 cm.
- Erste Tests
- Lassen Sie dem Fisch nach der Trainingszeit 15 Minuten Ruhe. Entfernen Sie sie nicht aus der Shuttle-Box. Testen Sie die anfängliche Speicheraufbewahrung, indem Sie jede Testversion unmittelbar nach dieser Ruhezeit als strikt bestanden/nicht bestanden aufzeichnen.
- Tragen Sie bis zu 15 s nur den Lichtreiz auf und zeichnen Sie die Reaktionen wie folgt auf.
- Betrachten Sie den Versuch als erfolgreich, wenn der Fisch innerhalb von 15 s nach Beginn des Lichtreizes die Hälfte der Shuttle-Box überquert. Stoppen Sie den Lichtreiz sofort, wenn der Fisch die Hälfte des Wegs überquert.
- Betrachten Sie den Versuch als fehlgeschlagen, wenn der Fisch die Hälfte der Shuttle-Box 15 s nach Dem Start des Lichtreizes nicht überquert. Stoppen Sie den Lichtreiz nach 15 s.
HINWEIS: Während der ersten Tests wird nach einem fehlgeschlagenen Versuch kein unerwünschter Stimulus angewendet.
- Wiederholen Sie Schritt 2.2.2 mit einer Ruhezeit von 30 s zwischen den Studien und zeichnen Sie erfolgreiche Studien (2.2.2.1) und fehlgeschlagene Studien (2.2.2.2) in 25 Studien auf. Dieser Wert dient als individuelle Referenz für jeden Fisch.
- Sofortiger Speicher
- Induzieren Sie Verletzungen unmittelbar nach der anfänglichen Testphase durch bevorzugtes Schadensparadigma (z. B. ein stumpfes Krafttrauma mit dem modifizierten Marmarou-Gewichtsabfall). Fisch einzeln zur einfachen Identifizierung beherbergen. Notieren Sie ihre ersten Testwerte und bringen Sie die Fische in die Tieranlage zurück.
HINWEIS: Fische wurden durch stumpfe TBI verletzt, wie zuvor beschrieben22. - Sammeln Sie 2-3 unbeschädigte oder TBI-Fische 4 h nach dem ersten Test und/ oder 4 Stunden nach der Verletzung (oder im fraglichen experimentellen Zeitrahmen) in der Tieranlage. Bewahren Sie alle Fische im dunklen Raum in einzelnen Tanks mit Systemwasser auf.
- Legen Sie Fische in die Mitte der Shuttle-Box (vorbereitet mit Systemwasser wie in 1.1 beschrieben), einen Fisch nach dem anderen und befestigen Sie den Deckel. Schließen Sie das Netzteil an und lassen Sie den Fisch 15 Minuten lang akklimatisieren.
- Bewerten Sie nach der Akklimatisierung das unmittelbare Gedächtnis (strikt bestanden / nicht), indem Sie nur den Lichtreiz für bis zu 15 s anwenden und die Antworten wie folgt aufzeichnen.
- Betrachten Sie den Versuch als erfolgreich, wenn der Fisch innerhalb der 15 s Testperiode die Hälfte der Box überquert. Beenden Sie den Lichtreiz beim Überqueren des Halben Punktes.
- Betrachten Sie den Versuch als fehlgeschlagen, wenn der Fisch nicht innerhalb von 15 s nach Beginn des Lichtreizes die Hälfte der Box überquert. Beenden Sie den Lichtreiz nach 15 s Periode ist vorbei.
HINWEIS: Während dieses Tests nach einer Verletzung wird nach einem fehlgeschlagenen Versuch kein negativer Schockreiz angewendet.
- Wiederholen Sie Schritt 2.3.4 mit einer Ruhezeit von 30 s zwischen den Studien und notieren Sie die Anzahl der erfolgreichen Studien (2.3.4.1) und der fehlgeschlagenen Studien (2.3.4.2) in 25 Studien.
- Berechnen Sie die prozentuale Differenz in erfolgreichen Versuchen nach der Verletzung zum anfänglichen Testzeitraum mit der folgenden Gleichung:
- Induzieren Sie Verletzungen unmittelbar nach der anfänglichen Testphase durch bevorzugtes Schadensparadigma (z. B. ein stumpfes Krafttrauma mit dem modifizierten Marmarou-Gewichtsabfall). Fisch einzeln zur einfachen Identifizierung beherbergen. Notieren Sie ihre ersten Testwerte und bringen Sie die Fische in die Tieranlage zurück.
- Verzögerter Speicher
- Geben Sie die Fische, die einzeln untergebracht sind, um ihre anfänglichen Testwerte einfach zu identifizieren und aufzuzeichnen, unmittelbar nach der ersten Testphase in die Tierhaltung zurück.
- Erlauben Sie den Fischen 4 Tage (oder den fraglichen experimentellen Zeitrahmen) zwischen dem ersten Test und dem Verletzungs- und / oder verzögerten Gedächtnistest.
- Induzieren Sie Verletzungen durch das bevorzugte Schadensparadigma (z. B. den modifizierten Marmarou-Gewichtsabfall, um ein stumpfes Krafttrauma zu induzieren). Fisch einzeln zur einfachen Identifizierung der ersten Testwerte beherbergen und Fische in die Tieranlage zurückbringen.
HINWEIS: Fische wurden durch stumpfe TBI verletzt, wie zuvor beschrieben22. - Sammeln Sie 2-3 unbeschädigte oder TBI-Fische 4 h nach dem ersten Test und/ oder 4 Stunden nach der Verletzung (oder im fraglichen experimentellen Zeitrahmen) in der Tieranlage.
- Bewahren Sie alle Fische im dunklen Raum in einzelnen Tanks auf, die Systemwasser enthalten, und legen Sie einen nach dem anderen in die Mitte der Shuttle-Box (vorbereitet mit Systemwasser wie in 1.1 beschrieben), sichern Sie den Deckel, befestigen Sie das Netzteil und lassen Sie die Fische 15 Minuten zeitweise akklimatisieren.
- Bewerten Sie nach der Akklimatisierung den unmittelbaren Speicher (strikt bestanden / fehlgeschlagen), indem Sie nur den Lichtreiz für bis zu 15 s anwenden und die folgenden Reaktionen aufzeichnen:
- Betrachten Sie den Weg als erfolgreich, wenn der Fisch innerhalb der 15 s Testphase die Hälfte der Box überquert. Beenden Sie den Lichtreiz beim Überqueren des Halben Punktes.
- Betrachten Sie die Spur als fehlgeschlagen, wenn der Fisch nicht innerhalb von 15 s nach Beginn des Lichtreizes die Hälfte der Box überquert und den Lichtreiz beendet.
HINWEIS: Während dieses Tests nach einer Verletzung wird nach einem fehlgeschlagenen Versuch kein nachteiliger Schockreiz angewendet.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4.6 mit einer Ruhezeit von 30 s zwischen den Studien und notieren Sie die Anzahl der erfolgreichen Studien (2.4.6.1) und der fehlgeschlagenen Studien (2.4.6.2) in 25 Studien.
- Berechnen Sie die prozentuale Differenz in erfolgreichen Versuchen nach der Verletzung zum anfänglichen Testzeitraum mit der Gleichung:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das im Protokoll und Schema (Abbildung 1) beschriebene Lernparadigma bietet eine schnelle Bewertung der Kognition in Bezug auf assoziatives Lernen. Darüber hinaus hat dieses Paradigma ein hohes Maß an Stringenz, indem es lernen als wiederholte und konsistente Anzeige von 5 aufeinanderfolgenden positiven Studien definiert. Dieses Paradigma ist auch auf eine Reihe von Altersgruppen und Verletzungen anwendbar. Unbeschädigte Fische im Alter von 8 Monaten (junger Erwachsener), 18 Monaten (Erwachsener mittleren Alters) und 24 Monaten (älterer Erwachsener) erforderten eine ähnliche Anzahl von Versuchen, um das Verhalten der Vermeidung des roten Lichts zu erlernen (unbeschädigt 8 m: 15,28 ± 4,92 Versuche, 18 m: 17,66 ± 5,5 Versuche, 24 m: 16,2 ± 4,79 Versuche, 8 m vs. 18 m p = 0,92, 8 m vs. 24 m p = 0,98, 18 m vs. 24 m p=0,97, Abbildung 2A). Wir verwendeten auch ein sTBI-Modell (sTBI) mit schwerer stumpfer Kraft und beobachteten, dass Fische in verschiedenen Altersstufen eine ähnliche Anzahl von Studien benötigten, um den Assay über 1-5 Tage nach der Verletzung zu beherrschen (dpi; 8 m vs 18 m, p = 0,09, 8 m vs 24 m, p = 0,96, 18 m vs 24 m, p = 0,12, Abbildung 2A). An Tag 1 nach sTBI benötigten Fische jeden Alters (8, 18 und 24 m) eine ähnliche Anzahl von Versuchen, um das Verhalten zu erlernen (8 m: 73,3 ± 9,45 Versuche, 18 m: 79,33 ± 6,35 Versuche, 24 m: 68,25 ± 6,65 Versuche, 8 m vs. 18 m p = 0,71, 8 m vs. 24 m p = 0,76, 18 m vs. 24 m p = 0,28, Abbildung 2A) und sie waren alle deutlich größer als die unbeschädigten Kontrollen (S<0,01). Insgesamt zeigen diese Daten, dass die Shuttle-Box verwendet werden kann, um verletzungsbedingte kognitive Defizite über Altersgruppen hinweg zu untersuchen, und legen nahe, dass sich erwachsene Zebrafische nach stumpfen Verletzungen kognitiv erholen können.
Da wiederholte miTBI-Ereignisse die kognitive Funktion zunehmend beeinträchtigen können, haben wir den Shuttle-Box-Assay als Metrik verwendet, um die dosisabhängige Progression mit repetitivem TBI zu verfolgen. Wir haben diesen Assay verwendet, um das Lernen nach einer stumpfen miTBI-Kraftverletzung22 zu bewerten, die täglich für die verschiedenen Zeiträume wiederholt wird. Wie bereits beobachtet, meisterten unbeschädigte Fische die Shuttle-Box schnell und erreichten 5 aufeinanderfolgende positive Versuche in 16,4 ± 3,5 Versuchen(Abbildung 2B). Einen Tag nach einem einzigen miTBI zeigen Fische einen signifikanten Anstieg der Anzahl der Versuche, um das Verhalten zu lernen (40,25 ± 12,65 Versuche, s<0,05, Abbildung 2B). Dieses Defizit erhöhte sich nach 2 miTBI-Ereignissen (48 ± 14,9 Studien) und war nach 3 miTBI-Verletzungen weiter erhöht (56,63 ± 12,75 Studien, Abbildung 2B). Darüber hinaus beobachteten wir eine signifikante Zunahme der kognitiven Beeinträchtigung zwischen miTBI-Fischen, die eine singuläre Verletzung erhielten, und 3 Verletzungen (S<0,05).
Wir untersuchten auch, wie der Speicher nach wiederholten miTBI-Ereignissen beeinflusst wurde, wobei das Protokoll für sofortige und verzögerte Speicherparadigmen verwendet wurde (Abbildung 1A). Naive unbeschädigte Fische erhielten eine Trainingsphase und eine erste Testphase, nach der ein Teil der Fische zum sofortigen Gedächtnis verletzt wurde und andere für 4 Tage in die Fischanlage zurückgebracht wurden, um auf verzögerte Speicher zuzugreifen (Abbildung 2C). Unbeschädigte Fische zeigen einen leichten Anstieg der prozentualen Differenz erfolgreicher Versuche sowohl im unmittelbaren Gedächtnis (6,22% ± 4,7%) als auch im verzögerten Gedächtnis (6,13% ± 5,57%) im Vergleich zum ersten Testzeitraum. Wir untersuchten dann die Auswirkungen mehrerer stumpfer TBI-Ereignisse auf das Gedächtnis. Signifikante Defizite wurden nach miTBI im unmittelbaren Gedächtnis beobachtet, aber nicht im verzögerten Gedächtnis. Nach einem einzigen miTBI zeigten Fische signifikante unmittelbare Gedächtnisdefizite (-26,77% ± 8,93%) im Vergleich zu unbeschädigten Fischen (p<0,0001, Abbildung 2C). Dieser Trend setzte sich mit wiederholten Verletzungen mit steigenden Defiziten fort, die sowohl 2x miTBI (-37,42% ± 10,01%) als auch 3x miTBI (-39,71% ± 11,39%) folgten. Darüber hinaus beobachteten wir einen ähnlichen Dosiseffekt zwischen Fischen, die mit einem einzelnen (1x) miTBI und 3x miTBI behandelt wurden (p<0,05, Abbildung 2C). Diese Daten deuten darauf hin, dass das Lernen und Gedächtnis bei miTBI-Fischen mit der zunehmenden Anzahl von Verletzungen reduziert wird, was das Defizit signifikant erhöht, und der oben beschriebene Shuttle-Box-Assay und die oben beschriebenen Protokolle sind empfindlich genug, um diese Unterschiede zu erkennen.
Abbildung 1:Der Shuttle Box Assay. (A) Instruktiver Überblick über die Lern- und Gedächtnisparadigmen für die kognitive Bewertung. (B) Schematische Darstellung einer umgewandelten großen DNA-Gelbox für den Shuttle-Box-Assay. (C,D) Grafische Darstellung der Reizanwendung während der Versuche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zebrafische zeigen kognitive Defizite nach stumpfem Kraft-TBI. (A) Nach sTBI weisen Zebrafische im Alter von 8, 18 und 24 Monaten Lerndefizite auf, die sich zwischen den Altersgruppen nicht signifikant unterscheiden. Signifikante Erhöhungen in der Anzahl der Versuche, um das Shuttle-Box-Paradigma im Vergleich zu altersangepassten Kontrollen zu erlernen, wurden bei 1 dpi beobachtet, die um 4-5 dpi auf unbeschädigte Werte zurückkehrten. (B,C) Wiederholte miTBI-Fische zeigten dosisabhängig sowohl Lern- (B) als auch Gedächtnisdefizite (C). Der Mittelwert ± SEM wird in A und Bdargestellt, während der Mittelwert ± Standardabweichung in Cdargestellt wird. Jeder Datenpunkt in allen drei Diagrammen stellt einen einzelnen erwachsenen Zebrafisch dar. Statistische Analysen wurden entweder mit einer Einweg- oder Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test. # S<0.05, ## S<0.01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kognitive Beeinträchtigungen können sich signifikant und negativ auf die Lebensqualität auswirken. Aufgrund der erhöhten Sichtbarkeit und des Auftretens von Gehirnerschütterungen und traumatischen Hirnverletzungen in der gesamten Bevölkerung ist es wichtig zu verstehen, wie sie kognitive Beeinträchtigungen verursachen und wie der Schaden minimiert oder rückgängig gemacht werden kann. Aus diesen Gründen spielen Modellorganismen, die auf kognitiven Verfall getestet werden können, in diesen Studien eine entscheidende Rolle. Nagetiere sind seit langem das primäre Modell zur Untersuchung von Neuroverhalten und Kognition, zebrafische haben sich jedoch als nützliches Modell mit zahlreichen unterschiedlichen Verhaltensweisen herausgestellt, um eine Reihe von entwicklungsbedingten, altersbedingten und erworbenen kognitiven Defiziten zu untersuchen17,20,23,24,25,26. Verschiedene Methoden zur Beurteilung der Kognition wurden verwendet, vom eindimensionalen Lernen in Form von Gewöhnung über komplexes Lernen und räumliches Gedächtnis, neuartige Objekt- und Ortserkennung bis hin zur Entscheidungsfindung18,19,20,21,27,28. Diese kognitiven Tests beschränken sich jedoch auf das Testen der nicht-assoziativen Kognition oder erfordern ein komplexes Setup, finanzielle Investitionen in die Ausrüstung oder einen umfangreichen Zeitaufwand, bevor Tests durchgeführt werden können. Im Gegensatz dazu verwenden die Shuttle-Box und die hier beschriebenen Lern- und Gedächtnisparadigmen einen komplexen assoziativen Lernassay, der kostengünstig, schnell bewertet und von einem unerfahrenen Ermittler leicht eingesetzt werden kann. Am wichtigsten ist, dass unser Assay in Übereinstimmung mit den anderen kognitiven Tests zeigt, dass unbeschädigte Fische die assoziative Aufgabe schnell erlernen und sich die Aufgabe Tage später ohne intermittierendes Training merken können29.
Die Anpassungsfähigkeit des Assays bietet Möglichkeiten, verschiedene Zeitpunkte des Lernens und des Gedächtnisses als Metrik des Krankheitsverlaufs oder mechanistischer Interventionen zu untersuchen. Es gibt zwei Hauptmerkmale des Assays. Erstens ist die Methode einfach. Der Assay ist schnell eingerichtet und hat klare und eindeutige Endpunkte in Bezug auf erfolgreiche und gescheiterte Studien, so dass er für eine Reihe von Prüfärzten zugänglich ist. Wir haben festgestellt, dass aufgrund der Einfachheit dieses Assays nur sehr wenig Fehlerbehebung erforderlich ist, um die Shuttle-Box erfolgreich zu verwenden. Zweitens ist der Assay im Vergleich zu anderen kognitiven Untersuchungen extrem schnell, was Flexibilität oder die Fähigkeit bietet, eine große Anzahl von Fischen an einem einzigen Tag schnell zu untersuchen. Die Zeit zur Beurteilung des Lernens beträgt mindestens 19,75 Minuten(Abbildung 1),wobei die Fische 15 Minuten benötigen, um sich an die Shuttle-Box zu gewöhnen (bestimmt durch Tankerkundung), gefolgt von einem einzigen fehlgeschlagenen Versuch (15 s LeichterReiz, 15 s Aversionsreiz, 30 s zwischen den Versuchen) und 5 sofortigen und aufeinanderfolgenden positiven Versuchen (<15 s Lichtreiz). In der Praxis beobachteten wir, dass unbeschädigte Fische 6-30 Versuche (19,75 min-43,75 min) benötigen, während in extremen Fällen (nach einem schweren stumpfen Gewalttrauma) die schwersten Defizite 100 Versuche (113,75 min) erfordern können. Gedächtnisstudien werden auch schnell durchgeführt. Gemäß der Protokollbeschreibung beträgt die Mindestzeit für Akklimatisierung, Training und anfängliche Tests 67,5 Minuten (15 Minuten Akklimatisierung, 25 Iterationen von Licht und Schock für 15 s, 30 s Ruhe zwischen den Versuchen und Wiederholung für erste Tests ohne die nachteiligen Reize). Während das erneute Testen des sofortigen oder verzögerten Gedächtnisses nur 33,75 Minuten erfordert (15 Minuten Akklimatisierung, 25 Iterationen von nur Lichtreiz für 15 s und 30 s Ruhe zwischen den Studien), unabhängig von Verletzung, Behandlung oder kognitivem Defizit.
Bei der Beurteilung des Neuroverhaltens nutzen verschiedene Paradigmen entweder positive oder nachteilige Reize. Positive Reize in Form von Nahrung oder sozialer Interaktion, die oft in klassischen T-Box-Labyrinthen verwendet werden, können zu einer starken Reaktion auf eine erlernte Aufgabe beitragen. Assays, die eine positive Assoziation verwenden, tun dies jedoch auf Kosten der Zeit. Im Gegensatz dazu bietet die Konditionierung als Reaktion auf einen nachteiligen Reiz eine schnelle Assoziation und eine starke Verhaltensreaktion, geht jedoch auf Kosten des nachteiligen Reizes. Unbeschädigte Fische lernen den Shuttle-Box-Assay oft schnell und sind daher einer minimalen Anzahl von Schocks ausgesetzt und scheinen daher keine unerwünschten Ereignisse zu haben. Neurologisch kompromittierte Fische (TBI) mit schweren kognitiven Defiziten erfordern jedoch eine erhebliche Anzahl von Versuchen und Elektroschocks. Es wurde beobachtet, dass diese multiplen Schocks gelegentlich zu tonisch-klonischen Anfällen führen. Jeder Fisch, der einen tonisch-klonischen Anfall erfährt, während er sich in der Shuttle-Box befindet, sollte sofort entfernt und ethisch eingeschläfert werden. Alle Versuche für den eingeschläferten Fisch bis einschließlich des Anfallsereignisses sollten in jeder statistischen Analyse ausgeschlossen werden. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass ein elektrischer Schlag bei einem neurologisch geschädigten Subjekt unbeabsichtigte Unterschiede zwischen beschädigten Fischen verursachen kann, die aus der Shuttle-Box resultieren und nicht. Aus diesem Grund schlagen wir vor, dass alle Fische, die einer Beurteilung des Neuroverhaltens unterzogen werden, nicht für andere quantitative Metriken (Serum-Biomarker, IHC usw.) verwendet werden sollten. Es ist auch wichtig zu verstehen, dass diese Lernmethode auf einem visuellen Reiz basiert und nicht für Schäden geeignet ist, die visuelle Schaltkreise beeinträchtigen können, da sie die Ergebnisse verwirren.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass Zebrafische nach stumpfem TBI ein schnelles kognitives Defizit aufweisen, das zu verstärkten Versuchen führt, eine assoziative Aufgabe im Shuttle-Box-Assay zu meistern. Ähnliche unmittelbare Defizite werden in Nagetiermodellen von TBI beobachtet, jedoch können diese Defizite abnehmen, sie bleiben oft bestehen und bleiben signifikant30. Im Gegensatz dazu zeigen Zebrafische innerhalb von 7 Tagen nach der Verletzung eine kognitive Erholung. Die Regenerationsfähigkeit des erwachsenen Zebrafisches ist gut dokumentiert9,10,11,12,13,14,15, mit bekannten neurogenen Nischen in den ventrikulären/subventrikulären Zonen des Telencephalons31,32. Die kognitive Erholung, die in unserem Assay nach TBI beobachtet wurde, gibt Einblick in notwendige Untersuchungen, um festzustellen, ob diese neurogenen Nischen stimuliert werden und eine Rolle bei der Gewebe- und kognitiven Erholung spielen.
Zusammenfassend bietet die Shuttle-Box eine schnelle Beurteilung der Kognition in Bezug auf assoziatives Lernen und Gedächtnis. Der Assay verwendet minimale und konventionelle Ausrüstung und ist technisch einfach. Zukünftige Anwendungen könnten genutzt werden, um genetische und pharmakologische Eingriffe an neurologisch beleidigten Fischen in Bezug auf Neuroprotektion sowie andere Verletzungsparadigmen oder neurodegenerative Modelle zu bewerten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Hyde-Labormitgliedern für ihre durchdachten Diskussionen und den Technikern des Freimann Life Sciences Center für die Pflege und Haltung von Zebrafischen. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Center for Zebrafish Research an der University of Notre Dame, dem Center for Stem Cells and Regenerative Medicine an der University of Notre Dame und Zuschüssen des National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), dem National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH) und das Pat Tillman Stipendium (JTH). Abbildung 1 mit BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flashlight | Ultrafire | 9145 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Large DNA Gel Box | Fisher Scientific | FB-SB-1316 | Shuttle Box |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB-105 |
References
- Deutsch, M., Mendez, M., Teng, E. Interactions between traumatic brain injury and frontotemporal degeneration. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 39, 143-153 (2015).
- Gardner, R., et al. Traumatic brain injury in later life increases risk for Parkinson disease. Annals in Neurology. 77, 987 (2015).
- Fleminger, S., Oliver, D., Lovestone, S., Rabe-Hesketh, S., Giora, A. Head injury as a risk factor for Alzheimer's disease: the evidence 10 years on; a partial replication. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 74, 857-886 (2003).
- Johnson, V., Stewart, W., Smith, D. Traumatic brain injury and amyloid-β pathology: a link to Alzheimer's disease. Nature Reviews Neurosciences. 11, 361-370 (2010).
- Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31, 379-387 (2016).
- Corrigan, J. D., Selassie, A. W., Orman, J. A. L.
- Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14, 506-517 (2015).
- GBD 2016 Traumatic Brain Injury and Spinal Cord Injury Collaborators. Global, regional, and national burden of traumatic brain injury and spinal cord injury, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet, Neurology. 18 (1), 56-87 (2019).
- Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
- Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342, 26-38 (2010).
- Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Reviews of Vision Sciences. 6, 171-193 (2020).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), Cambridge, England. 4831-4841 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Bhattarai, P., et al. Neuron-glia interaction through Serotonin-BDNF-NGFR axis enables regenerative neurogenesis in Alzheimer's model of adult zebrafish brain. PLoS Biology. 18 (1), 3000585 (2020).
- Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Chanin, S., et al. Assessing startle responses and their habituation in adult zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Humana Press. (2012).
- López-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 54, 134-139 (2019).
- Maheras, A. L., et al. Genetic pathways of neuroregeneration in a novel mild traumatic brain injury model in adult zebrafish. eNeuro. 5 (1), (2018).
- Gaspary, K. V., Reolon, G. K., Gusso, D., Bonan, C. D. Novel object recognition and object location tasks in zebrafish: Influence of habituation and NMDA receptor antagonism. Neurobiology of Learning and Memory. 155, 249-260 (2018).
- Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A scalable model to study the effects of blunt-force injury in adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Wu, Y. J., et al. Fragile X mental retardation-1 knockout zebrafish shows precocious development in social behavior. Zebrafish. 14 (5), 438-443 (2017).
- Rea, V., Van Raay, T. J. Using zebrafish to model autism spectrum disorder: A Comparison of ASD risk genes between zebrafish and their mammalian counterparts. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 575575 (2020).
- Zhdanova, I. V., et al. Aging of the circadian system in zebrafish and the effects of melatonin on sleep and cognitive performance. Brain Research Bulletin. 75 (2-4), 433-441 (2008).
- Yu, L., Tucci, V., Kishi, S., Zhdanova, I. V.
- Bahl, A., Engert, F. Neural circuits for evidence accumulation and decision making in larval zebrafish. Nature Neuroscience. 23 (1), 94-102 (2020).
- Ngoc Hieu, B. T., et al. Development of a modified three-day t-maze protocol for evaluating learning and memory capacity of adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1464 (2020).
- Williams, F. E., White, D., Messer, W. S. A simple spatial alternation task for assessing memory function in zebrafish. Behavioural Processes. 58 (3), 125-132 (2002).
- Zohar, O., et al. Closed-head minimal traumatic brain injury produces long-term cognitive deficits in mice. Neuroscience. 118 (4), 949-955 (2003).
- Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration, and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
