Summary
ट्रांसमिटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड्स माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) को फ्यूज करके प्राप्त हाइब्रिड कोशिकाएं हैं - माइटोकॉन्ड्रियल विकारों से प्रभावित रोगियों से प्राप्त साइटोप्लास्ट (यून्यूक्लिएटेड कोशिकाओं) के साथ समाप्त कोशिकाएं (rho0 कोशिकाएं)। वे बीमारी के परमाणु या माइटोकॉन्ड्रियल मूल के निर्धारण, जैव रासायनिक गतिविधि के मूल्यांकन, और एमटीडीएनए से संबंधित वेरिएंट की पैथोजेनेटिक भूमिका की पुष्टि की अनुमति देते हैं।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला परिसरों की कमी जो ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (OXPHOS) को पूरा करती है, मानव माइटोकॉन्ड्रियल विकारों का जैव रासायनिक मार्कर है। आनुवांशिक दृष्टिकोण से, OXPHOS एक अद्वितीय उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि यह दो अलग-अलग आनुवंशिक प्रणालियों के पूरक के परिणामस्वरूप होता है: परमाणु डीएनए (nDNA) और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (mtDNA)। इसलिए, OXPHOS दोष परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल एन्कोडेड जीन को प्रभावित करने वाले उत्परिवर्तन के कारण हो सकते हैं।
1989 में प्रकाशित किंग और अटार्डी द्वारा ग्राउंडब्रेकिंग काम से पता चला है कि एमटीडीएनए (जिसका नाम rho0 है) की समाप्त हो गई मानव सेल लाइनों को तथाकथित "ट्रांसमिटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड्स" प्राप्त करने के लिए बहिर्जात माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा पुन: स्थापित किया जा सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल विकारों (एमडी) और rho0 कोशिकाओं से नाभिक के साथ रोगियों से व्युत्पन्न माइटोकॉन्ड्रिया युक्त इन cybrids के लिए धन्यवाद, यह सत्यापित करना संभव है कि क्या कोई दोष mtDNA- या nDNA से संबंधित है। ये साइब्रिड्स एक उत्परिवर्तन की रोगजनकता को मान्य करने और जैव रासायनिक स्तर पर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण भी हैं। यह पेपर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो साइब्रिड पीढ़ी, चयन और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रियल विकार (एमडी) मल्टीसिस्टम सिंड्रोम का एक समूह है जो या तो परमाणु (एनडीएनए) या माइटोकॉन्ड्रियल (एमटीडीएनए) डीएनए 1 में उत्परिवर्तन के कारण माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों में हानि के कारण होताहै। वे 1: 5,000 के प्रसार के साथ, सबसे आम विरासत में मिली चयापचय बीमारियों में से एक हैं। mtDNA से संबंधित रोग माइटोकॉन्ड्रियल आनुवांशिकी के नियमों का पालन करते हैं: मातृ विरासत, हेटरोप्लाज्मी और थ्रेशोल्ड प्रभाव, और माइटोटिक अलगाव2। मानव mtDNA 16.6 KB का एक डबल-फंसे हुए डीएनए सर्कल है, जिसमें प्रतिकृति और प्रतिलेखन के लिए आवश्यक अनुक्रमों के साथ एक छोटा नियंत्रण क्षेत्र होता है, 13 प्रोटीन-कोडिंग जीन (श्वसन श्रृंखला के सभी सबयूनिट्स), 22 tRNA, और 2 rRNA जीन3।
स्वस्थ व्यक्तियों में, एक एकल एमटीडीएनए जीनोटाइप (होमोप्लाज्मी) होता है, जबकि एक से अधिक जीनोटाइप रोग संबंधी स्थितियों में सह-अस्तित्व (हेटरोप्लाज्मी) होता है। हानिकारक हेटरोप्लाज्मिक उत्परिवर्तन को OXPHOS को बाधित करने के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा को दूर करना चाहिए और उन बीमारियों का कारण बनना चाहिए जो किसी भी उम्रमें किसी भी अंग को प्रभावित कर सकते हैं। OXPHOS के दोहरे आनुवांशिकी विरासत को निर्देशित करते हैं: ऑटोसोमल रिसेसिव या प्रमुख और एनडीएनए उत्परिवर्तन के लिए एक्स-लिंक्ड, एमटीडीएनए उत्परिवर्तन के लिए मातृ, साथ ही एनडीएनए और एमटीडीएनए दोनों के लिए छिटपुट मामले।
माइटोकॉन्ड्रियल चिकित्सा युग की शुरुआत में, किंग और अटार्डी5 द्वारा किए गए एक ऐतिहासिक प्रयोग ने ट्यूमर सेल लाइनों से नाभिक युक्त हाइब्रिड कोशिकाओं का निर्माण करके एमडी के लिए जिम्मेदार उत्परिवर्तन की उत्पत्ति को समझने के लिए आधार स्थापित किया, जिसमें एमटीडीएनए पूरी तरह से समाप्त हो गया था (rho0 कोशिकाएं) और एमडी वाले रोगियों से माइटोकॉन्ड्रिया। अगली पीढ़ी की अनुक्रमण (NGS) तकनीकउस समय उपलब्ध नहीं थी, और यह निर्धारित करना आसान नहीं था कि परमाणु या माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम में उत्परिवर्तन मौजूद था या नहीं। 1989 में वर्णित विधि, तब माइटोकॉन्ड्रियल चिकित्सा 6,7,8,9 के क्षेत्र में काम करने वाले कई शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग की गई थी; एक विस्तृत प्रोटोकॉल हाल ही में प्रकाशित किया गया है10, लेकिन कोई वीडियो अभी तक नहीं बनाया गया है. इस तरह के प्रोटोकॉल को आजकल प्रासंगिक क्यों होना चाहिए जब एनजीएस ठीक और तेजी से पहचान सकता है कि उत्परिवर्तन कहां स्थित है? जवाब यह है कि साइब्रिड पीढ़ी अभी भी किसी भी उपन्यास एमटीडीएनए उत्परिवर्तन की रोगजनक भूमिका को समझने के लिए अत्याधुनिक प्रोटोकॉल है, जो बीमारी की गंभीरता के साथ हेटरोप्लाज्मी के प्रतिशत को सहसंबंधित करती है, और एक सजातीय परमाणु प्रणाली में एक जैव रासायनिक जांच करती है जिसमें रोगी की ऑटोक्थोनस परमाणु पृष्ठभूमि का योगदान अनुपस्थित है11, 12,13.
यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि 35 मिमी पेट्री व्यंजनों में उगाए गए कॉन्फ्लुएंट, रोगी-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट से साइटोप्लास्ट कैसे प्राप्त किया जाए। साइटोकैलासिन बी की उपस्थिति में व्यंजनों का सेंट्रीफ्यूजेशन एन्यूक्लिएटेड साइटोप्लास्ट के अलगाव की अनुमति देता है, जो तब पॉलीइथिलीन ग्लाइकोल (पीईजी) की उपस्थिति में rho0 कोशिकाओं के साथ जुड़े होते हैं। परिणामी cybrids तो चयनात्मक माध्यम में खेती कर रहे हैं जब तक क्लोन उत्पन्न होता है. प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग परिणाम cybrids के आणविक लक्षण वर्णन का एक उदाहरण दिखाता है यह साबित करने के लिए कि mtDNA दाता रोगियों के fibroblasts के समान है और nDNA ट्यूमरल rho0 सेल लाइन के परमाणु डीएनए के समान है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
नोट: मानव फाइब्रोब्लास्ट के उपयोग के लिए नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता हो सकती है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले फाइब्रोब्लास्ट एमडी रोगियों से प्राप्त किए गए थे और नैतिक आवश्यकताओं के अनुपालन में संस्थागत बायोबैंक में संग्रहीत किए गए थे। कोशिकाओं के उपयोग के लिए सूचित सहमति प्रदान की गई थी। कमरे के तापमान (आरटी, 22-25 डिग्री सेल्सियस) पर एक बाँझ लैमिनर प्रवाह कैबिनेट के तहत सभी सेल संस्कृति प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें। सेल संस्कृति और बाँझ उपकरणों के लिए उपयुक्त बाँझ-फ़िल्टर किए गए समाधानों का उपयोग करें। 5% CO2 के साथ 37 °C पर एक humidified इनक्यूबेटर में सभी सेल लाइनों को विकसित करें। माइकोप्लाज्मा परीक्षण ों को माइकोप्लाज्मा-मुक्त संस्कृतियों को सुनिश्चित करने के लिए साप्ताहिक रूप से आयोजित किया जाना चाहिए। 143BTK- rho0 कोशिकाओं को पहले वर्णित 5 के रूप में उत्पन्न किया जा सकताहै।
1. कोशिकाओं की संस्कृति
- किसी भी प्रक्रिया को शुरू करने से पहले, एमडी रोगी (ओं) से व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट्स में उत्परिवर्तन की उपस्थिति को सत्यापित करें और प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) और / या पूरे एमटीडीएनए अनुक्रमण विश्लेषण14 द्वारा हेटरोप्लाज्मी या होमोप्लाज्मी के प्रतिशत को निर्धारित करें।
- चार 35 मिमी पेट्री व्यंजनों में बीज फाइब्रोब्लास्ट, प्रत्येक में पूर्ण संस्कृति माध्यम के 2 एमएल होते हैं (तालिका 1)। कोशिकाओं को 80% confluent (48 h) तक बढ़ने दें।
- एक100 मिमी पेट्री डिश में पूरक संस्कृति माध्यम (तालिका 1) के 8 मिलीलीटर में 143BTK- rho 0 कोशिकाओं को विकसित करें।
- 5% CO2 के साथ 37 °C पर एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बनाए रखें।
- अनुक्रमणतकनीकों द्वारा rho 0 कोशिकाओं में mtDNA की अनुपस्थिति की जाँच करें14.
2. फाइब्रोब्लास्ट्स का न्यूक्लिएशन
- एक 20 मिनट के चक्र के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव नसबंदी द्वारा चार 250 एमएल सेंट्रीफ्यूज-उपयुक्त बोतलों को निष्फल करें। उन्हें एक प्रयोगशाला ओवन में या आरटी पर सुखाएं।
- Prewarm 37 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज.
- फाइब्रोब्लास्ट वाले 35 मिमी व्यंजनों को दो बार धोएं, 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के 2 मिलीलीटर का उपयोग करके (डब्ल्यू / ओ) कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना।
- 70% इथेनॉल के साथ व्यंजनों की बाहरी सतह को साफ करें और शराब के वाष्पित होने तक प्रतीक्षा करें।
- बर्तन से ढक्कन और बोतलों से पेंच टोपी निकालें। ढक्कन के बिना प्रत्येक पकवान को रखें, प्रत्येक 250 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज बोतल के नीचे उल्टा।
- धीरे-धीरे प्रत्येक बोतल (तालिका 1) में 32 मिलीलीटर न्यूक्लिएशन मीडियम जोड़ें, जिससे माध्यम डिश में प्रवेश कर सके और कोशिकाओं के संपर्क में आ सके। एक लंबे ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके व्यंजनों से किसी भी बुलबुले को हटा दें, एक बुनसेन लौ में टिप को घुमाएं।
नोट: माध्यम को डिश में प्रवेश करने और कोशिकाओं के संपर्क में आने की अनुमति देने के लिए बुलबुले को हटाना महत्वपूर्ण है। - पेंच टोपी के साथ प्रत्येक बोतल को बंद करें और उन्हें सेंट्रीफ्यूज में स्थानांतरित करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस और 8,000 × जी, त्वरण अधिकतम, मंदी धीमी गति से 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। सेंट्रीफ्यूज को संतुलित करने के लिए ध्यान दें: प्रत्येक बोतल को काउंटरवेट करें। यदि आवश्यक हो, तो न्यूक्लिएशन मीडियम की एक उपयुक्त मात्रा जोड़कर वजन को समायोजित करें।
- centrifugation के दौरान, वैक्यूम या एक 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करने के लिए aspirate और 143BTK- rho0 संस्कृति प्लेटों से माध्यम को त्यागने के लिए और उन्हें 1x PBS w / o कैल्शियम और मैग्नीशियम के 4 मिलीलीटर का उपयोग करके दो बार धोएं।
- सेल मोनोलेयर को पूरी तरह से कवर करने के लिए ट्रिप्सिन के 2 एमएल जोड़ें।
- ~ 2 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में व्यंजनों को रखें।
- इनक्यूबेटर से व्यंजनों को निकालें, लाइव कोशिकाओं (उद्देश्यों 4x या 10x) के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल टुकड़ी का निरीक्षण करें, और पूरक संस्कृति माध्यम के 2 एमएल जोड़कर एंजाइम गतिविधि को बाधित करें।
- डिश में सेल सस्पेंशन के 4 एमएल को 10 एमएल पिपेट के साथ एस्पिरेट करें और इसे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- एक Burker hemocytometer कक्ष या एक स्वचालित काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें।
- centrifugation (चरण 2.8) के अंत में, बोतलों से माध्यम aspirate और इसे त्याग दें।
- पहले 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव किए गए बाँझ धुंध पर बोतलों को उलटकर व्यंजनों को हटा दें। 70% इथेनॉल के साथ व्यंजनों और उनके ढक्कन की बाहरी सतह को साफ करें। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि शराब वाष्पित न हो जाए, और फिर व्यंजनों को बंद कर दें।
- आगे बढ़ने से पहले, लाइव कोशिकाओं (उद्देश्य 4x या 10x) के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके साइटोप्लास्ट (भूत) गठन की जांच करें। साइटोकैलासिन बी द्वारा प्रेरित उनके नाभिक के बाहर निकालना के कारण बेहद लम्बी फाइब्रोब्लास्ट की तलाश करें।
- प्रत्येक 35 मिमी पकवान के लिए, 1 × 143BTK के 106 जोड़ें- rho 0 कोशिकाओंको 143BTK के 2 mL में पुन: निलंबित किया गया- rho0 संस्कृति माध्यम 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक।
- 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक humidified इनक्यूबेटर में 3 घंटे के लिए व्यंजन छोड़ दें और 143BTK- rho0 कोशिकाओं को भूतों पर बसने दें। पकवानों को परेशान न करें।
3. rho 0 कोशिकाओं के साथ enucleated fibroblasts का संलयन
- इनक्यूबेशन के 3 घंटे के बाद, एस्पिरेट करें और व्यंजनों से माध्यम को छोड़ दें।
- Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) उच्च ग्लूकोज w / o सीरम या न्यूनतम आवश्यक माध्यम (MEM) के साथ 2 मिलीलीटर के साथ अनुयायी कोशिकाओं को दो बार धोएं।
- एस्पिरेट करें और माध्यम को छोड़ दें।
- कोशिकाओं के लिए खूंटी समाधान के 500 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और ठीक 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- Aspirate और खूंटी समाधान छोड़ दें।
- DMEM उच्च ग्लूकोज w / o सीरम के 2 मिलीलीटर का उपयोग करके या एमईएम के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं।
- फ्यूजन मीडियम (तालिका 1) के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
4. Cybrid चयन और विस्तार
- रात भर इनक्यूबेशन के बाद, इनक्यूबेटर से प्लेटों को हटा दें, ऊपर वर्णित कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करें (चरण 2.9-2.13), और प्रत्येक 35 मिमी डिश की सामग्री को 100 मिमी डिश में स्थानांतरित करें।
- चयन माध्यम (तालिका 1) के 8 मिलीलीटर जोड़ें और 5% CO2 के साथ 37 °C पर इनक्यूबेटर में प्लेटों को रखें।
- माध्यम को हर 2-3 दिनों में बदलें।
- चयन के ~ 10-15 दिनों के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि कोशिकाओं की कॉलोनियां दिखाई न दें।
- सभी क्लोनों को इकट्ठा करके और साइब्रिड्स के बैकअप के रूप में "बड़े पैमाने पर" संस्कृति उत्पन्न करके चार पेट्री व्यंजनों में से एक को फ्रीज करें, जिसे अंततः आगे की जांच के लिए फिर से खोला जा सकता है और उपयोग किया जा सकता है।
- शेष संस्कृति व्यंजनों में कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करें, गिनती करें, और पूरक संस्कृति माध्यम (तालिका 1) में 50-100 कोशिकाओं / डिश पर एक या अधिक पेट्री व्यंजनों में बीज करें जब तक कि क्लोन दिखाई न दें। उन्हें कुछ दिनों के लिए बढ़ने दें।
- आरटी में 3 मिनट के लिए 1,200 × जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शेष कोशिकाओं को गोली मारें और supernatant को त्याग दें।
- गोली से डीएनए निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- अग्रानुक्रम रूप से दोहराए गए (VNTR) विश्लेषण की चर संख्या द्वारा जीनोटाइपिंग करें जैसा कि पहले15 की सूचना दी गई थी।
- क्लोनिंग सिलेंडर या एक पिपेट टिप के साथ पेट्री डिश से क्लोन उठाएं, विभिन्न क्लोनों के पूलिंग से बचने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके, और उन्हें 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें, प्रत्येक में पूरक संस्कृति माध्यम (तालिका 1) के 200 μL शामिल हैं।
- प्रत्येक क्लोन का विस्तार करें जब तक कि डीएनए को ठंडा करने और निकालने के लिए पर्याप्त कोशिकाएं न हों।
- RFLP या अन्य अनुक्रमण विधियों द्वारा प्रत्येक क्लोन का उत्परिवर्तन प्रतिशत सत्यापित करें। आदर्श रूप से, जंगली-प्रकार के एमटीडीएनए (0% उत्परिवर्तन) और विभिन्न उत्परिवर्तन प्रतिशत के साथ क्लोन दोनों क्लोन प्राप्त करने का प्रयास करें, दोनों होमोप्लाज्मिक उत्परिवर्ती एमटीडीएनए (100% उत्परिवर्तन) को जोड़ते हैं। cybrid जनरेशन प्रोटोकॉल के एक योजनाबद्ध आरेख के लिए चित्र 1 देखें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cybrids उत्पन्न प्रयोगशाला काम के 3 दिनों के साथ-साथ एक चयन अवधि (~ 2 सप्ताह) और क्लोन के विकास के लिए अतिरिक्त 1-2 सप्ताह की आवश्यकता होती है। महत्वपूर्ण कदम साइटोप्लास्ट की गुणवत्ता और चयन अवधि हैं। Cybrids की आकृति विज्ञान rho0 दाता कोशिकाओं के समान है। कोशिकाओं की पहचान की पुष्टि करने के लिए साइब्रिड्स में सही mtDNA और nDNA का असाइनमेंट अनिवार्य है। एक उदाहरण चित्र 2 में दिया गया है। इस मामले में, हमने हेटरोप्लाज्मिक एम.3243ए>जी ले जाने वाले रोगी से व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट्स से शुरू होने वाले साइब्रिड उत्पन्न किए, जो माइटोकॉन्ड्रियल मायोपैथी, एन्सेफैलोपैथी, लैक्टिक एसिडोसिस और स्ट्रोक जैसे एपिसोड (मेलास) से जुड़े सबसे आम एमटीडीएनए उत्परिवर्तनों में से एक है। वीएनटीआर के विश्लेषण से पता चला है कि साइब्रिड एनडीएनए rho0 कोशिकाओं (चित्रा 2A) के समान है, जो 143B जीनोम के साथ रोगी के nDNA के प्रतिस्थापन की पुष्टि करता है। RFLP और / या अनुक्रमण विश्लेषण का उपयोग mtDNA उत्परिवर्तन और हेटरोप्लाज्मी प्रतिशत (चित्रा 2B, C) की उपस्थिति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
चित्रा 1: cybrid जनरेशन प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आरेख. रोगी-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट्स को साइटोकैलासिन बी के साथ इलाज किया जाता है और साइटोप्लास्ट (यूक्ल्यूलिएटेड कोशिकाओं) को प्राप्त करने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। साइटोप्लास्ट और mtDNA-समाप्त कोशिकाओं (143BTk- rho0) के साइटोप्लाज्मिक संलयन cybrids की पीढ़ी की अनुमति देता है जिसे उपयुक्त माध्यम में चयन के बाद अलग किया जा सकता है। एकल क्लोनों को उठाना और प्रवर्धित करना अलग-अलग हेटरोप्लाज्मी प्रतिशत उत्पन्न करता है, जो सिद्धांत रूप में 100% जंगली-प्रकार से 100% उत्परिवर्तित तक भिन्न हो सकता है। संक्षिप्त नाम: mtDNA = माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: cybrids के आणविक लक्षण वर्णन. (A) Apo-B माइक्रोसेटेलाइट्स के विश्लेषण से पता चलता है कि उत्पन्न cybrids से निकाला गया nDNA rho0 सेल लाइन के परमाणु डीएनए के समान है। (बी) MELAS-संबद्ध m.3243A>G, जिसका उपयोग WT की मात्रा को मापने के लिए किया जाता है) और Mut mtDNA प्रजातियों में फैले PCR उत्पाद के HaeIII प्रतिबंध मानचित्र। (सी) आरएफएलपी विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम विभिन्न साइब्रिड क्लोन (सी 1, सी 2, सी 3) में एम.3243 ए>जी हेटरोप्लाज्मी स्तर दिखाते हैं। संक्षिप्त रूप: M = मार्कर; bp = आधार जोड़े; WT = जंगली प्रकार; Mut = उत्परिवर्ती; RFLP = प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता; MELAS = माइटोकॉन्ड्रियल मायोपैथी, एन्सेफैलोपैथी, लैक्टिक एसिडोसिस, और स्ट्रोक जैसे एपिसोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| मीडिया संरचना | |
| पूर्ण संस्कृति माध्यम | अंतिम conc. |
| DMEM उच्च ग्लूकोज (w / o L-Glutamine W / सोडियम पाइरूवेट) | [1:1] |
| FetalClone III (गोजातीय सीरम उत्पाद) | 10% |
| सोडियम पाइरूवेट 100 mM | 1 mM |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (समाधान 100x) | 1% |
| एल ग्लूटामाइन 200 mM (100x) | 2 mM |
| पूरक संस्कृति माध्यम | अंतिम conc. |
| DMEM उच्च ग्लूकोज (w / o L-Glutamine W / सोडियम पाइरूवेट) | [1:1] |
| FetalClone III (गोजातीय सीरम उत्पाद) | 10% |
| सोडियम पाइरूवेट 100 mM | 1 mM |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (समाधान 100x) | 1% |
| एल ग्लूटामाइन 200 mM (100x) | 4 mM |
| यूरिडीन | 50 μg/mL |
| न्यूक्लिएशन माध्यम | अंतिम conc. |
| DMEM उच्च ग्लूकोज (w / o L-Glutamine W / सोडियम पाइरूवेट) | [1:1] |
| FetalClone III (गोजातीय सीरम उत्पाद) | 5% |
| सोडियम पाइरूवेट 100 mM | 1 mM |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (समाधान 100x) | 1% |
| एल ग्लूटामाइन 200 mM (100x) | 2 mM |
| Drechslera dematioidea से Cytochalasin B | 10 μg/mL |
| संलयन माध्यम | अंतिम conc. |
| DMEM उच्च ग्लूकोज (w / o L-Glutamine W / सोडियम पाइरूवेट) | [1:1] |
| FetalClone III (गोजातीय सीरम उत्पाद) | 5% |
| सोडियम पाइरूवेट 100 mM | 1 mM |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (समाधान 100x) | 1% |
| एल ग्लूटामाइन 200 mM (100x) | 2 mM |
| चयन माध्यम | अंतिम conc. |
| DMEM उच्च ग्लूकोज (w / o L-Glutamine W / सोडियम पाइरूवेट) | [1:1] |
| डायलिज्ड FBS | 5% |
| सोडियम पाइरूवेट 100 mM | 1 mM |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (समाधान 100x) | 1% |
| एल ग्लूटामाइन 200 mM (100x) | 2 mM |
| 5-ब्रोमो-2'-Deoxyuridine | 100 μg/mL |
तालिका 1: cybrid पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया मीडिया का विवरण.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
एमटीडीएनए में सुरक्षात्मक हिस्टोन की कमी और श्वसन श्रृंखला के करीब इसके स्थान के कारण एनडीएनए की तुलना में बहुत अधिक उत्परिवर्तन दर होती है, जो अणु को ऑक्सीडेटिव प्रभावों को नुकसान पहुंचाने के लिए उजागर करती है जो मरम्मत प्रणालियों द्वारा कुशलतापूर्वक प्रतिकार नहीं की जातीहै 16। पहले रोगजनक एमटीडीएनए उत्परिवर्तन की पहचान 1988 में17,18 में की गई थी, और तब से, बड़ी संख्या में उत्परिवर्तन का वर्णन किया गया है। एनजीएस प्रौद्योगिकी पूरे माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम को स्क्रीन करने और आसानी सेवेरिएंट 14 की पहचान करने के लिए एक प्रासंगिक दृष्टिकोण है। हालांकि, कभी वर्णित एमटीडीएनए उत्परिवर्तन की रोगजनक भूमिका का आकलन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है और अभी भी "पुराने जमाने" के तरीकों पर निर्भर करता है जैसे कि इस प्रोटोकॉल11,12,13 में वर्णित साइब्रिड कोशिकाओं की पीढ़ी। यहां वर्णित साइब्रिड पीढ़ी राजा और अटार्डी 5 द्वारा वर्णित मूल तरीकों को दोहरातीहै। हालांकि, अन्य प्रोटोकॉल में मामूली संशोधन होते हैं जो मुख्य रूप से सेल न्यूक्लिएशन10 के लिए सिस्टम से संबंधित होते हैं। अन्य उदाहरणों में, न्यूक्लिएशन अनावश्यक है, उदाहरण के लिए, जब रोगी-व्युत्पन्न जैविक सामग्री में प्लेटलेट्स होते हैं, जिसमें नाभिक19 नहीं होता है।
ट्रांसमिटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड्स में कई महत्वपूर्ण विशेषताएं होती हैं, जिससे उन्हें एक प्रासंगिक शोध उपकरण बन जाता है, भले ही उच्च-थ्रूपुट आणविक प्रौद्योगिकियां एकल-कोशिका स्तर पर डीएनए और आरएनए को प्रोफ़ाइल कर सकती हैं। अग्रणी कार्यों में, साइब्रिड्स का उपयोग नैदानिक रूप से और जैव रासायनिक रूप से माइटोकॉन्ड्रियल विकारों 6,7,8,9,20 के रूप में परिभाषित विकारों की आनुवंशिक उत्पत्ति को स्थापित करने या पुष्टि करने के लिए किया गया था। दरअसल, प्रणाली विशेष रूप से प्रोबैंड के परमाणु जीन के प्रभाव के बिना और rho0 कोशिकाओं की एक सजातीय परमाणु पृष्ठभूमि में mtDNA उत्परिवर्तन के योगदान के अध्ययन की अनुमति देती है।
इसके अलावा, एक मात्रात्मक जीनोटाइप-टू-फेनोटाइप सहसंबंध किया जा सकता है, उत्परिवर्तन के विभिन्न प्रतिशत को ले जाने वाले विभिन्न साइब्रिड क्लोनों के अलगाव के लिए धन्यवाद। विभिन्न क्लोनों का चयन चयन माध्यम (तालिका 1) का उपयोग करके किया गया था, जो डायलिज़्ड एफबीएस के साथ पूरक था और इसमें यूरिडिन और पाइरूवेट नहीं थे, जिससे केवल साइटोप्लास्ट के साथ फ्यूज किए गए rho0 कोशिकाओं के विकास की अनुमति मिलती है। इस प्रकार, rho0 कोशिकाएं जो फ्यूज नहीं हुई थीं या बरकरार फाइब्रोब्लास्ट्स (द्वि- या पॉलीन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं) के साथ-साथ किसी भी अवशिष्ट गैर-न्यूक्लिएटेड बरकरार फाइब्रोब्लास्ट्स के साथ फ्यूज नहीं हुई थीं, उन्हें समाप्त कर दिया जाता है। दरअसल, rho0 कोशिकाओं को पूरी तरह से ethidium ब्रोमाइड, माइटोकॉन्ड्रियल गामा-पोलीमरेज़21 के एक शक्तिशाली अवरोधक की कम सांद्रता के लिए दीर्घकालिक जोखिम से mtDNA के समाप्त कर रहे हैं।
एक कार्यात्मक श्वसन श्रृंखला की कमी, rho0 कोशिकाएं अपनी ऊर्जा आवश्यकताओं के लिए विशेष रूप से ग्लाइकोलाइसिस पर भरोसा करती हैं और पाइरूवेट-निर्भर हो जाती हैं। इसके अतिरिक्त, rho0 कोशिकाएं pyrimidines के लिए auxotrophic बन गई हैं (uridine एक pyrimidine अग्रदूत है) dihydroorotate dehydrogenase की कमी के कारण, माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर काम करने वाला एक एंजाइम और pyrimidine जैवसंश्लेषण में शामिल है। जबकि rho0 कोशिकाओं को मानव osteosarcoma 143B थाइमिडिन किनेज-कमी (टीके-) कोशिकाओं से प्राप्त किया जाता है, फाइब्रोब्लास्ट, साइटोप्लास्ट और पॉलीन्यूक्लिएटेड हाइब्रिड टीके + होते हैं। इसलिए, टीके + कोशिकाओं को 5-ब्रोमो -2'-डीऑक्सीयूरिडीन के संपर्क में आने के कारण हटा दिया जाता है। वास्तव में, इस यूरिडीन एनालॉग को टीके द्वारा मान्यता प्राप्त है जो डीऑक्सीथाइमिडीन के फॉस्फोराइलेशन को उत्प्रेरित करता है, जिसका उपयोग तब डीएनए जैवसंश्लेषण में किया जाता है। इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप घातक उत्परिवर्तन होते हैं जो कोशिका मृत्यु का कारण बनते हैं। Cybrids का एक और लाभ यह है कि उन्हें बिना किसी परिवर्तन के लंबे समय तक स्थिर और / या पुन: उपयोग करने की संभावना है। इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं की तरह, उनकी उच्च विकास दर प्रयोगात्मक अध्ययन की अवधि को कम करती है।
इस प्रणाली को उपयोगी और विश्वसनीय बनाने के लिए आणविक शर्त परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के सही आनुवंशिक योगदान और पुन: आबादी वाले साइब्रिड्स में एमटीडीएनए राशि को सत्यापित करना है। आजकल, यह आसानी से एनजीएस तकनीकों का उपयोग करके किया जा सकता है जो पूरे एमटीडीएनए अणु के विश्लेषण को हैप्लोग्रुप को परिभाषित करने की अनुमति देता है और जांच के तहत वेरिएंट के अलावा किसी भी अन्य अवांछित रोगजनक वेरिएंट की उपस्थिति को लगातार सत्यापित करता है। हेटरोप्लाज्मिक स्थितियों के मामले में, विभिन्न उत्परिवर्तन भार के साथ क्लोन के अलगाव, आदर्श रूप से 0% से 100% तक, माइटोकॉन्ड्रियल हानि की गंभीरता के साथ उत्परिवर्तन प्रतिशत को सहसंबंधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
इन cybrid पीढ़ी की प्रक्रियाओं में छिपे संभावित नुकसान परमाणु दाताओं के रूप में उपयोग किए जाने वाले rho0 कोशिकाओं के ट्यूमर मूल से जुड़े हुए हैं। ये कोशिकाएं एन्यूप्लॉइड हैं, और यह स्पष्ट नहीं है कि यह अंततः माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों और क्रमशः परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए द्वारा एन्कोड किए गए विभिन्न श्वसन श्रृंखला सबयूनिट्स के अनुवाद और असेंबली को कैसे प्रभावित कर सकता है। आम तौर पर, विभिन्न मूल के rho0 कोशिकाओं का उपयोग करके cybrids उत्पन्न करने और सत्यापित करने की सलाह दी जाएगी कि प्राप्त क्लोन तुलनीय फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं। अभी भी एक और सीमा यह है कि ट्यूमर कोशिकाएं मुख्य रूप से ग्लाइकोलाइटिक होती हैं जबकि माइटोकॉन्ड्रियल विकार OXPHOS पर बड़े पैमाने पर निर्भर करते हैं। इसलिए, एक mtDNA उत्परिवर्तन के परिणामों पर एक ग्लाइकोलाइटिक नाभिक (rho0 कोशिकाओं) के प्रभाव को सावधानीपूर्वक स्थापित किया जाना चाहिए।
उपरोक्त सीमाओं के बावजूद, साइब्रिड्स की पीढ़ी ने माइटोकॉन्ड्रियल दवा क्षेत्र में क्रांति ला दी है और अभी भी उपन्यास एमटीडीएनए उत्परिवर्तन की रोगजनक भूमिका स्थापित करने के लिए उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, साइब्रिड तकनीक का उपयोग विभिन्न बीमारियों के लिए माइटोकॉन्ड्रियल योगदान की जांच करने के लिए किया जाता है, पार्किंसंस, अल्जाइमर और हंटिंगटन रोग जैसे सामान्य न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों से लेकर 22,23,24,25,26, कैंसर और एंटीकैंसर उपचार 27,28 तक।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।
Acknowledgments
यह अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल बाल रोगों के अध्ययन के लिए केंद्र (http://www.mitopedia.org) में किया गया था, जिसे मारियानी फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था। वीटी दुर्लभ न्यूरोमस्कुलर रोगों (ईआरएन यूरो-एनएमडी) के लिए यूरोपीय संदर्भ नेटवर्क का एक सदस्य है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
- Gorman, G. S., et al.
- DiMauro, S., Davidzon, G.
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F.
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
