Summary
Transmitokondrial sibridler, mitokondriyal DNA (mtDNA) tükenmiş hücrelerin (rho0 hücreleri) mitokondriyal bozukluklardan etkilenen hastalardan türetilen sitoplastlarla (enüklee hücreler) kaynaştırılmasıyla elde edilen melez hücrelerdir. Hastalığın nükleer veya mitokondriyal kökeninin belirlenmesine, biyokimyasal aktivitenin değerlendirilmesine ve mtDNA ile ilişkili varyantların patogenetik rolünün doğrulanmasına izin verir.
Abstract
Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) gerçekleştiren mitokondriyal solunum zinciri komplekslerinin eksikliği, insan mitokondriyal bozukluklarının biyokimyasal belirtecidir. Genetik açıdan bakıldığında, OXPHOS benzersiz bir örneği temsil eder, çünkü iki farklı genetik sistemin tamamlanmasından kaynaklanır: nükleer DNA (nDNA) ve mitokondriyal DNA (mtDNA). Bu nedenle, OXPHOS defektleri nükleer ve mitokondriyal kodlu genleri etkileyen mutasyonlardan kaynaklanabilir.
King ve Attardi'nin 1989'da yayınlanan çığır açan çalışması, mtDNA'dan (rho0 olarak adlandırılan) tükenmiş insan hücre hatlarının, sözde "transmitokondrial sibridler" elde etmek için eksojen mitokondri ile yeniden doldurulabileceğini gösterdi. Mitokondriyal bozuklukları (MD'ler) olan hastalardan ve rho0 hücrelerinden çekirdeklerden türetilen mitokondri içeren bu sibridler sayesinde, bir kusurun mtDNA veya nDNA ile ilişkili olup olmadığını doğrulamak mümkündür. Bu sibridler ayrıca bir mutasyonun patojenitesini doğrulamak ve biyokimyasal düzeyde etkisini incelemek için güçlü bir araçtır. Bu yazıda sibrid üretimi, seçimi ve karakterizasyonunu açıklayan ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.
Introduction
Mitokondriyal bozukluklar (MD'ler), nükleer (nDNA) veya mitokondriyal (mtDNA) DNA1'deki mutasyonlara bağlı mitokondriyal fonksiyonlardaki bozulmanın neden olduğu bir grup multisistem sendromudur. En sık görülen kalıtsal metabolik hastalıklar arasındadır ve prevalansı 1:5.000'dir. mtDNA ile ilişkili hastalıklar mitokondriyal genetik kurallarını izler: maternal kalıtım, heteroplazmi ve eşik etkisi ve mitotik ayrışma2. İnsan mtDNA'sı, replikasyon ve transkripsiyon için gerekli diziler, 13 protein kodlayan gen (solunum zincirinin tüm alt birimleri), 22 tRNA ve 2 rRNAgeni 3 içeren kısa bir kontrol bölgesi içeren 16.6 kb'lik çift sarmallı bir DNA çemberidir.
Sağlıklı bireylerde, patolojik koşullarda tek bir mtDNA genotipi (homoplazmi) bulunurken, birden fazla genotip (heteroplazmi) bir arada bulunur. Zararlı heteroplazmik mutasyonlar, OXPHOS'u bozmak ve4 yaşında herhangi bir organı etkileyebilecek hastalıklara neden olmak için kritik bir eşiğin üstesinden gelmelidir. OXPHOS'un ikili genetiği kalıtımı belirler: nDNA mutasyonları için otozomal resesif veya baskın ve X'e bağlı, mtDNA mutasyonları için anne, artı hem nDNA hem de mtDNA için sporadik vakalar.
Mitokondriyal tıp çağının başlangıcında, King ve Attardi5 tarafından yapılan bir dönüm noktası deneyi, mtDNA'nın tamamen tükendiği tümör hücre hatlarından (rho0 hücreleri) çekirdek içeren hibrit hücreler ve MD'li hastalardan mitokondri içeren hibrit hücreler yaratarak bir MD'den sorumlu bir mutasyonun kökenini anlamak için temel oluşturdu. ve nükleer veya mitokondriyal genomda bir mutasyonun mevcut olup olmadığını belirlemek kolay değildi. 1989'da tanımlanan yöntem daha sonra mitokondriyal tıp alanında çalışan birkaç araştırmacı tarafından kullanıldı 6,7,8,9; 10 yakın zamanda ayrıntılı bir protokol yayınlandı, ancak henüz bir video yapılmadı. NGS'nin bir mutasyonun nerede olduğunu kesin ve hızlı bir şekilde tanımlayabildiği günümüzde böyle bir protokol neden geçerli olmalıdır? Cevap, cybrid üretiminin, herhangi bir yeni mtDNA mutasyonunun patojenik rolünü anlamak, heteroplazmi yüzdesini hastalığın ciddiyeti ile ilişkilendirmek ve hastanın otokton nükleer arka planının katkısının bulunmadığı homojen bir nükleer sistemde biyokimyasal bir araştırma yapmak için hala en gelişmiş protokol olmasıdır11, 12,13.
Bu protokol, 35 mm Petri kaplarında yetiştirilen birleşik, hasta kaynaklı fibroblastlardan sitoplastların nasıl elde edileceğini açıklar. Çanakların sitoçalasin B varlığında santrifüjlenmesi, daha sonra polietilen glikol (PEG) varlığında rho0 hücreleri ile kaynaştırılan enüklee sitoplastların izolasyonuna izin verir. Elde edilen sibridler daha sonra klonlar ortaya çıkana kadar seçici ortamda yetiştirilir. Temsili sonuçlar bölümü, mtDNA'nın donör hastaların fibroblastlarınınkiyle aynı olduğunu ve nDNA'nın tümöral rho0 hücre hattının nükleer DNA'sı ile aynı olduğunu kanıtlamak için ortaya çıkan sibridlerin moleküler karakterizasyonunun bir örneğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: İnsan fibroblastlarının kullanımı etik onay gerektirebilir. Bu çalışmada kullanılan fibroblastlar MD hastalarından türetilmiş ve etik gerekliliklere uygun olarak Kurumsal biyobankada saklanmıştır. Hücrelerin kullanımı için bilgilendirilmiş onam verildi. Tüm hücre kültürü prosedürlerini steril laminer akış kabini altında oda sıcaklığında (RT, 22-25 °C) gerçekleştirin. Hücre kültürü ve steril ekipmanlar için uygun steril filtrelenmiş çözeltiler kullanın. Nemlendirilmiş bir inkübatördeki tüm hücre hatlarını %5 CO2 ile 37 °C'de büyütün. Mikoplazma içermeyen kültürleri sağlamak için mikoplazma testleri haftalık olarak yapılmalıdır. 143BTK- rho0 hücreleri daha önce açıklandığı gibioluşturulabilir 5.
1. Hücrelerin kültürü
- Herhangi bir prosedüre başlamadan önce, MD hastalarından türetilen fibroblastlardaki mutasyonun varlığını doğrulayın ve Kısıtlama Fragman Uzunluğu Polimorfizmi (RFLP) ve / veya tüm mtDNA dizileme analizleri14 ile heteroplazmi veya homoplazmi yüzdesini ölçün.
- Her biri 2 mL Tam Kültür Ortamı içeren dört adet 35 mm Petri kabında tohum fibroblastları (Tablo 1). Hücrelerin% 80'ine kadar kaynaşmasına izin verin (48 saat).
- 100 mm'lik bir Petri kabında 8 mL Takviyeli Kültür Ortamında (Tablo 1) 143BTK- rho 0 hücreleri büyütün.
- Hücreleri bir inkübatörde% 5 CO2 ile 37 ° C'de tutun.
- Rho0 hücrelerinde mtDNA yokluğunu dizileme teknikleri ile kontrol edin14.
2. Fibroblastların enükleasyonu
- 250 mL'lik santrifüje uygun dört şişeyi, 20 dakikalık bir döngü için 121 °C'de otoklav sterilizasyonu ile sterilize edin. Bunları bir laboratuvar fırınında veya RT'de kurutun.
- Santrifüjü 37 °C'de önceden ısıtın.
- Fibroblastları içeren 35 mm'lik bulaşıkları iki kez, kalsiyum ve magnezyum olmadan 2 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) kullanarak yıkayın.
- Bulaşıkların dış yüzeyini% 70 etanol ile temizleyin ve alkol buharlaşana kadar bekleyin.
- Kapakları bulaşıklardan ve vidalı kapakları şişelerden çıkarın. Her tabağı, kapaksız, her 250 mL santrifüj şişesinin altına baş aşağı yerleştirin.
- Her şişeye yavaşça 32 mL Enükleasyon Ortamı ekleyin (Tablo 1), ortamın yemeğe girmesine ve hücrelerle temas etmesine izin verin. Uzun bir cam Pasteur pipet kullanarak bulaşıklardaki kabarcıkları çıkarın ve ucu bir Bunsen alevinde kıvırın.
NOT: Ortamın çanağa girmesine ve hücrelerle temas etmesine izin vermek için kabarcıkları çıkarmak önemlidir. - Her şişeyi vidalı kapakla kapatın ve santrifüje aktarın.
- 37 °C ve 8.000 × g'de 20 dakika santrifüj, maksimum hızlanma, yavaşlama yavaş. Santrifüjü dengelemeye dikkat edin: her şişeyi karşı ağırlıklandırın. Gerekirse, uygun miktarda Enucleation Medium ekleyerek ağırlığı ayarlayın.
- Santrifüjleme sırasında, ortamı 143BTK- rho 0 kültür plakalarından aspire etmek ve atmak için vakum veya10 mL serolojik pipet kullanın ve kalsiyum ve magnezyum olmadan 4 mL 1x PBS kullanarak iki kez yıkayın.
- Hücre tek katmanını tamamen örtmek için 2 mL tripsin ekleyin.
- Bulaşıkları ~ 2 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Bulaşıkları inkübatörden çıkarın, canlı hücreler için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücre ayrılmasını gözlemleyin (4x veya 10x hedefler) ve 2 mL Takviyeli Kültür Ortamı ekleyerek enzim aktivitesini inhibe edin.
- Çanak içindeki hücre süspansiyonunun 4 mL'sini 10 mL'lik bir pipetle aspire edin ve 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- Bir Burker hemositometre odası veya otomatik bir sayaç kullanarak hücreleri sayın.
- Santrifüjlemenin sonunda (adım 2.8), ortamı şişelerden aspire edin ve atın.
- Şişeleri daha önce% 70 etanol ile püskürtülen steril bir gazlı bez üzerinde ters çevirerek bulaşıkları çıkarın. Bulaşıkların dış yüzeyini ve kapaklarını% 70 etanol ile temizleyin. Alkol buharlaşana kadar bekleyin ve ardından bulaşıkları kapatın.
- Devam etmeden önce, canlı hücreler için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak sitoplast (hayalet) oluşumunu kontrol edin (objektif 4x veya 10x). Sitochalasin B tarafından indüklenen çekirdeklerinin ekstrüzyonu nedeniyle aşırı derecede uzatılmış fibroblastları arayın.
- Her 35 mm'lik kaba, %5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 2 mL'lik 143BTK- rho 0 kültür ortamında yeniden askıya alınmış 143BTK- rho0 hücresinden 1 × 10 6'sını ekleyin.
- Bulaşıkları nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 3 saat bekletin ve 143BTK- rho0 hücrelerinin hayaletlerin üzerine yerleşmesine izin verin. Bulaşıkları rahatsız etmeyin.
3. Enüklee fibroblastların rho 0 hücreleri ile füzyonu
- 3 saatlik inkübasyondan sonra, ortamı bulaşıklardan aspire edin ve atın.
- Yapışkan hücreleri iki kez 2 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) yüksek glikoz ile serumsuz veya Minimum Esansiyel Ortam (MEM) ile yıkayın.
- Ortamı aspire edin ve atın.
- Hücrelere 500 μL PEG çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve tam olarak 1 dakika inkübe edin.
- PEG çözeltisini aspire edin ve atın.
- Hücreleri 2 mL DMEM yüksek glikoz kullanarak serum olmadan veya MEM ile üç kez yıkayın.
- 2 mL Füzyon Ortamı ekleyin (Tablo 1) ve inkübatörde gece boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
4. Cybrid seçimi ve genişlemesi
- Gece boyunca inkübasyondan sonra, plakaları inkübatörden çıkarın, hücreleri yukarıda açıklandığı gibi tripsinize edin (adım 2.9-2.13) ve her 35 mm'lik kabın içeriğini 100 mm'lik bir kaba aktarın.
- 8 mL Seçim Ortamı (Tablo 1) ekleyin ve plakaları inkübatöre% 5 CO2 ile 37 ° C'ye yerleştirin.
- Ortamı her 2-3 günde bir değiştirin.
- Hücre kolonileri görünene kadar ~ 10-15 günlük seçim bekleyin.
- Tüm klonları toplayarak ve sonunda yeniden klonlanabilecek ve daha ileri araştırmalar için kullanılabilecek cybridlerin yedeği olarak "büyük" bir kültür oluşturarak dört Petri kabından birini dondurun.
- Klonlar ortaya çıkana kadar Takviyeli Kültür Ortamında (Tablo 1) 50-100 hücre/tabakta kalan kültür tabaklarındaki hücreleri tripsinize edin, sayın ve bir veya daha fazla Petri kabına tohumlayın. Birkaç gün büyümelerine izin verin.
- Kalan hücreleri RT'de 3 dakika boyunca 1.200 × g'de santrifüjleme ile pelet edin ve süpernatanı atın.
- Peletten DNA çıkarın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Daha önce bildirildiği gibi değişken sayıda tandemly tekrarlanan (VNTR) analizi ile genotipleme gerçekleştirin15.
- Petri kabından klonlama silindirleri veya pipet ucu ile klonları alın, farklı klonların bir araya gelmesini önlemek için bir stereomikroskop kullanın ve bunları her biri 200 μL Takviyeli Kültür Ortamı içeren 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın (Tablo 1).
- DNA'yı dondurmak ve çıkarmak için yeterli hücre olana kadar her klonu genişletin.
- RFLP veya diğer sıralama yöntemleriyle her klonun mutasyon yüzdesini doğrulayın. İdeal olarak, her ikisi de homoplazmik mutant mtDNA'ya (% 100 mutasyon) ekleyen vahşi tip mtDNA'lı klonları (% 0 mutasyon) ve farklı mutasyon yüzdelerine sahip klonları elde etmeye çalışın. Kibrid oluşturma protokolünün şematik diyagramı için Şekil 1'e bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sibrid üretmek, 3 günlük laboratuvar çalışması artı bir seçim süresi (~ 2 hafta) ve klonların büyümesi için ek 1-2 hafta gerektirir. Kritik adımlar sitoplastların kalitesi ve seçim dönemidir. Sibridlerin morfolojisi rho0 donör hücrelerininkine benzer. Hücrelerin kimliğini doğrulamak için sibridlerde doğru mtDNA ve nDNA'nın atanması zorunludur. Örnek Şekil 2'de verilmiştir. Bu durumda, mitokondriyal miyopati, ensefalopati, laktik asidoz ve inme benzeri ataklar (MELAS) ile ilişkili en yaygın mtDNA mutasyonlarından biri olan heteroplazmik m.3243A>G taşıyan bir hastadan türetilen fibroblastlardan başlayarak sibridler ürettik. VNTR'nin analizi, cybrid nDNA'nın rho0 hücrelerininkiyle aynı olduğunu gösterdi (Şekil 2A), hastanın nDNA'sının 143B genomu ile değiştirilmesini doğruladı. RFLP ve/veya dizileme analizleri, mtDNA mutasyonunun varlığını ve heteroplazmi yüzdesini değerlendirmek için kullanılabilir (Şekil 2B,C).
Şekil 1: Cybrid üretim protokolünün şematik diyagramı. Hasta kaynaklı fibroblastlar sitokalasin B ile tedavi edilir ve sitoplastlar (enüklee hücreler) elde etmek için santrifüj edilir. Sitoplastların ve mtDNA ile tükenmiş hücrelerin (143BTk- rho0) sitoplazmik füzyonu, uygun ortamda seçildikten sonra izole edilebilen sibridlerin üretilmesini sağlar. Tek klonların toplanması ve amplifikasyonu, teoride% 100 vahşi tipten% 100 mutasyona uğramış olana kadar değişebilen farklı heteroplazmi yüzdeleri verir. Kısaltma: mtDNA = mitokondriyal DNA. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sibridlerin moleküler karakterizasyonu . (A) Apo-B mikrosattelitlerinin analizi, üretilen cybridlerden ekstrakte edilen nDNA'nın rho0 hücre hattının nükleer DNA'sı ile aynı olduğunu göstermektedir. (B) WT miktarını ölçmek için kullanılan MELAS ile ilişkili m.3243A>G) ve Mut mtDNA türlerini kapsayan PCR ürününün HaeIII kısıtlama haritaları. (C) Farklı cybrid klonlarında (c1, c2> c3) m.3243AG heteroplazmi seviyelerini gösteren RFLP analizinin temsili sonuçları. Kısaltmalar: M = marker; bp = baz çiftleri; WT = vahşi tip; Mut = mutant; RFLP = kısıtlama parçası uzunluğu polimorfizmi; MELAS = mitokondriyal miyopati, ensefalopati, laktik asidoz ve inme benzeri ataklar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Medya Kompozisyonu | |
| Komple kültür ortamı | Son conc. |
| DMEM Yüksek Glikoz (L-Glutamin W/Sodyum Piruvat ile) | [1:1] |
| FetalClone III (Sığır Serumu Ürünü) | 10% |
| Sodyum Piruvat 100 mM | 1 mM |
| Penisilin-Streptomisin (çözelti 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Takviyeli kültür ortamı | Son conc. |
| DMEM Yüksek Glikoz (L-Glutamin W/Sodyum Piruvat ile) | [1:1] |
| FetalClone III (Sığır Serumu Ürünü) | 10% |
| Sodyum Piruvat 100 mM | 1 mM |
| Penisilin-Streptomisin (çözelti 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 4 mM |
| İdrar | 50 μg/mL |
| Enükleasyon ortamı | Son conc. |
| DMEM Yüksek Glikoz (L-Glutamin W/Sodyum Piruvat ile) | [1:1] |
| FetalClone III (Sığır Serumu Ürünü) | 5% |
| Sodyum Piruvat 100 mM | 1 mM |
| Penisilin-Streptomisin (çözelti 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Drechslera dematioidea'dan Cytochalasin B | 10 μg/mL |
| Füzyon ortamı | Son conc. |
| DMEM Yüksek Glikoz (L-Glutamin W/Sodyum Piruvat ile) | [1:1] |
| FetalClone III (Sığır Serumu Ürünü) | 5% |
| Sodyum Piruvat 100 mM | 1 mM |
| Penisilin-Streptomisin (çözelti 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Seçim ortamı | Son conc. |
| DMEM Yüksek Glikoz (L-Glutamin W/Sodyum Piruvat ile) | [1:1] |
| Diyalize FBS | 5% |
| Sodyum Piruvat 100 mM | 1 mM |
| Penisilin-Streptomisin (çözelti 100x) | 1% |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| 5-Bromo-2'-Deoksiüridin | 100 μg/mL |
Tablo 1: Kiril üretimi için kullanılan ortamın detayları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mtDNA, koruyucu histonların eksikliği ve solunum zincirine yakın konumu nedeniyle nDNA'ya kıyasla çok yüksek bir mutasyon oranına sahiptir, bu da molekülü onarım sistemleri tarafından verimli bir şekilde karşı konulamayan zararlı oksidatif etkilere maruz bırakır16. İlk patojenik mtDNA mutasyonları 1988'de17,18 olarak tanımlandı ve o zamandan beri çok sayıda mutasyon tanımlandı. NGS teknolojisi, tüm mitokondriyal genomu taramak ve varyantları kolayca tanımlamak için uygun bir yaklaşımdır14. Bununla birlikte, hiç tanımlanmamış bir mtDNA mutasyonunun patojenik rolünü değerlendirmek zor olabilir ve hala bu protokolde tanımlanan sibrid hücrelerinin oluşumu gibi "eski moda" yöntemlere dayanır11,12,13. Burada tarif edilen cybrid nesli, Kral ve Attardi5 tarafından tanımlanan orijinal yöntemleri özetlemektedir. Bununla birlikte, diğer protokoller esas olarak hücre enükleasyonu için sistemlerle ilgili küçük değişiklikler içerir10. Diğer durumlarda, örneğin hasta kaynaklı biyolojik materyal çekirdek19 içermeyen trombositlerden oluştuğunda enükleasyon gereksizdir.
Transmitodondrial sibridler birkaç önemli özelliğe sahiptir, bu da onları yüksek verimli moleküler teknolojiler DNA ve RNA'yı tek hücre seviyesinde profilleyebilse bile ilgili bir araştırma aracı haline getirir. Öncü çalışmalarda, klinik ve biyokimyasal olarak mitokondriyal bozukluklar olarak tanımlanan bozuklukların genetik kökenini belirlemek veya doğrulamak için sibridler kullanılmıştır 6,7,8,9,20. Gerçekten de, sistem sadece mtDNA mutasyonunun katkısının, probandın nükleer genlerinin etkisi olmadan ve rho0 hücrelerinin homojen bir nükleer arka planında incelenmesine izin verir.
Ek olarak, mutasyonların farklı yüzdelerini taşıyan farklı cybrid klonlarının izolasyonu sayesinde nicel bir genotip-fenotip korelasyonu gerçekleştirilebilir. Farklı klonlar, diyalize FBS ile desteklenmiş ve idrar ve piruvat içermeyen Seçim Ortamı (Tablo 1) kullanılarak seçildi ve sadece sitoplastlarla kaynaşmış rho0 hücrelerinin büyümesine izin verdi. Böylece, bozulmamış fibroblastlarla (bi- veya polinüklee hücreler) kaynaşmamış veya kaynaşmış rho0 hücreleri ve ayrıca enüklee edilmemiş herhangi bir kalıntı bozulmamış fibroblast elimine edilir. Gerçekten de, rho0 hücreleri, mitokondriyal gama-polimeraz21'in güçlü bir inhibitörü olan düşük konsantrasyonlarda ethidyum bromüre uzun süreli maruz kalma ile mtDNA'dan tamamen tükenir.
Fonksiyonel bir solunum zincirinden yoksun olan rho0 hücreleri, enerji gereksinimleri için sadece glikolize güvenir ve piruvata bağımlı hale gelir. Ek olarak, rho0 hücreleri, mitokondri içinde işlev gören ve pirimidin biyosentezinde rol oynayan bir enzim olan dihidroorotat dehidrogenazın eksikliği nedeniyle pirimidinler için auxotrophic hale gelmiştir (idrar bir pirimidin öncüsüdür). Rho0 hücreleri insan osteosarkomu 143B timidin kinaz eksikliği (TK-) hücrelerinden türetilirken, fibroblastlar, sitoplastlar ve polinüklee melezler TK +'dır. Bu nedenle, TK + hücreleri 5-bromo-2'-deoksiürisine maruz kalma nedeniyle çıkarılır. Aslında, bu idrar analoğu, daha sonra DNA biyosentezinde kullanılan deoksitimidinin fosforilasyonunu katalize eden TK tarafından tanınır. Bu süreç, hücre ölümüne neden olan ölümcül mutasyonlarla sonuçlanır. Kibridlerin bir diğer avantajı, onları uzun kültür süreleri boyunca değiştirmeden dondurma ve / veya yeniden kullanma olasılığıdır. Ayrıca, tümör hücreleri gibi, yüksek büyüme oranları deneysel çalışma süresini azaltır.
Bu sistemi yararlı ve güvenilir hale getirmenin moleküler ön koşulu, nükleer ve mitokondriyal DNA'nın doğru genetik katkısını ve yeniden doldurulmuş sibridlerdeki mtDNA miktarını doğrulamaktır. Günümüzde bu, haplogrupları tanımlamak için tüm mtDNA molekülünün analizine izin veren ve araştırılan varyanta ek olarak diğer istenmeyen patojenik varyantların varlığını sürekli olarak doğrulayan NGS teknikleri kullanılarak kolayca gerçekleştirilebilir. Heteroplazmik koşullar söz konusu olduğunda, ideal olarak% 0 ila% 100 arasında değişen farklı mutasyon yüklerine sahip klonların izolasyonu, mutasyon yüzdesini mitokondriyal bozukluğun ciddiyeti ile ilişkilendirmek için kullanılabilir.
Bu cybrid üretim prosedürlerinde gizlenen olası tuzaklar, nükleer donör olarak kullanılan rho0 hücrelerinin tümör kökeni ile bağlantılıdır. Bu hücreler anöploiddir ve bunun sonunda mitokondriyal fonksiyonları ve sırasıyla nükleer ve mitokondriyal DNA tarafından kodlanan farklı solunum zinciri alt birimlerinin translasyonunu ve montajını nasıl etkileyebileceği açık değildir. Genel olarak, farklı kökenlere sahip rho0 hücreleri kullanarak sibridlerin üretilmesi ve elde edilen klonların karşılaştırılabilir fenotipler gösterdiğini doğrulamanız önerilir. Yine başka bir sınırlama, tümör hücrelerinin esas olarak glikolitik olması, mitokondriyal bozuklukların ise büyük ölçüde OXPHOS'a dayanmasıdır. Bu nedenle, glikolitik bir çekirdeğin (rho0 hücreleri) bir mtDNA mutasyonunun sonuçları üzerindeki etkisi dikkatlice belirlenmelidir.
Yukarıdaki sınırlamalara rağmen, sibridlerin oluşumu mitokondriyal tıp alanında devrim yarattı ve hala yeni mtDNA mutasyonlarının patojenik rolünü belirlemek için kullanılıyor. Ayrıca, cybrid teknolojisi, Parkinson, Alzheimer ve Huntington hastalığı gibi yaygın nörodejeneratif bozukluklardan 22,23,24,25,26, kanser ve antikanser tedavisine kadar farklı hastalıklara mitokondriyal katkıyı araştırmak için kullanılır 27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Mariani Vakfı tarafından finanse edilen Mitokondriyal Çocuk Hastalıkları Çalışmaları Merkezi'nde (http://www.mitopedia.org) gerçekleştirilmiştir. VT, Nadir Nöromüsküler Hastalıklar için Avrupa Referans Ağı'nın (ERN EURO-NMD) bir üyesidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
- Gorman, G. S., et al.
- DiMauro, S., Davidzon, G.
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F.
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
