Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

مطيافية نيوترونية عالية الدقة لدراسة ديناميكيات بيكو ثانية-نانوثانية للبروتينات ومياه الترطيب

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

يوفر التحليل الطيفي للتشتت العكسي للنيوترونات وصولا غير مدمر وخالي من الملصقات إلى ديناميكيات ps-ns للبروتينات ومياه ترطيبها. يتم تقديم سير العمل مع دراستين حول بروتينات الأميلويد: حول ديناميكيات الليزوزيم التي تم حلها زمنيا أثناء التجميع وعلى ديناميكيات الماء المائية لتاو عند تكوين الألياف.

Abstract

يوفر تشتت النيوترونات إمكانية سبر الديناميكيات داخل العينات لمجموعة واسعة من الطاقات بطريقة غير مدمرة وبدون تسمية بخلاف الديوتيريوم. على وجه الخصوص ، يسجل التحليل الطيفي للتشتت العكسي للنيوترونات إشارات التشتت بزوايا تشتت متعددة في وقت واحد وهو مناسب تماما لدراسة ديناميكيات الأنظمة البيولوجية على مقياس ps-ns الزمني. من خلال استخدام D2O - وربما مكونات عازلة متوقفة - تسمح الطريقة بمراقبة كل من انتشار مركز الكتلة وحركات العمود الفقري والسلسلة الجانبية (الديناميات الداخلية) للبروتينات في الحالة السائلة.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دراسة ديناميكيات مياه الترطيب عن طريق استخدام مساحيق من البروتينات المثبطة المرطبة ب H2O. تقدم هذه الورقة سير العمل المستخدم على الأداة IN16B في معهد Laue-Langevin (ILL) للتحقيق في ديناميكيات البروتين والماء المائي. يتم شرح تحضير عينات المحلول وعينات مسحوق البروتين المائي باستخدام تبادل البخار. يتم وصف إجراء تحليل البيانات لكل من ديناميات البروتين والماء الإماهة لأنواع مختلفة من مجموعات البيانات (الأطياف شبه المرنة أو عمليات المسح ذات النافذة الثابتة) التي يمكن الحصول عليها على مطياف التشتت العكسي للنيوترونات.

يتم توضيح الطريقة من خلال دراستين تتضمنان بروتينات الأميلويد. يظهر أن تجميع الليزوزيم إلى مجاميع كروية بحجم ميكرومتر - يشار إليها بالجسيمات - يحدث في عملية من خطوة واحدة على النطاق المكاني والزمني الذي تم فحصه في IN16B ، بينما تظل الديناميكيات الداخلية دون تغيير. علاوة على ذلك ، تمت دراسة ديناميات ماء الترطيب في تاو على مساحيق رطبة من البروتين perdeuteated. يتبين أن الحركات الانتقالية للماء يتم تنشيطها عند تكوين ألياف الأميلويد. أخيرا ، تتم مناقشة الخطوات الحاسمة في البروتوكول حول كيفية وضع تشتت النيوترونات فيما يتعلق بدراسة الديناميات فيما يتعلق بالطرق الفيزيائية الحيوية التجريبية الأخرى.

Introduction

النيوترون هو جسيم ضخم بدون شحنة تم استخدامه بنجاح على مر السنين لفحص العينات في مختلف المجالات من الفيزياء الأساسية إلى علم الأحياء1. بالنسبة للتطبيقات البيولوجية ، يتم استخدام تشتت النيوترونات بزاوية صغيرة ، وتشتت النيوترونات غير المرن ، وعلم البلورات النيوتروني وقياس الانعكاس على نطاق واسع2،3،4. يوفر تشتت النيوترونات غير المرن قياسا متوسطا للديناميكيات دون الحاجة إلى وضع علامات محددة في حد ذاتها ، وجودة إشارة لا تعتمد على الحجم أو البروتين5. يمكن إجراء القياس باستخدام بيئة معقدة للغاية للبروتين قيد الدراسة الذي يحاكي الوسط داخل الخلايا ، مثل المحللة البكتيرية المنزوعة أو حتى في الجسم الحي3،6،7. يمكن استخدام إعدادات تجريبية مختلفة لدراسة الديناميات ، وهي i) وقت الرحلة الذي يمنح الوصول إلى ديناميكيات ps-ps الفرعية ، ii) الوصول إلى التشتت العكسي إلى ديناميكيات ps-ns ، و iii) الوصول إلى الصدى المغزلي إلى الديناميكيات من ns إلى مئات ns. يستخدم التشتت العكسي للنيوترونات قانون براغ 2d sinθ = nλ ، حيث d هي المسافة بين المستويات في البلورة ، و θ زاوية التشتت ، و n ترتيب التشتت ، و λ الطول الموجي. يسمح استخدام البلورات للتشتت العكسي نحو أجهزة الكشف بتحقيق دقة عالية في الطاقة ، عادة ~ 0.8 μeV. لقياس تبادل الطاقة ، يتم استخدام إما محرك دوبلر يحمل بلورة في التشتت العكسي لتحديد وضبط الطول الموجي النيوتروني الوارد8،9،10 (الشكل 1) ، أو يمكن استخدام إعداد وقت الرحلة على حساب انخفاض في دقة الطاقة11.

Figure 1
الشكل 1: رسم مطياف التشتت العكسي للنيوترونات بمحرك دوبلر. يصطدم الشعاع الوارد بمروحية تحويل فضاء الطور (PST)42 ، مما يزيد من التدفق في موضع العينة. ثم يتم تشتيتها مرة أخرى نحو العينة بواسطة محرك دوبلر ، الذي يختار الطاقة E1 (السهم السماوي). ثم يتم تشتيت النيوترونات بواسطة العينة (مع طاقات مختلفة ممثلة بلون الأسهم) والمحللين ، المصنوع من بلورات Si 111 ، سوف ينتشر فقط النيوترونات ذات الطاقة المحددة E0 (الأسهم ذات اللون الأحمر هنا). ومن ثم ، يتم الحصول على نقل الزخم q من الموضع المكتشف للنيوترون على صفيف الكاشف ، ويتم الحصول على نقل الطاقة من الفرق E1- E0. يتم استخدام وقت الرحلة المتوقع لنبضة النيوترون التي تنتجها PST لتجاهل الإشارة من النيوترونات المنتشرة مباشرة نحو أنابيب الكاشف. اختصار: PST = تحويل مساحة الطور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالنسبة للتحليل الطيفي للتشتت العكسي ، تأتي المساهمة الرئيسية في الإشارة من العينات الغنية ببروتون الهيدروجين ، مثل البروتينات ، من التشتت غير المترابط ، حيث تظهر شدة التشتت Sinc (q ، ω) بواسطة Eq (1) 12

Equation 1 (1)

حيث σinc هو المقطع العرضي غير المترابط للعنصر المعتبر ، k 'هو معيار المتجه الموجي المتناثر ، k هو معيار المتجه الموجي الوارد ، q (= k - k') نقل الزخم ، r j (t) متجه موضع الذرة j في الوقت t ، و ω التردد المقابل لنقل الطاقة بين النيوترون الوارد والنظام. تشير الأقواس الزاوية إلى متوسط المجموعة. ومن ثم ، فإن التشتت غير المترابط يسبر الارتباط الذاتي للجسيم الواحد متوسط المجموعة لمواقع الذرة مع الوقت ويعطي متوسط الديناميكيات الذاتية على جميع الذرات في النظام وأصول زمنية مختلفة (متوسط المجموعة). دالة التشتت هي تحويل فورييه في زمن دالة التشتت الوسيطة I (q، t) ، والتي يمكن اعتبارها تحويل فورييه في الفضاء لدالة ارتباط فان هوف الموضحة بواسطة Eq (2):

Equation 2 (2)

حيث ρ (r، t) هي كثافة احتمال إيجاد ذرة في الموضع r والوقت t 13.

بالنسبة لعملية الانتشار الويكي ، تنتج دالة الانتشار الذاتي (انظر Eq (3)) بعد تحويل فورييه المزدوج في دالة تشتت تتكون من لورنتزيان بعرض الخط المعطى بواسطة γ = Dq2.

Equation 10 (3)

تم تطوير نماذج أكثر تطورا ووجدت مفيدة مثل نموذج انتشار القفز بواسطة Singwi و Sjölander لديناميات البروتين الداخليةps-ns 14 أو نموذج الدوران بواسطة Sears لمياه الترطيب15،16،17.

على أداة التشتت العكسي للنيوترونات (NBS) IN16B 8,9 في ILL، غرونوبل، فرنسا (الشكل التكميلي S1)، يتكون الإعداد الذي يشيع استخدامه مع البروتينات من بلورات Si 111 للمحللات مع محرك دوبلر لضبط الطول الموجي الوارد (الشكل التكميلي S2A)، مما يتيح الوصول إلى نطاق نقل الزخم ~ 0.2 Å-1 < q < ~ 2 Å-1 ونطاق نقل الطاقة -30 μeV < Equation 3 < 30 μeV المقابلة لجداول زمنية تتراوح من بضعة ps إلى عدد قليل من ns ومسافات قليلة Å. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر IN16B إمكانية إجراء عمليات مسح مرنة وغير مرنة للنافذة الثابتة (E / IFWS) 10 ، والتي تشمل الحصول على البيانات عند نقل الطاقة الثابتة. نظرا لأن التدفق محدود عند العمل مع النيوترونات ، فإن E / IFWS يسمح بتعظيم التدفق لنقل طاقة واحد ، وبالتالي تقليل وقت الاكتساب اللازم للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء مرضية. والخيار الأحدث هو النمط11 لمطياف التشتت العكسي ووقت الطيران (BATS) ، والذي يسمح بقياس مجموعة واسعة من عمليات نقل الطاقة ، (على سبيل المثال ، -150 μeV < Equation 3 < 150 μeV) ، مع تدفق أعلى من محرك دوبلر ، ولكن على حساب دقة طاقة أقل (الشكل التكميلي S2B).

من الخصائص المهمة لتشتت النيوترونات أن المقطع العرضي غير المترابط σinc له قيمة أعلى 40 مرة للهيدروجين من الديوتيريوم ولا يكاد يذكر بالنسبة للعناصر الأخرى التي توجد عادة في العينات البيولوجية. لذلك ، يمكن دراسة ديناميكيات البروتينات في بيئة سائلة باستخدام مخزن مؤقت مقسم ، وتسمح حالة المسحوق بدراسة إما الديناميات الداخلية للبروتين مع مسحوق البروتين المهدرج المبلل ب D 2 O ، أودراسة ماء الترطيب لمسحوق البروتين perdeuterated المائي باستخدام H2O. في الحالة السائلة ، يسمح التشتت العكسي للنيوترونات عادة بالوصول في وقت واحد إلى الانتشار الذاتي لمركز الكتلة للبروتينات (الانتشار من نوع Fickian) وديناميكياتها الداخلية. هذه الأخيرة هي حركات العمود الفقري والسلسلة الجانبية التي يصفها عادة ما يسمى نموذج انتشار القفز أو غيره 3,18. في مساحيق البروتين المهدرجة ، يكون انتشار البروتين غائبا ويجب نمذجة الديناميات الداخلية فقط. بالنسبة لمياه الإماهة ، فإن مساهمات الحركات الانتقالية والدورانية لجزيئات الماء تقدم اعتمادا مختلفا على نقل الزخم q ، مما يسمح بتمييزها في عملية تحليل البيانات17.

توضح هذه الورقة طريقة التشتت العكسي للنيوترونات مع دراسة البروتينات التي وجد أنها قادرة على التكشف ، وتتجمع في شكل قانوني يتكون من أكوام من خيوط β - ما يسمى بنمط β المتقاطع19،20 - وتشكل أليافا ممدودة. هذا هو ما يسمى بتجميع الأميلويد ، والذي تمت دراسته على نطاق واسع بسبب دوره المركزي في الاضطرابات التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر أو مرض باركنسون21,22. إن دراسة بروتينات الأميلويد مدفوعة أيضا بالدور الوظيفي الذي يمكن أن تلعبه 23,24 أو إمكاناتها العالية لتطوير مواد حيوية جديدة25. لا تزال المحددات الفيزيائية والكيميائية لتجميع الأميلويد غير واضحة ، ولا تتوفر نظرية عامة لتجميع الأميلويد ، على الرغم من التقدم الهائل خلال السنوات الماضية21,26.

ينطوي تجميع الأميلويد على تغييرات في بنية البروتين واستقراره مع مرور الوقت ، والتي تنطوي دراستها بشكل طبيعي على ديناميكيات مرتبطة باستقرار تكوين البروتين ، ووظيفة البروتين ، ومشهد طاقة البروتين27. ترتبط الديناميكيات ارتباطا مباشرا باستقرار حالة معينة من خلال المساهمة الإنتروبية لأسرع الحركات28 ، ويمكن الحفاظ على وظيفة البروتين من خلال الحركات على نطاقات زمنية مختلفة من sub-ps للبروتينات الحساسة للضوء29 إلى ms لحركات المجال ، والتي يمكن تسهيلها بواسطة ديناميكيات بيكو ثانيةنانو ثانية 30.

سيتم تقديم مثالين على استخدام التحليل الطيفي للتشتت العكسي للنيوترونات لدراسة بروتينات الأميلويد ، أحدهما في الحالة السائلة لدراسة ديناميكيات البروتين والآخر في حالة المسحوق المائي لدراسة ديناميكيات الماء المماهة. يتعلق المثال الأول بتجميع الليزوزيم في كرات بحجم ميكرومتر (تسمى الجسيمات) متبوعة في الوقت الفعلي5 ، والثاني مقارنة لديناميكيات المياه في الحالات الأصلية والمجمعة للبروتين البشري تاو31.

الليزوزيم هو إنزيم يشارك في الدفاع المناعي ويتكون من 129 من بقايا الأحماض الأمينية. يمكن أن يشكل الليزوزيم جسيمات في المخزن المؤقت المثبط عند pD 10.5 وعند درجة حرارة 90 درجة مئوية. مع تشتت النيوترونات ، أظهرنا أن التطور الزمني لمعامل انتشار مركز الكتلة للليزوزيم يتبع الحركية الأسية المفردة لتألق ثيوفلافين T (مسبار فلوري يستخدم لمراقبة تكوين أنماط β المتقاطع الأميلويد32) ، مما يشير إلى أن الهياكل الفوقية للجسيمات وأنماط β المتقاطع تحدث في خطوة واحدة بنفس المعدل. علاوة على ذلك ، ظلت الديناميات الداخلية ثابتة طوال عملية التجميع ، والتي يمكن تفسيرها إما من خلال تغيير توافقي سريع لا يمكن ملاحظته على أدوات NBS ، أو من خلال عدم وجود تغيير كبير في الطاقة الداخلية للبروتين عند التجميع.

البروتين البشري تاو هو بروتين مضطرب جوهريا (IDP) يتكون من 441 من الأحماض الأمينية لما يسمى ب 2N4R isoform ، والذي يشارك بشكل خاص في مرض الزهايمر33. باستخدام التشتت العكسي للنيوترونات على مساحيق بروتين تاو perdeuterated ، أظهرنا أن ديناميكيات الماء المائيات تزداد في حالة الألياف ، مع وجود عدد أكبر من جزيئات الماء التي تخضع لحركات متعدية. تشير النتيجة إلى أن الزيادة في إنتروبيا الماء المائي قد تؤدي إلى رجفان الأميلويد في تاو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المخزن المؤقت deuterated للبروتينات في الحالة السائلة

  1. حل جميع مكونات المخزن المؤقت في D2O النقي.
  2. إذا تمت معايرة قطب الأس الهيدروجيني في H2O ، فاضبط pD وفقا للصيغة pD = pH + 0.4 باستخدام NaOD أو DCl34.
    ملاحظة: قد يؤثر استخدام D 2O بدلا من H2O على قابلية ذوبان البروتين وقد تحتاج الظروف العازلة إلى التكيف (على سبيل المثال ، عن طريق تغيير طفيف في تركيز الملح).

2. تحضير مساحيق H2O المائية من البروتين perdeuterated

  1. تحضير حامل العينة.
    1. قم بتنظيف حامل عينة الألمنيوم المسطح تماما باستخدام ختم سلك الإنديوم والبراغي بالماء والإيثانول واتركه يجف.
      ملاحظة: يتم استخدام حامل عينة مسطح بحيث يمكن توزيع المسحوق بشكل متجانس على السطح. يجب أن تكون كمية المسحوق كافية بحيث يمكن الحفاظ عليها بين الجدران ولا تسقط عند وضع حامل العينة عموديا.
    2. قم بوزن الأجزاء المختلفة من قاع حامل العينة والغطاء وسلك الإنديوم بشكل منفصل على ميزان دقيق.
    3. ضع ختم سلك الإنديوم 1 مم في أخدود الجزء السفلي من حامل العينة ، تاركا تداخلا صغيرا حيث ينضم الطرفان (الشكل 2 أ).
    4. ضع كمية مناسبة من البروتين المجفف بالتجميد (عادة ~ 100 ملغ من البروتين) بحيث يملأ السطح الداخلي للجزء السفلي من حامل العينة.
  2. رطب مسحوق البروتين.
    1. ضع حامل العينة في مجفف مع طبق بتري يحتوي على مسحوق P2O5 لمدة 24 ساعة لتجفيف مسحوق البروتين تماما35 (الشكل 2B). قم بوزن الجزء السفلي الجاف من حامل العينة الذي يحتوي على ختم الإنديوم والمسحوق الجاف للحصول علىم جاف.
      تنبيه: مسحوق P2O5 تآكل للغاية.
    2. أخرج P 2 O5 من المجفف وضع طبق بتري مع D2O بالداخل. تحكم في كتلة المسحوق بانتظام للتحقق من مستوى الترطيب h = m hyd / m الجاف حيث mhyd و mdry هما كتلة المسحوق المائي والمسحوقالجاف ، على التوالي.
      ملاحظة: بالنسبة للبروتينات الكارهة للماء مثل الأنسولين ، قد يكون من الضروري زيادة درجة الحرارة داخل المجفف للحصول على ضغط بخار أعلى والوصول إلى مستوى الترطيب المطلوب h.
    3. كرر الخطوتين 2.2.1 و 2.2.2 ثلاث مرات على الأقل لتحويل جميع الهيدروجين القابل للتبديل إلى الديوترونات بشكل صحيح.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام دورات التجفيف بالتجميد والذوبان في D2O النقي لتحسين تبادل H / D بشرط ألا يتأثر البروتين به.
    4. قم بترطيب المسحوق إلى أعلى قليلا من المستوى المطلوب ، واترك الجزء السفلي من حامل العينة بسلك الإنديوم والمسحوق المائي على ميزان الدقة ، وانتظر حتى تنخفض الكتلة ببطء إلى القيمة المطلوبة للحصول على الهدف h (عادة 0.2-0.4 إذا كان البروتين الكروي متوسط الحجم سيتم تغطيته بطبقة ترطيب كاملة واحدة).
    5. ضع الغطاء بسرعة على الجزء السفلي وأغلق حامل العينة أولا بأربعة براغي لإيقاف تبادل البخار (الشكل التكميلي S3A).
    6. ضع جميع البراغي المتبقية وأحكمها حتى لا تظهر فجوة بين الجزء السفلي والغطاء (الشكل التكميلي S3B).
    7. قم بوزن حامل العينة المختوم للتحقق من أي فقد محتمل للترطيب عن طريق التسريبات بعد تجربة النيوترونات.

3. إجراء تجربة تشتت النيوترونات غير المتماسكة

  1. ناقش وتحقق مرة أخرى من تكوين الأداة اللازمة للتجربة مع جهة الاتصال المحلية قبل بضعة أسابيع من وقت الحزمة المعين.
  2. تحضير عينة الحالة السائلة.
    1. حل البروتين في المخزن المؤقت deuteated.
    2. تحديد الحجم المناسب للسائل الذي سيتم وضعه في حامل العينة باستخدام الماء (تأكد من عدم وجود فائض عند إغلاق حامل العينة ؛ الشكل 2 ج).
      ملاحظة: تصف الخطوتان التاليتان (3.3 و 3.4) تجربة أجريت على مطياف NBS IN16B في ILL 8,9 ، باستخدام فرن التبريد كبيئة عينة. سيتغير نظام التحكم في الأداة من أداة إلى أخرى ، لكن مبادئ العمل تظل كما هي.
  3. أدخل العينة.
    1. جفف عصا العينة تماما (الشكل 2D) ، وأزل العينة السابقة ، إن وجدت ، بعد التحقق من أن جرعة الإشعاع المؤين أقل من 100 μSv / h قبل التعامل مع أي مادة (في ILL).
    2. ضع العينة ، وتحقق من التمركز المناسب بالنسبة لمركز الحزمة (الشكل التكميلي S4) ، وأدخل عصا العينة في فرن التبريد (الشكل 2D). قم بتشغيل مضخة التفريغ للوصول إلى أقل من 10-3 بار ، واطرد الهواء داخل فرن التبريد عن طريق تكرار ثلاث مرات التالية: املأ فرن التبريد بغاز الهيليوم حتى يتم الوصول إلى الضغط الجوي ، وقم بإزالة الغاز مرة أخرى باستخدام مضخة التفريغ.
      ملاحظة: في حالة حامل العينة المسطح ، يجب توجيه حامل العينة بزاوية 45 درجة بالنسبة إلى الحزمة الواردة. يمكن تقليل نطاق نقل الزخم المفيد بسبب الامتصاص والتشتت بواسطة الخلية. يمكن استخدام ممتص نيوتروني قوي مثل الكادميوم لإخفاء أجزاء معينة من حامل العينة (على سبيل المثال ، البراغي والأجزاء السميكة).
    3. أدخل بعض غاز الهيليوم في فرن التبريد بحيث يكون الضغط ~ 0.05 بار.
  4. الحصول على البيانات (على سبيل المثال ، باستخدام NOMAD على IN16B في ILL ، يفترض أن المستخدم يفضل درجة حرارة 200 K قبل الحصول على طيف طيف نيوتروني شبه مرن (QENS) ، ثم E / IFWS أثناء منحدر درجة الحرارة إلى 310 K عند 0.5 K في الدقيقة وأخيرا QENS عند 310 K).
    1. باستخدام NOMAD ، في علامة تبويب التنفيذ ، اسحب وحدة تحكم FurnaceCryostat وأفلتها في لوحة التشغيل. اضبط درجة الحرارة على 200 كلفن. استخدم الوضع السريع ومهلة 30 دقيقة بحيث يكون لدرجة الحرارة وقت للاستقرار. انقر على أيقونة الأسهم الدوارة لتشغيلها في الخلفية بحيث يمكن الحصول على البيانات أثناء انخفاض درجة الحرارة.
    2. اسحب وحدة التحكم IN16DopplerSettings وأفلتها، واضبط ملف تعريف السرعة على السرعة الدقيقة التي تم تعيينها بواسطة Max ΔE، وقيمة 0.00 μeV و128 قناة للحصول على تكوين EFWS.
    3. قم بسحب وإسقاط وحدة تحكم العد ، واملأ حقل العنوان الفرعي باسم يسمح بسهولة التعرف على البيانات ، وقم بتعيين 60 تكرارا لمسح 30 ثانية (الشكل التكميلي S5A).
    4. اسحب وحدة تحكم IN16DopplerSettings وأفلتها، واضبط ملف تعريف السرعة على Sine الذي تم تعيينه بواسطة Speed بقيمة 4.5 m/s و2048 قناة للحصول على تكوين QENS.
    5. قم بسحب وإسقاط وحدة تحكم العد مع 4 تكرارات لمدة 30 دقيقة من عمليات المسح الضوئي (الشكل التكميلي S5B).
    6. بالنسبة لمنحدر درجة الحرارة ، اسحب وحدة تحكم FurnaceCryostat وأفلتها ، واضبط درجة الحرارة على 310 K ، واضبط المنحدر على SetPoint مع Δ = 0.05 K و 6 ثوان. استخدم وقتا من 220 دقيقة (الشكل التكميلي S6A).
    7. استخدم حلقة for مع 65 تكرارا. في الداخل ، أدخل وحدة تحكم IN16DopplerSettings كما في الخطوة 3.4.2 ، متبوعة بعدد واحد يبلغ 30 ثانية. بعد ذلك ، أدخل IN16DopplerSettings ، كما هو موضح سابقا ولكن باستخدام إزاحة طاقة تبلغ 1.5 μeV و 1024 قناة متبوعة بعدد واحد قدره 3 دقائق (الشكل التكميلي S6B).
    8. للحصول على آخر QENS عند 310 كلفن، قم بسحب وإفلات وحدات التحكم IN16DopplerSettings وCount التي تم تكوينها كما هو موضح في الخطوتين 3.4.4 و3.4.5 على التوالي.
    9. اضغط على زر البدء (مثلث قائم الزاوية في أسفل النافذة) لتشغيل البرنامج النصي.
      ملاحظة: ستتطلب كل تجربة الحصول على بيانات المعايرة. أي الخلية الفارغة لتصحيحات الطرح أو الامتصاص ، والمخزن المؤقت وحده في درجات الحرارة المختلفة المستخدمة لنمذجة الخلفية ، وقياس الفاناديوم (أو ما يعادله ، العينة عند درجة حرارة 10 كلفن أو أقل) للحصول على وظيفة دقة الجهاز.

4. تحليل البيانات - QENS

  1. قم باستيراد مجموعة البيانات باستخدام طريقة 'IN16B_QENS.process()' في برنامج Python nPDyn v3.x36
    >>>> من nPDyn.dataParsers استيراد IN16B_QENS

    >>> العينة = IN16B_QENS(
    ... <المسار إلى ملفات البيانات>
    ... [detGroup = < عدد صحيح أو ملف تجميع كاشف في XML
    ... الشكل>]
    ... ). عملية ()

    >>> عينة = sample.get_q_range (0.3 ، 1.8)
  2. قم بإجراء تصحيحات البيانات (اختياري) باستخدام الأوامر التالية (انظر وثائق nPDyn لمزيد من المعلومات ، الشكل 3):
    يفترض #it أن بيانات الخلية الفارغة والفاناديوم والمخزن المؤقت
    # تم استيرادها بالفعل في مجموعة بيانات تسمى "empty_cell" ، "الفاناديوم" ،
    # و "المخزن المؤقت" ، على التوالي.

    # لطرح الخلية الفارغة بعامل تحجيم
    # (يتم نشر الأخطاء تلقائيا)
    >>> عينة = عينة - 0.95 * empty_cell

    # للتصحيح باستخدام معامل بالمان بينغ
    # (حصري بشكل متبادل مع المثال أعلاه)
    >>> العينة = sample.absorptionCorrection(empty_cell)

    # للتطبيع
    >>> عينة = عينة.تطبيع (الفاناديوم)

    # للتجميع على طول المحور الذي يمكن ملاحظته
    # يمكن ملاحظته هو وقت التجميع هنا
    >>> العينة = العينة .bin (3 ، المحور = 0)
  3. تناسب بيانات المعايرة. يمكن تركيب عينات مجموعة البيانات والخلية الفارغة والمخزن المؤقت المخفف (إذا لزم الأمر) والفاناديوم باستخدام نماذج مدمجة أو نموذج محدد من قبل المستخدم (انظر وثائق nPDyn):
    >>> من استيراد nPDyn.models.builtins (
    ... نموذجPVoigt,
    ... نموذجالمياه,
    ... نموذجمعايرةD2O,
    ...     )

    # تستخدم النماذج المدمجة متجه عمود للزخم
    # نقل قيم q
    >>> q = الفاناديوم.q[:, لا يوجد]

    # يتم تركيب الفاناديوم باستخدام ملف تعريف زائف Voigt
    >>> الفاناديوم.فيت (نموذجPVoigt (ف))
  4. استخدم النموذج المدمج لمياه الترطيب المسمى "modelWater". يقرأ هذا النموذج كما هو موضح بواسطة مكافئ (4) 17
    Equation 4 (4)
    حيث0 وr وt هي أعداد قياسية تمثل المساهمة النسبية للإشارة المرنة والحركات الدورانية والحركات الانتقالية ، على التوالي ؛ j1 (qd) هي دالةبيسل الكروية من الدرجة l th ، مع q هي نقل الزخم ؛ د مسافة O-H في جزيء الماء ؛ δ (ω) هي دلتا ديراك ، والتي يتم ضربها في EISF هنا ؛ N هو أعلى ترتيب لدالة Bessel الكروية المستخدمة (عادة ~ 5) ؛ Equation 5 وهي Equation 11 الحركات الدورانية والانتقالية لورنتزيان ، على التوالي ؛ ب (ف) هو مصطلح خلفية مسطح. تعطي دوال Bessel الكروية المساهمة النسبية لكل حالة زخم زاوية لجزيئات الماء ، ويتم تحديد الرقم N بناء على نطاق q لنقل الزخم. في حالة مطياف NBS النموذجي ، فإن المصطلحات حتى N = 4 تشرح الإشارة بالكامل تقريبا (الشكل التكميلي S7).
    # هنا ، يتم استخدام المعادلة 2 لمياه الترطيب
    # الالتفاف مع وظيفة القرار وإضافة
    # تتم خلفية D2O تلقائيا باستخدام ملف
    # الحجج المقدمة
    >>> sample.fit (modelWater (q) ،
    ... الدقة = الفاناديوم ،
    ... bkgd = العازلة ،
    ... volume_fraction_bkgd=0.95
    ... )
    ملاحظة: يجب أن تكون مساهمات الحركات الدورانية والانتقالية معقدة لتكون صارمة تماما. يعزى نجاح النموذج الإضافي إلى وجود مجموعات متميزة من الماء على سطح البروتين ونطاق الطاقة المحدود الذي يمكن الوصول إليه.
  5. استخدم ما يلي لرسم البيانات (الشكل 4):
    >>> من قطعة أرض استيراد nPDyn.plot
    مؤامرة >>> (عينة)

5. تحليل البيانات - منحدر درجة الحرارة ، مسح النافذة الثابتة المرنة (EFWS)

  1. استخدم إجراء مشابها للقسم 4 لتطبيع بيانات منحدر درجة الحرارة بواسطة الإشارة عند أدنى درجة حرارة (عادة 10 كلفن):
    >>> من nPDyn.dataParsers استيراد IN16B_FWS

    >>> عينة = IN16B_FWS(
    ... <المسار إلى ملفات البيانات> ،
    ... detGroup=[detGroup=<ملف تجميع عدد صحيح أو كاشف بتنسيق XML>]
    ... ). عملية ()

    # التطبيع مع النقاط ال 5 الأولى على ما يمكن ملاحظته
    # المحور ، والتي تتوافق مع درجة الحرارة
    >>> عينة /= عينة [:5].يعني (0)

    # نطاق Q لنقل الزخم المستخدم هنا أصغر
    # حيث أن النموذج المستخدم صالح ل Low Q فقط
    >>> عينة = sample.get_q_range (0.2 ، 0.8)
  2. استخدم نموذجا غاوسيا بسيطا للبدء ، يتم إعطاء عرضه بواسطة ما يسمى بمتوسط الإزاحة التربيعية (MSD). قم ببناء النموذج وملاءمته باستخدام الأوامر التالية:
    >>> استيراد numpy ك np
    >>> من nPDyn.models استيراد المعلمات والنموذج والمكون

    # أ هو عامل التحجيم
    >>> المعلمات = المعلمات (
    ... a={'value': 1، 'bounds': (0, np.inf)},
    ... msd = {'القيمة': 1 ، 'الحدود': (0 ، np.inf)}
    ... )

    >>> نموذج = نموذج (معلمات)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... "غاوسي" ،
    ... لامدا س ، أ ، إم إس دي: أ * NP.exp (-x ** 2 * MSD / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit (نموذج ، x = sample.q [: ، لا شيء])

    مؤامرة >>> (عينة)
    ملاحظة: ينطبق تقريب Gaussian دائما على q2MSD << 1 ، ولكن يمكن استخدام نطاق نقل زخم أوسع للمقارنة النسبية بين العينات. تم تطوير نماذج أكثر تطورا ، والتي تتجاوز التقريب الغاوسي ،37،38،39.

6. تحليل البيانات - عمليات المسح المرنة وغير المرنة للنوافذ الثابتة (E / IFWS)

  1. على غرار الخطوة 4 ، قم باستيراد مجموعة البيانات ولكن باستخدام الفئة "IN16B_FWS":
    >>> من nPDyn.dataParsers استيراد IN16B_FWS

    >>> عينة = IN16B_FWS(
    ... <المسار إلى ملفات البيانات>
    ... [detGroup = <ملف تجميع عدد صحيح أو كاشف بتنسيق XML>]
    ... ). عملية ()

    >>> عينة = sample.get_q_range (0.3 ، 1.8)
  2. تناسب بيانات المعايرة وبيانات العينة.
    1. قم بتحليل بيانات E / IFWS باستخدام MSD40 المعمم أو من خلال اعتبارها أطياف QENS الخشنة (مع وجود عدد قليل فقط من نقاط البيانات على محور الطاقة). عندما ينظر إلى E / IFWS على أنه QENS-خشن ، يتم استخدام النماذج المستخدمة في QENS لتناسب مجموعة بيانات E / IFWS بأكملها في وقت واحد (التوافق العالمي لعمليات نقل الطاقة وتحويلات الزخم).
      ملاحظة: يتم استخدام نماذج استخدام الحل الأخير ل QENS على بيانات E / IFWS هنا حيث يتم فرض اعتماد نقل الزخم لانتشار مركز الكتلة والديناميات الداخلية للبروتين.
    2. نموذج ديناميكيات البروتين في السوائل باستخدام مكافئ البروتين التالي (5) ("modelProteinJumpDiff" في nPDyn):
      Equation 6 (5)
      حيث R (q، ω) هي دالة الدقة ؛ β عدد قياسي مستقل لكل نقل زخم q ؛ 0 هو عامل البنية غير المتماسكة المرنة (EISF) ؛ Equation 7 حساب لورنتزيان لانتشار مركز الكتلة بعرض معطى بواسطة Eq (6) ؛ Equation 12 هو لورنتزيان يتضمن انتشار مركز الكتلة ومساهمة بعد نموذج انتشار القفز14 الذي يمثل الديناميكيات الداخلية (Eq (7) ؛ Equation 8 كونها الإشارة المجهزة من D2O المعاد قياسها بواسطة جزء حجمها في العينة.
      γ = دقس 2 (6)
      Ds هو معامل الانتشار الذاتي.
      Equation 9 (7)
      Di هو معامل الانتشار الظاهر للديناميكيات الداخلية و τ وقت استرخاء للحركات الانتشارية.
      >>> من استيراد nPDyn.models.builtins (
      ... نموذجPVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... نموذجمعايرةD2O,
      ... )

      # تستخدم النماذج المدمجة متجه عمود للزخم
      # نقل قيم q
      >>> q = الفاناديوم.q[:, لا يوجد]

      # يتم تركيب الفاناديوم باستخدام ملف تعريف زائف Voigt
      >>> الفاناديوم.فيت (نموذجPVoigt (ف))

      # ل D2O النقي ، نموذج بعرض خط معاير
      # لدرجات حرارة مختلفة يتم تضمينها في nPDyn
      >>> buffer.fit (modelCalibratedD2O (q ، temp = 363))

      # هنا ، يتم استخدام المعادلة 3 للعينات السائلة
      # الالتفاف مع وظيفة القرار وإضافة
      # تتم خلفية D2O تلقائيا باستخدام # الوسيطات المقدمة
      >>> sample.fit (modelProteinJumpDiff (q) ،
      ... الدقة = الفاناديوم ،
      ... bkgd = العازلة ،
      ... volume_fraction_bkgd=0.95
      ... )
  3. ارسم البيانات المجهزة باستخدام:
    >>> من قطعة أرض استيراد nPDyn.plot
    مؤامرة >>> (عينة)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إجراء تجميع الليزوزيم في الجسيمات عند 90 درجة مئوية بتركيز بروتين 50 مجم / مل في مخزن مؤقت مقسم (0.1 M NaCl عند pD 10.5). يتم تشغيل تكوين الجسيمات من خلال زيادة درجة الحرارة إلى 90 درجة مئوية ويحدث في غضون 6 ساعات (الشكل التكميلي S8). تم الحصول على البيانات على IN16B ، كما هو موضح في البروتوكول أعلاه (يتم تنسيق البيانات بشكل دائم بواسطة ILL ويمكن الوصول إليها في http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

تم الحصول على طيف QENS عند 7 درجات مئوية لتوصيف الحالة الأولية بشكل كامل. بعد ذلك ، تم زيادة درجة الحرارة إلى 90 درجة مئوية (عادة ما تستغرق ~ 30 دقيقة على IN16B ، الشكل التكميلي S9) لبدء عملية التجميع. يمكن تتبع الحركية باستخدام متوسط منزلق لأطياف QENS ، مما يسمح بالوصول إلى النطاق الكامل لنقل الطاقة ، ولكن بدقة محدودة في الوقت المناسب. يمكن تحسين دقة الوقت إلى ~ 1 دقيقة باستخدام EFWS وإلى ~ 20 دقيقة باستخدام E / IFWS عند أربع قيم لنقل الطاقة5.

في المثال المقدم ، استكشفنا عمليات نقل الطاقة من 0 و 0.6 و 1.5 و 3 μeV. يتم الحصول على عمليات المسح E / IFWS بشكل مستمر أثناء عملية التجميع ، وتم الحصول على طيف QENS للحالة النهائية عند 90 درجة مئوية. تم تصحيح بيانات E / IFWS للامتصاص باستخدام E / IFWS للخلية الفارغة وتمت تسويتها باستخدام بيانات الفاناديوم.

بالنسبة للليزوزيم E / IFWS ، نلاحظ زيادة في الإشارة في الوقت المناسب عند نقل الزخم المنخفض ونقل الطاقة المنخفض ، بينما تنخفض الإشارة عند نقل الطاقة العالية ونقل الزخم المنخفض (الشكل التكميلي 10). تشير هذه الملاحظة النوعية إلى تكوين أجسام أكبر ، تنتشر ببطء أكثر وتؤكد أن عملية التجميع قد حدثت. ينتج عن التحليل ، وفقا ل Eq (4) ، معامل انتشار أولي لمركز الكتلة يبلغ 15 Å2 / ns ، بالاتفاق مع وجود مجموعات بروتينية صغيرة (مدعومة بتشتت الضوء الديناميكي وحسابات HYDROPRO 5,41) ، والتي تتناقص بعد ذلك أضعافا مضاعفة بمرور الوقت (الشكل 5). يظل معامل الانتشار الظاهر للديناميكيات الداخلية ثابتا طوال عملية التجميع. ومن ثم ، يبدو أن تكوين جسيمات الليزوزيم يحدث في مرحلة تجميع واحدة. يشير غياب التغيير في ديناميكيات البروتين الداخلية إلى أن التحويل إلى β المتقاطع والتغير المحتمل المرتبط به في الطاقة سريع جدا أو أن التأثيرات الدافعة الأخرى ، مثل زيادة إنتروبيا المذيبات ، قد تكون مهيمنة تماما ضمن نطاق الطاقة الذي تم فحصه.

أجريت دراسة ديناميكيات الماء الإماهة حول مونومرات وألياف تاو على SPHERES في مركز Maier-Leibnitz Zentrum (MLZ) في Garching ، ألمانيا ، باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه لعينات المسحوق. تم استخدام ما يقرب من 100 ملغ من مسحوق بروتين تاو المثبط ، رطب إلى 0.4 غرام من H2O لكل غرام من البروتين. تم الحصول على EFWS خلال منحدر درجة الحرارة وأطياف QENS عند درجة حرارة ثابتة. تم تسجيل EFWS بدءا من 20 K وزيادة درجة الحرارة إلى 300 K بمعدل 0.2 K / min مع الحصول على البيانات باستمرار خلال 5 دقائق من المسح.

تم تسجيل أطياف QENS عند 20 و 280 K. تم تركيب بيانات EFWS باستخدام Gaussian بسيط على نطاق نقل الزخم q 0.2 Å-1 < q < 0.8 Å-1 لاستخراج MSD (الشكل التكميلي S11A). قيم MSD أعلى من حد الصلاحية لنموذج Gaussian. وبالتالي ، يوصى في هذه الحالة باستكشاف نماذج أخرى تتجاوز تقريب Gaussian37،38،39. عند درجات حرارة أعلى من 220 كلفن ، يكون ماء الترطيب حول ألياف تاو أكثر قدرة على الحركة بشكل ملحوظ من ماء الترطيب حول مونومرات تاو (الشكل 6). يسمح تركيب بيانات QENS للمستخدمين بالحصول على عرض الخط والمساهمة النسبية للحركات المرنة والدورانية والانتقالية لمياه الإماهة في العينة (الشكل التكميلي S11B). يبدو أن جزء جزيئات الماء التي تخضع لحركة متعدية يزداد حول الألياف ، وتزداد معاملات الانتشار الانتقالي والدوران لجزيئات الماء حول الألياف17,31. في المقابل ، لم تتغير الديناميكيات الداخلية ps-ns للبروتين تاو ، والتي تعكس حركات العمود الفقري والسلسلة الجانبية ، عند الرجفان.

Figure 2
الشكل 2: قاعدة حامل عينة مسطح من الألومنيوم. (أ) يمثل حامل عينة الألومنيوم المسطح جزءا مركزيا معرضا للنيوترونات حيث يتم الاحتفاظ بمسحوق البروتين داخل فجوة صغيرة - عادة ~ 0.3 مم - بين القاعدة والغطاء. يمكن استخدام سلك الإنديوم للختم لأنه يقاوم ارتفاع درجات الحرارة حتى 90 درجة مئوية. في حالة ارتفاع درجات الحرارة ، يمكن استخدام ختم تفلون. (ب) يوضع مسحوق البروتين في قاعدة حامل العينة مع وضع سلك الإنديوم في مكانه. يوضع حامل العينة في مجفف إما P 2 O5 للتجفيف أو H 2 O / D2O للترطيب. يضاف شحم الفراغ لتجنب أي تسرب بين الجزء السفلي وغطاء المجفف. يمكن استخدام الفراغ بحذر لتسريع عملية التجفيف. قد تكون هناك حاجة لتسخين الجزء السفلي من المجفف للعينات شديدة الكارهة للماء. (ج) يوضع محلول البروتين بين المخبار الداخلي والخارجي. تأكد من عدم وجود الكثير من السوائل (يجب ألا يكون هناك فائض عند إغلاق حامل العينة). يتم وضع سلك الإنديوم في الأخدود الدائري. (د) توفر عصا العينة (في الخلفية) التحكم في ارتفاع العينة واتجاهها ويمكن أن تتضمن وحدات تحكم وكاشفات مختلفة لبيئات العينة (درجة الحرارة والضغط). يتم إدخال عصا العينة من أعلى فرن التبريد (الأمامي) ، مما يوفر التحكم في درجة الحرارة أثناء التجربة. أثناء التجربة ، عادة ما تصطدم الحزمة النيوترونية بقاع الفرن المبرد ، كما هو موضح بالمستطيل الأبيض (يعتمد حجم الحزمة على تكوين الجهاز). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: قد يؤدي تصحيح البيانات والتطبيع إلى تحسين الملاءمة. تم استيراد البيانات باستخدام nPDyn ، كما هو موضح في البروتوكول. على اليسار ، تمت تسوية مجموعة البيانات باستخدام بيانات الشاشة فقط. على اليمين ، تم استخدام إشارة العلبة الفارغة جنبا إلى جنب مع معاملات Paalman-Ping43 لتصحيح امتصاص النيوترون من حامل العينة. بعد ذلك ، تم دمج النموذج المجهز لإشارة الفاناديوم بشكل مستقل لكل نقل زخم q ، وتم استخدام النتيجة لتطبيع مجموعة بيانات العينة. في كلا المخططين ، يشير S (q ، ω) إلى إشارة التشتت ، q هو نقل الزخم ، وهو Equation 3 نقل الطاقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نافذة رسم تم إنشاؤها بواسطة nPDyn تظهر نتيجة الملاءمة. تم تركيب بيانات QENS باستخدام nPDyn ، كما هو موضح في البروتوكول. تسمح نافذة التخطيط للمستخدمين برسم البيانات على طول محاور مختلفة يمكن ملاحظتها (الوقت أو درجة الحرارة أو الضغط) أو نقل الزخم q أو نقل الطاقة - وتتوفر محددات للتنقل على طول المحاور الأخرى. تتوفر أنواع مختلفة من قطع الأراضي ، مع "المؤامرة" البسيطة المعروضة في (أ) و "التحليل - q-wise" في (ب). يعرض زر "Plot" مجموعات البيانات المختلفة في حبكات فرعية منفصلة ، ويعرض الزر "مقارنة" مجموعات البيانات في نفس المخطط ، ويعرض "مخطط 3D" مجموعات البيانات في حبكات فرعية ثلاثية الأبعاد مختلفة مشابهة ل s ، ويظهر زر "Analysis - q-wise" المعلمات المجهزة كدالة لنقل الزخم q و "التحليل - يمكن ملاحظته - من الحكمة' المعلمات المجهزة كدالة يمكن ملاحظتها (الوقت أو درجة الحرارة أو الضغط). اختصار: QENS = تشتت نيوتروني شبه مرن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: يحدث تجمع الليزوزيم في عملية من خطوة واحدة ذات ديناميكيات داخلية ثابتة. تم إذابة الليزوزيم في مخزن التجميع (الموصوف في مكان آخر5) ، وتم الحصول على E / IFWS طوال فترة التجميع ، والتي تم تشغيلها عن طريق زيادة درجة الحرارة إلى 90 درجة مئوية. بعد تصحيح الامتصاص بخلية فارغة والتطبيع باستخدام إشارة الفاناديوم ، تم تحليل البيانات باستخدام نموذج انتشار القفز كما هو موضح في البروتوكول. يتم رسم معامل الانتشار الذاتي لمركز الكتلة المجهز كدالة للوقت (المثلثات الزرقاء) جنبا إلى جنب مع معامل الانتشار الظاهر للديناميكيات الداخلية (المربعات البرتقالية). هذا الرقم من 5. الاختصار: E / IFWS = عمليات مسح مرنة وغير مرنة للنوافذ الثابتة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تزداد ديناميكيات الماء الإماهة حول ألياف تاو. تم إغلاق مساحيق H2O المائية من ألياف ومونومرات تاو المثبطة في حامل عينة مسطح من الألومنيوم ، وتم الحصول على بيانات EFWS خلال منحدر درجة حرارة من 20 إلى 300 كلفن. بعد تصحيح الامتصاص بخلية فارغة والتطبيع باستخدام إشارة الفاناديوم ، تم تحليل البيانات باستخدام نموذج انتشار القفز كما هو موضح في البروتوكول. تمت إعادة رسم هذه الصورة باستخدام نطاق q أصغر (0.2 < q < 0.8 Å-1) من بيانات من 31. اختصار: EFWS = مسح مرن للنافذة الثابتة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: صور فوتوغرافية للأداة IN16B في ILL. (أعلى) الأداة IN16B كما ترى من المنطقة التي يتم التحكم فيها بالإشعاع والمخصصة للأداة. تنتقل الحزمة الواردة داخل دليل النيوترون إلى غرفة التفريغ ، والتي تحتوي على معظم عناصر الأداة (مروحية PST ، أجهزة التحليل ، العينة ، أجهزة الكشف). (أسفل) داخل غرفة التفريغ. مروحية PST مرئية وكذلك أجهزة التحليل المحيطة بفرن التبريد الذي يحتوي على العينة. تقع أجهزة الكشف خلف فرن التبريد. بإذن من لوران ثيون ، إكليبتيك. اختصار: PST = تحويل مساحة الطور. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: رسم تخطيطي ل IN16B في الأوضاع الكلاسيكية (مع محرك دوبلر) و BATS. (أ) الحزمة النيوترونية أحادية اللون جزئيا بواسطة محدد السرعة. بعد ذلك ، ستنتج الخلفية ومروحيات PST نبضة نيوترونية ، والتي سيتم من خلالها اختيار ملف تعريف الطاقة بواسطة أحادي اللون دوبلر (وضع E / IFWS أو QENS). ثم تنتشر النيوترونات بواسطة العينة ، وتنعكس طاقة واحدة نحو أجهزة الكشف بواسطة أجهزة التحليل. بإذن من ILL. (ب) تستخدم مروحيات BATS لتحديد نبضة نيوترونية واحدة ذات نطاق طاقة محدد. الحزمة النيوترونية أحادية اللون جزئيا بواسطة محدد السرعة. بعد ذلك ، ستقوم مروحية الخلفية بإزالة النيوترونات غير المرغوب فيها التي لا تنتمي إلى النبضة المحددة. ثم تنتشر النيوترونات بواسطة العينة ، وتنعكس طاقة واحدة نحو أجهزة الكشف بواسطة أجهزة التحليل. بإذن من ILL. الاختصارات: BATS = مطياف التشتت العكسي ووقت الطيران. PST = تحويل الفضاء المرحلة ؛ E/IFWS = عمليات مسح مرنة وغير مرنة للنوافذ الثابتة؛ QENS = تشتت النيوترونات شبه المرن ؛ PG = الجرافيت الانحلال الحراري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: يتم إغلاق حامل العينة بسرعة بعد وصول المسحوق إلى الترطيب المطلوب وإغلاقه. (أ) يغلق حامل العينة المسطح بسرعة باستخدام أربعة مسامير. ستبقى فجوة صغيرة بسبب سلك الإنديوم. ثم تتم إضافة البراغي الأخرى ، ويتم إغلاق حامل العينة ببطء عن طريق شد كل برغي برفق عدة مرات للسماح للإنديوم بالاسترخاء. (ب) يتم إغلاق حامل العينة المسطح بشكل صحيح عندما لا تكون هناك فجوة مرئية بين قاعدة الحامل والغطاء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S4: يتمركز حامل العينة فيما يتعلق بحزمة النيوترونات. تم وضع حامل عينة أسطواني على عصا العينة. يتم فحص موضع حامل العينة بحيث تصطدم الحزمة بالجزء السفلي من الحامل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S5: الاستحواذ على EFWS متبوعا ب QENS على IN16B مع NOMAD. (أ) يتم سحب وحدات التحكم ذات الصلة وإسقاطها في لوحة الإطلاق كما هو موضح في البروتوكول (الخطوات 3.4.1 إلى 3.4.3). قد يكون من الضروري النقر فوق القفل (الرمز الأخضر في الزاوية العلوية اليمنى - الجزء الرأسي) للتحكم في الواجهة. (ب) يتم سحب وحدات التحكم ذات الصلة وإسقاطها في لوحة الإطلاق كما هو موضح في البروتوكول (الخطوات 3.4.4 إلى 3.4.5). هنا ، يتم تسمية آخر وحدتي تحكم IN16DopplerSettings و Count. الاختصارات: QENS = تشتت النيوترونات شبه المرنة ، EFWS = عمليات مسح مرنة للنافذة الثابتة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S6: إعداد منحدر درجة الحرارة و E / IFWS على IN16B مع NOMAD. (أ) تتم إضافة وحدة التحكم FurnaceCryostat في لوحة الإطلاق وتكوينها كما هو موضح في البروتوكول (الخطوة 3.4.6). (B) تتم إضافة وحدة التحكم في الحلقة For في لوحة التشغيل ويتم إدخال وحدات التحكم ذات الصلة فيها وتكوينها كما هو موضح في البروتوكول (الخطوة 3.4.7). الاختصار: E / IFWS = عمليات مسح مرنة وغير مرنة للنوافذ الثابتة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S7: تشرح وظائف Bessel الخمس الأولى الكروية معظم المساهمة الدورانية لمياه الترطيب. يتم رسم أول ثماني دوال كروية Bessel باستخدام القيمة d = 0.98 Å وقيم نقل الزخم q من 0 إلى 3 Å (خطوط ملونة صلبة). يتم تحديد نطاق نقل الزخم البالغ 0.3 Å < q < 1.8 Å بالخطوط المنقطة الزرقاء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S8: يشكل الليزوزيم بشكل متكرر جسيمات. تم إذابة الليزوزيم في المخزن المؤقت للتجميع (تم إعداده كما هو موضح في البروتوكول ، الخطوة 1) ، وأضيف ThT إلى تركيز نهائي قدره 2 ميكرومتر لمراقبة تكوين بنية β المتقاطع باستخدام التألق. يمثل المخطط متوسط ثلاثة قياسات مستقلة ، وأشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري. يظهر الجزء الداخلي صورة مجهرية مضان للجسيمات المتكونة بعد 6 ساعات من التجميع. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. هذا الرقم من 5. اختصار: ThT = ثيوفلافين T. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S9: منحدر سريع لدرجة الحرارة كما هو متاح في IN16B. في الوضع السريع في IN16B ، يمكن زيادة درجة الحرارة من 280 كلفن إلى 363 كلفن في حوالي 30 دقيقة. هذا الرقم من 5. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S10: بيانات E / IFWS عن الليزوزيم أثناء التجميع إلى جسيمات. تم إذابة الليزوزيم في مخزن التجميع (الموصوف في مكان آخر5) ، وتم الحصول على E / IFWS طوال فترة التجميع ، والتي تم تشغيلها عن طريق زيادة درجة الحرارة إلى 90 درجة مئوية. يتم رسم تصحيح البيانات بعد الامتصاص بخلية فارغة والتطبيع باستخدام إشارة الفاناديوم مقابل نقل الزخم q والوقت لنقل الطاقة المختلف المقاس ، 0 μeV (أعلى اليسار) ، 0.6 μeV (أعلى اليمين) ، 1.5 μeV (أسفل اليسار) ، و 3 μeV (أسفل اليمين). لكل مخطط فرعي ، يتوافق المحور الرأسي مع إشارة التشتت S (q ، ΔE) ، المرسومة مقابل الوقت التجريبي بالساعات ونقل الزخم q. هذا الرقم من 5. الاختصار: E / IFWS = عمليات مسح مرنة وغير مرنة للنوافذ الثابتة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S11: تركيب بيانات مياه الترطيب في تاو. (أ) ملاءمة بيانات EFWS باستخدام Gaussian. تم إغلاق مسحوق H2O المائي لمونومرات تاو المثبطة في حامل عينة مسطح من الألومنيوم ، وتم الحصول على EFWS خلال منحدر درجة حرارة من 20 إلى 300 كلفن. تم رسم البيانات التجريبية (الإشارة المرنة S (q ، 0) على خط المحور الرأسي الأزرق مع أشرطة الخطأ) لنطاق نقل الزخم q 0.2 < q < 0.6 Å-1 جنبا إلى جنب مع Gaussian المجهز المستخدم لاستخراج MSD. (ب) الحركات الانتقالية والدورانية لمياه الإماهة التي تم الحصول عليها من تركيبات QENS. تم إغلاق مساحيق H2O المائية من ألياف تاو deuterated (يسار) والمونومرات (يمين) في حامل عينة مسطح من الألومنيوم ، وتم الحصول على بيانات QENS عند 280 كلفن. تم رسم البيانات التجريبية (شدة S (q، ω) كدالة لنقل الطاقة) للألياف (المثلثات الزرقاء) والمونومرات (النقاط الخضراء) جنبا إلى جنب مع النموذج المجهز (الخط الصلب الأسود) ومكوناته والخلفية (الأزرق) ووظيفة الدقة (الأخضر) والدوران (الأحمر) والترجمات (سماوي) لنقل الزخم q = 0.783 Å-1. هذا الرقم من 31. الاختصارات: QENS = تشتت النيوترونات شبه المرن ، EFWS = مسح النوافذ الثابتة المرنة ؛ MSD = متوسط الإزاحة التربيعية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التحليل الطيفي النيوتروني هو الطريقة الوحيدة التي تسمح بفحص ديناميكيات ps-ns ذات المتوسط الجماعي لعينات البروتين بغض النظر عن حجم البروتين أو تعقيد المحلول عند استخدام deuteration6. على وجه التحديد ، من خلال التحقيق في الانتشار الذاتي لمجموعات البروتين في المحلول ، يمكن تحديد الحجم الهيدروديناميكي لهذه التجميعات بشكل لا لبس فيه. ومع ذلك ، فإن الطريقة محدودة عادة بسبب التدفق النيوتروني المنخفض ، مما يعني أوقات اكتساب طويلة ومتطلبات كميات عالية من العينة (عادة 100 ملغ من البروتين) للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة خلال وقت الحزمة المخصص.

إعداد العينة (الخطوتان البروتوكوليتان 1 و 2). بالنسبة لعينات الحالة السائلة ، فإن الحد الأدنى للتركيز الذي يمكن استخدامه هو ~ 50 مجم / مل (يمكن استخدام تركيزات أقل على حساب أوقات الاستحواذ الممتدة). يرتبط تركيز البروتين العالي بمعدلات رجفان أسرع ، مما يساعد في تركيب القياس في وقت الحزمة المخصص ولكن يمكن أن يؤثر على مسار التجميع أيضا44. ومن ثم ، فإن توصيف العينة الشامل بطرق تكميلية ، مثل القوة الذرية أو المجهر الإلكتروني ، أمر ضروري.

مادة حامل العينة هي أيضا نقطة يجب معالجتها عند تحضير العينات لأن سبائك الألومنيوم عرضة للتآكل45. سبيكة الألومنيوم النموذجية التي تقدم مقاومة جيدة للتآكل ولها امتصاص نيوتروني منخفض هي المعيار الأوروبي (EN) AW-6060 [AlMgSi] المصنوع من 98٪ -98.75٪ Al ، 0.1٪ Ti ، 0.15٪ Zn ، 0.05٪ Cr ، 0.35٪ -0.6٪ Mg ، 0.1٪ Mn ، 0.1٪ Cu ، 0.1٪ -0.3٪ Fe ، و 0.3٪ -0.6٪ Si. يمكن تقليل التآكل على سبيل المثال عن طريق تقليل الوقت في حامل العينة أو استخدام طبقة واقية (والتي يمكن أن تضيف إلى إشارة الخلفية) مثل النيكل أو الذهب.

بالنسبة لعينات مسحوق البروتينات المهدرجة ، تبين أن إجراء التجفيف بالتجميد قد اكتمل بكفاءة بخطوة في مجفف في وجود مسحوق P2O5 لإزالة أكبر قدر ممكن من الماء الخفيف المتبقي35. بالنسبة لعينات المسحوق ، ينصح أيضا بتوصيف (باستخدام مجهر القوة الذرية وحيود مسحوق الأشعة السينية) المسحوق في حالته النهائية المائية وتقييم تأثير إزالة الترطيب والتجفيف بالتجميد وانتشار البخار على كل من حالات المونومر والألياف. على وجه الخصوص ، يمكن أن يؤدي التجفيف بالتجميد إلى كسر الألياف ، مما يؤدي إلى تقصير الأجزاء ، دون التأثير على التشكل. علاوة على ذلك ، لوحظ من خلال حيود طاقة الأشعة السينية أن التبريد البطيء ، بدلا من التبريد السريع في النيتروجين السائل ، يمكن أن يحفز وجود هياكل تشبه الأميلويد (نتيجة غير منشورة).

جمع البيانات (بروتوكول الخطوة 3). ينصح بالتخطيط لجمع البيانات مع جهة الاتصال المحلية قبل التجربة (حتى لو تمت مناقشتها أثناء عملية كتابة الاقتراح). تخضع خطة جمع البيانات للتغييرات بعد عمليات المسح الأولى ، اعتمادا على نسبة الإشارة إلى الضوضاء التي تم الحصول عليها. بالنسبة للتجارب التي تم حلها زمنيا على وجه الخصوص ، يسمح استخدام E / IFWS بجمع البيانات بسرعة - 30 ثانية إلى 1 دقيقة للخط المرن ، 4-5 دقائق لنقطة بيانات عند 3 μeV5 - لكن نطاق عمليات نقل الطاقة التي يمكن الوصول إليها محدود بطبيعته. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام متوسط منزلق لبيانات QENS46. تحقيقا لهذه الغاية ، يوفر خيار التحليل الطيفي الجديد للتشتت العكسي ووقت الطيران (BATS) في IN16B تدفقا أعلى من IN16B الكلاسيكي مع نطاق من الطاقة يبلغ ±150 μeV (أو أعلى اعتمادا على التكوين المستخدم) على حساب دقة أقل في الطاقة11. لذلك ، يوصى باستخدام خيار BATS للدراسات التي تم حلها بمرور الوقت ، خاصة لعمليات مثل تجميع الأميلويد ، والذي يحدث على مدار عدة ساعات.

تحليل البيانات (خطوات البروتوكول 4 و 5 و 6). تتضمن دالة التشتت S (q، ω) جميع أنواع الحركات في العينة ، والنماذج الموضحة في البروتوكول أعلاه تقريبية. على وجه الخصوص ، بالنسبة ل IDP في الحالة السائلة ، يمكن أن تحدث الحركات واسعة النطاق للسلسلة المضطربة على نفس الطول والنطاق الزمني مثل انتشار مركز الكتلة للبروتين بأكمله. ومن ثم ، يجب على المستخدم أن يضع في اعتباره أن فصل انتشار مركز الكتلة والديناميكيات الداخلية للبروتين ليس دائما واضحا. يمكن أن يستفيد إجراء التركيب من المعلومات المتعلقة بانتشار مركز الكتلة التي تم الحصول عليها عبر الطرق التكميلية ، بحيث يمكن إصلاح هذه المعلمة (مع الأخذ في الاعتبار أن الطرق الأخرى يمكن أن توفر معامل انتشار جماعي مرتبط بمقاييس زمنية وطول مختلفة) للحصول على نتيجة أكثر قوة للديناميكيات الداخلية.

بالإضافة إلى تشتت النيوترونات ، يمكن تمييز ديناميكيات النظام الجزيئي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، والذي يوفر معلومات محلية عن البروتينات ذات العلامات النظيرية وعلى نطاق واسع من الجداول الزمنية47،48،49. تم استخدام الطريقة بنجاح لدراسة أنظمة الأميلويد48،50،51،52،53 ولكنها لا تسمح للمستخدمين ببساطة بدراسة مياه الترطيب أو متابعة عملية تجميع الأميلويد في الوقت الفعلي بسبب القيود المتأصلة على حجم البروتين. التطورات الأخيرة في التحليل الطيفي بالرنين المغنطيسي للإلكترون (EPR) والطريقة المشتقة من EPR يوفر الاستقطاب النووي الديناميكي Overhauser (ODNP) منظورا جيدا عند دمجه مع تشتت النيوترونات. في الواقع ، على الرغم من وضع العلامات المغزلية الموجهة للموقع (SDSL) ، يمكن ل EPR و ODNP التحقيق في البروتين54 وديناميكيات الترطيب55 ، على التوالي ، على مقياس زمني ps-ns حول ملصق الدوران الذي تم تقديمه.

تم استخدام هذه الطرق لدراسة تجميع بروتين تاو56,57 وستوفر تكاملا كبيرا مع تشتت النيوترونات التي يمكنها الحصول على معلومات مماثلة ، ولكن في المتوسط على العينة بأكملها. علاوة على ذلك ، يمكن أن يوفر التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء معلومات ديناميكية للحركات عالية الطاقة المرتبطة بأنماط هيكلية محددة ، ولكن تعقيد بيئة البروتين (المخزن المؤقت المستخدم) يمكن أن يؤثر على تفسير البيانات58,59. توفر تقنيات التشتت العكسي للنيوترونات رؤية فريدة ومتكاملة لديناميكيات البروتين والماء المائي على مقياس الوقت ps-ns جنبا إلى جنب مع نتائج الطرق المذكورة أعلاه. لا تتطلب وضع علامات محددة على العينة ، وجودة الإشارة ليست حساسة لحجم البروتين ، ويمكن إجراء القياسات في الجسم الحي أو في بيئات معقدة للغاية مثل المحللة البكتيرية المثنوية3،6،7. نظرا لأن هذه الطريقة توفر نتيجة متوسطة المجموعة ، يتم استكمالها جيدا بمحاكاة الديناميات الجزيئية للحصول على معلومات تفصيلية ذرية عن النظام قيد الدراسة. يمكن التحقق من صحة عمليات المحاكاة بسهولة من خلال مقارنة مباشرة بين مجموعة البيانات التجريبية وأطياف QENS النظرية المحسوبة من مسار المحاكاة باستخدام برامج مثل mdanse60.

فيما يتعلق بأنظمة الأميلويد ، أثبت التشتت العكسي للنيوترونات أنه مفيد لتوصيف ديناميكيات البروتين والماء ps-ns لمختلف الأنظمة والظروف5،31،61،62،63،64. على وجه الخصوص ، تم استخدام التشتت العكسي للنيوترونات للكشف عن العلاقة بين نسبة تسلسل البروتين المتضمن في بنية β المتقاطع وسعة كسب إنتروبيا الماء عند الرجفان (نتائج غير منشورة). علاوة على ذلك ، يسمح تطوير بيئات العينات بالحصول المتزامن على أطياف النيوترونات وإما بيانات الاسترخاء العازل65 أو بيانات تشتت رامان66. علاوة على ذلك، توجد كاشفات الحيود في IN16B للحصول على البيانات الهيكلية جنبا إلى جنب مع البيانات الديناميكية. بالإضافة إلى ذلك ، من المتوقع تحسين تدفق النيوترونات الوارد لوضع BATS ل IN16B في المستقبل القريب ، وذلك بفضل استخدام ما يسمى بدليل التركيز المتغير ، والذي يمكن تكييف هندسته عند الطلب مع الإعداد الآلي المستخدم. إن دفع تطوير بيئة العينات المتطورة والأجهزة إلى أبعد من ذلك من شأنه أن يسمح بإجراء تجارب أكثر تعقيدا في المستقبل ، وربما تقديم المزيد من المعلومات الديناميكية والهيكلية في نفس الوقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

يعرب المؤلفون عن امتنانهم لميكايلا زامبوني من مركز يوليش لعلوم النيوترون في هاينز ماير لايبنيتز سنتروم ، جارشينج ، ألمانيا ، لجزء من تجارب تشتت النيوترونات التي أجريت على أداة SPHERES. وقد استفاد هذا العمل من أنشطة اتحاد مختبرات Deuteration (DLAB) الذي يموله الاتحاد الأوروبي بموجب العقدين HPRI-2001-50065 و RII3-CT-2003-505925 ، ومن النشاط الممول من مجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية في المملكة المتحدة (EPSRC) داخل معهد Laue Langevin EMBL DLAB بموجب المنح GR / R99393/01 و EP / C015452 / 1. الدعم المقدم من المفوضية الأوروبية في إطار البرنامج الإطاري السابع من خلال الإجراء الرئيسي: تعزيز منطقة البحوث الأوروبية ، يتم الاعتراف بالبنى التحتية البحثية [العقد 226507 (NMI3)]. يشكر كيفن بونوت وكريستيان بيك الوزارة الفيدرالية للتعليم والبحث (BMBF ، رقم المنحة 05K19VTB) على تمويل زمالات ما بعد الدكتوراه.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
  2. Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. Acta Crystallographica Section D. 74 (8), 715-726 (2018).
  3. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7 (2019).
  4. Martel, A., et al. Membrane permeation versus amyloidogenicity: A multitechnique study of islet amyloid polypeptide interaction with model membranes. Journal of the American Chemical Society. 139 (1), 137-148 (2017).
  5. Pounot, K., et al. Tracking internal and global diffusive dynamics during protein aggregation by high-resolution neutron spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (15), 6299-6304 (2020).
  6. Grimaldo, M., et al. Protein short-time diffusion in a naturally crowded environment. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (8), 1709-1715 (2019).
  7. Jasnin, M., Stadler, A., Tehei, M., Zaccai, G. Specific cellular water dynamics observed in vivo by neutron scattering and NMR. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10154-10160 (2010).
  8. Frick, B. The neutron backscattering spectrometer IN16 at ILL-high energy resolution with high intensity and excellent signal-to-noise ratio. Neutron News. 13 (2), 15-22 (2002).
  9. Frick, B., Mamontov, E., van Eijck, L., Seydel, T. Recent backscattering instrument developments at the ILL and SNS. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 224 (1-2), 33-60 (2010).
  10. Frick, B., Combet, J., van Eijck, L. New possibilities with inelastic fixed window scans and linear motor Doppler drives on high resolution neutron backscattering spectrometers. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 669, 7-13 (2012).
  11. Appel, M., Frick, B., Magerl, A. A flexible high speed pulse chopper system for an inverted neutron time-of-flight option on backscattering spectrometers. Scientific Reports. 8 (1), 13580 (2018).
  12. Squires, G. L. Introduction to the theory of thermal neutron scattering. , Dover Publications. Mineola N.Y. (1996).
  13. Bee, M. Quasielastic neutron scattering. , Available from: http://inis.iaea.org/Search/search.aspx?orig_q=RN:20038756 (1988).
  14. Singwi, K. S., Sjölander, A. Diffusive motions in water and cold neutron scattering. Physical Review. 119 (3), 863-871 (1960).
  15. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear diatomic liquids: i. free rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1279-1297 (1966).
  16. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear liquid: ii. hindered rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1299-1311 (1966).
  17. Schirò, G., et al. Translational diffusion of hydration water correlates with functional motions in folded and intrinsically disordered proteins. Nature Communications. 6, 6490 (2015).
  18. Grimaldo, M., et al. Hierarchical molecular dynamics of bovine serum albumin in concentrated aqueous solution below and above thermal denaturation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (6), 4645-4655 (2015).
  19. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 16 (11), 673-677 (1968).
  20. Bonar, L., Cohen, A. S., Skinner, M. M. Characterization of the Amyloid Fibril as a Cross-β Protein. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 131 (4), 1373-1375 (1969).
  21. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  22. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  23. Maji, S. K., et al. Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science. 325 (5938), 328-332 (2009).
  24. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  25. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. 28 (31), 6546-6561 (2016).
  26. Stephens, A. D., Kaminski Schierle, G. S. The role of water in amyloid aggregation kinetics. Current Opinion in Structural Biology. 58, 115-123 (2019).
  27. Adamcik, J., Mezzenga, R. Amyloid polymorphism in the protein folding and aggregation energy landscape. Angewandte Chemie International Edition. 57 (28), 8370-8382 (2018).
  28. Liu, Z., et al. Entropic contribution to enhanced thermal stability in the thermostable P450 CYP119. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10049-10058 (2018).
  29. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2018).
  30. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
  31. Fichou, Y., et al. Hydration water mobility is enhanced around tau amyloid fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), 6365-6370 (2015).
  32. Burns, J., Pennock, C. A., Stoward, P. J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. The Journal of Pathology and Bacteriology. 94 (2), 337-344 (1967).
  33. Iqbal, K., Liu, F., Gong, C. -X., Grundke-Iqbal, I. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies. Current Alzheimer Research. 7 (8), 656-664 (2010).
  34. Krȩżel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  35. Dolman, M., Halling, P. J., Moore, B. D., Waldron, S. How dry are anhydrous enzymes? Measurement of residual and buried 18O-labeled water molecules using mass spectrometry. Biopolymers. 41 (3), 313-321 (1997).
  36. Pounot, K. kpounotnPDyn: v3.0.0. Zenodo. , (2021).
  37. Yi, Z., Miao, Y., Baudry, J., Jain, N., Smith, J. C. Derivation of mean-square displacements for protein dynamics from elastic incoherent neutron scattering. Journal of Physical Chemistry B. 116 (16), 5028-5036 (2012).
  38. Peters, J., Kneller, G. R. Motional heterogeneity in human acetylcholinesterase revealed by a non-Gaussian model for elastic incoherent neutron scattering. The Journal of Chemical Physics. 139 (16), 165102 (2013).
  39. Zeller, D., Telling, M. T. F., Zamponi, M., García Sakai, V., Peters, J. Analysis of elastic incoherent neutron scattering data beyond the Gaussian approximation. The Journal of Chemical Physics. 149 (23), 234908 (2018).
  40. Roosen-Runge, F., Seydel, T. A generalized mean-squared displacement from inelastic fixed window scans of incoherent neutron scattering as a model-free indicator of anomalous diffusion confinement. EPJ Web of Conferences. 83, 02015 (2015).
  41. Ortega, A., Amorós, D., García de la Torre, J. Prediction of hydrodynamic and other solution properties of rigid proteins from atomic- and residue-level models. Biophysical Journal. 101 (4), 892-898 (2011).
  42. Hennig, M., Frick, B., Seydel, T. IUCr Optimum velocity of a phase-space transformer for cold-neutron backscattering spectroscopy. Journal of Applied Crystallography. 44 (3), 467-472 (2011).
  43. Paalman, H. H., Pings, C. J. Numerical evaluation of X-ray absorption factors for cylindrical samples and annular sample cells. Journal of Applied Physics. 33 (8), 2635-2639 (1962).
  44. Ow, S. -Y., Dunstan, D. E. The effect of concentration, temperature and stirring on hen egg white lysozyme amyloid formation. Soft Matter. 9 (40), 9692-9701 (2013).
  45. Tominaga, T., Sahara, M., Kawakita, Y., Nakagawa, H., Yamada, T. Evaluation of sample cell materials for aqueous solutions used in quasi-elastic neutron scattering measurements. Journal of Applied Crystallography. 54 (6), 1631-1640 (2021).
  46. Beck, C., et al. Following protein dynamics in real time during crystallization. Crystal Growth & Design. 19 (12), 7036-7045 (2019).
  47. Smith, A. A., Testori, E., Cadalbert, R., Meier, B. H., Ernst, M. Characterization of fibril dynamics on three timescales by solid-state NMR. Journal of Biomolecular NMR. 65 (3-4), 171-191 (2016).
  48. Wang, T., Jo, H., DeGrado, W. F., Hong, M. Water distribution, dynamics, and interactions with Alzheimer's β-amyloid fibrils investigated by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 139 (17), 6242-6252 (2017).
  49. Rezaei-Ghaleh, N., Giller, K., Becker, S., Zweckstetter, M. Effect of zinc dinding on β-amyloid structure and dynamics: Implications for Aβ aggregation. Biophysical Journal. 101 (5), 1202-1211 (2011).
  50. Vugmeyster, L., et al. Fast motions of key methyl groups in amyloid-β fibrils. Biophysical Journal. 111 (10), 2135-2148 (2016).
  51. Yang, X., Wang, B., Hoop, C. L., Williams, J. K., Baum, J. NMR unveils an N-terminal interaction interface on acetylated-α-synuclein monomers for recruitment to fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (18), (2021).
  52. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human α-synuclein. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (5), 409-415 (2016).
  53. Karamanos, T. K., Kalverda, A. P., Thompson, G. S., Radford, S. E. Mechanisms of amyloid formation revealed by solution NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 88-89, 86-104 (2015).
  54. Lai, Y. -C., Kuo, Y. -H., Chiang, Y. -W. Identifying protein conformational dynamics using spin-label ESR. Chemistry - An Asian Journal. 14 (22), 3981-3991 (2019).
  55. Franck, J. M., Han, S. Overhauser dynamic nuclear polarization for the study of hydration dynamics, explained. Methods in Enzymology. 615, 131-175 (2019).
  56. Pavlova, A., et al. Protein structural and surface water rearrangement constitute major events in the earliest aggregation stages of tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 127-136 (2016).
  57. Lin, Y., et al. Liquid-liquid phase separation of tau driven by hydrophobic interaction facilitates fibrillization of tau. bioRxiv. , (2020).
  58. Decatur, S. M. Elucidation of residue-level structure and dynamics of polypeptides via isotope-edited infrared spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 39 (3), 169-175 (2006).
  59. Chatani, E., Tsuchisaka, Y., Masuda, Y., Water Tsenkova, R. molecular system dynamics associated with amyloidogenic nucleation as revealed by real time near infrared spectroscopy and aquaphotomics. PLoS One. 9 (7), 101997 (2014).
  60. Goret, G., Aoun, B., Pellegrini, E. MDANSE: An interactive analysis environment for molecular dynamics simulations. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (1), 1-5 (2017).
  61. Fujiwara, S., et al. Internal dynamics of a protein that forms the amyloid fibrils observed by neutron scattering. Journal of the Physical Society of Japan. 82, Suppl A (2013).
  62. Schiró, G., et al. Neutron scattering reveals enhanced protein dynamics in concanavalin a amyloid fibrils. Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (8), 992-996 (2012).
  63. Pounot, K., et al. Zinc determines dynamical properties and aggregation kinetics of human insulin. Biophysical Journal. 120 (5), 886-898 (2021).
  64. Fujiwara, S., et al. Dynamic properties of human α-synuclein related to propensity to amyloid fibril formation. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3229-3245 (2019).
  65. Sanz, A., et al. High-pressure cell for simultaneous dielectric and neutron spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 89 (2), 023904 (2018).
  66. Adams, M. A., et al. Simultaneous neutron scattering and Raman scattering. Applied Spectroscopy. 63 (7), 727-732 (2009).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 182 ،
مطيافية نيوترونية عالية الدقة لدراسة ديناميكيات بيكو ثانية-نانوثانية للبروتينات ومياه الترطيب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pounot, K., Appel, M., Beck, C.,… More

Pounot, K., Appel, M., Beck, C., Weik, M., Schirò, G., Fichou, Y., Seydel, T., Schreiber, F. High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water. J. Vis. Exp. (182), e63664, doi:10.3791/63664 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter