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Biochemistry

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

중성자 후방 산란 분광법은 단백질과 단백질의 수화수의 ps-ns 역학에 대한 비파괴적이고 표지 없는 접근을 제공합니다. 워크플로우는 아밀로이드 단백질에 대한 두 가지 연구, 즉 응집 중 리소자임의 시간 분해 역학과 섬유 형성 시 타우의 수화 물 역학에 대한 연구로 제공됩니다.

Abstract

중성자 산란은 중수소 이외의 표지 없이 비파괴적인 방식으로 광범위한 에너지에 대한 샘플 내 역학을 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 특히, 중성자 후방 산란 분광법은 여러 산란 각도에서 산란 신호를 동시에 기록하며 ps-ns 시간 척도에서 생물학적 시스템의 역학을 연구하는 데 매우 적합합니다. D2O및 중수소화 완충액 성분을 사용함으로써, 이 방법은 액체 상태에서 단백질의 질량 중심 확산 및 골격 및 측쇄 운동(내부 역학)을 모두 모니터링할 수 있습니다.

또한, 수화수 역학은 H2O로 수화된 과중수소화 단백질 분말을 사용하여 연구할 수 있습니다. 이 논문은 단백질 및 수화수 역학을 조사하기 위해 Institut Laue-Langevin(ILL)의 IN16B 기기에 사용된 워크플로를 제시합니다. 증기 교환을 이용한 용액 시료 및 수화된 단백질 분말 시료의 제조에 대해 설명합니다. 단백질 및 수화수 역학에 대한 데이터 분석 절차는 중성자 후방 산란 분광계에서 얻을 수 있는 다양한 유형의 데이터 세트(준탄성 스펙트럼 또는 고정 창 스캔)에 대해 설명됩니다.

이 방법은 아밀로이드 단백질과 관련된 두 가지 연구로 설명됩니다. 리소자임이 μm 크기의 구형 응집체(미립자로 표시됨)로 응집되는 것은 IN16B에서 조사된 공간 및 시간 범위에서 1단계 공정으로 발생하는 것으로 나타났지만 내부 역학은 변하지 않았습니다. 또한, 타우의 수화수의 역학은 과중수소화 단백질의 수화된 분말에 대해 연구되었다. 물의 병진 운동은 아밀로이드 섬유의 형성시 활성화되는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 프로토콜의 중요한 단계는 다른 실험적 생물물리학적 방법과 관련하여 역학 연구와 관련하여 중성자 산란이 어떻게 위치하는지에 대해 논의됩니다.

Introduction

중성자는 기초 물리학에서 생물학에 이르기까지 다양한 분야의 샘플을 탐사하는 데 수년에 걸쳐 성공적으로 사용되어 온 전하가 없는 거대한 입자입니다1. 생물학적 응용을 위해, 소각 중성자 산란, 비탄성 중성자 산란, 중성자 결정학 및 반사 측정법이 광범위하게 사용된다 2,3,4. 비탄성 중성자 산란은 특정 표지 그 자체를 필요로 하지 않고 역학의 앙상블 평균 측정을 제공하며, 크기 또는 단백질에 의존하지 않는 신호 품질을 제공한다5. 측정은 중수소화 박테리아 용해물 또는 생체 내 3,6,7과 같은 세포내 배지를 모방하는 연구 중인 단백질에 대해 매우 복잡한 환경을 사용하여 수행할 수 있습니다. 역학을 연구하기 위해 다양한 실험 설정, 즉 i) sub-ps-ps 역학에 대한 비행 시간 액세스 제공, ii) ps-ns 역학에 대한 후방 산란 제공 액세스 및 iii) ns에서 수백 ns까지의 역학에 대한 스핀 에코 제공 액세스. 중성자 후방 산란은 브래그의 법칙 2d sinθ = nλ를 사용하며, 여기서 d는 결정에서 평면 사이의 거리, θ는 산란 각도, n은 산란 차수, λ는 파장입니다. 검출기를 향한 후방 산란을 위해 크리스털을 사용하면 일반적으로 ~0.8μeV의 높은 에너지 분해능을 달성할 수 있습니다. 에너지 교환을 측정하기 위해, 후방 산란에서 크리스털을 운반하는 도플러 드라이브를 사용하여 들어오는 중성자 파장8,9,10을 정의하고 조정하거나(그림 1), 에너지 분해능을 감소시키는 대가로 ToF(Time-of-Flight) 설정을 사용할 수 있다(11).

Figure 1
그림 1: 도플러 드라이브가 있는 중성자 후방 산란 분광계의 스케치. 인입 빔은 위상 공간 변환(PST) 초퍼(42)에 부딪히고, 이는 샘플 위치에서의 플럭스를 증가시킨다. 그런 다음 에너지 E1(청록색 화살표)을 선택하는 도플러 드라이브에 의해 샘플을 향해 후방 산란됩니다. 그런 다음 중성자는 샘플에 의해 산란되고(화살표 색상으로 표시되는 다른 에너지로) Si 111 결정으로 만들어진 분석기는 특정 에너지 E0(여기서는 빨간색 화살표)를 가진 중성자만 후방 산란합니다. 따라서, 운동량 전달 q는 검출기 어레이 상의 중성자의 검출 위치로부터 얻어지고, 에너지 전달은 차이E1-E0로부터 얻어진다. PST에 의해 생성된 중성자 펄스에 대해 예상되는 비행 시간은 검출기 튜브를 향해 직접 산란된 중성자의 신호를 버리는 데 사용됩니다. 약어: PST = 위상 공간 변환. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

후방 산란 분광법의 경우, 단백질과 같은 수소 양성자가 풍부한 샘플의 신호에 대한 주요 기여는 비간섭성 산란에서 비롯되며, 이에 대해 산란 강도 Sinc(q, ω)는 Eq (1)12로 표시됩니다

Equation 1 (1개)

여기서σ inc는 고려된 요소의 비간섭성 단면이고, k'는 산란된 파동 벡터의 노름이고, k는 들어오는 파동 벡터의 노름이고, q(= k - k')는 운동량 전달, r j(t)는 시간 t에서 원자 j의 위치 벡터이고, ω는 들어오는 중성자와 시스템 사이의 에너지 전달에 해당하는 주파수입니다. 꺾은 괄호는 앙상블 평균을 나타냅니다. 따라서 비간섭성 산란은 시간에 따른 원자 위치의 앙상블 평균 단일 입자 자기 상관을 조사하고 시스템의 모든 원자와 다른 시간 기원(앙상블 평균)에 대한 자체 역학 평균을 제공합니다. 산란 함수는 중간 산란 함수 I(q, t)의 시간에서의 푸리에 변환이며, 이는 Eq (2)에 의해 표시된 van Hove 상관 함수의 공간에서의 푸리에 변환으로 볼 수 있습니다.

Equation 2 (2개)

여기서 ρ(r,t)는 위치 r과 시간 t 13에서 원자를 찾을 확률 밀도입니다.

Fickian 확산 과정의 경우, γ = Dq2로 주어진 선폭의 로렌치안으로 구성된 산란 함수에서 이중 푸리에 변환 후 자기 확산 함수 결과(Eq (3) 참조)가 발생합니다.

Equation 10 (3)

ps-ns 내부 단백질 역학14에 대한 Singwi 및 Sjölander의 점프 확산 모델 또는 수화수15,16,17에 대한 Sears의 회전 모델과 같이 보다 정교한 모델이 개발되어 유용한 것으로 나타났습니다.

프랑스 그르노블의 ILL에 있는 중성자 후방 산란(NBS) 기기 IN16B 8,9(보충 그림 S1)에서 단백질과 함께 일반적으로 사용되는 설정은 들어오는 파장을 조정하기 위한 도플러 드라이브가 있는 분석기용 Si 111 결정으로 구성되며(보충 그림 S2A), 이에 따라 ~0.2 Å-1 -30 μeV의 에너지 전달 범위에 대한 액세스를 제공합니다< Equation 3 < 30 μeV - 몇 ps에서 몇 ns 범위의 시간 척도 및 몇 Å의 거리에 해당합니다. 또한 IN16B는 고정 에너지 전송에서 데이터 수집을 포함하는 탄성 및 비탄성 고정 창 스캔(E/IFWS)10을 수행할 수 있는 가능성을 제공합니다. 중성자로 작업할 때 플럭스가 제한되기 때문에 E/IFWS를 사용하면 한 번의 에너지 전달에 대해 플럭스를 최대화할 수 있으므로 만족스러운 신호 대 잡음비를 얻는 데 필요한 획득 시간을 줄일 수 있습니다. 보다 최근의 옵션은 후방 산란 및 비행 시간 분광계(BATS) 모드(11)로, 도플러 드라이브보다 더 높은 플럭스로 광범위한 에너지 전달(예: -150μeV < < Equation 3 150μeV)을 측정할 수 있지만 에너지 분해능은 더 낮습니다(보충 그림 S2B).

중성자 산란의 중요한 특성은 incoherent 단면σ inc가 중수소보다 수소에 대해 40배 더 높은 값을 가지며 생물학적 샘플에서 일반적으로 발견되는 다른 원소에 대해서는 무시할 수 있다는 것입니다. 따라서, 액체 환경에서 단백질의 역학은 중수소화 완충액을 사용하여 연구 할 수 있으며, 분말 상태는 D 2 O로 수화 된 수소화 단백질 분말을 사용한 단백질 내부 역학 연구 또는 H2O로 수화 된 과중수소화 단백질 분말에 대한 수화수 연구를 허용합니다. 액체 상태에서, 중성자 후방 산란은 전형적으로 단백질의 질량 중심 자기 확산 (Fickian-type diffusion)과 그 내부 역학에 동시에 접근 할 수있게한다. 후자는 일반적으로 소위 점프 확산 모델 또는 기타 3,18에 의해 설명되는 백본 및 사이드 체인 운동입니다. 수소화 단백질 분말에서는 단백질 확산이 없으며 내부 역학만 모델링하면 됩니다. 수화수의 경우, 물 분자의 병진 및 회전 운동의 기여도는 운동량 전달 q에 대한 다른 의존성을 나타내며, 이는 데이터 분석 프로세스17에서 구별할 수 있습니다.

이 논문은 전개될 수 있는 것으로 밝혀진 단백질에 대한 연구와 함께 중성자 후방 산란 방법을 설명하고, 소위 교차 β 패턴19,20이라고 하는 β가닥 스택으로 구성된 표준 형태로 응집되고 길쭉한 섬유를 형성합니다. 이것은 소위 아밀로이드 응집체이며, 이는 알츠하이머 병이나 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 질환에서 중심적인 역할을하기 때문에 광범위하게 연구되고 있습니다21,22. 아밀로이드 단백질에 대한 연구는 또한 아밀로이드 단백질이 할 수 있는 기능적 역할에 의해 동기가 부여된다23,24 또는 새로운 생체 재료 개발에 대한 높은 잠재력 25. 아밀로이드 응집의 물리 화학적 결정 인자는 불분명하며, 지난 몇 년 동안 엄청난 진전이 있었음에도 불구하고 아밀로이드 응집에 대한 일반적인 이론은 없다21,26.

아밀로이드 응집은 시간에 따른 단백질 구조와 안정성의 변화를 의미하며, 이에 대한 연구는 자연적으로 단백질 형태 안정성, 단백질 기능 및 단백질 에너지 환경과 관련된 역학을 의미한다27. 동역학은 가장 빠른 운동(28)에 대한 엔트로피 기여를 통해 특정 상태의 안정성과 직접적으로 연결되며, 단백질 기능은 빛에 민감한 단백질(29 )에 대한 sub-ps에서 도메인 운동에 대한 ms에 이르기까지 다양한 시간 척도의 운동에 의해 유지될 수 있으며, 이는 피코초-나노초 역학(30)에 의해 촉진될 수 있다.

아밀로이드 단백질을 연구하기 위해 중성자 후방 산란 분광법을 사용하는 두 가지 예가 제시될 것인데, 하나는 단백질 역학을 연구하기 위해 액체 상태에서, 다른 하나는 수화 물 역학을 연구하기 위해 수화된 분말 상태입니다. 첫 번째 예는 리소자임을 μm 크기의 구체(미립자라고 함)로 응집하는 것과 관련이있으며, 두 번째 예는 인간 단백질 타우(tau)의 천연 상태와 응집 상태에서의 물 역학 비교에 관한 것이다31.

리소자임은 면역 방어에 관여하는 효소로 129개의 아미노산 잔기로 구성되어 있습니다. 리소자임은 10.5의 pD 및 90°C의 온도에서 중수소화 완충액에서 미립자를 형성할 수 있습니다. 중성자 산란을 통해 우리는 리소자임의 질량 중심 확산 계수의 시간 진화가 티오플라빈 T 형광(아밀로이드 교차 β 패턴32의 형성을 모니터링하는 데 사용되는 형광 프로브)의 단일 지수 동역학을 따른다는 것을 보여주었으며, 이는 형성 미립자 상부 구조와 교차 β 패턴이 동일한 속도로 단일 단계에서 발생함을 나타냅니다. 또한, 내부 역학은 응집 과정 전반에 걸쳐 일정하게 유지되었으며, 이는 NBS 기기에서 관찰할 수 없는 빠른 구조적 변화 또는 응집 시 단백질 내부 에너지의 유의미한 변화가 없는 것으로 설명할 수 있습니다.

인간 단백질 타우(tau)는 소위 2N4R 이소형(isoform)을 위한 441개의 아미노산으로 구성된 본질적으로 무질서한 단백질(IDP)로, 특히 알츠하이머병에 관여한다33. 과중수소화된 단백질 타우의 분말에 중성자 후방 산란을 사용하여, 우리는 수화 물 역학이 섬유 상태에서 증가하고, 더 많은 물 분자 집단이 병진 운동을 겪는다는 것을 보여주었습니다. 결과는 수화수 엔트로피의 증가가 타우의 아밀로이드 세동을 유발할 수 있음을 시사합니다.

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Protocol

1. 액체 상태의 단백질에 대한 중수소화 완충액 준비

  1. 완충액의 모든 성분을 순수한D2O에 용해시킨다.
  2. pH 전극을H2O로 보정한 경우, NaOD 또는DCl34를 사용하여 pD = pH + 0.4 공식에 따라 pD를 조정하였다.
    참고: H2O대신 D2O를 사용하면 단백질 용해도에 영향을 미칠 수 있으며 완충액 조건을 조정해야 할 수도 있습니다(예: 염 농도의 약간의 변화).

2. 과중수소화 단백질의H2O-수화 분말을 준비합니다

  1. 샘플 홀더를 준비합니다.
    1. 인듐 와이어 씰과 나사로 평평한 알루미늄 샘플 홀더를 물과 에탄올로 철저히 청소하고 건조시킵니다.
      알림: 평평한 샘플 홀더는 분말이 표면에 균일하게 분포될 수 있도록 사용됩니다. 분말의 양은 벽 사이에 유지될 수 있고 샘플 홀더를 수직으로 놓을 때 떨어지지 않도록 충분해야 합니다.
    2. 샘플 홀더의 다른 부분(바닥, 뚜껑 및 인듐 와이어)을 정밀 저울에서 개별적으로 칭량합니다.
    3. 샘플 홀더 하단 부분의 홈에 1mm 인듐 와이어 씰을 놓고 두 끝이 결합되는 부분에 작은 겹침을 남깁니다(그림 2A).
    4. 적절한 양의 동결건조된 단백질(일반적으로 ~100mg의 단백질)을 넣어 샘플 홀더의 바닥 부분의 내부 표면을 채우도록 합니다.
  2. 단백질 분말을 수화하십시오.
    1. 샘플 홀더를P2O5분말이 들어 있는 페트리 접시에 24시간 동안 두어 단백질 분말(35)을 완전히 건조시켰다(도 2B). 인듐 시일 및 건조 분말을 함유하는 샘플 홀더의 건조 바닥 부분을 칭량하여m건조물을 얻는다.
      주의 : P2O5 분말은 부식성이 매우 강합니다.
    2. 데시케이터로부터P2O5를 제거하고, 내부에D2O가 있는 페트리 접시를넣는다. 분말의 질량을 규칙적으로 제어하여 수화 수준 h = m hyd / m dry를 확인하며, 여기서 mhyd 및 mdry는 각각 수화 분말 및 건조 분말의 질량입니다.
      알림: 인슐린과 같이 소수성이 높은 단백질의 경우 더 높은 증기압을 얻고 원하는 수화 수준 h에 도달하기 위해 데시케이터 내부의 온도를 높여야 할 수 있습니다.
    3. 2.2.1단계와 2.2.2단계를 세 번 이상 반복하여 교환 가능한 모든 수소를 중수소로 적절하게 변환합니다.
      참고: 대안적으로, 순수한D2O에서의 동결건조 및 용해 주기는 단백질이 그것에 의해 영향을 받지 않는 한 더 나은 H/D 교환을 위해 사용될 수 있습니다.
    4. 분말을 원하는 수준보다 약간 높게 수화하고, 인듐 와이어와 수화된 분말이 있는 샘플 홀더의 바닥 부분을 정밀 저울에 유지하고, 질량이 목표 h를 얻기 위해 원하는 값으로 천천히 감소할 때까지 기다립니다(중간 크기의 구형 단백질이 하나의 완전한 수화 층으로 덮여야 하는 경우 일반적으로 0.2-0.4).
    5. 뚜껑을 바닥에 빠르게 놓고 먼저 4개의 나사로 샘플 홀더를 닫아 증기 교환을 중지합니다(보충 그림 S3A).
    6. 바닥 부분과 뚜껑 사이에 틈이 보이지 않을 때까지 나머지 나사를 모두 놓고 조입니다(보충 그림 S3B).
    7. 밀봉된 샘플 홀더의 무게를 측정하여 중성자 실험 후 누출로 인한 잠재적인 수화 손실이 있는지 확인합니다.

3. 비간섭성 중성자 산란 실험 수행

  1. 할당된 빔 시간 몇 주 전에 현지 담당자와 실험에 필요한 기기 구성에 대해 논의하고 다시 확인합니다.
  2. 액체 상태 샘플을 준비합니다.
    1. 중수소화 완충액에 단백질을 용해시킵니다.
    2. 물을 사용하여 샘플 홀더에 넣을 적절한 양의 액체를 결정합니다(샘플 홀더가 닫힐 때 오버플로가 없는지 확인하십시오. 그림 2C).
      알림: 다음 단계(3.3 및 3.4)는 ILL16에서 NBS 분광계 IN8,9B에서 극저온로를 사용하여 수행된 실험을 설명합니다.amp르 환경. 기기 제어 시스템은 기기마다 변경되지만 작동 원리는 동일하게 유지됩니다.
  3. 샘플을 삽입합니다.
    1. 샘플 스틱을 완전히 건조시키고(그림 2D), 재료를 취급하기 전에 전리 방사선량이 100μSv/h보다 낮은지 확인한 후(ILL에서) 이전 샘플을 제거합니다(있는 경우).
    2. 샘플을 배치하고 빔 중심을 기준으로 센터링이 적절한지 확인하고(보충 그림 S4), 샘플 스틱을 극저온로에 삽입합니다(그림 2D). 진공 펌프를 켜서 10-3bar 미만에 도달하고 대기압에 도달할 때까지 극저온 용광로에 헬륨 가스를 채우고 진공 펌프를 사용하여 가스를 다시 제거하는 세 번 반복하여 극저온 용광로 내부의 공기를 씻어냅니다.
      알림: 평평한 샘플 홀더의 경우 샘플 홀더는 들어오는 빔에 대해 45° 각도로 향해야 합니다. 유용한 운동량 전달 범위는 세포에 의한 흡수 및 산란으로 인해 감소될 수 있습니다. 카드뮴과 같은 강력한 중성자 흡수제는 샘플 홀더의 특정 부분(예: 나사, 두꺼운 부품)을 마스킹하는 데 사용할 수 있습니다.
    3. 압력이 ~0.05bar가 되도록 극저온로에 약간의 헬륨 가스를 주입합니다.
  4. 데이터 수집(예: ILL에서 IN16B의 NOMAD를 사용하여 사용자가 준탄성 중성자 스펙트럼(QENS) 스펙트럼을 획득하기 전에 200K의 온도를 선호한다고 가정하고, 그 다음 분당 0.5K에서 310K로 온도 상승 동안 E/IFWS를 선호하고 마지막으로 310K에서 QENS를 선호한다고 가정합니다.
    1. NOMAD를 사용하여 실행 탭에서 FurnaceCryostat 컨트롤러를 Launch Pad로 끌어다 놓습니다. 온도를 200K로 설정합니다. 온도가 안정화될 시간이 있도록 빠른 모드와 30분의 시간 초과를 사용합니다. 회전하는 화살표 아이콘을 클릭하여 백그라운드에서 실행하여 온도가 감소하는 동안 데이터를 얻을 수 있습니다.
    2. IN16DopplerSettings 컨트롤러를 끌어다 놓고 속도 프로를 설정하십시오.file 최대 ΔE로 설정된 정확한 속도, 0.00μeV 값 및 128개 채널로 EFWS 구성을 얻습니다.
    3. 카운트 컨트롤러를 드래그 앤 드롭하고, 데이터를 쉽게 식별할 수 있는 이름으로 자막 필드를 채우고, 30초 스캔의 60회 반복을 설정합니다(보충 그림 S5A).
    4. IN16DopplerSettings 컨트롤러를 드래그 앤 드롭하고 속도 프로를 설정합니다.file 4.5m/s 및 2,048개 채널 값으로 Speed로 설정된 사인으로 QENS 구성을 얻습니다.
    5. 30분 스캔을 4회 반복하여 Count 컨트롤러를 끌어다 놓습니다(보충 그림 S5B).
    6. 온도 r의 경우amp, FurnaceCryostat 컨트롤러를 끌어다 놓고 온도를 310K로 설정하고 R을 Δ = 0.05K 및 6초로 설정하여 R을 SetPoint로 설정합니다. 220분 중 시간을 사용합니다(보충 그림 S6A).
    7. 65회 반복되는 for 루프를 사용합니다. 내부에 3.4.2단계와 같이 IN16DopplerSettings 컨트롤러를 삽입한 다음 30초를 한 번 계산합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 IN16DopplerSettings를 삽입하되 1.5μeV 및 1,024채널의 에너지 오프셋을 사용한 다음 3분의 단일 카운트를 사용합니다(보충 그림 S6B).
    8. 310K에서 마지막 QENS를 획득하려면 각각 3.4.4 및 3.4.5단계에 설명된 대로 구성된 IN16DopplerSettings 및 Count 컨트롤러를 끌어다 놓습니다.
    9. 시작 버튼(창 하단의 오른쪽 삼각형)을 눌러 스크립트를 실행합니다.
      참고: 모든 실험에는 보정 데이터 수집이 필요합니다. 즉, 빼기 또는 흡수 보정을 위한 빈 셀, 배경을 모델링하는 데 사용되는 다양한 온도의 버퍼 단독, 바나듐 측정(또는 이에 상응하는 10K 이하의 온도의 샘플)을 사용하여 기기의 분해능 함수를 얻습니다.

4. 데이터 분석 - QENS

  1. Python 소프트웨어 nPDyn v3.x36에서 'IN16B_QENS.process()' 메서드를 사용하여 데이터 세트를 가져옵니다.
    nPDyn.dataParsers에서 >>>> 가져 오기 IN16B_QENS

    >>> 샘플 = IN16B_QENS(
    ... <데이터 파일의 경로>
    ... [detGroup=... 체재>]
    ... ). 프로세스()

    >>> 샘플 = sample.get_q_range(0.3, 1.8)
  2. 다음 명령을 사용하여 데이터 수정(선택 사항)을 수행합니다(자세한 내용은 nPDyn 설명서, 그림 3 참조).
    #it 빈 셀, 바나듐 및 버퍼에 대한 데이터가
    # 'empty_cell', '바나듐'이라는 데이터 세트에서 이미 가져 왔습니다.
    # 및 'buffer'를 각각 사용합니다.

    # 배율 인수가 있는 빈 셀 빼기
    # (오류가 자동으로 전파됨)
    >>> 샘플 = 샘플 - 0.95 * empty_cell

    # Paalman-Ping 계수를 사용한 보정
    # (위의 예와 함께 사용할 수 없음)
    >>> 샘플 = sample.absorptionCorrection(empty_cell)

    # 정규화
    >>> 샘플 = sample.normalize(바나듐)

    # 관찰 가능한 축을 따라 비닝
    # observable은 여기서 집계 시간입니다.
    >>> 샘플 = 샘플.bin(3, 축=0)
  3. 교정 데이터를 맞춥니다. 데이터 세트-샘플, 빈 셀, 중수소화 버퍼(필요한 경우) 및 바나듐은 내장 모델 또는 사용자 정의 모델을 사용하여 장착할 수 있습니다(nPDyn 문서 참조).
    nPDyn.models.builtins 가져오기에서 >>>(
    ... 모델PVoigt,
    ... 모델물,
    ... 모델캘리브레이션D2O,
    ...     )

    # 내장 모델은 모멘텀의 열 벡터를 사용합니다.
    # Q 값 전송
    >>> q = 바나듐.q[:, 없음]

    # 바나듐은 pseudo-Voigt 프로파일을 사용하여 장착됩니다.
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. 'modelWater'라는 수화수에 내장된 모델을 사용합니다. 이 모델은 Eq (4)17에 표시된 대로 읽습니다.
    Equation 4 (4개)
    여기서0,r 및t 는 각각 탄성 신호, 회전 운동 및 병진 운동의 상대적 기여를 설명하는 스칼라입니다. j1(qd)는 l차 구형 베셀 함수이고 q는 운동량 전달입니다. d 물 분자 내의 OH 거리; δ(ω)는 디랙 델타이며, 여기서 EISF를 곱합니다. N은 사용된 구형 베셀 함수의 가장 높은 차수입니다(일반적으로 ~5). Equation 5 는 각각 로렌치안 회전 운동과 병진 운동입니다. b(q)는 Equation 11 평평한 배경 항입니다. 구형 베셀 함수는 물 분자의 각 각운동량 상태의 상대적 기여도를 제공하며, 숫자 N은 운동량 전달 q-범위에 따라 결정됩니다. 전형적인 NBS 분광계의 경우, N=4까지의 항은 신호를 거의 완전히 설명한다(보충 그림 S7).
    # 여기서, 수학식 2는 수화수에 사용된다
    # 분해능 함수와 추가
    # D2O 배경은 자동으로 수행됩니다.
    # 제공된 인수
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=바나듐,
    ... bkgd=버퍼,
    ... volume_fraction_bkgd=0.95
    ... )
    참고: 회전 및 병진 운동의 기여도는 완벽하게 엄격하도록 복잡해야 합니다. 첨가제 모델의 성공은 단백질 표면에 뚜렷한 물 집단이 존재하고 접근 가능한 제한된 에너지 범위에 기인합니다.
  5. 다음을 사용하여 데이터를 플로팅합니다(그림 4).
    nPDyn.plot 가져 오기 플롯에서 >>>
    >>> 플롯(샘플)

5. 데이터 분석 - 온도 램프, 탄성 고정 창 스캔(EFWS)

  1. 섹션 4와 유사한 절차를 사용하여 최저 온도(일반적으로 10K)의 신호로 온도 램프 데이터를 정규화합니다.
    nPDyn.dataParsers 가져 오기 IN16B_FWS에서 >>>

    >>> 샘플 = IN16B_FWS(
    ... <데이터 파일 경로>,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ). 프로세스()

    # 관찰 가능 개체의 첫 번째 점 5개로 정규화
    # 온도에 해당하는 축
    >>> 샘플 /= 샘플[:5].mean(0)

    # 여기에 사용된 모멘텀 전달 Q 범위는 더 작습니다.
    # 사용된 모델은 낮은 Q에만 유효하므로
    >>> 표본 = sample.get_q_range(0.2, 0.8)
  2. 간단한 가우스 모델을 사용하여 시작하며, 너비는 소위 평균 제곱 변위(MSD)로 제공됩니다. 다음 명령을 사용하여 모델을 빌드하고 피팅합니다.
    >>> numpy를 np로 가져 오기
    nPDyn.models에서 >>> 매개변수, 모델, 구성요소 가져오기

    # a는 배율 인수입니다.
    >>> 매개변수 = 매개변수(
    ... a={'값': 1, '범위': (0, np.inf)},
    ... msd={'값': 1, '범위': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> 모델 = 모델(매개변수)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... '가우시안',
    ... 람다 X, A, MSD: A * NP.EXP(-X ** 2 * MSD / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, 없음])

    >>> 플롯(샘플)
    참고: 가우스 근사는 항상 q2MSD << 1에 대해 유지되지만 샘플 간의 상대적 비교를 위해 더 넓은 운동량 전달 범위를 사용할 수 있습니다. 가우스 근사를 뛰어 넘는보다 정교한 모델이 개발되었습니다37,38,39.

6. 데이터 분석 - 탄성 및 비탄성 고정 창 스캔(E/IFWS)

  1. 4단계와 유사하게 'IN16B_FWS' 클래스를 사용하여 데이터 세트를 가져옵니다.
    nPDyn.dataParsers 가져 오기 IN16B_FWS에서 >>>

    >>> 샘플 = IN16B_FWS(
    ... <데이터 파일의 경로>
    ... [detGroup=]
    ... ). 프로세스()

    >>> 샘플 = sample.get_q_range(0.3, 1.8)
  2. 교정 데이터와 샘플 데이터를 피팅합니다.
    1. 일반화된 MSD40 을 사용하거나 E/IFWS 데이터를 대략적인 QENS 스펙트럼(에너지 축에 몇 개의 데이터 포인트만 있음)으로 간주하여 분석합니다. E/IFWS를 대략적 QENS로 볼 때 QENS에 사용되는 모델은 전체 E/IFWS 데이터 세트를 한 번에 맞추는 데 사용됩니다(에너지 전달 및 운동량 전달의 글로벌 적합도).
      참고: E/IFWS 데이터의 QENS에 대한 후자의 솔루션 사용 모델은 질량 중심 확산 및 단백질 내부 역학의 운동량 전달 의존성이 부과되는 경우에 사용됩니다.
    2. 다음 Eq (5) (nPDyn의 'modelProteinJumpDiff')를 사용하여 액체의 단백질 역학을 모델링합니다.
      Equation 6 (5개)
      여기서 R(q,ω)는 분해능 함수입니다. β 각 운동량 전달 q에 대해 독립적인 스칼라입니다. a0는 탄성 비간섭성 구조 인자(EISF)이고; Equation 7 Eq(6)에 의해 주어진 너비를 갖는 질량 중심 확산에 대한 Lorentzian 설명; Equation 12 는 질량 중심 확산 및 내부 역학을 설명하는 점프 확산 모델14에 따른 기여를 포함하는 로렌치안입니다(Eq(7); Equation 8 샘플의 부피 분율에 의해 재조정된D2O의 적합 신호입니다.
      γ = Dsq2 (6)
      DS는 자기 확산 계수입니다.
      Equation 9 (7)
      Di는 내부 동역학에 대한 겉보기 확산 계수이고 τ는 확산 운동에 대한 이완 시간입니다.
      nPDyn.models.builtins 가져오기에서 >>>(
      ... 모델PVoigt,
      ... 모델ProteinJumpDiff,
      ... 모델캘리브레이션D2O,
      ... )

      # 내장 모델은 모멘텀의 열 벡터를 사용합니다.
      # Q 값 전송
      >>> q = 바나듐.q[:, 없음]

      # 바나듐은 pseudo-Voigt 프로파일을 사용하여 장착됩니다.
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # 순수 D2O의 경우, 선폭이 보정된 모델
      # 다른 온도에 대한 nPDyn에 포함됩니다.
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # 여기서 방정식 3은 액체 샘플에 사용됩니다
      # 분해능 함수와 추가
      # D2O 배경은 # 제공된 인수로 자동으로 수행됩니다.
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=바나듐,
      ... bkgd=버퍼,
      ... volume_fraction_bkgd=0.95
      ... )
  3. 다음을 사용하여 적합된 데이터를 플로팅합니다.
    nPDyn.plot 가져 오기 플롯에서 >>>
    >>> 플롯(샘플)

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Representative Results

리소자임의 미립자 응집은 중수소화 완충액(pD 10.5에서 0.1M NaCl)에서 50mg/mL의 단백질 농도로 90°C에서 수행되었습니다. 미립자의 형성은 90°C로의 온도 상승에 의해 촉발되고 6시간 이내에 발생합니다(보충 그림 S8). 데이터 수집은 위의 프로토콜에 설명된 대로 IN16B에서 수행되었습니다(데이터는 ILL에 의해 영구적으로 큐레이팅되고 http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811 에서 액세스할 수 있음).

초기 상태를 완전히 특성화하기 위해 7°C에서 QENS 스펙트럼을 획득했습니다. 이어서, 응집 과정을 트리거하기 위해 온도를 90°C(일반적으로 IN16B에서 ~30분 소요, 보충 그림 S9)로 증가시켰습니다. QENS 스펙트럼의 슬라이딩 평균을 사용하여 동역학을 따를 수 있으므로 전체 범위의 에너지 전달에 액세스할 수 있지만 시간 분해능은 제한적입니다. 시간 분해능은 EFWS를 사용하여 ~1분으로, E/IFWS를 사용하여 4개의 에너지 전달 값에서 ~20분으로 개선할 수 있습니다5.

제시된 예에서 우리는 0, 0.6, 1.5 및 3 μeV의 에너지 전달을 탐구했습니다. 응집 과정에서 E/IFWS 스캔이 연속적으로 수집되고 90°C에서 최종 상태에 대한 QENS 스펙트럼이 수집되었습니다. E/IFWS 데이터는 빈 셀의 E/IFWS를 사용하여 흡수에 대해 보정되고 바나듐 데이터를 사용하여 정규화되었습니다.

라이소자임 E/IFWS의 경우, 낮은 운동량 전달 및 낮은 에너지 전달에서 시간에 따라 신호가 증가하는 반면, 높은 에너지 전달 및 낮은 운동량 전달에서 신호는 감소하는 것을 관찰합니다(보충 그림 10). 이 정성적 관찰은 더 큰 물체의 형성을 나타내며 더 천천히 확산되고 응집 과정이 발생했음을 확인합니다. Eq (4)에 따른 분석은 작은 단백질 클러스터의 존재와 일치하여 15 Å2 / ns의 초기 질량 중심 확산 계수 (동적 광 산란 및 HYDROPRO 계산 5,41에 의해 지원됨)를 초래 한 다음 시간이 지남에 따라 기하 급수적으로 감소합니다 (그림 5). 내부 동역학에 대한 겉보기 확산 계수는 응집 과정 전반에 걸쳐 일정하게 유지됩니다. 따라서 리소자임 미립자의 형성은 단일 응집 단계에서 발생하는 것으로 보입니다. 내부 단백질 역학의 변화가 없다는 것은 교차 β으로의 전환 및 가능한 관련 에너지 변화가 너무 빠르거나 용매 엔트로피의 증가와 같은 다른 구동 효과가 조사된 에너지 범위 내에서 완전히 지배적일 수 있음을 시사합니다.

타우의 단량체 및 섬유 주변의 수화 물 역학에 대한 연구는 분말 샘플에 대해 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 독일 가르힝에 있는 Maier-Leibnitz Zentrum(MLZ)의 SPHERES에서 수행되었습니다. 단백질 g 당 0.4 g의 H2O로 수화 된 약 100 mg의 중수소화 타우 단백질 분말을 사용하였다. EFWS는 일정한 온도에서 온도 램프 및 QENS 스펙트럼 동안 획득되었습니다. EFWS는 20K에서 시작하여 0.2K/min의 속도로 온도를 300K로 증가시키면서 5분 스캔 동안 지속적으로 데이터를 수집하면서 기록되었습니다.

QENS 스펙트럼은 20 및 280K에서 기록되었습니다. EFWS 데이터는 MSD를 추출하기 위해 0.2 Å-1 < q < 0.8 Å-1의 운동량 전달 q 범위에 걸쳐 간단한 가우시안을 사용하여 피팅하였다(보충 그림 S11A). MSD 값이 가우스 모델의 유효 한계를 초과합니다. 따라서 이 경우 가우스 근사37,38,39 이상의 다른 모델을 탐색하는 것이 좋습니다. 220K보다 높은 온도에서 타우 섬유 주변의 수화수는 타우 단량체 주변의 수화수보다 훨씬 더 이동성이 높습니다(그림 6). QENS 데이터의 피팅을 통해 사용자는 샘플에서 수화수의 탄성, 회전 및 병진 운동의 선폭과 상대적 기여도를 얻을 수 있습니다(보충 그림 S11B). 병진 운동을 하는 물 분자의 분율은 섬유 주위에서 증가하고, 물 분자의 병진 및 회전 확산 계수는 섬유 주위에서 모두 증가하는 것으로 보인다17,31. 대조적으로, 골격 및 측쇄 운동을 반영하는 단백질 타우의 ps-ns 내부 역학은 세동시 변하지 않았습니다.

Figure 2
그림 2: 평평한 알루미늄 샘플 홀더의 베이스. (A) 평평한 알루미늄 샘플 홀더는 단백질 분말이 베이스와 뚜껑 사이의 작은 간격(일반적으로 ~0.3mm) 내에서 유지되는 중성자에 노출된 중앙 부분을 제공합니다. 인듐 와이어는 최대 90°C의 온도 상승에 견디기 때문에 밀봉에 사용할 수 있습니다. 더 높은 온도의 경우 테프론 씰을 사용할 수 있습니다. (B) 단백질 분말을 인듐 와이어가 제자리에 있는 상태로 샘플 홀더의 바닥에 놓습니다. 시료 홀더는 건조를 위한P2O5 또는 수화를 위한 H2O/D2O가 있는 데시케이터에 배치됩니다. 진공 그리스는 건조기의 바닥과 뚜껑 사이의 누출을 방지하기 위해 추가됩니다. 진공은 건조 과정을 가속화하기 위해 주의해서 사용할 수 있습니다. 건조기의 바닥을 가열하는 것은 소수성이 높은 샘플의 경우 필요할 수 있습니다. (C) 단백질 용액을 내부 실린더와 외부 실린더 사이에 배치합니다. 너무 많은 액체를 피펫팅하지 않도록 하십시오(샘플 홀더가 닫혀 있을 때 오버플로가 없어야 함). 인듐 와이어는 원형 홈에 배치됩니다. (D) 샘플 스틱(배경에 있음)은 샘플 높이와 방향을 제어할 수 있으며 샘플 환경(온도, 압력)에 대한 다양한 컨트롤러와 검출기를 포함할 수 있습니다. 샘플 스틱은 극저온 용광로 상단(전면)에서 삽입되어 실험 중 온도를 제어할 수 있습니다. 실험 중에 중성자 빔은 일반적으로 흰색 직사각형으로 표시된 것처럼 극저온 용광로의 바닥에 부딪칩니다(빔의 크기는 기기 구성에 따라 다름). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 데이터 수정 및 정규화를 통해 피팅을 개선할 수 있습니다. 프로토콜에 설명된 대로 nPDyn을 사용하여 데이터를 가져왔습니다. 왼쪽, 데이터 세트는 모니터의 데이터만을 사용하여 정규화되었습니다. 오른쪽, 빈 캔의 신호는 샘플 홀더로부터의 중성자 흡수를 보정하기 위해 Paalman-Ping 계수43 과 함께 사용되었습니다. 그 후, 바나듐 신호에 대한 적합 모델은 각 운동량 전달 q에 대해 독립적으로 통합되었으며 그 결과는 샘플 데이터 세트를 정규화하는 데 사용되었습니다. 두 플롯 모두에서 S(q,ω)는 산란 신호, q는 운동량 전달, Equation 3 는 에너지 전달을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 피팅 결과를 보여주는 nPDyn에 의해 생성된 플로팅 창. QENS 데이터는 프로토콜에 설명된 대로 nPDyn을 사용하여 적합되었습니다. 플로팅 창을 통해 사용자는 관찰 가능한 다른 축(시간, 온도 또는 압력), 운동량 전달 q 또는 에너지 전달을 따라 데이터를 플로팅할 수 있으며 선택기를 사용하여 다른 축을 따라 탐색할 수 있습니다. (A)에 간단한 '플롯'이 표시되고 (B)에 '분석 - q-wise'가 표시되는 다양한 유형의 플롯을 사용할 수 있습니다. '플롯' 버튼은 서로 다른 데이터세트를 별도의 서브플롯에 표시하고, '비교' 버튼은 동일한 플롯에 있는 데이터세트를 표시하고, '3D 플롯'은 s와 유사한 다른 3D 서브플롯의 데이터셋을 표시하고, '분석 - q-wise' 버튼은 운동량 전달 q의 함수로 적합된 파라미터를 표시하고, '분석 - 관찰 가능한 측면''는 적합된 모수를 관측 가능 함수(시간, 온도 또는 압력)로 표시합니다. 약어: QENS = 준탄성 중성자 산란. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: Lysozyme 응집은 일정한 내부 역학을 가진 1단계 공정에서 발생합니다. 리소자임은 응집 완충액(다른 문헌5에 기술됨)에 용해되었고, E/IFWS는 응집 전반에 걸쳐 획득되었으며, 이는 온도를 90°C로 증가시킴으로써 촉발되었다. 빈 셀을 이용한 흡수 보정 및 바나듐 신호를 이용한 정규화 후, 데이터는 프로토콜에 기재된 바와 같이 점프 확산 모델을 사용하여 분석되었다. 적합된 질량 중심 자기 확산 계수는 내부 동역학에 대한 겉보기 확산 계수(주황색 사각형)와 함께 시간 함수(파란색 삼각형)로 표시됩니다. 이 수치는 5에서 가져온 것입니다. 약어: E/IFWS = 탄성 및 비탄성 고정 창 스캔. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 타우 섬유 주변에서 수화수 역학이 증가합니다. 중수소화 타우 섬유 및 단량체의 H2O 수화 분말을 평평한 알루미늄 샘플 홀더에 밀봉하고, 20 내지 300 K의 온도 상승 동안 EFWS 데이터를 획득하였다. 빈 셀을 이용한 흡수 보정 및 바나듐 신호를 이용한 정규화 후, 데이터는 프로토콜에 기재된 바와 같이 점프 확산 모델을 사용하여 분석되었다. 이 이미지는 31의 데이터에서 더 작은 q 범위(0.2 < q < 0.8 Å-1)를 사용하여 다시 그려졌습니다. 약어: EFWS = elastic fixed-window scans. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: ILL에서 기기 IN16B의 사진. (맨 위) 기기 전용 방사선 통제 구역에서 본 기기 IN16B. 들어오는 빔은 중성자 가이드 내에서 기기의 대부분의 요소(PST 초퍼, 분석기, 샘플, 검출기)를 포함하는 진공 챔버로 이동합니다. (아래) 진공 챔버의 내부. PST 초퍼는 샘플이 들어 있는 극저온로를 둘러싸고 있는 분석기와 마찬가지로 볼 수 있습니다. 감지기는 극저온 용광로 뒤에 있습니다. 제공: Laurent Thion, ecliptique. 약어: PST = 위상 공간 변환. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: 클래식(도플러 드라이브 포함) 및 BATS 모드의 IN16B 스케치. (A) 중성자 빔은 속도 선택기에 의해 부분적으로 단색화됩니다. 그 후, 배경 및 PST 초퍼는 중성자 펄스를 생성하며, 이 펄스로부터 에너지 프로파일은 도플러 모노크로메이터(E/IFWS 또는 QENS 모드)에 의해 선택됩니다. 그런 다음 중성자는 샘플에 의해 산란되고 단일 에너지가 분석기에 의해 검출기로 반사됩니다. ILL의 제공. (B) BATS 초퍼는 정의된 에너지 범위를 가진 단일 중성자 펄스를 정의하는 데 사용됩니다. 중성자 빔은 속도 선택기에 의해 부분적으로 단색화됩니다. 그 후, 배경 초퍼는 선택한 펄스에 속하지 않는 원치 않는 중성자를 제거합니다. 그런 다음 중성자는 샘플에 의해 산란되고 단일 에너지가 분석기에 의해 검출기로 반사됩니다. ILL의 제공. 약어: BATS = 후방 산란 및 비행 시간 분광계; PST = 위상 공간 변환; E/IFWS = 탄성 및 비탄성 고정 창 스캔; QENS = 준탄성 중성자 산란; PG = 열분해 흑연. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S3: 샘플 홀더는 분말이 원하는 수화에 도달하고 밀봉된 후 빠르게 닫힙니다. (A) 플랫 샘플 홀더는 4개의 나사를 사용하여 빠르게 닫힙니다. 인듐 와이어로 인해 작은 간격이 남습니다. 그런 다음 다른 나사를 추가하고 인듐이 이완될 수 있도록 각 나사를 여러 번 부드럽게 조여 샘플 홀더를 천천히 밀봉합니다. (B) 홀더 베이스와 뚜껑 사이에 더 이상 틈이 보이지 않을 때 평평한 샘플 홀더가 제대로 밀봉됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S4: 샘플 홀더는 중성자 빔에 대해 중앙에 위치합니다. 원통형 샘플 홀더가 샘플 스틱에 배치되었습니다. 빔이 홀더의 바닥 부분에 닿도록 샘플 홀더의 위치를 확인합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S5: NOMAD와 함께 IN16B에서 EFWS를 인수한 후 QENS를 인수했습니다. (A) 프로토콜에 설명된 대로 관련 컨트롤러를 런치 패드 로 끌어다 놓습니다(3.4.1-3.4.3단계). 인터페이스에서 제어권을 얻기 위해 자물쇠(오른쪽 상단 모서리에 있는 녹색 아이콘 - 세로 창)를 클릭해야 할 수도 있습니다. (B) 관련 컨트롤러를 프로토콜에 설명된 대로 런치 패드 로 끌어다 놓습니다(3.4.4-3.4.5단계). 여기서 마지막 두 컨트롤러의 이름은 IN16DopplerSettings 및 Count입니다. 약어: QENS = 준탄성 중성자 산란, EFWS = 탄성 고정 창 스캔. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S6: NOMAD를 사용하여 IN16B에서 온도 램프 및 E/IFWS 설정. (A) FurnaceCryostat 컨트롤러가 런치 패드 에 추가되고 프로토콜에 설명된 대로 구성됩니다(3.4.6단계). (B) For 루프 컨트롤러가 런치 패드 에 추가되고 관련 컨트롤러가 삽입되고 프로토콜에 설명 된대로 구성됩니다 (3.4.7 단계). 약어: E/IFWS = 탄성 및 비탄성 고정 창 스캔. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S7: 처음 5개의 구형 베셀 함수는 수화수의 회전 기여도의 대부분을 설명합니다. 처음 8개의 구형 베셀 함수는 값 d = 0.98 Å와 운동량 전달 q 값이 0에서 3 Å(실선)를 사용하여 플로팅됩니다. 0.3 Å < q < 1.8 Å의 운동량 전달 범위는 파란색 점선으로 구분됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S8: 리소자임은 재현성 있게 미립자를 형성합니다. 라이소자임을 응집 완충액(프로토콜, 단계 1에 설명된 대로 제조됨)에 용해시키고, 형광을 사용하여 교차 β 구조의 형성을 모니터링하기 위해 최종 농도 2μM에 ThT를 첨가했습니다. 그림은 세 개의 독립적인 측정값의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차입니다. 삽입물은 6시간 응집 후 형성된 미립자의 형광 현미경 사진을 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 수치는 5에서 가져온 것입니다. 약어: ThT = thioflavin T. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S9: 빠른 온도 ramp IN16B에서 사용할 수 있습니다. IN16B의 고속 모드에서는 약 30분 만에 온도를 280K에서 363K로 높일 수 있습니다. 이 수치는 5에서 가져온 것입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S10: 미립자로 응집하는 동안 리소자임에 대한 E/IFWS 데이터. 리소자임은 응집 완충액(다른 문헌5에 기술됨)에 용해되었고, E/IFWS는 응집 전반에 걸쳐 획득되었으며, 이는 온도를 90°C로 증가시킴으로써 촉발되었다. 데이터-빈 셀을 사용한 흡수 보정 및 바나듐 신호를 사용한 정규화 후-측정된 다른 에너지 전달에 대한 운동량 전달 q 및 시간, 0μeV(왼쪽 상단), 0.6μeV(오른쪽 상단), 1.5μeV(왼쪽 하단) 및 3μeV(오른쪽 아래). 각 서브플롯에 대해 세로축은 산란 신호 S(q, ΔE)에 대응하며, 실험 시간(시간)과 운동량 전달 q에 대해 플로팅됩니다. 이 수치는 5에서 가져온 것입니다. 약어: E/IFWS = 탄성 및 비탄성 고정 창 스캔. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S11: 타우의 수화수 데이터 피팅. (A) 가우시안을 사용한 EFWS 데이터의 피팅. 중수소화 타우 단량체의 H2O- 수화 분말을 편평한 알루미늄 샘플 홀더에 밀봉하고, 20 내지 300 K의 온도 상승 동안 EFWS를 획득하였다. 실험 데이터(오차 막대가 있는 수직 축-파란색 선의 탄성 신호 S(q, 0))는 MSD를 추출하는 데 사용된 피팅된 가우시안과 함께 운동량 전달 q 범위 0.2 < q < 0.6 Å-1에 대해 플로팅됩니다. (B) QENS 피팅에서 얻은 수화수의 병진 및 회전 운동. 중수소화 타우 섬유(왼쪽)와 단량체(오른쪽)의 H2O 수화 분말을 평평한 알루미늄 샘플 홀더에 밀봉하고 QENS 데이터를 280K에서 수집했습니다. 섬유(파란색 삼각형) 및 단량체(녹색 점)에 대한 실험 데이터(에너지 전달 함수로서의 강도 S(q,ω))는 적합 모델(검은색 실선) 및 그 구성 요소, 배경(파란색), 분해능 함수(녹색), 회전(빨간색) 및 이동(청록색)에 대한 운동량 전달 q = 0.783 Å-1. 이 수치는 31에서 나온 것입니다. 약어: QENS = 준탄성 중성자 산란, EFWS = 탄성 고정 창 스캔; MSD = 평균 제곱 변위. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

중성자 분광법(neutron spectroscopy)은 중수소를 사용할 때 단백질의 크기나 용액의 복잡성에 관계없이 단백질 샘플의 앙상블 평균 ps-ns 역학을 조사할 수 있는 유일한 방법이다6. 구체적으로, 용액에서 단백질 어셈블리의 자체 확산을 조사함으로써, 이러한 어셈블리의 유체역학적 크기를 명확하게 결정할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이 방법은 일반적으로 낮은 중성자 플럭스에 의해 제한되며, 이는 긴 획득 시간과 할당된 빔 시간 내에 양호한 신호 대 잡음비를 얻기 위해 많은 양의 샘플(일반적으로 100mg의 단백질)이 필요함을 의미합니다.

시료 전처리(프로토콜 단계 1 및 2). 액체 상태 샘플의 경우 사용할 수 있는 최소 농도는 ~50mg/mL입니다(더 낮은 농도는 수집 시간이 길어지는 대신 사용할 수 있음). 높은 단백질 농도는 더 빠른 세동 속도와 관련이 있으며, 이는 할당된 빔 시간에 측정을 맞추는 데 도움이 되지만 응집 경로에도 영향을 미칠 수 있습니다44. 따라서 원자력 또는 전자 현미경과 같은 보완적인 방법을 사용한 철저한 시료 특성 분석이 필요합니다.

샘플 홀더의 재질은 알루미늄 합금이 부식되기 쉽기 때문에 샘플을 준비할 때 해결해야 할 사항이기도 합니다(45). 부식에 대한 저항성이 우수하고 중성자 흡광도가 낮은 전형적인 알루미늄 합금은 98%-98.75% Al, 0.1% Ti, 0.15% Zn, 0.05% Cr, 0.35%-0.6% Mg, 0.1% Mn, 0.1% Cu, 0.1%-0.3% Fe 및 0.3%-0.6% Si로 만들어진 유럽 표준(EN) AW-6060 [AlMgSi]입니다. 예를 들어 샘플 홀더의 시간을 줄이거나 다음과 같은 보호 코팅(배경 신호에 추가할 수 있음)을 사용하여 부식을 최소화할 수 있습니다. 니켈 또는 금.

수소화된 단백질의 분말 샘플에 대해서는, 동결건조 절차가 가능한 한 많은 잔류 경수를 제거하기 위해P2O5분말의 존재 하에 데시케이터 내의 단계로 효율적으로 완료되는 것으로 나타났다35. 분말 샘플의 경우, 분말을 최종 수화 상태로 특성화하고(원자력 현미경 및 X선 분말 회절 사용) 단량체 및 섬유 상태 모두에 대한 중수소, 동결 건조 및 증기 확산의 영향을 평가하는 것이 좋습니다. 특히, 동결 건조는 섬유를 파괴하여 형태에 영향을 주지 않고 세그먼트를 단축시킬 수 있습니다. 또한, 액체 질소에서 플래시 냉각 대신 느린 냉각이 아밀로이드 유사 구조의 존재를 유도할 수 있다는 것이 X선 전력 회절에 의해 관찰되었습니다(미공개 결과).

데이터 수집(프로토콜 단계 3). 실험 전에 현지 담당자와 데이터 수집을 계획하는 것이 좋습니다(제안서 작성 과정에서 논의된 경우에도). 데이터 수집 계획은 얻은 신호 대 잡음비에 따라 첫 번째 스캔 후 변경될 수 있습니다. 특히 시간 분해 실험의 경우 E/IFWS를 사용하면 탄성 라인의 경우 30초에서 1분, 3μeV 5의 데이터 포인트에서4-5분의 빠른 데이터 수집이 가능하지만 접근 가능한 에너지 전달 범위는 본질적으로 제한적입니다. 대안적으로, QENS 데이터의 슬라이딩 평균이 사용될 수 있다(46). 이를 위해 IN16B의 새로운 후방 산란 및 비행 시간 분광법(BATS) 옵션은 에너지11에서 더 낮은 분해능을 희생시키면서 ±150μeV(또는 사용된 구성에 따라 더 높음)의 에너지 범위로 기존 IN16B보다 더 높은 플럭스를 제공합니다. 따라서 BATS 옵션은 시간 분해 연구, 특히 몇 시간에 걸쳐 발생하는 아밀로이드 응집과 같은 프로세스에 권장됩니다.

데이터 분석(프로토콜 단계 4, 5 및 6). 산란 함수 S(q,ω)는 샘플의 모든 유형의 모션을 포함하며, 위의 프로토콜에서 설명된 모델은 근사치입니다. 특히, 액체 상태의 IDP의 경우, 무질서한 사슬의 대규모 운동은 전체 단백질의 질량 중심 확산과 동일한 길이 및 시간 척도에 걸쳐 발생할 수 있습니다. 따라서 사용자는 질량 중심 확산과 단백질 내부 역학의 분리가 항상 간단하지는 않다는 점을 명심해야 합니다. 피팅 절차는 보완적인 방법을 통해 얻은 질량 중심 확산에 대한 정보를 활용할 수 있으므로 이 매개변수를 고정할 수 있습니다(다른 방법이 다른 시간 및 길이 척도와 관련된 집합 확산 계수를 제공할 수 있음을 명심).

중성자 산란 외에도 분자 시스템의 역학은 동위 원소 표지 단백질에 대한 국소 정보를 제공하는 핵 자기 공명 (NMR)과 광범위한 시간 척도 (47,48,49)에 의해 특징 지어 질 수 있습니다. 이 방법은 아밀로이드 시스템 48,50,51,52,53을 연구하는 데 성공적으로 사용되었지만 단백질 크기에 대한 고유한 제한으로 인해 사용자가 단순히 수화수를 연구하거나 실시간으로 아밀로이드 응집 과정을 따를 수 없습니다. 전자 상자성 공명 분광법(EPR)과 EPR 파생 방법인 Overhauser 동적 핵 분극(ODNP)의 최근 개발은 중성자 산란과 결합할 때 좋은 관점을 제공합니다. 실제로, 부위-지향적 스핀 라벨링(SDSL)이지만, EPR 및 ODNP는 도입된 스핀 라벨 주위의 ps-ns 시간 척도에서 각각 단백질54 및 수화 역학(55)을 조사할 수 있다.

이러한 방법은 tau56,57 단백질의 응집을 연구하는 데 사용되었으며 유사한 정보를 얻을 수 있지만 전체 샘플에 걸쳐 평균을 낼 수 있는 중성자 산란과 큰 상보성을 제공할 것입니다. 더욱이, 적외선 분광법은 특정 구조 패턴과 관련된 고에너지 운동에 대한 동적 정보를 제공할 수 있지만, 단백질 환경(사용된 완충액)의 복잡성은 데이터 해석에 영향을 미칠 수 있다(58,59). 중성자 후방 산란 기술은 앞서 언급한 방법의 결과와 함께 ps-ns 시간 척도에서 단백질 및 수화 물 역학에 대한 독특하고 보완적인 관점을 제공합니다. 샘플의 특정 라벨링이 필요하지 않고, 신호 품질은 단백질의 크기에 민감하지 않으며, 생체 내 또는 중수소화 박테리아 용해물 3,6,7과 같은 매우 복잡한 중수소화 환경에서 측정을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 앙상블 평균 결과를 제공하기 때문에 분자 역학 시뮬레이션으로 잘 보완되어 연구 중인 시스템에 대한 원자 세부 정보를 얻을 수 있습니다. 시뮬레이션은 mdanse60과 같은 소프트웨어를 사용하여 시뮬레이션 궤적에서 계산된 이론적 QENS 스펙트럼과 실험 데이터 세트를 직접 비교하여 쉽게 검증할 수 있습니다.

아밀로이드 시스템과 관련하여, 중성자 후방 산란은 다양한 시스템 및 조건 5,31,61,62,63,64에 대한 ps-ns 단백질 및 물 역학을 특성화하는 데 유용한 것으로 입증되었습니다. 특히, 중성자 후방 산란은 교차 β 구조에 관여하는 단백질 서열의 비율과 세동시 물 엔트로피 이득의 진폭 사이의 상관 관계를 밝히기 위해 사용되었습니다 (미공개 결과). 또한, 샘플 환경의 개발은 중성자 스펙트럼과 유전체 이완 데이터(65) 또는 라만 산란 데이터(66)의 동시 획득을 가능하게 한다. 또한 회절 검출기는 IN16B에 존재하여 동적 데이터와 함께 구조 데이터를 얻습니다. 또한, 들어오는 중성자 플럭스는 소위 가변 초점 가이드의 사용 덕분에 가까운 장래에 IN16B의 BATS 모드에서 개선될 것으로 예상되며, 이 가이드의 지오메트리는 사용된 기기 설정에 따라 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 정교한 시료 환경 및 계측기의 개발을 더욱 추진하면 향후 훨씬 더 복잡한 실험이 가능해져 더 많은 동적 및 구조적 정보를 동시에 제공할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

저자들은 SPHERES 장비에서 수행된 중성자 산란 실험의 일부에 대해 독일 가르힝의 Heinz Maier-Leibnitz Zentrum에 있는 Jülich 중성자 과학 센터의 Michaela Zamponi에게 감사를 표합니다. 이 작업은 HPRI-2001-50065 및 RII3-CT-2003-505925 계약에 따라 유럽 연합이 자금을 지원하는 DLAB(Deuteration Laboratory) 컨소시엄의 활동과 보조금 GR/R99393/01 및 EP/C015452/1에 따라 Institut Laue Langevin EMBL DLAB 내에서 영국 공학 및 물리 과학 연구 위원회(EPSRC)가 자금을 지원하는 활동의 혜택을 받았습니다. 제7차 프레임워크 프로그램에 따른 유럽연합 집행위원회(European Commission)의 주요 조치: 유럽 연구 영역 강화, 연구 인프라 강화(Key Action: Strengthening the European Research Area, Research Infrastructures)를 통해 [계약 226507(NMI3)]을 인정합니다. 케빈 푸노 (Kevin Pounot)와 크리스티안 벡 (Christian Beck)은 박사후 연구원 기금에 대해 연방 교육 연구부 (BMBF, 보조금 번호 05K19VTB)에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

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References

  1. Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
  2. Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. Acta Crystallographica Section D. 74 (8), 715-726 (2018).
  3. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7 (2019).
  4. Martel, A., et al. Membrane permeation versus amyloidogenicity: A multitechnique study of islet amyloid polypeptide interaction with model membranes. Journal of the American Chemical Society. 139 (1), 137-148 (2017).
  5. Pounot, K., et al. Tracking internal and global diffusive dynamics during protein aggregation by high-resolution neutron spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (15), 6299-6304 (2020).
  6. Grimaldo, M., et al. Protein short-time diffusion in a naturally crowded environment. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (8), 1709-1715 (2019).
  7. Jasnin, M., Stadler, A., Tehei, M., Zaccai, G. Specific cellular water dynamics observed in vivo by neutron scattering and NMR. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10154-10160 (2010).
  8. Frick, B. The neutron backscattering spectrometer IN16 at ILL-high energy resolution with high intensity and excellent signal-to-noise ratio. Neutron News. 13 (2), 15-22 (2002).
  9. Frick, B., Mamontov, E., van Eijck, L., Seydel, T. Recent backscattering instrument developments at the ILL and SNS. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 224 (1-2), 33-60 (2010).
  10. Frick, B., Combet, J., van Eijck, L. New possibilities with inelastic fixed window scans and linear motor Doppler drives on high resolution neutron backscattering spectrometers. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 669, 7-13 (2012).
  11. Appel, M., Frick, B., Magerl, A. A flexible high speed pulse chopper system for an inverted neutron time-of-flight option on backscattering spectrometers. Scientific Reports. 8 (1), 13580 (2018).
  12. Squires, G. L. Introduction to the theory of thermal neutron scattering. , Dover Publications. Mineola N.Y. (1996).
  13. Bee, M. Quasielastic neutron scattering. , Available from: http://inis.iaea.org/Search/search.aspx?orig_q=RN:20038756 (1988).
  14. Singwi, K. S., Sjölander, A. Diffusive motions in water and cold neutron scattering. Physical Review. 119 (3), 863-871 (1960).
  15. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear diatomic liquids: i. free rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1279-1297 (1966).
  16. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear liquid: ii. hindered rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1299-1311 (1966).
  17. Schirò, G., et al. Translational diffusion of hydration water correlates with functional motions in folded and intrinsically disordered proteins. Nature Communications. 6, 6490 (2015).
  18. Grimaldo, M., et al. Hierarchical molecular dynamics of bovine serum albumin in concentrated aqueous solution below and above thermal denaturation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (6), 4645-4655 (2015).
  19. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 16 (11), 673-677 (1968).
  20. Bonar, L., Cohen, A. S., Skinner, M. M. Characterization of the Amyloid Fibril as a Cross-β Protein. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 131 (4), 1373-1375 (1969).
  21. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  22. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  23. Maji, S. K., et al. Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science. 325 (5938), 328-332 (2009).
  24. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  25. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. 28 (31), 6546-6561 (2016).
  26. Stephens, A. D., Kaminski Schierle, G. S. The role of water in amyloid aggregation kinetics. Current Opinion in Structural Biology. 58, 115-123 (2019).
  27. Adamcik, J., Mezzenga, R. Amyloid polymorphism in the protein folding and aggregation energy landscape. Angewandte Chemie International Edition. 57 (28), 8370-8382 (2018).
  28. Liu, Z., et al. Entropic contribution to enhanced thermal stability in the thermostable P450 CYP119. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10049-10058 (2018).
  29. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2018).
  30. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
  31. Fichou, Y., et al. Hydration water mobility is enhanced around tau amyloid fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), 6365-6370 (2015).
  32. Burns, J., Pennock, C. A., Stoward, P. J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. The Journal of Pathology and Bacteriology. 94 (2), 337-344 (1967).
  33. Iqbal, K., Liu, F., Gong, C. -X., Grundke-Iqbal, I. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies. Current Alzheimer Research. 7 (8), 656-664 (2010).
  34. Krȩżel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  35. Dolman, M., Halling, P. J., Moore, B. D., Waldron, S. How dry are anhydrous enzymes? Measurement of residual and buried 18O-labeled water molecules using mass spectrometry. Biopolymers. 41 (3), 313-321 (1997).
  36. Pounot, K. kpounotnPDyn: v3.0.0. Zenodo. , (2021).
  37. Yi, Z., Miao, Y., Baudry, J., Jain, N., Smith, J. C. Derivation of mean-square displacements for protein dynamics from elastic incoherent neutron scattering. Journal of Physical Chemistry B. 116 (16), 5028-5036 (2012).
  38. Peters, J., Kneller, G. R. Motional heterogeneity in human acetylcholinesterase revealed by a non-Gaussian model for elastic incoherent neutron scattering. The Journal of Chemical Physics. 139 (16), 165102 (2013).
  39. Zeller, D., Telling, M. T. F., Zamponi, M., García Sakai, V., Peters, J. Analysis of elastic incoherent neutron scattering data beyond the Gaussian approximation. The Journal of Chemical Physics. 149 (23), 234908 (2018).
  40. Roosen-Runge, F., Seydel, T. A generalized mean-squared displacement from inelastic fixed window scans of incoherent neutron scattering as a model-free indicator of anomalous diffusion confinement. EPJ Web of Conferences. 83, 02015 (2015).
  41. Ortega, A., Amorós, D., García de la Torre, J. Prediction of hydrodynamic and other solution properties of rigid proteins from atomic- and residue-level models. Biophysical Journal. 101 (4), 892-898 (2011).
  42. Hennig, M., Frick, B., Seydel, T. IUCr Optimum velocity of a phase-space transformer for cold-neutron backscattering spectroscopy. Journal of Applied Crystallography. 44 (3), 467-472 (2011).
  43. Paalman, H. H., Pings, C. J. Numerical evaluation of X-ray absorption factors for cylindrical samples and annular sample cells. Journal of Applied Physics. 33 (8), 2635-2639 (1962).
  44. Ow, S. -Y., Dunstan, D. E. The effect of concentration, temperature and stirring on hen egg white lysozyme amyloid formation. Soft Matter. 9 (40), 9692-9701 (2013).
  45. Tominaga, T., Sahara, M., Kawakita, Y., Nakagawa, H., Yamada, T. Evaluation of sample cell materials for aqueous solutions used in quasi-elastic neutron scattering measurements. Journal of Applied Crystallography. 54 (6), 1631-1640 (2021).
  46. Beck, C., et al. Following protein dynamics in real time during crystallization. Crystal Growth & Design. 19 (12), 7036-7045 (2019).
  47. Smith, A. A., Testori, E., Cadalbert, R., Meier, B. H., Ernst, M. Characterization of fibril dynamics on three timescales by solid-state NMR. Journal of Biomolecular NMR. 65 (3-4), 171-191 (2016).
  48. Wang, T., Jo, H., DeGrado, W. F., Hong, M. Water distribution, dynamics, and interactions with Alzheimer's β-amyloid fibrils investigated by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 139 (17), 6242-6252 (2017).
  49. Rezaei-Ghaleh, N., Giller, K., Becker, S., Zweckstetter, M. Effect of zinc dinding on β-amyloid structure and dynamics: Implications for Aβ aggregation. Biophysical Journal. 101 (5), 1202-1211 (2011).
  50. Vugmeyster, L., et al. Fast motions of key methyl groups in amyloid-β fibrils. Biophysical Journal. 111 (10), 2135-2148 (2016).
  51. Yang, X., Wang, B., Hoop, C. L., Williams, J. K., Baum, J. NMR unveils an N-terminal interaction interface on acetylated-α-synuclein monomers for recruitment to fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (18), (2021).
  52. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human α-synuclein. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (5), 409-415 (2016).
  53. Karamanos, T. K., Kalverda, A. P., Thompson, G. S., Radford, S. E. Mechanisms of amyloid formation revealed by solution NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 88-89, 86-104 (2015).
  54. Lai, Y. -C., Kuo, Y. -H., Chiang, Y. -W. Identifying protein conformational dynamics using spin-label ESR. Chemistry - An Asian Journal. 14 (22), 3981-3991 (2019).
  55. Franck, J. M., Han, S. Overhauser dynamic nuclear polarization for the study of hydration dynamics, explained. Methods in Enzymology. 615, 131-175 (2019).
  56. Pavlova, A., et al. Protein structural and surface water rearrangement constitute major events in the earliest aggregation stages of tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 127-136 (2016).
  57. Lin, Y., et al. Liquid-liquid phase separation of tau driven by hydrophobic interaction facilitates fibrillization of tau. bioRxiv. , (2020).
  58. Decatur, S. M. Elucidation of residue-level structure and dynamics of polypeptides via isotope-edited infrared spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 39 (3), 169-175 (2006).
  59. Chatani, E., Tsuchisaka, Y., Masuda, Y., Water Tsenkova, R. molecular system dynamics associated with amyloidogenic nucleation as revealed by real time near infrared spectroscopy and aquaphotomics. PLoS One. 9 (7), 101997 (2014).
  60. Goret, G., Aoun, B., Pellegrini, E. MDANSE: An interactive analysis environment for molecular dynamics simulations. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (1), 1-5 (2017).
  61. Fujiwara, S., et al. Internal dynamics of a protein that forms the amyloid fibrils observed by neutron scattering. Journal of the Physical Society of Japan. 82, Suppl A (2013).
  62. Schiró, G., et al. Neutron scattering reveals enhanced protein dynamics in concanavalin a amyloid fibrils. Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (8), 992-996 (2012).
  63. Pounot, K., et al. Zinc determines dynamical properties and aggregation kinetics of human insulin. Biophysical Journal. 120 (5), 886-898 (2021).
  64. Fujiwara, S., et al. Dynamic properties of human α-synuclein related to propensity to amyloid fibril formation. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3229-3245 (2019).
  65. Sanz, A., et al. High-pressure cell for simultaneous dielectric and neutron spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 89 (2), 023904 (2018).
  66. Adams, M. A., et al. Simultaneous neutron scattering and Raman scattering. Applied Spectroscopy. 63 (7), 727-732 (2009).

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