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Biochemistry

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

Die Neutronenrückstreuspektroskopie bietet einen zerstörungsfreien und markierungsfreien Zugang zur ps-ns-Dynamik von Proteinen und deren Hydratationswasser. Der Workflow wird anhand von zwei Studien zu Amyloid-Proteinen vorgestellt: zur zeitaufgelösten Dynamik von Lysozym während der Aggregation und zur Hydratationswasserdynamik von Tau bei der Faserbildung.

Abstract

Die Neutronenstreuung bietet die Möglichkeit, die Dynamik in Proben für einen weiten Energiebereich zerstörungsfrei und ohne andere Markierung als Deuterium zu untersuchen. Insbesondere die Neutronenrückstreuspektroskopie zeichnet die Streusignale bei mehreren Streuwinkeln gleichzeitig auf und eignet sich gut, um die Dynamik biologischer Systeme auf der ps-ns-Zeitskala zu untersuchen. Durch die Verwendung vonD2O- und möglicherweise deuterierten Pufferkomponenten ermöglicht die Methode die Überwachung sowohl der Massenschwerpunktdiffusion als auch der Rückgrat- und Seitenkettenbewegungen (interne Dynamik) von Proteinen im flüssigen Zustand.

Darüber hinaus kann die Dynamik des Hydratationswassers untersucht werden, indem Pulver aus perdeuterierten Proteinen verwendet werden, die mitH2Ohydratisiert sind. In diesem Artikel wird der Arbeitsablauf des Instruments IN16B am Institut Laue-Langevin (ILL) zur Untersuchung der Protein- und Hydratationswasserdynamik vorgestellt. Die Herstellung von Lösungsproben und hydratisierten Proteinpulverproben mittels Dampfaustausch wird erläutert. Das Datenanalyseverfahren sowohl für die Protein- als auch für die Hydratationswasserdynamik wird für verschiedene Arten von Datensätzen (quasielastische Spektren oder Fixed-Window-Scans) beschrieben, die mit einem Neutronenrückstreuspektrometer erhalten werden können.

Die Methode wird anhand von zwei Studien mit Amyloid-Proteinen veranschaulicht. Es wird gezeigt, dass die Aggregation von Lysozym in μm-große sphärische Aggregate - als Partikel bezeichnet - in einem einstufigen Prozess auf dem auf IN16B untersuchten Raum- und Zeitbereich erfolgt, während die interne Dynamik unverändert bleibt. Des Weiteren wurde die Dynamik des Hydratationswassers von Tau an hydratisierten Pulvern aus perdeuteriertem Protein untersucht. Es wird gezeigt, dass Translationsbewegungen von Wasser bei der Bildung von Amyloidfasern aktiviert werden. Abschließend werden kritische Schritte im Protokoll diskutiert, wie die Neutronenstreuung im Hinblick auf die Untersuchung der Dynamik im Vergleich zu anderen experimentellen biophysikalischen Methoden positioniert ist.

Introduction

Das Neutron ist ein ladungsloses und massereiches Teilchen, das im Laufe der Jahre erfolgreich zur Untersuchung von Proben in verschiedenen Bereichen von der Grundlagenphysik bis zur Biologieeingesetzt wurde 1. Für biologische Anwendungen werden Kleinwinkel-Neutronenstreuung, inelastische Neutronenstreuung sowie Neutronenkristallographie und Reflektometrie häufig eingesetzt 2,3,4. Die inelastische Neutronenstreuung ermöglicht eine ensemblegemittelte Messung der Dynamik, ohne dass eine spezifische Markierung an sich erforderlich ist, und eine Signalqualität, die nicht von der Größe oder dem Protein abhängt5. Die Messung kann in einer hochkomplexen Umgebung für das untersuchte Protein durchgeführt werden, die das intrazelluläre Medium nachahmt, wie z. B. ein deuteriertes bakterielles Lysat oder sogar in vivo 3,6,7. Verschiedene experimentelle Aufbauten können verwendet werden, um die Dynamik zu untersuchen, nämlich i) Flugzeit-gebender Zugang zu sub-ps-ps-Dynamik, ii) Rückstreuung-gebender Zugang zu ps-ns-Dynamik und iii) Spin-Echo-gebender Zugang zu Dynamik von ns bis zu Hunderten von ns. Die Neutronenrückstreuung nutzt das Braggsche Gesetz 2d sinθ = nλ, wobei d der Abstand zwischen Ebenen in einem Kristall, θ der Streuwinkel, n die Streuordnung und λ die Wellenlänge ist. Die Verwendung von Kristallen für die Rückstreuung zu den Detektoren ermöglicht es, eine hohe Energieauflösung von typischerweise ~0,8 μeV zu erreichen. Um den Energieaustausch zu messen, wird entweder ein Dopplerantrieb verwendet, der einen Kristall in der Rückstreuung trägt, um die einfallende Neutronenwellenlänge 8,9,10 zu definieren und einzustellen (Abbildung 1), oder es kann ein Time-of-Flight-Setup auf Kosten einer Verringerung der Energieauflösung 11 verwendet werden.

Figure 1
Abbildung 1: Skizze eines Neutronenrückstreuspektrometers mit Dopplerantrieb. Der einfallende Strahl trifft auf den Phasenraumtransformations-Chopper42 (PST), der den Fluss an der Probenposition erhöht. Es wird dann durch den Dopplerantrieb, der eine Energie E1 (cyanfarbener Pfeil) wählt, in Richtung der Probe zurückgestreut. Die Neutronen werden dann von der Probe gestreut (mit unterschiedlichen Energien, die durch die Farbe der Pfeile dargestellt werden) und die Analysatoren, die aus Si 111-Kristallen bestehen, streuen nur Neutronen mit einer spezifischen Energie E0 zurück (hier rote Pfeile). Daher wird der Impulstransfer q aus der detektierten Position des Neutrons auf dem Detektorarray und der Energietransfer aus der Differenz E1 - E0 erhalten. Die erwartete Flugzeit für den vom PST erzeugten Neutronenpuls wird verwendet, um das Signal der Neutronen zu verwerfen, die direkt in Richtung der Detektorröhren gestreut werden. Abkürzung: PST = Phasenraumtransformation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Für die Rückstreuspektroskopie kommt der Hauptbeitrag zum Signal von protonenreichen Wasserstoffproben, wie z. B. Proteinen, aus der inkohärenten Streuung, für die die Streuintensität Sinc(q, ω) durch Gl (1)12 gezeigt wird

Equation 1 (1)

Dabei ist σinc der inkohärente Wirkungsquerschnitt des betrachteten Elements, k' die Norm des gestreuten Wellenvektors, k die Norm des eingehenden Wellenvektors, q (= k - k') die Impulsübertragung, r j(t) der Ortsvektor des Atoms j zum Zeitpunkt t und ω die Frequenz, die dem Energietransfer zwischen dem einfallenden Neutron und dem System entspricht. Die eckigen Klammern bezeichnen den Ensembledurchschnitt. Die inkohärente Streuung untersucht daher die ensemblegemittelte Einzelteilchen-Selbstkorrelation der Atompositionen mit der Zeit und liefert die Selbstdynamik gemittelt über alle Atome im System und verschiedene Zeitursprünge (Ensemble-Mittelwert). Die Streufunktion ist die zeitliche Fourier-Transformation der intermediären Streufunktion I(q, t), die als Fourier-Transformation im Raum der van-Hove-Korrelationsfunktion angesehen werden kann, die durch Gl (2) gezeigt wird:

Equation 2 (2)

Wobei ρ(r,t) die Wahrscheinlichkeitsdichte ist, ein Atom an der Position r und der Zeit t 13 zu finden.

Für einen Fickschen Diffusionsprozess ergibt sich die Selbstdiffusionsfunktion (siehe Gl (3)) nach einer doppelten Fourier-Transformation in einer Streufunktion, die aus einem Lorentz-Operator mit Linienbreite besteht, der durch γ = Dq2 gegeben ist.

Equation 10 (3)

Ausgefeiltere Modelle wurden entwickelt und für nützlich befunden, wie z.B. das Sprungdiffusionsmodell von Singwi und Sjölander für die interne ps-ns-Proteindynamik14 oder das Rotationsmodell von Sears für Hydratationswasser15,16,17.

Auf dem Neutronenrückstreuinstrument IN16B 8,9 am ILL in Grenoble, Frankreich (Supplemental Figure S1), besteht ein bei Proteinen üblicherweise verwendeter Aufbau aus Si 111-Kristallen für die Analysatoren mit einem Dopplerantrieb zur Abstimmung der eingehenden Wellenlänge (Supplemental Figure S2A), wodurch der Impulsübertragungsbereich ~0,2 Å-1 < q < ~2 Å-1 und der Energieübertragungsbereich von -30 μeV < Equation 3 < 30 μeV, was Zeitskalen von wenigen ps bis einigen ns und Entfernungen von einigen Å entspricht. Darüber hinaus bietet IN16B die Möglichkeit, elastische und inelastische Fixed-Window-Scans (E/IFWS)10 durchzuführen, die die Datenerfassung bei einer festen Energieübertragung beinhalten. Da der Fluss bei der Arbeit mit Neutronen begrenzt ist, ermöglicht E/IFWS die Maximierung des Flusses für einen Energietransfer, wodurch die Erfassungszeit reduziert wird, die benötigt wird, um ein zufriedenstellendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Eine neuere Option ist das Rückstreu- und Flugzeitspektrometer (BATS) Mode11, das die Messung eines breiten Bereichs von Energietransfers (z. B. -150 μeV < < Equation 3 150 μeV) mit einem höheren Fluss als mit dem Dopplerantrieb, jedoch auf Kosten einer geringeren Energieauflösung ermöglicht (ergänzende Abbildung S2B).

Eine wichtige Eigenschaft der Neutronenstreuung ist, dass der inkohärente Wirkungsquerschnitt σinc für Wasserstoff einen 40-mal höheren Wert als für Deuterium hat und für andere Elemente, die üblicherweise in biologischen Proben vorkommen, vernachlässigbar ist. Daher kann die Dynamik von Proteinen in einer flüssigen Umgebung unter Verwendung eines deuterierten Puffers untersucht werden, und der Pulverzustand ermöglicht die Untersuchung entweder der inneren Dynamik von Proteinen mit hydriertem Proteinpulver, das mit D2O hydratisiert ist, oder die Untersuchung von Hydratationswasser für perdeuteriertes Proteinpulver, das mitH2Ohydratisiert ist. Im flüssigen Zustand ermöglicht die Neutronenrückstreuung typischerweise den gleichzeitigen Zugriff auf die Selbstdiffusion des Massenschwerpunkts von Proteinen (Fickian-Typ-Diffusion) und deren interne Dynamik. Bei letzteren handelt es sich um Rückgrat- und Seitenkettenbewegungen, die in der Regel durch das sogenannte Sprungdiffusionsmodell oder andere beschrieben werden 3,18. In hydrierten Proteinpulvern fehlt die Proteindiffusion und es muss nur die interne Dynamik modelliert werden. Für Hydratationswasser weisen die Beiträge von Translations- und Rotationsbewegungen von Wassermolekülen eine andere Abhängigkeit vom Impulstransfer q auf, was ihre Unterscheidung im Datenanalyseprozess ermöglicht17.

Diese Arbeit veranschaulicht die Methode der Neutronenrückstreuung anhand der Untersuchung von Proteinen, die in der Lage sind, sich zu entfalten, zu einer kanonischen Form zu aggregieren, die aus Stapeln von β-Strängen besteht - dem sogenannten Kreuz-β-Muster19,20 - und längliche Fasern zu bilden. Dabei handelt es sich um die sogenannte Amyloid-Aggregation, die aufgrund ihrer zentralen Rolle bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson ausgiebig untersucht wird21,22. Die Untersuchung der Amyloid-Proteine ist auch durch die funktionelle Rolle, die sie spielen können, motiviert 23,24 oder durch ihr hohes Potenzial für die Entwicklung neuartiger Biomaterialien25. Die physikalisch-chemischen Determinanten der Amyloid-Aggregation sind nach wie vor unklar, und es gibt keine allgemeine Theorie der Amyloid-Aggregation, trotz enormer Fortschritte in den letzten Jahren21,26.

Die Amyloid-Aggregation impliziert Veränderungen in der Proteinstruktur und -stabilität im Laufe der Zeit, deren Untersuchung natürlich eine Dynamik impliziert, die mit der Stabilität der Proteinkonformation, der Proteinfunktion und der Proteinenergielandschaft zusammenhängt27. Die Dynamik ist durch den entropischen Beitrag für die schnellsten Bewegungen28 direkt mit der Stabilität eines bestimmten Zustands verbunden, und die Proteinfunktion kann durch Bewegungen auf verschiedenen Zeitskalen von sub-ps für lichtempfindliche Proteine29 bis ms für Domänenbewegungen aufrechterhalten werden, was durch die Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik30 erleichtert werden kann.

Es werden zwei Beispiele für die Verwendung der Neutronenrückstreuspektroskopie zur Untersuchung von Amyloidproteinen vorgestellt, eines im flüssigen Zustand, um die Proteindynamik zu untersuchen, und eines im hydratisierten Pulverzustand, um die Dynamik des Hydratationswassers zu untersuchen. Das erste Beispiel betrifft die Aggregation von Lysozym in μm-große Kügelchen (Partikel genannt), gefolgt in Echtzeit5, und das zweite ein Vergleich der Wasserdynamik in nativen und aggregierten Zuständen des menschlichen Proteins Tau31.

Lysozym ist ein Enzym, das an der Immunabwehr beteiligt ist und aus 129 Aminosäureresten besteht. Lysozym kann in deuteriertem Puffer bei einem pD-Wert von 10,5 und einer Temperatur von 90 °C Partikel bilden. Mit Hilfe der Neutronenstreuung konnten wir zeigen, dass die zeitliche Entwicklung des Massenschwerpunkt-Diffusionskoeffizienten von Lysozym der einzelnen exponentiellen Kinetik der Thioflavin-T-Fluoreszenz folgt (eine Fluoreszenzsonde, die zur Überwachung der Bildung von Amyloid-Kreuz-β-Musternverwendet wird 32), was darauf hindeutet, dass die Bildung von partikulären Überstrukturen und Kreuz-β-Mustern in einem einzigen Schritt mit der gleichen Geschwindigkeit erfolgt. Darüber hinaus blieb die interne Dynamik während des gesamten Aggregationsprozesses konstant, was entweder durch eine schnelle Konformationsänderung erklärt werden kann, die mit NBS-Instrumenten nicht beobachtet werden kann, oder durch das Fehlen einer signifikanten Änderung der internen Proteinenergie bei der Aggregation.

Das menschliche Protein Tau ist ein intrinsisch ungeordnetes Protein (IDP), das aus 441 Aminosäuren für die sogenannte 2N4R-Isoform besteht, die insbesondere an der Alzheimer-Krankheit beteiligt ist33. Mit Hilfe der Neutronenrückstreuung an Pulvern aus perdeuteriertem Proteintau konnten wir zeigen, dass die Dynamik des Hydratationswassers im Faserzustand erhöht ist, wobei eine höhere Population von Wassermolekülen Translationsbewegungen durchläuft. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass eine Erhöhung der Entropie des Hydratationswassers das Amyloid-Flimmern von Tau antreiben könnte.

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Protocol

1. Bereiten Sie den deuterierten Puffer für Proteine im flüssigen Zustand vor

  1. Alle Bestandteile des Puffers werden in reinemD2Ogelöst.
  2. Wenn die pH-Elektrode inH2Okalibriert wurde, stellen Sie die pD nach der Formel pD = pH + 0,4 mit NaOD oder DCl34 ein.
    HINWEIS: Die Verwendung von D2O anstelle vonH2Okanndie Proteinlöslichkeit beeinträchtigen und die Pufferbedingungen müssen möglicherweise angepasst werden (z. B. durch eine geringfügige Änderung der Salzkonzentration).

2. Bereiten Sie die H2O-hydratisierten Pulver aus perdeuteriertem Protein vor

  1. Bereiten Sie den Probenhalter vor.
    1. Reinigen Sie einen flachen Aluminium-Probenhalter mit Indiumdrahtdichtung und Schrauben gründlich mit Wasser und Ethanol und lassen Sie ihn trocknen.
      Anmerkungen: Es wird ein flacher Probenhalter verwendet, damit sich das Pulver homogen auf der Oberfläche verteilen kann. Die Pulvermenge sollte so groß sein, dass sie zwischen den Wänden gehalten werden kann und nicht herunterfällt, wenn der Probenhalter senkrecht platziert wird.
    2. Wiegen Sie die verschiedenen Teile des Probenhalters - Boden, Deckel und Indiumdraht - separat auf einer Präzisionswaage.
    3. Setzen Sie die 1-mm-Indiumdrahtdichtung in die Nut des unteren Teils des Probenhalters ein und lassen Sie eine kleine Überlappung an den Verbindungsstellen der beiden Enden (Abbildung 2A).
    4. Geben Sie eine geeignete Menge lyophilisiertes Protein (typischerweise ~100 mg Protein) so, dass es die Innenfläche des unteren Teils des Probenhalters ausfüllt.
  2. Hydratisieren Sie das Proteinpulver.
    1. Stellen Sie den Probenhalter für 24 Stunden in einen Exsikkator mit einer Petrischale mit P2O5-Pulver, um das Proteinpulver35 vollständig zu trocknen (Abbildung 2B). Wiegen Sie den trockenen unteren Teil des Probenhalters, der die Indiumdichtung und das trockene Pulver enthält, um mtrocken zu erhalten.
      ACHTUNG: P2O5 Pulver ist sehr korrosiv.
    2. Entfernen Sie das P2 O5 aus dem Exsikkator und stellen Sie eine Petrischale mit D2O hinein. Kontrollieren Sie regelmäßig die Masse des Pulvers, um den Hydratationsgrad h = m hyd / m dry zu überprüfen, wobei mhyd und mdry die Masse des hydratisierten Pulvers bzw. des trockenen Pulvers sind.
      Anmerkungen: Bei stark hydrophoben Proteinen wie Insulin kann es erforderlich sein, die Temperatur im Exsikkator zu erhöhen, um einen höheren Dampfdruck zu erhalten und den gewünschten Hydratationsgrad h zu erreichen.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 und 2.2.2 mindestens dreimal, um alle austauschbaren Wasserstoffe ordnungsgemäß in Deuteronen umzuwandeln.
      ANMERKUNG: Alternativ können Zyklen der Gefriertrocknung und Auflösung in reinemD2Ofür einen besseren H/D-Austausch verwendet werden, vorausgesetzt, das Protein wird davon nicht beeinflusst.
    4. Hydratisieren Sie das Pulver bis etwas über den gewünschten Gehalt, lassen Sie den unteren Teil des Probenhalters mit dem Indiumdraht und dem hydratisierten Pulver auf der Präzisionswaage verbleiben und warten Sie, bis die Masse langsam auf den gewünschten Wert abnimmt, um das Ziel h zu erreichen (typischerweise 0,2-0,4, wenn ein mittelgroßes kugelförmiges Protein von einer vollständigen Hydratationsschicht bedeckt werden soll).
    5. Setzen Sie schnell den Deckel auf den unteren Teil und verschließen Sie zuerst den Probenhalter mit vier Schrauben, um den Dampfaustausch zu stoppen (ergänzende Abbildung S3A).
    6. Setzen Sie alle verbleibenden Schrauben ein und ziehen Sie sie fest, bis kein Spalt mehr zwischen dem unteren Teil und dem Deckel sichtbar ist (ergänzende Abbildung S3B).
    7. Wiegen Sie den versiegelten Probenhalter, um nach dem Neutronenexperiment auf einen möglichen Hydratationsverlust durch Lecks zu prüfen.

3. Führen Sie das inkohärente Neutronenstreuexperiment durch

  1. Besprechen und überprüfen Sie die Konfiguration des für das Experiment benötigten Instruments mit dem lokalen Kontakt einige Wochen vor der zugewiesenen Strahlzeit.
  2. Bereiten Sie die Probe im flüssigen Zustand vor.
    1. Lösen Sie das Protein im deuterierten Puffer auf.
    2. Bestimmen Sie das geeignete Flüssigkeitsvolumen, das in den Probenhalter gegeben werden soll, mit Wasser (stellen Sie sicher, dass es nicht zu einem Überlaufen kommt, wenn der Probenhalter geschlossen ist; Abbildung 2C).
      ANMERKUNG: Die folgenden Schritte (3.3 und 3.4) beschreiben ein Experiment, das mit dem NBS-Spektrometer IN16B am ILL8,9 durchgeführt wurde, wobei ein Kryoofen als Probenumgebung verwendet wurde. Das Steuerungssystem der Instrumente ändert sich von einem Instrument zum anderen, aber die Funktionsprinzipien bleiben gleich.
  3. Legen Sie die Probe ein.
    1. Trocknen Sie das Probenstäbchen gründlich ab (Abbildung 2D) und entfernen Sie die vorherige Probe, falls vorhanden, nachdem Sie überprüft haben, ob die ionisierende Strahlungsdosis niedriger als 100 μSv/h ist, bevor Sie Material anfassen (am ILL).
    2. Platzieren Sie die Probe, prüfen Sie die richtige Zentrierung relativ zur Strahlmitte (ergänzende Abbildung S4) und setzen Sie das Probenstäbchen in den Kryoofen ein (Abbildung 2D). Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um weniger als 10-3 bar zu erreichen, und spülen Sie die Luft im Kryoofen aus, indem Sie die folgenden drei Wiederholungen wiederholen: Füllen Sie den Kryoofen mit Heliumgas, bis der atmosphärische Druck erreicht ist, und entfernen Sie das Gas wieder mit der Vakuumpumpe.
      Anmerkungen: Bei einem flachen Probenhalter muss der Probenhalter in einem Winkel von 45° zum einfallenden Strahl ausgerichtet sein. Der nutzbare Impulsübertragungsbereich könnte durch Absorption und Streuung durch die Zelle reduziert werden. Ein starker Neutronenabsorber wie Cadmium kann verwendet werden, um bestimmte Teile des Probenhalters (z. B. Schrauben, dicke Teile) abzudecken.
    3. Geben Sie etwas Heliumgas in den Kryoofen, so dass der Druck ~0,05 bar beträgt.

4. Datenanalyse - QENS

  1. Importieren Sie den Datensatz mit der Methode 'IN16B_QENS.process()' in der Python-Software nPDyn v3.x36
    >>>> von nPDyn.dataParsers importieren IN16B_QENS

    >>> Stichprobe = IN16B_QENS(
    ...
    ... [detGroup=... Format>]
    ... ). process()

    >>> Stichprobe = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Führen Sie Datenkorrekturen (optional) mit den folgenden Befehlen durch (weitere Informationen finden Sie in der Dokumentation von nPDyn, Abbildung 3):
    #it wird davon ausgegangen, dass Daten für leere Zelle, Vanadium und Puffer
    # wurden bereits in den Datensatz 'empty_cell', 'Vanadium' importiert,
    # bzw. 'buffer'.

    # für die Subtraktion leerer Zellen mit einem Skalierungsfaktor
    # (Fehler werden automatisch propagiert)
    >>> Probe = Probe - 0,95 * empty_cell

    # für die Korrektur mit Paalman-Ping-Koeffizient
    # (schließt sich mit dem obigen Beispiel gegenseitig aus)
    >>> Stichprobe = sample.absorptionCorrection(empty_cell)

    # für Normalisierung
    >>> sample = sample.normalize(Vanadium)

    # für das Binning entlang der beobachtbaren Achse
    # beobachtbar ist hier die Aggregationszeit
    >>> Stichprobe = Stichprobe.bin(3, Achse=0)
  3. Passen Sie die Kalibrierungsdaten an. Der Datensatz - Samples, leere Zelle, deuterierter Puffer (falls erforderlich) und Vanadium - kann mit integrierten Modellen oder einem benutzerdefinierten Modell angepasst werden (siehe nPDyn-Dokumentation):
    >>> aus dem nPDyn.models.builtins-Import (
    ... ModellPVoigt,
    ... ModellWasser,
    ... ModellKalibriertD2O,
    ...     )

    # Eingebaute Modelle verwenden einen Säulenvektor des Impulses
    # q-Werte übertragen
    >>> q = vanadium.q[:, Keine]

    # das Vanadium wird mit einem Pseudo-Voigt-Profil montiert
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. Verwenden Sie das integrierte Modell für Hydratationswasser namens "modelWater". Dieses Modell liest sich wie in Gl. (4)17 gezeigt
    Equation 4 (4)
    Wobei a0, ar und at Skalare sind, die den relativen Beitrag des elastischen Signals, der Rotationsbewegungen bzw. der Translationsbewegungen erklären; j1(qd) ist die sphärische Bessel-Funktionl-ter Ordnung, wobei q die Impulsübertragung ist; d der O-H-Abstand im Wassermolekül; δ(ω) ist das Dirac-Delta, das hier mit dem EISF multipliziert wird; N ist die höchste Ordnung der verwendeten sphärischen Bessel-Funktion (typischerweise ~5); Equation 5 und Equation 11 sind die Lorentzschen Rotations- bzw. Translationsbewegungen; b(q) ist ein flacher Hintergrundterm. Die sphärischen Bessel-Funktionen geben den relativen Beitrag jedes Drehimpulszustands der Wassermoleküle an, und die Zahl N wird auf der Grundlage des Impulsübertragungs-q-Bereichs bestimmt. Bei einem typischen NBS-Spektrometer erklären die Terme bis N = 4 das Signal fast vollständig (ergänzende Abbildung S7).
    # Hier wird Gleichung 2 für Hydratationswasser verwendet
    # Faltung mit Auflösungsfunktion und Addition von
    # Der D2O-Hintergrund wird automatisch mit dem Befehl
    # bereitgestellte Argumente
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res = Vanadium,
    ... bkgd=Puffer,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    ANMERKUNG: Die Beiträge von Rotations- und Translationsbewegungen sollten so verworren sein, dass sie vollkommen rigoros sind. Der Erfolg eines additiven Modells ist auf das Vorhandensein unterschiedlicher Wasserpopulationen auf der Proteinoberfläche und den begrenzten zugänglichen Energiebereich zurückzuführen.
  5. Verwenden Sie Folgendes, um die Daten darzustellen (Abbildung 4):
    >>> aus nPDyn.plot importieren
    >>> Plot(Beispiel)

5. Datenanalyse - Temperaturrampe, elastische Fixed-Window-Scans (EFWS)

  1. Verwenden Sie ein ähnliches Verfahren wie in Abschnitt 4, um die Temperaturrampendaten durch das Signal bei der niedrigsten Temperatur (in der Regel 10 K) zu normalisieren:
    >>> von nPDyn.dataParsers importieren IN16B_FWS

    >>> Stichprobe = IN16B_FWS(
    ... ,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ). process()

    # Normalisierung mit den ersten 5 Punkten auf dem Observablen
    # Achse, die der Temperatur entspricht
    >>> Beispiel /= Beispiel[:5].Mittelwert(0)

    # Der hier verwendete Bereich der Impulsübertragung Q ist kleiner
    # da das verwendete Modell nur für niedrige Q gültig ist
    >>> Stichprobe = sample.get_q_range(0,2; 0,8)
  2. Verwenden Sie zum Ausgangspunkt ein einfaches Gauß-Modell, dessen Breite durch die sogenannte mittlere quadratische Verschiebung (MSD) gegeben ist. Erstellen und passen Sie das Modell mit den folgenden Befehlen an:
    >>> numpy als NP importieren
    >>> aus nPDyn.models importieren Parameter, Modell, Komponente

    # a ist ein Skalierungsfaktor
    >>> Parameter = Parameter(
    ... a={'Wert': 1, 'Grenzen': (0, np.inf)},
    ... msd={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> Modell = Modell(Parameter)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... 'Gauß',
    ... Lambda x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, Keine])

    >>> Plot(Beispiel)
    HINWEIS: Die Gaußsche Näherung gilt immer für q2MSD << 1, aber ein größerer Impulsübertragungsbereich kann für den relativen Vergleich zwischen Proben verwendet werden. Ausgefeiltere Modelle, die über die Gaußsche Approximation hinausgehen, wurden entwickelt37,38,39.

6. Datenanalyse - elastische und inelastische Fixed-Window-Scans (E/IFWS)

  1. Importieren Sie ähnlich wie in Schritt 4 den Datensatz, jedoch mit der Klasse "IN16B_FWS":
    >>> von nPDyn.dataParsers importieren IN16B_FWS

    >>> Stichprobe = IN16B_FWS(
    ...
    ... [detGroup=]
    ... ). process()

    >>> Stichprobe = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Passen Sie die Kalibrierungsdaten und die Probendaten an.
    1. Analysieren Sie die E/IFWS-Daten mit einem verallgemeinerten MSD40 oder betrachten Sie sie als grobe QENS-Spektren (mit nur wenigen Datenpunkten auf der Energieachse). Wenn E/IFWS als grobes QENS betrachtet wird, werden Modelle verwendet, die für QENS verwendet werden, um den gesamten E/IFWS-Datensatz auf einmal anzupassen (globale Anpassung von Energietransfers und Impulstransfers).
      ANMERKUNG: Die letztgenannte Lösung, die Modelle für QENS auf E/IFWS-Daten verwendet, wird hier verwendet, wenn die Impulsübertragungsabhängigkeit der Massenschwerpunktdiffusion und der internen Dynamik des Proteins auferlegt wird.
    2. Modellieren Sie die Proteindynamik in Flüssigkeiten mit folgendem Gl (5) ('modelProteinJumpDiff' in nPDyn):
      Equation 6 (5)
      Wobei R(q,ω) die Auflösungsfunktion ist; β einen Skalar, der für jede Impulsübertragung q unabhängig ist; a0 ist der elastische inkohärente Strukturfaktor (EISF); Equation 7 ein Lorentz-Scher, der die Diffusion des Massenschwerpunkts mit einer Breite berücksichtigt, die durch Gl (6) gegeben ist; Equation 12 ist ein Lorentz-Operator, der die Schwerpunktdiffusion und einen Beitrag nach dem Sprungdiffusionsmodell14 unter Berücksichtigung der internen Dynamik (Gl. (7) enthält; Equation 8 wobei das angepasste Signal von D2O um seinen Volumenanteil in der Probe neu skaliert wird.
      γ = Dsq2 (6)
      Ds ist der Eigendiffusionskoeffizient.
      Equation 9 (7)
      Di ist der scheinbare Diffusionskoeffizient für die innere Dynamik und τ eine Relaxationszeit für diffusive Bewegungen.
      >>> aus dem nPDyn.models.builtins-Import (
      ... ModellPVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... ModellKalibriertD2O,
      ... )

      # Eingebaute Modelle verwenden einen Säulenvektor des Impulses
      # q-Werte übertragen
      >>> q = vanadium.q[:, Keine]

      # das Vanadium wird mit einem Pseudo-Voigt-Profil montiert
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # für reines D2O, ein Modell mit kalibrierter Linienbreite
      # für unterschiedliche Temperaturen ist in nPDyn enthalten
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # Hier wird Gleichung 3 für flüssige Proben verwendet
      # Faltung mit Auflösungsfunktion und Addition von
      # Der D2O-Hintergrund wird automatisch mit den # bereitgestellten Argumenten erstellt
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res = Vanadium,
      ... bkgd=Puffer,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. Zeichnen Sie die angepassten Daten mit:
    >>> aus nPDyn.plot importieren
    >>> Plot(Beispiel)

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Representative Results

Die Aggregation von Lysozym zu partikulären Partikeln erfolgte bei 90 °C mit einer Proteinkonzentration von 50 mg/ml in einem deuterierten Puffer (0,1 M NaCl bei pD 10,5). Die Partikelbildung wird durch den Temperaturanstieg auf 90 °C ausgelöst und erfolgt innerhalb von 6 h (Ergänzungsbild S8). Die Datenerfassung wurde auf IN16B durchgeführt, wie im obigen Protokoll beschrieben (die Daten werden permanent von der Fernleihe kuratiert und sind unter http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811 zugänglich).

Ein QENS-Spektrum wurde bei 7 °C aufgenommen, um den Ausgangszustand vollständig zu charakterisieren. Anschließend wurde die Temperatur auf 90 °C erhöht (dauert typischerweise ~30 min bei IN16B, ergänzende Abbildung S9), um den Aggregationsprozess auszulösen. Die Kinetik kann mit einem gleitenden Mittelwert von QENS-Spektren verfolgt werden, was den Zugriff auf den gesamten Bereich der Energieübertragung ermöglicht, jedoch mit einer zeitlich begrenzten Auflösung. Die Zeitauflösung kann mit EFWS auf ~1 min und mit E/IFWS auf ~20 min bei vier Energietransferwerten5 verbessert werden.

Im vorgestellten Beispiel haben wir Energietransfers von 0, 0,6, 1,5 und 3 μeV untersucht. Die E/IFWS-Scans werden kontinuierlich während des Aggregationsprozesses aufgenommen, und für den Endzustand bei 90 °C wurde ein QENS-Spektrum aufgenommen. Die E/IFWS-Daten wurden mit dem E/IFWS der leeren Zelle für die Absorption korrigiert und mit den Vanadiumdaten normalisiert.

Für das Lysozym E/IFWS beobachten wir eine zeitliche Zunahme des Signals bei niedrigem Impulstransfer und niedrigem Energietransfer, während das Signal bei hohem Energietransfer und niedrigem Impulstransfer abnimmt (ergänzende Abbildung 10). Diese qualitative Beobachtung deutet auf die Bildung größerer Objekte hin, die langsamer diffundieren und bestätigen, dass der Aggregationsprozess stattgefunden hat. Die Analyse nach Gl (4) ergibt einen anfänglichen Massenschwerpunkt-Diffusionskoeffizienten von 15 Å2/ns, in Übereinstimmung mit dem Vorhandensein kleiner Proteincluster (unterstützt durch dynamische Lichtstreuung und HYDROPRO-Berechnungen 5,41), der dann im Laufe der Zeit exponentiell abnimmt (Abbildung 5). Der scheinbare Diffusionskoeffizient für die interne Dynamik bleibt während des gesamten Aggregationsprozesses konstant. Die Bildung von Lysozym-Partikeln scheint also in einer einzigen Aggregationsphase zu erfolgen. Das Fehlen einer Änderung der internen Proteindynamik deutet darauf hin, dass entweder die Umwandlung in Kreuz-β und die damit möglicherweise verbundene Energieänderung zu schnell sind oder dass andere treibende Effekte, wie z.B. eine Erhöhung der Lösungsmittelentropie, innerhalb des untersuchten Energiebereichs vollständig dominieren könnten.

Die Untersuchung der Dynamik des Hydratationswassers um Monomere und Fasern von Tau wurde auf SPHERES am Maier-Leibnitz Zentrum (MLZ) in Garching durchgeführt, wobei das oben beschriebene Protokoll für Pulverproben verwendet wurde. Es wurden etwa 100 mg deuteriertes Tau-Proteinpulver, hydratisiert auf 0,4 gH2Opro g Protein, verwendet. EFWS wurden während einer Temperaturrampe und QENS-Spektren bei konstanter Temperatur aufgenommen. Die EFWS wurden ab 20 K aufgezeichnet und die Temperatur auf 300 K mit einer Rate von 0,2 K/min erhöht, während während 5-minütige Scans kontinuierlich Daten erfasst wurden.

Die QENS-Spektren wurden bei 20 und bei 280 K aufgenommen. Die EFWS-Daten wurden mit Hilfe einer einfachen Gaußschen Methode über den Impulstransferbereich q 0,2 Å-1 < q < 0,8 Å-1 angepasst, um die MSD zu extrahieren (ergänzende Abbildung S11A). Die MSD-Werte liegen über der Gültigkeitsgrenze für das Gaußsche Modell. Daher empfiehlt es sich in diesem Fall, andere Modelle als die Gaußsche Approximation37,38,39 zu untersuchen. Bei Temperaturen von mehr als 220 K ist das Hydratationswasser um die Taufasern herum deutlich beweglicher als das Hydratationswasser um Tau-Monomere (Abbildung 6). Die Anpassung der QENS-Daten ermöglicht es den Benutzern, die Linienbreite und den relativen Beitrag der elastischen, Rotations- und Translationsbewegungen von Hydratationswasser in der Probe zu erhalten (ergänzende Abbildung S11B). Es scheint, dass der Anteil der Wassermoleküle, die eine Translationsbewegung durchlaufen, um die Fasern herum erhöht ist, und sowohl der Translations- als auch der Rotationsdiffusionskoeffizienten der Wassermoleküle sind um die Fasern erhöht17,31. Im Gegensatz dazu änderte sich die ps-ns-interne Dynamik des Proteins Tau, die die Bewegungen des Rückgrats und der Seitenkette widerspiegelt, bei Flimmern nicht.

Figure 2
Abbildung 2: Basis eines flachen Aluminium-Probenhalters. (A) Der flache Aluminium-Probenhalter stellt einen zentralen Teil dar, der den Neutronen ausgesetzt ist, wo das Proteinpulver in einem kleinen Spalt - typischerweise ~0,3 mm - zwischen der Basis und dem Deckel gehalten wird. Zur Abdichtung kann ein Indiumdraht verwendet werden, da er Temperaturerhöhungen bis zu 90 °C standhält. Bei höheren Temperaturen kann eine Teflondichtung verwendet werden. (B) Das Proteinpulver wird mit dem Indiumdraht in den Boden des Probenhalters gegeben. Der Probenhalter wird in einem Exsikkator in Gegenwart von entweder P 2 O5 zum Trocknen oder H 2 O/D2O zur Hydratation platziert. Vakuumfett wird hinzugefügt, um ein Leck zwischen dem Boden und dem Deckel des Exsikkators zu vermeiden. Vakuum kann mit Vorsicht verwendet werden, um den Trocknungsprozess zu beschleunigen. Bei stark hydrophoben Proben kann eine Erwärmung des Bodens des Exsikkators erforderlich sein. (C) Die Proteinlösung wird zwischen dem inneren und äußeren Zylinder platziert. Achten Sie darauf, nicht zu viel Flüssigkeit zu pipettieren (bei geschlossenem Probenhalter darf es nicht zu einem Überlauf kommen). Der Indiumdraht wird in die kreisförmige Nut gelegt. (D) Der Probenstab (im Hintergrund) ermöglicht die Steuerung der Probenhöhe und -ausrichtung und kann verschiedene Regler und Detektoren für Probenumgebungen (Temperatur, Druck) enthalten. Das Probenstäbchen wird von der Oberseite des Kryoofens (vorne) eingeführt, wodurch die Temperatur während des Experiments gesteuert wird. Während des Experiments trifft der Neutronenstrahl normalerweise auf den Boden des Kryoofens, wie das weiße Rechteck anzeigt (die Größe des Strahls hängt von der Gerätekonfiguration ab). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Datenkorrekturen und Normalisierung können die Anpassung verbessern. Die Daten wurden mit nPDyn importiert, wie im Protokoll beschrieben. Links wurde der Datensatz nur mit den Daten des Monitors normalisiert. Richtig, das Signal der leeren Dose wurde zusammen mit den Paalman-Ping-Koeffizienten43 verwendet, um die Neutronenabsorption aus dem Probenhalter zu korrigieren. Anschließend wurde das angepasste Modell für das Vanadiumsignal unabhängig für jeden Impulstransfer q integriert und das Ergebnis zur Normalisierung des Probendatensatzes verwendet. In beiden Diagrammen bezeichnet S(q,ω) das Streusignal, q ist die Impulsübertragung und Equation 3 ist die Energieübertragung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Von nPDyn generiertes Plotfenster, das das Ergebnis der Anpassung anzeigt. Die QENS-Daten wurden mit nPDyn angepasst, wie im Protokoll beschrieben. Das Plotfenster ermöglicht es dem Benutzer, die Daten entlang verschiedener Achsen darzustellen - beobachtbar (Zeit, Temperatur oder Druck), Impulsübertragung q oder Energieübertragung - und Selektoren stehen zur Verfügung, um entlang der anderen Achsen zu navigieren. Es stehen verschiedene Arten von Diagrammen zur Verfügung, wobei das einfache "Diagramm" in (A) und die "Analyse - q-weise" in (B) dargestellt werden. Die Schaltfläche "Plot" zeigt die verschiedenen Datensätze in separaten Subplots, die Schaltfläche "Vergleichen" zeigt die Datensätze im selben Diagramm an, die Schaltfläche "3D-Plot" zeigt die Datensätze in verschiedenen 3D-Subplots, ähnlich wie s, die Schaltfläche "Analyse - q-weise" zeigt die angepassten Parameter als Funktion der Impulsübertragung q und "Analyse - beobachtbar"' zeigt die angepassten Parameter als Funktion des Beobachtbaren (Zeit, Temperatur oder Druck) an. Abkürzung: QENS = quasielastische Neutronenstreuung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Die Lysozym-Aggregation erfolgt in einem einstufigen Prozess mit konstanter interner Dynamik. Das Lysozym wurde im Aggregationspuffer gelöst (an anderer Stelle5 beschrieben), und E/IFWS wurde während der Aggregation erworben, die durch Erhöhung der Temperatur auf 90 °C ausgelöst wurde. Nach der Absorptionskorrektur mit einer leeren Zelle und der Normalisierung mit dem Vanadiumsignal wurden die Daten mit dem im Protokoll beschriebenen Sprungdiffusionsmodell analysiert. Der angepasste Selbstdiffusionskoeffizient des Massenschwerpunkts wird als Funktion der Zeit (blaue Dreiecke) zusammen mit dem scheinbaren Diffusionskoeffizienten für die interne Dynamik (orangefarbene Quadrate) aufgetragen. Diese Zahl ist von 5. Abkürzung: E/IFWS = elastische und inelastische Fixed-Window-Scans. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Die Dynamik des Hydratationswassers um die Tau-Fasern ist erhöht. DieH2O-hydratisiertenPulver aus deuterierten Tau-Fasern und Monomeren wurden in einem flachen Aluminium-Probenhalter versiegelt, und EFWS-Daten wurden während einer Temperaturrampe von 20 bis 300 K erfasst. Nach der Absorptionskorrektur mit einer leeren Zelle und der Normalisierung mit dem Vanadiumsignal wurden die Daten mit dem im Protokoll beschriebenen Sprungdiffusionsmodell analysiert. Dieses Bild wurde mit einem kleineren q-Bereich (0,2 < q < 0,8 Å-1) aus Daten von 31 neu gezeichnet. Abkürzung: EFWS = elastic fixed-window scans. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung S1: Fotografien des Instruments IN16B am ILL. (nach oben) Das Instrument IN16B von der dem Instrument gewidmeten strahlungskontrollierten Zone aus gesehen. Der einfallende Strahl wandert innerhalb des Neutronenleiters zur Vakuumkammer, die die meisten Elemente des Instruments (PST-Chopper, Analysatoren, Probe, Detektoren) enthält. (unten) Innenraum der Vakuumkammer. Der PST-Chopper ist sichtbar, ebenso wie die Analysatoren, die den Kryoofen umgeben, in dem sich die Probe befindet. Die Detektoren befinden sich hinter dem Kryoofen. Mit freundlicher Genehmigung von Laurent Thion, ecliptique. Abkürzung: PST = Phasenraumtransformation. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Skizze von IN16B im klassischen (mit Dopplerantrieb) und BATS-Modus. (A) Der Neutronenstrahl wird durch den Geschwindigkeitswähler teilweise monochromatisiert. Anschließend erzeugen die Hintergrund- und PST-Chopper einen Neutronenpuls, aus dem der Doppler-Monochromator ein Energieprofil auswählt (E/IFWS- oder QENS-Modus). Die Neutronen werden dann von der Probe gestreut und eine einzelne Energie wird von den Analysatoren in Richtung der Detektoren reflektiert. Mit freundlicher Genehmigung der Fernleihe. (B) Die BATS-Chopper werden verwendet, um einen einzelnen Neutronenpuls mit einem definierten Energiebereich zu definieren. Der Neutronenstrahl wird durch den Geschwindigkeitswähler teilweise monochromatisiert. Anschließend entfernt der Hintergrundzerkleinerer unerwünschte Neutronen, die nicht zum ausgewählten Puls gehören. Die Neutronen werden dann von der Probe gestreut und eine einzelne Energie wird von den Analysatoren in Richtung der Detektoren reflektiert. Mit freundlicher Genehmigung der Fernleihe. Abkürzungen: BATS = Rückstreu- und Flugzeitspektrometer; PST = Phasenraumtransformation; E/IFWS = elastische und unelastische Scans mit festem Fenster; QENS = quasielastische Neutronenstreuung; PG = pyrolytischer Graphit. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Der Probenhalter wird schnell geschlossen, nachdem das Pulver die gewünschte Hydratation erreicht hat, und versiegelt. (A) Der flache Probenhalter wird mit vier Schrauben schnell verschlossen. Durch den Indiumdraht bleibt ein kleiner Spalt zurück. Die anderen Schrauben werden dann hinzugefügt, und der Probenhalter wird langsam verschlossen, indem jede Schraube mehrmals vorsichtig angezogen wird, damit sich das Indium entspannen kann. (B) Der flache Probenhalter ist ordnungsgemäß abgedichtet, wenn kein Spalt mehr zwischen dem Halterboden und dem Deckel sichtbar ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Der Probenhalter ist in Bezug auf den Neutronenstrahl zentriert. Auf dem Probenstäbchen wurde ein zylindrischer Probenhalter platziert. Die Position des Probenhalters wird so überprüft, dass der Strahl auf den unteren Teil des Halters trifft. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S6: Einrichten einer Temperaturrampe und E/IFWS auf IN16B mit NOMAD. (A) Der FurnaceCryostat-Controller wird in die Startrampe eingefügt und wie im Protokoll beschrieben konfiguriert (Schritt 3.4.6). (B) Der For-Schleifencontroller wird in das Launch Pad eingefügt und die entsprechenden Controller werden eingefügt und wie im Protokoll beschrieben konfiguriert (Schritt 3.4.7). Abkürzung: E/IFWS = elastische und inelastische Fixed-Window-Scans. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S7: Die ersten fünf sphärischen Bessel-Funktionen erklären den größten Teil des Rotationsbeitrags von Hydratationswasser. Die ersten acht sphärischen Bessel-Funktionen werden mit einem Wert d = 0,98 Å und Werten der Impulsübertragung q von 0 bis 3 Å (durchgezogene farbige Linien) aufgetragen. Der Impulsübertragungsbereich von 0,3 Å < q < 1,8 Å wird durch die blau gestrichelten Linien begrenzt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S8: Lysozym bildet reproduzierbar Partikel. Lysozym wurde im Aggregationspuffer gelöst (hergestellt wie im Protokoll, Schritt 1 beschrieben), und ThT wurde zu einer Endkonzentration von 2 μM hinzugefügt, um die Bildung einer Kreuz-β-Struktur mittels Fluoreszenz zu überwachen. Das Diagramm stellt den Durchschnitt von drei unabhängigen Messungen dar, und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Der Ausschnitt zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der Partikel, die sich nach 6 h Aggregation gebildet haben. Maßstabsbalken = 20 μm. Diese Zahl ist von 5. Abkürzung: ThT = Thioflavin T. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S9: Schnelle Temperaturrampe, wie sie bei IN16B verfügbar ist. Im schnellen Modus des IN16B kann die Temperatur in ca. 30 min von 280 K auf 363 K erhöht werden. Diese Zahl ist von 5. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S10: E/IFWS-Daten zu Lysozym während der Aggregation zu Partikeln. Das Lysozym wurde im Aggregationspuffer gelöst (an anderer Stelle5 beschrieben), und E/IFWS wurde während der Aggregation erworben, die durch Erhöhung der Temperatur auf 90 °C ausgelöst wurde. Die Daten - nach der Absorptionskorrektur mit einer leeren Zelle und der Normalisierung mit dem Signal von Vanadium - werden gegen den Impulstransfer q und die Zeit für den verschiedenen gemessenen Energietransfer 0 μeV (oben links), 0,6 μeV (oben rechts), 1,5 μeV (unten links) und 3 μeV (unten rechts) aufgetragen. Für jedes Teildiagramm entspricht die vertikale Achse dem Streusignal S(q, ΔE), aufgetragen gegen die experimentelle Zeit in Stunden und den Impulstransfer q. Diese Zahl ist von 5. Abkürzung: E/IFWS = elastische und inelastische Fixed-Window-Scans. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S11: Anpassung der Hydratationswasserdaten von Tau. (A) Anpassung der EFWS-Daten unter Verwendung einer Gauß-Zahl. DasH2O-hydratisiertePulver aus deuterierten Tau-Monomeren wurde in einem flachen Aluminium-Probenhalter versiegelt, und EFWS wurden während einer Temperaturrampe von 20 bis 300 K aufgenommen. Die experimentellen Daten (elastisches Signal S(q, 0) auf der vertikalen Achse-blaue Linie mit Fehlerbalken) werden für den Impulstransfer q-Bereich 0,2 < q < 0,6 Å-1 zusammen mit der angepassten Gauß-Zahl , die zur Extraktion der MSD verwendet wird, aufgetragen. (B) Translations- und Rotationsbewegungen von Hydratationswasser, das aus der QENS-Armatur gewonnen wird. DieH2O-hydratisiertenPulver aus deuterierten Taufasern (links) und Monomeren (rechts) wurden in einem flachen Aluminiumprobenhalter versiegelt, und QENS-Daten wurden bei 280 K erfasst. Die experimentellen Daten (Intensität S(q,ω) als Funktion des Energietransfers) für Fasern (blaue Dreiecke) und Monomere (grüne Punkte) werden zusammen mit dem angepassten Modell (schwarze durchgezogene Linie) und seinen Komponenten, dem Hintergrund (blau), der Auflösungsfunktion (grün), den Rotationen (rot) und den Translationen (cyan) für den Impulstransfer q = 0,783 Å-1 aufgetragen. Diese Zahl stammt aus dem 31. Abkürzungen: QENS = quasielastische Neutronenstreuung, EFWS = elastische Fixed-Window-Scans; MSD = mittlere quadratische Verschiebung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die Neutronenspektroskopie ist die einzige Methode, die es ermöglicht, die ensemblegemittelte ps-ns-Dynamik von Proteinproben unabhängig von der Größe des Proteins oder der Komplexität der Lösung bei Verwendung der Deuterierung zu untersuchen6. Insbesondere durch die Untersuchung der Selbstdiffusion von Proteinanordnungen in Lösung kann die hydrodynamische Größe solcher Anordnungen eindeutig bestimmt werden. Nichtsdestotrotz ist die Methode in der Regel durch den geringen Neutronenfluss begrenzt, was lange Erfassungszeiten und die Notwendigkeit großer Probenmengen (typischerweise 100 mg Protein) impliziert, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis innerhalb der zugewiesenen Strahlzeit zu erhalten.

Probenvorbereitung (Protokollschritte 1 und 2). Für Proben im flüssigen Zustand beträgt die Mindestkonzentration, die verwendet werden kann, ~50 mg/ml (niedrigere Konzentrationen können auf Kosten längerer Erfassungszeiten verwendet werden). Eine hohe Proteinkonzentration ist mit schnelleren Flimmerraten verbunden, was bei der Anpassung der Messung an die zugewiesene Strahlzeit hilft, aber auch den Aggregationsweg beeinflussen kann44. Daher ist eine gründliche Probencharakterisierung mit komplementären Methoden, wie z.B. Rasterkraft- oder Elektronenmikroskopie, notwendig.

Das Material des Probenhalters ist auch ein Punkt, der bei der Vorbereitung der Proben berücksichtigt werden muss, da Aluminiumlegierungen der Korrosion unterliegen45. Eine typische Aluminiumlegierung, die eine gute Korrosionsbeständigkeit aufweist und eine geringe Neutronenabsorption aufweist, ist die Europäische Norm (EN) AW-6060 [AlMgSi], die aus 98%-98,75% Al, 0,1% Ti, 0,15% Zn, 0,05% Cr, 0,35%-0,6% Mg, 0,1% Mn, 0,1% Cu, 0,1%-0,3% Fe und 0,3%-0,6% Si besteht. Korrosion kann minimiert werden, z. B. durch Verkürzung der Verweildauer im Probenhalter oder durch Verwendung einer Schutzbeschichtung (die das Hintergrundsignal verstärken kann) wie z Nickel oder Gold.

Für pulverförmige Proben von hydrierten Proteinen wurde gezeigt, dass das Gefriertrocknungsverfahren mit einem Schritt in einem Exsikkator in Gegenwart von P2O5-Pulvereffizient abgeschlossen werden kann, um so viel Restlicht wie möglich zu entfernen35. Bei Pulverproben wird auch empfohlen, das Pulver in seinem endgültigen, hydratisierten Zustand zu charakterisieren (mittels Rasterkraftmikroskopie und Röntgenpulverbeugung) und die Auswirkungen von Deuterierung, Gefriertrocknung und Dampfdiffusion sowohl auf den Monomer- als auch auf den Faserzustand zu bewerten. Insbesondere die Gefriertrocknung kann die Fasern brechen, was zu verkürzten Segmenten führt, ohne die Morphologie zu beeinträchtigen. Darüber hinaus wurde durch Röntgenleistungsbeugung beobachtet, dass eine langsame Abkühlung anstelle einer Blitzkühlung in flüssigem Stickstoff das Vorhandensein von Amyloid-ähnlichen Strukturen induzieren könnte (unveröffentlichtes Ergebnis).

Datenerfassung (Protokollschritt 3). Es wird empfohlen, die Datenerhebung vor dem Experiment mit dem lokalen Ansprechpartner zu planen (auch wenn dies während des Antragsschreibprozesses besprochen wurde). Der Datenerfassungsplan kann sich nach den ersten Scans ändern, abhängig vom erzielten Signal-Rausch-Verhältnis. Insbesondere für zeitaufgelöste Experimente ermöglicht die Verwendung von E/IFWS eine schnelle Datenerfassung - 30 s bis 1 min für die elastische Linie, 4-5 min für einen Datenpunkt bei 3 μeV5 -, aber der Bereich der zugänglichen Energieübertragungen ist von Natur aus begrenzt. Alternativ kann ein gleitender Durchschnitt der QENS-Daten verwendet werden46. Zu diesem Zweck bietet die neue Rückstreu- und Flugzeitspektroskopie-Option (BATS) auf IN16B einen höheren Fluss als das klassische IN16B mit einem Energiebereich von ±150 μeV (oder höher, je nach verwendeter Konfiguration) auf Kosten einer geringeren Auflösung in Energie11. Daher empfiehlt sich die BATS-Option für zeitaufgelöste Studien, insbesondere für Prozesse wie die Amyloid-Aggregation, die über mehrere Stunden stattfindet.

Datenanalyse (Protokollschritte 4, 5 und 6). Die Streufunktion S(q,ω) umfasst alle Arten von Bewegungen in der Probe, und die im obigen Protokoll beschriebenen Modelle sind Näherungen. Insbesondere für IDP im flüssigen Zustand können die großräumigen Bewegungen der ungeordneten Kette über die gleiche Länge und Zeitskala wie die Massenschwerpunktdiffusion des gesamten Proteins auftreten. Daher sollte der Anwender bedenken, dass die Trennung von Massenschwerpunktdiffusion und Proteininterndynamik nicht immer einfach ist. Das Anpassungsverfahren kann von Informationen über die Massenschwerpunktdiffusion profitieren, die durch komplementäre Methoden gewonnen werden, so dass dieser Parameter festgelegt werden kann (wobei zu berücksichtigen ist, dass andere Methoden einen kollektiven Diffusionskoeffizienten liefern können, der mit unterschiedlichen Zeit- und Längenskalen verbunden ist), um ein robusteres Ergebnis für die interne Dynamik zu erhalten.

Neben der Neutronenstreuung kann die Dynamik eines molekularen Systems durch Kernspinresonanz (NMR) charakterisiert werden, die lokale Informationen über isotopenmarkierte Proteine und auf einer Vielzahl von Zeitskalen liefert47,48,49. Die Methode wurde erfolgreich zur Untersuchung von Amyloid-Systemen 48,50,51,52,53 eingesetzt, erlaubt es den Anwendern jedoch nicht, einfach Hydratationswasser zu untersuchen oder den Amyloid-Aggregationsprozess in Echtzeit zu verfolgen, da die Proteingröße inhärent begrenzt ist. Neuere Entwicklungen in der Elektronenspinresonanzspektroskopie (EPR) und der von EPR abgeleiteten Methode Overhauser dynamische Kernpolarisation (ODNP) bieten in Kombination mit Neutronenstreuung eine gute Perspektive. In der Tat können EPR und ODNP trotz ortsgerichteter Spinmarkierung (SDSL) das Protein54 bzw. die Hydratationsdynamik55 auf der ps-ns-Zeitskala um die eingeführte Spinmarkierung herum untersuchen.

Diese Methoden wurden verwendet, um die Aggregation des Tau-56,57-Proteins zu untersuchen, und bieten eine große Komplementarität mit der Neutronenstreuung, die ähnliche Informationen erhalten kann, aber über die gesamte Probe gemittelt wird. Darüber hinaus kann die Infrarotspektroskopie dynamische Informationen für hochenergetische Bewegungen liefern, die mit bestimmten Strukturmustern verbunden sind, aber die Komplexität der Proteinumgebung (verwendeter Puffer) kann die Dateninterpretation beeinflussen58,59. Die Neutronenrückstreutechniken bieten einen einzigartigen und komplementären Blick auf die Dynamik von Protein- und Hydratationswasser auf der ps-ns-Zeitskala zusammen mit den Ergebnissen der oben genannten Methoden. Sie erfordern keine spezifische Markierung der Probe, die Signalqualität ist nicht empfindlich gegenüber der Größe des Proteins, und Messungen können in vivo oder in hochkomplexen, deuterierten Umgebungen wie deuteriertem bakteriellem Lysat 3,6,7 durchgeführt werden. Da diese Methode ein ensemblegemitteltes Ergebnis liefert, wird sie durch Molekulardynamik-Simulationen gut ergänzt, um atomare Detailinformationen über das untersuchte System zu erhalten. Die Simulationen können leicht durch einen direkten Vergleich zwischen dem experimentellen Datensatz und den theoretischen QENS-Spektren validiert werden, die aus der Simulationstrajektorie mit Software wie mdanse60 berechnet wurden.

In Bezug auf Amyloid-Systeme hat sich die Neutronenrückstreuung als nützlich erwiesen, um die ps-ns-Protein- und Wasserdynamik für verschiedene Systeme und Bedingungen zu charakterisieren 5,31,61,62,63,64. Insbesondere wurde die Neutronenrückstreuung verwendet, um die Korrelation zwischen dem Anteil der Proteinsequenz, der an der Kreuzstruktur beteiligt ist β, und der Amplitude des Wasserentropiegewinns bei Flimmern aufzudecken (unveröffentlichte Ergebnisse). Darüber hinaus ermöglicht die Entwicklung von Probenumgebungen die gleichzeitige Erfassung von Neutronenspektren und entweder dielektrischen Relaxationsdaten65 oder Raman-Streudaten66. Darüber hinaus sind auf IN16B Beugungsdetektoren vorhanden, um neben dynamischen Daten auch Strukturdaten zu erhalten. Darüber hinaus wird erwartet, dass der einfallende Neutronenfluss für den BATS-Modus von IN16B in naher Zukunft verbessert wird, dank der Verwendung der sogenannten variablen Fokussierführung, deren Geometrie bei Bedarf an den verwendeten Instrumentenaufbau angepasst werden kann. Die Weiterentwicklung anspruchsvoller Probenumgebungen und Instrumente würde in Zukunft noch komplexere Experimente ermöglichen und möglicherweise gleichzeitig weitere dynamische und strukturelle Informationen liefern.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren danken Michaela Zamponi vom Jülich Centre for Neutron Science am Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, für einen Teil der Neutronenstreuexperimente, die mit dem Instrument SPHERES durchgeführt wurden. Diese Arbeit profitierte von den Aktivitäten des Konsortiums Deuteration Laboratory (DLAB), das von der Europäischen Union im Rahmen der Verträge HPRI-2001-50065 und RII3-CT-2003-505925 finanziert wurde, sowie von den vom UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) finanzierten Aktivitäten innerhalb des Institut Laue Langevin EMBL DLAB im Rahmen der Zuschüsse GR/R99393/01 und EP/C015452/1. Die Unterstützung durch die Europäische Kommission im Rahmen des 7. Rahmenprogramms im Rahmen der Leitaktion zur Stärkung des Europäischen Forschungsraums und der Forschungsinfrastrukturen wird anerkannt [Vertrag 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot und Christian Beck danken dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, Förderkennzeichen 05K19VTB) für die Förderung ihrer Postdoc-Stipendien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
  2. Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. Acta Crystallographica Section D. 74 (8), 715-726 (2018).
  3. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7 (2019).
  4. Martel, A., et al. Membrane permeation versus amyloidogenicity: A multitechnique study of islet amyloid polypeptide interaction with model membranes. Journal of the American Chemical Society. 139 (1), 137-148 (2017).
  5. Pounot, K., et al. Tracking internal and global diffusive dynamics during protein aggregation by high-resolution neutron spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (15), 6299-6304 (2020).
  6. Grimaldo, M., et al. Protein short-time diffusion in a naturally crowded environment. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (8), 1709-1715 (2019).
  7. Jasnin, M., Stadler, A., Tehei, M., Zaccai, G. Specific cellular water dynamics observed in vivo by neutron scattering and NMR. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10154-10160 (2010).
  8. Frick, B. The neutron backscattering spectrometer IN16 at ILL-high energy resolution with high intensity and excellent signal-to-noise ratio. Neutron News. 13 (2), 15-22 (2002).
  9. Frick, B., Mamontov, E., van Eijck, L., Seydel, T. Recent backscattering instrument developments at the ILL and SNS. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 224 (1-2), 33-60 (2010).
  10. Frick, B., Combet, J., van Eijck, L. New possibilities with inelastic fixed window scans and linear motor Doppler drives on high resolution neutron backscattering spectrometers. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 669, 7-13 (2012).
  11. Appel, M., Frick, B., Magerl, A. A flexible high speed pulse chopper system for an inverted neutron time-of-flight option on backscattering spectrometers. Scientific Reports. 8 (1), 13580 (2018).
  12. Squires, G. L. Introduction to the theory of thermal neutron scattering. , Dover Publications. Mineola N.Y. (1996).
  13. Bee, M. Quasielastic neutron scattering. , Available from: http://inis.iaea.org/Search/search.aspx?orig_q=RN:20038756 (1988).
  14. Singwi, K. S., Sjölander, A. Diffusive motions in water and cold neutron scattering. Physical Review. 119 (3), 863-871 (1960).
  15. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear diatomic liquids: i. free rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1279-1297 (1966).
  16. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear liquid: ii. hindered rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1299-1311 (1966).
  17. Schirò, G., et al. Translational diffusion of hydration water correlates with functional motions in folded and intrinsically disordered proteins. Nature Communications. 6, 6490 (2015).
  18. Grimaldo, M., et al. Hierarchical molecular dynamics of bovine serum albumin in concentrated aqueous solution below and above thermal denaturation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (6), 4645-4655 (2015).
  19. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 16 (11), 673-677 (1968).
  20. Bonar, L., Cohen, A. S., Skinner, M. M. Characterization of the Amyloid Fibril as a Cross-β Protein. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 131 (4), 1373-1375 (1969).
  21. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  22. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  23. Maji, S. K., et al. Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science. 325 (5938), 328-332 (2009).
  24. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  25. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. 28 (31), 6546-6561 (2016).
  26. Stephens, A. D., Kaminski Schierle, G. S. The role of water in amyloid aggregation kinetics. Current Opinion in Structural Biology. 58, 115-123 (2019).
  27. Adamcik, J., Mezzenga, R. Amyloid polymorphism in the protein folding and aggregation energy landscape. Angewandte Chemie International Edition. 57 (28), 8370-8382 (2018).
  28. Liu, Z., et al. Entropic contribution to enhanced thermal stability in the thermostable P450 CYP119. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10049-10058 (2018).
  29. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2018).
  30. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
  31. Fichou, Y., et al. Hydration water mobility is enhanced around tau amyloid fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), 6365-6370 (2015).
  32. Burns, J., Pennock, C. A., Stoward, P. J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. The Journal of Pathology and Bacteriology. 94 (2), 337-344 (1967).
  33. Iqbal, K., Liu, F., Gong, C. -X., Grundke-Iqbal, I. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies. Current Alzheimer Research. 7 (8), 656-664 (2010).
  34. Krȩżel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  35. Dolman, M., Halling, P. J., Moore, B. D., Waldron, S. How dry are anhydrous enzymes? Measurement of residual and buried 18O-labeled water molecules using mass spectrometry. Biopolymers. 41 (3), 313-321 (1997).
  36. Pounot, K. kpounotnPDyn: v3.0.0. Zenodo. , (2021).
  37. Yi, Z., Miao, Y., Baudry, J., Jain, N., Smith, J. C. Derivation of mean-square displacements for protein dynamics from elastic incoherent neutron scattering. Journal of Physical Chemistry B. 116 (16), 5028-5036 (2012).
  38. Peters, J., Kneller, G. R. Motional heterogeneity in human acetylcholinesterase revealed by a non-Gaussian model for elastic incoherent neutron scattering. The Journal of Chemical Physics. 139 (16), 165102 (2013).
  39. Zeller, D., Telling, M. T. F., Zamponi, M., García Sakai, V., Peters, J. Analysis of elastic incoherent neutron scattering data beyond the Gaussian approximation. The Journal of Chemical Physics. 149 (23), 234908 (2018).
  40. Roosen-Runge, F., Seydel, T. A generalized mean-squared displacement from inelastic fixed window scans of incoherent neutron scattering as a model-free indicator of anomalous diffusion confinement. EPJ Web of Conferences. 83, 02015 (2015).
  41. Ortega, A., Amorós, D., García de la Torre, J. Prediction of hydrodynamic and other solution properties of rigid proteins from atomic- and residue-level models. Biophysical Journal. 101 (4), 892-898 (2011).
  42. Hennig, M., Frick, B., Seydel, T. IUCr Optimum velocity of a phase-space transformer for cold-neutron backscattering spectroscopy. Journal of Applied Crystallography. 44 (3), 467-472 (2011).
  43. Paalman, H. H., Pings, C. J. Numerical evaluation of X-ray absorption factors for cylindrical samples and annular sample cells. Journal of Applied Physics. 33 (8), 2635-2639 (1962).
  44. Ow, S. -Y., Dunstan, D. E. The effect of concentration, temperature and stirring on hen egg white lysozyme amyloid formation. Soft Matter. 9 (40), 9692-9701 (2013).
  45. Tominaga, T., Sahara, M., Kawakita, Y., Nakagawa, H., Yamada, T. Evaluation of sample cell materials for aqueous solutions used in quasi-elastic neutron scattering measurements. Journal of Applied Crystallography. 54 (6), 1631-1640 (2021).
  46. Beck, C., et al. Following protein dynamics in real time during crystallization. Crystal Growth & Design. 19 (12), 7036-7045 (2019).
  47. Smith, A. A., Testori, E., Cadalbert, R., Meier, B. H., Ernst, M. Characterization of fibril dynamics on three timescales by solid-state NMR. Journal of Biomolecular NMR. 65 (3-4), 171-191 (2016).
  48. Wang, T., Jo, H., DeGrado, W. F., Hong, M. Water distribution, dynamics, and interactions with Alzheimer's β-amyloid fibrils investigated by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 139 (17), 6242-6252 (2017).
  49. Rezaei-Ghaleh, N., Giller, K., Becker, S., Zweckstetter, M. Effect of zinc dinding on β-amyloid structure and dynamics: Implications for Aβ aggregation. Biophysical Journal. 101 (5), 1202-1211 (2011).
  50. Vugmeyster, L., et al. Fast motions of key methyl groups in amyloid-β fibrils. Biophysical Journal. 111 (10), 2135-2148 (2016).
  51. Yang, X., Wang, B., Hoop, C. L., Williams, J. K., Baum, J. NMR unveils an N-terminal interaction interface on acetylated-α-synuclein monomers for recruitment to fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (18), (2021).
  52. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human α-synuclein. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (5), 409-415 (2016).
  53. Karamanos, T. K., Kalverda, A. P., Thompson, G. S., Radford, S. E. Mechanisms of amyloid formation revealed by solution NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 88-89, 86-104 (2015).
  54. Lai, Y. -C., Kuo, Y. -H., Chiang, Y. -W. Identifying protein conformational dynamics using spin-label ESR. Chemistry - An Asian Journal. 14 (22), 3981-3991 (2019).
  55. Franck, J. M., Han, S. Overhauser dynamic nuclear polarization for the study of hydration dynamics, explained. Methods in Enzymology. 615, 131-175 (2019).
  56. Pavlova, A., et al. Protein structural and surface water rearrangement constitute major events in the earliest aggregation stages of tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 127-136 (2016).
  57. Lin, Y., et al. Liquid-liquid phase separation of tau driven by hydrophobic interaction facilitates fibrillization of tau. bioRxiv. , (2020).
  58. Decatur, S. M. Elucidation of residue-level structure and dynamics of polypeptides via isotope-edited infrared spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 39 (3), 169-175 (2006).
  59. Chatani, E., Tsuchisaka, Y., Masuda, Y., Water Tsenkova, R. molecular system dynamics associated with amyloidogenic nucleation as revealed by real time near infrared spectroscopy and aquaphotomics. PLoS One. 9 (7), 101997 (2014).
  60. Goret, G., Aoun, B., Pellegrini, E. MDANSE: An interactive analysis environment for molecular dynamics simulations. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (1), 1-5 (2017).
  61. Fujiwara, S., et al. Internal dynamics of a protein that forms the amyloid fibrils observed by neutron scattering. Journal of the Physical Society of Japan. 82, Suppl A (2013).
  62. Schiró, G., et al. Neutron scattering reveals enhanced protein dynamics in concanavalin a amyloid fibrils. Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (8), 992-996 (2012).
  63. Pounot, K., et al. Zinc determines dynamical properties and aggregation kinetics of human insulin. Biophysical Journal. 120 (5), 886-898 (2021).
  64. Fujiwara, S., et al. Dynamic properties of human α-synuclein related to propensity to amyloid fibril formation. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3229-3245 (2019).
  65. Sanz, A., et al. High-pressure cell for simultaneous dielectric and neutron spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 89 (2), 023904 (2018).
  66. Adams, M. A., et al. Simultaneous neutron scattering and Raman scattering. Applied Spectroscopy. 63 (7), 727-732 (2009).

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Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser
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Pounot, K., Appel, M., Beck, C., Weik, M., Schirò, G., Fichou, Y., Seydel, T., Schreiber, F. High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water. J. Vis. Exp. (182), e63664, doi:10.3791/63664 (2022).

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