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Biochemistry

La spectroscopie neutronique à haute résolution pour étudier la dynamique picoseconde-nanoseconde des protéines et de l’eau d’hydratation

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

La spectroscopie de rétrodiffusion neutronique offre un accès non destructif et sans marquage à la dynamique ps-ns des protéines et de leur eau d’hydratation. Le flux de travail est présenté avec deux études sur les protéines amyloïdes: sur la dynamique résolue dans le temps du lysozyme pendant l’agrégation et sur la dynamique de l’eau d’hydratation de tau lors de la formation de fibres.

Abstract

La diffusion neutronique offre la possibilité de sonder la dynamique dans les échantillons pour une large gamme d’énergies d’une manière non destructive et sans marquage autre que le deutérium. En particulier, la spectroscopie de rétrodiffusion neutronique enregistre les signaux de diffusion à plusieurs angles de diffusion simultanément et est bien adaptée pour étudier la dynamique des systèmes biologiques sur l’échelle de temps ps-ns. En utilisant des composants tampons D2O et éventuellement deutérés, la méthode permet de surveiller à la fois la diffusion du centre de masse et les mouvements du squelette et de la chaîne latérale (dynamique interne) des protéines à l’état liquide.

De plus, la dynamique de l’eau d’hydratation peut être étudiée en utilisant des poudres de protéines perdeutérées hydratées avecH2O. Cet article présente le flux de travail utilisé sur l’instrument IN16B à l’Institut Laue-Langevin (ILL) pour étudier la dynamique des protéines et de l’eau d’hydratation. La préparation d’échantillons de solution et d’échantillons de poudre de protéines hydratées par échange de vapeur est expliquée. La procédure d’analyse des données pour la dynamique des protéines et de l’eau d’hydratation est décrite pour différents types d’ensembles de données (spectres quasi-élastiques ou balayages à fenêtre fixe) qui peuvent être obtenus sur un spectromètre de rétrodiffusion de neutrons.

La méthode est illustrée par deux études portant sur des protéines amyloïdes. L’agrégation du lysozyme en agrégats sphériques de taille μm - notés particules - se produit dans un processus en une étape sur l’espace et la plage temporelle sondés sur IN16B, tandis que la dynamique interne reste inchangée. De plus, la dynamique de l’hydratation de l’eau de tau a été étudiée sur des poudres hydratées de protéines perdeutérées. Il est montré que les mouvements de translation de l’eau sont activés lors de la formation de fibres amyloïdes. Enfin, les étapes critiques du protocole sont discutées quant à la position de la diffusion neutronique par rapport à l’étude de la dynamique par rapport à d’autres méthodes biophysiques expérimentales.

Introduction

Le neutron est une particule massive et sans charge qui a été utilisée avec succès au fil des ans pour sonder des échantillons dans divers domaines allant de la physique fondamentale à la biologie1. Pour les applications biologiques, la diffusion neutronique aux petits angles, la diffusion inélastique des neutrons, la cristallographie et la réflectométrie neutroniques sont largement utilisées 2,3,4. La diffusion inélastique des neutrons fournit une mesure de la dynamique en moyenne d’ensemble sans nécessiter de marquage spécifique en soi, et une qualité de signal qui ne dépend pas de la taille ou de la protéine5. La mesure peut être effectuée en utilisant un environnement très complexe pour la protéine étudiée qui imite le milieu intracellulaire, comme un lysat bactérien deutéré ou même in vivo 3,6,7. Différentes configurations expérimentales peuvent être utilisées pour étudier la dynamique, à savoir i) le temps de vol donnant accès à la dynamique sous-ps-ps, ii) l’accès à la rétrodiffusion donnant accès à la dynamique ps-ns, et iii) l’accès spin-echo-donnant accès à la dynamique de ns à des centaines de ns. La rétrodiffusion neutronique utilise la loi de Bragg 2d sinθ = nλ, où d est la distance entre les plans d’un cristal, θ l’angle de diffusion, n l’ordre de diffusion et λ la longueur d’onde. L’utilisation de cristaux pour la rétrodiffusion vers les détecteurs permet d’obtenir une haute résolution en énergie, typiquement ~0,8 μeV. Pour mesurer l’échange d’énergie, soit un entraînement Doppler transportant un cristal en rétrodiffusion est utilisé pour définir et régler la longueur d’onde neutronique entrante 8,9,10 (Figure 1), soit une configuration de temps de vol peut être utilisée au prix d’une diminution de la résolution d’énergie 11.

Figure 1
Figure 1 : Croquis d’un spectromètre de rétrodiffusion à neutrons avec un entraînement Doppler. Le faisceau entrant frappe le hacheur42 de transformation de l’espace de phase (PST), ce qui augmente le flux à la position de l’échantillon. Il est ensuite rétrodiffusé vers l’échantillon par le lecteur Doppler, qui sélectionne une énergieE1 (flèche cyan). Les neutrons sont ensuite dispersés par l’échantillon (avec différentes énergies représentées par la couleur des flèches) et les analyseurs, constitués de cristaux de Si 111, ne feront que rétrodiffuser des neutrons avec une énergie spécifique E0 (flèches de couleur rouge ici). Par conséquent, le transfert de quantité de mouvement q est obtenu à partir de la position détectée du neutron sur le réseau de détecteurs, et le transfert d’énergie est obtenu à partir de la différence E1- E0. Le temps de vol prévu pour l’impulsion de neutrons produite par le PST est utilisé pour rejeter le signal des neutrons diffusés directement vers les tubes détecteurs. Abréviation : PST = transformation de l’espace de phase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour la spectroscopie de rétrodiffusion, la principale contribution au signal des échantillons riches en protons d’hydrogène, tels que les protéines, provient de la diffusion incohérente, pour laquelle l’intensité de diffusion Sinc(q, ω) est représentée par Eq (1)12

Equation 1 (1)

Où σinc est la section efficace incohérente de l’élément considéré, k' est la norme du vecteur d’onde diffusé, k la norme du vecteur d’onde entrant, q (= k - k') le transfert de quantité de mouvement, r j(t) le vecteur position de l’atome j au temps t, et ω la fréquence correspondant au transfert d’énergie entre le neutron entrant et le système. Les crochets angulaires indiquent la moyenne de l’ensemble. Par conséquent, la diffusion incohérente sonde l’auto-corrélation d’une seule particule moyenne d’ensemble des positions des atomes avec le temps et donne l’autodynamique moyenne sur tous les atomes du système et différentes origines temporelles (moyenne d’ensemble). La fonction de diffusion est la transformée de Fourier dans le temps de la fonction de diffusion intermédiaire I(q, t), qui peut être vue comme la transformée de Fourier dans l’espace de la fonction de corrélation de van Hove représentée par Eq (2):

Equation 2 (2)

Où ρ(r,t) est la densité de probabilité de trouver un atome à la position r et au temps t 13.

Pour un processus de diffusion de Fickian, la fonction d’autodiffusion résulte (voir Eq (3)) après une double transformée de Fourier dans une fonction de diffusion consistant en un Lorentzien de largeur de droite donnée par γ = Dq2.

Equation 10 (3)

Des modèles plus sophistiqués ont été développés et jugés utiles, tels que le modèle de diffusion de saut de Singwi et Sjölander pour la dynamique des protéines internes ps-ns14 ou le modèle de rotation de Sears pour l’eau d’hydratation15,16,17.

Sur l’instrument de rétrodiffusion de neutrons (NBS) IN16B8,9 à l’ILL, Grenoble, France (Figure supplémentaire S1), une configuration couramment utilisée avec des protéines est constituée de cristaux de Si 111 pour les analyseurs avec un entraînement Doppler pour régler la longueur d’onde entrante (Figure supplémentaire S2A), donnant ainsi accès à la plage de transfert de quantité de mouvement ~0,2 Å-1 < q < ~2 Å-1 et à la plage de transfert d’énergie de -30 μeV < Equation 3 < 30 μeV-correspondant à des échelles de temps allant de quelques ps à quelques ns et des distances de quelques Å. En outre, IN16B offre la possibilité d’effectuer des balayages élastiques et inélastiques à fenêtre fixe (E/IFWS)10, qui incluent l’acquisition de données lors d’un transfert d’énergie fixe. Comme le flux est limité lorsque l’on travaille avec des neutrons, E/IFWS permet de maximiser le flux pour un transfert d’énergie, réduisant ainsi le temps d’acquisition nécessaire pour obtenir un rapport signal sur bruit satisfaisant. Une option plus récente est le spectromètre de rétrodiffusion et de temps de vol (BATS) mode11, qui permet de mesurer une large gamme de transferts d’énergie (par exemple, -150 μeV < Equation 3 < 150 μeV), avec un flux plus élevé qu’avec le lecteur Doppler, mais au prix d’une résolution énergétique inférieure (figure supplémentaire S2B).

Une propriété importante de la diffusion des neutrons est que la section efficace incohérente σinc a une valeur 40 fois plus élevée pour l’hydrogène que pour le deutérium et est négligeable pour d’autres éléments couramment trouvés dans les échantillons biologiques. Par conséquent, la dynamique des protéines dans un environnement liquide peut être étudiée en utilisant un tampon deutérisé, et l’état de la poudre permet l’étude soit de la dynamique interne des protéines avec de la poudre de protéine hydrogénée hydratée avec D2O, soit de l’étude de l’eau d’hydratation pour la poudre de protéine perdeutérée hydratée avecH2O. À l’état liquide, la rétrodiffusion neutronique permet généralement d’accéder simultanément à l’autodiffusion du centre de masse des protéines (diffusion de type fickien) et à leur dynamique interne. Ces derniers sont des mouvements de colonne vertébrale et de chaîne latérale généralement décrits par le modèle dit de diffusion de saut ou d’autres 3,18. Dans les poudres de protéines hydrogénées, la diffusion des protéines est absente et seule la dynamique interne doit être modélisée. Pour l’eau d’hydratation, les contributions des mouvements translationnels et rotationnels des molécules d’eau présentent une dépendance différente du transfert de quantité de mouvement q, ce qui permet leur distinction dans le processus d’analyse des données17.

Cet article illustre la méthode de rétrodiffusion des neutrons avec l’étude des protéines qui se sont avérées capables de se déplier, de s’agréger sous une forme canonique composée d’empilements de brins β - le motif dit de βcroisée 19,20 - et de former des fibres allongées. C’est ce qu’on appelle l’agrégation amyloïde, qui est largement étudiée en raison de son rôle central dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson21,22. L’étude des protéines amyloïdes est également motivée par le rôle fonctionnel qu’elles peuvent jouer 23,24 ou leur fort potentiel pour le développement de nouveaux biomatériaux25. Les déterminants physico-chimiques de l’agrégation amyloïde restent flous, et aucune théorie générale de l’agrégation amyloïde n’est disponible, malgré d’énormes progrès au cours des dernières années21,26.

L’agrégation amyloïde implique des changements dans la structure et la stabilité des protéines avec le temps, dont l’étude implique naturellement une dynamique, liée à la stabilité de la conformation des protéines, à la fonction protéique et au paysage énergétique des protéines27. La dynamique est directement liée à la stabilité d’un état spécifique par la contribution entropique pour les mouvements les plus rapides28, et la fonction protéique peut être maintenue par des mouvements sur différentes échelles de temps de sub-ps pour les protéines sensibles à la lumière29 à ms pour les mouvements de domaine, ce qui peut être facilité par la dynamique picoseconde-nanoseconde30.

Deux exemples d’utilisation de la spectroscopie de rétrodiffusion neutronique pour étudier les protéines amyloïdes seront présentés, l’un à l’état liquide pour étudier la dynamique des protéines et l’autre à l’état de poudre hydratée pour étudier la dynamique de l’hydratation de l’eau. Le premier exemple concerne l’agrégation du lysozyme en sphères de taille μm (appelées particules) suivies en temps réel5, et le second une comparaison de la dynamique de l’eau aux états natifs et agrégés de la protéine humaine tau31.

Le lysozyme est une enzyme impliquée dans la défense immunitaire et est composé de 129 résidus d’acides aminés. Le lysozyme peut former des particules dans un tampon deutéré à une température de 10,5 et à une température de 90 °C. Avec la diffusion neutronique, nous avons montré que l’évolution temporelle du coefficient de diffusion du centre de masse du lysozyme suit la cinétique exponentielle unique de la fluorescence T de la thioflavine (une sonde fluorescente utilisée pour surveiller la formation de motifs de β croisée amyloïde32), indiquant que les superstructures particulaires de formation et les modèles de β croisée se produisent en une seule étape avec le même taux. De plus, la dynamique interne est restée constante tout au long du processus d’agrégation, ce qui peut s’expliquer soit par un changement conformationnel rapide qui ne peut être observé sur les instruments NBS, soit par l’absence de changement significatif de l’énergie interne des protéines lors de l’agrégation.

La protéine tau humaine est une protéine intrinsèquement désordonnée (PDI) constituée de 441 acides aminés pour l’isoforme dite 2N4R, qui est notamment impliquée dans la maladie d’Alzheimer33. En utilisant la rétrodiffusion neutronique sur des poudres de protéine tau perdeutérée, nous avons montré que la dynamique de l’eau d’hydratation est augmentée à l’état fibreux, avec une population plus élevée de molécules d’eau subissant des mouvements de translation. Le résultat suggère qu’une augmentation de l’entropie de l’eau d’hydratation pourrait conduire la fibrillation amyloïde de tau.

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Protocol

1. Préparer le tampon deutéré pour les protéines à l’état liquide

  1. Dissoudre tous les composants du tampon dans duD2Opur.
  2. Si l’électrode de pH a été étalonnée enH2O, ajuster le selon la formule = pH + 0,4 en utilisant NaOD ou DCl34.
    REMARQUE : L’utilisation deD 2 O au lieu de H2O pourrait avoir une incidence sur la solubilité des protéines et il pourrait être nécessaire d’adapter les conditions tampons (p. ex., par un léger changement de la concentration en sel).

2. Préparer les poudresH2O-hydratées de protéines perdeutérées

  1. Préparez le porte-échantillon.
    1. Nettoyez soigneusement un porte-échantillon plat en aluminium avec son joint en fil d’indium et ses vis avec de l’eau et de l’éthanol et laissez-le sécher.
      REMARQUE: Un porte-échantillon plat est utilisé de manière à ce que la poudre puisse être répartie de manière homogène sur la surface. La quantité de poudre doit être suffisante pour pouvoir être maintenue entre les parois et ne pas tomber lorsque le porte-échantillon est placé verticalement.
    2. Pesez les différentes parties du porte-échantillon - fond, couvercle et fil d’indium - séparément sur une balance de précision.
    3. Placer le joint métallique d’indium de 1 mm dans la rainure de la partie inférieure du porte-échantillon, en laissant un petit chevauchement à l’endroit où les deux extrémités se rejoignent (figure 2A).
    4. Placez une quantité appropriée de protéine lyophilisée (généralement ~ 100 mg de protéines) de telle sorte qu’elle remplisse la surface interne de la partie inférieure du porte-échantillon.
  2. Hydrater la poudre de protéine.
    1. Placer le porte-échantillon dans un dessiccateur avec une boîte de Petri contenant de la poudreP2O5pendant 24 h pour sécher complètement la poudre protéique35 (figure 2B). Peser la partie inférieure sèche du porte-échantillon contenant le joint d’indium et la poudre sèche pour obtenir msec.
      ATTENTION : La poudreP2O5est très corrosive.
    2. Retirez le P 2 O5 du dessiccateur et mettez une boîte de Petri avec D2O à l’intérieur. Contrôler régulièrement la masse de la poudre pour vérifier le niveau d’hydratation h = m hyd/m sec où mhyd et msec sont respectivement la masse de la poudre hydratée et de la poudre sèche.
      REMARQUE: Pour les protéines hautement hydrophobes telles que l’insuline, il peut être nécessaire d’augmenter la température à l’intérieur du dessiccateur pour obtenir une pression de vapeur plus élevée et atteindre le niveau d’hydratation souhaité h.
    3. Répétez les étapes 2.2.1 et 2.2.2 au moins trois fois pour convertir correctement tous les hydrogènes échangeables en deutérons.
      NOTE: Alternativement, des cycles de lyophilisation et de dissolution en D2O pur peuvent être utilisés pour un meilleur échange H / D à condition que la protéine ne soit pas affectée par celui-ci.
    4. Hydratez la poudre légèrement au-dessus du niveau souhaité, laissez la partie inférieure du porte-échantillon avec le fil d’indium et la poudre hydratée rester sur la balance de précision et attendez que la masse diminue lentement jusqu’à la valeur souhaitée pour obtenir le h cible (généralement 0,2-0,4 si une protéine globulaire de taille moyenne doit être recouverte d’une couche d’hydratation complète).
    5. Placez rapidement le couvercle sur la partie inférieure et fermez d’abord le porte-échantillon avec quatre vis pour arrêter l’échange de vapeur (Figure supplémentaire S3A).
    6. Placez et serrez toutes les vis restantes jusqu’à ce qu’aucun espace ne soit visible entre la partie inférieure et le couvercle (figure supplémentaire S3B).
    7. Pesez le porte-échantillon scellé pour vérifier toute perte d’hydratation potentielle due à des fuites après l’expérience sur les neutrons.

3. Effectuer l’expérience de diffusion de neutrons incohérents

  1. Discutez et revérifiez la configuration de l’instrument nécessaire à l’expérience avec le contact local quelques semaines avant le temps de faisceau assigné.
  2. Préparer l’échantillon à l’état liquide.
    1. Dissoudre la protéine dans le tampon deutéré.
    2. Déterminer le volume approprié de liquide à mettre dans le porte-échantillon à l’aide d’eau (s’assurer qu’il n’y a pas de débordement lorsque le porte-échantillon est fermé; Figure 2C).
      NOTE: Les étapes suivantes (3.3 et 3.4) décrivent une expérience menée sur le spectromètre NBS IN16B à l’ILL8,9, en utilisant un cryofour comme environnement d’échantillonnage. Le système de contrôle des instruments changera d’un instrument à l’autre, mais les principes de fonctionnement restent les mêmes.
  3. Insérez l’exemple.
    1. Sécher soigneusement le bâtonnet d’échantillon (figure 2D) et prélever l’échantillon précédent, le cas échéant, après avoir vérifié que la dose de rayonnement ionisant est inférieure à 100 μSv/h avant de manipuler toute matière (au PEB).
    2. Placer l’échantillon, vérifier le centrage approprié par rapport au centre du faisceau (figure supplémentaire S4) et insérer le bâtonnet d’échantillon dans le four cryogénique (figure 2D). Allumez la pompe à vide pour atteindre moins de 10-3 bars et évacuez l’air à l’intérieur du cryofour en répétant les trois fois suivantes: remplissez le cryofour avec de l’hélium gazeux jusqu’à ce que la pression atmosphérique soit atteinte et retirez à nouveau le gaz à l’aide de la pompe à vide.
      NOTA: Dans le cas d’un porte-échantillon plat, le porte-échantillon doit être orienté à un angle de 45° par rapport au faisceau entrant. La plage de transfert de quantité de mouvement utile pourrait être réduite en raison de l’absorption et de la diffusion par la cellule. Un absorbeur de neutrons puissant tel que le cadmium peut être utilisé pour masquer certaines parties du porte-échantillon (par exemple, des vis, des pièces épaisses).
    3. Introduire de l’hélium gazeux dans le four cryogénique de telle sorte que la pression soit de ~0,05 bar.
  4. Acquérir des données (par exemple, en utilisant NOMAD sur IN16B à l’ILL, on suppose que l’utilisateur préfère une température de 200 K avant d’acquérir un spectre de spectre de neutrons quasi-élastiques (QENS), puis E/IFWS lors d’une rampe de température à 310 K à 0,5 K par minute et enfin un QENS à 310 K).
    1. À l’aide de NOMAD, dans l’onglet exécution , glissez-déposez un contrôleur FurnaceCryostat dans la rampe de lancement. Réglez la température à 200 K. Utilisez le mode rapide et un délai d’attente de 30 minutes pour que la température ait le temps de se stabiliser. Cliquez sur l’icône des flèches rotatives pour l’exécuter en arrière-plan afin que les données puissent être acquises pendant la baisse de température.
    2. Faites glisser et déposez le contrôleur IN16DopplerSettings , définissez le profil de vitesse sur Vitesse précise définie par Max ΔE, une valeur de 0,00 μeV et 128 canaux pour obtenir une configuration EFWS.
    3. Faites glisser et déposez un contrôleur de comptage , remplissez le champ Sous-titres avec un nom qui permet une identification facile des données et définissez 60 répétitions de 30 s de balayage (figure supplémentaire S5A).
    4. Faites glisser et déposez un contrôleur IN16DopplerSettings , définissez le profil de vitesse sur Sine défini par Speed avec une valeur de 4,5 m/s et 2 048 canaux pour obtenir une configuration QENS.
    5. Faites glisser et déposez un contrôleur de comptage avec 4 répétitions de 30 minutes de balayage (figure supplémentaire S5B).
    6. Pour la rampe de température, glissez-déposez un contrôleur FurnaceCryostat , réglez la température sur 310 K, réglez Ramp sur SetPoint avec Δ = 0,05 K et 6 s. Utilisez un temps sur 220 min (figure supplémentaire S6A).
    7. Utilisez une boucle for avec 65 répétitions. À l’intérieur, insérez un contrôleur IN16DopplerSettings comme à l’étape 3.4.2, suivi d’un seul compte de 30 s. Ensuite, insérez IN16DopplerSettings, comme décrit précédemment, mais en utilisant un décalage d’énergie de 1,5 μeV et 1 024 canaux suivis d’un seul comptage de 3 min (figure supplémentaire S6B).
    8. Pour acquérir le dernier QENS à 310 Ko, faites glisser et déposez les contrôleurs IN16DopplerSettings et Count configurés comme décrit aux étapes 3.4.4 et 3.4.5, respectivement.
    9. Appuyez sur le bouton de démarrage (triangle rectangle en bas de la fenêtre) pour exécuter le script.
      NOTE: Chaque expérience nécessitera l’acquisition de données d’étalonnage; c’est-à-dire la cellule vide pour les corrections de soustraction ou d’absorption, le tampon seul aux différentes températures utilisées pour modéliser le bruit de fond, et une mesure du vanadium (ou de manière équivalente, l’échantillon à une température de 10 K ou moins) pour obtenir la fonction de résolution de l’instrument.

4. Analyse des données - QENS

  1. Importez le jeu de données à l’aide de la méthode 'IN16B_QENS.process()' dans le logiciel Python nPDyn v3.x36
    >>>> à partir de nPDyn.dataParsers import IN16B_QENS

    >>> échantillon = IN16B_QENS(
    ...
    ... [detGroup=... format>]
    ... ). processus()

    >>> échantillon = sample.get_q_range(0,3, 1,8)
  2. Effectuez des corrections de données (facultatif) à l’aide des commandes suivantes (reportez-vous à la documentation de nPDyn pour plus d’informations, Figure 3) :
    #it est supposé que les données pour les cellules vides, le vanadium et le tampon
    # ont déjà été importés dans un ensemble de données appelé 'empty_cell', 'vanadium',
    # et 'buffer', respectivement.

    # pour la soustraction de cellules vides avec un facteur d’échelle
    # (les erreurs se propagent automatiquement)
    >>> échantillon = échantillon - 0,95 * empty_cell

    # pour correction à l’aide du coefficient de Paalman-Ping
    # (mutuellement exclusif avec l’exemple ci-dessus)
    >>> sample = sample.absorptionCorrection(empty_cell)

    # pour la normalisation
    >>> échantillon = sample.normalize(vanadium)

    # pour le regroupement le long de l’axe observable
    # observable est le temps d’agrégation ici
    >>> échantillon = échantillon.bin(3, axe = 0)
  3. Ajustez les données d’étalonnage. Les ensembles de données - échantillons, cellule vide, tampon deutéré (si nécessaire) et vanadium - peuvent être ajustés à l’aide de modèles intégrés ou d’un modèle défini par l’utilisateur (voir la documentation nPDyn) :
    >>> de l’importation nPDyn.models.builtins (
    ... modèlePVoigt,
    ... modèleEau,
    ... modèleCalibratedD2O,
    ...     )

    # Les modèles intégrés utilisent un vecteur colonne de la quantité de mouvement
    # Transférer les valeurs Q
    >>> q = vanadium.q[:, Aucun]

    # le vanadium est monté à l’aide d’un profil pseudo-Voigt
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. Utilisez le modèle intégré pour l’eau d’hydratation appelé « modelWater ». Ce modèle se lit comme indiqué par Eq (4)17
    Equation 4 (4)
    Où a0, ar et at sont des scalaires représentant la contribution relative du signal élastique, des mouvements de rotation et des mouvements de translation, respectivement; j1(qd) est la fonction de Bessel sphérique du lème ordre, q étant le transfert de quantité de mouvement; d la distance O-H dans la molécule d’eau; δ(ω) est le delta de Dirac, qui est multiplié ici par l’EISF; N est l’ordre le plus élevé de la fonction de Bessel sphérique utilisée (typiquement ~5); Equation 5 et sont respectivement les mouvements de rotation et Equation 11 de translation lorentziens; b(q) est un terme de fond plat. Les fonctions de Bessel sphériques donnent la contribution relative de chaque état de moment angulaire des molécules d’eau, et le nombre N est déterminé sur la base de la gamme q de transfert de quantité de mouvement. Dans le cas d’un spectromètre NBS typique, les termes jusqu’à N = 4 expliquent presque entièrement le signal (figure supplémentaire S7).
    # ici, l’équation 2 est utilisée pour l’eau d’hydratation
    # convolution avec fonction de résolution et ajout de
    # L’arrière-plan D2O se fait automatiquement avec le
    # arguments fournis
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=vanadium,
    ... bkgd=tampon,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    NOTE: Les contributions des mouvements de rotation et de translation doivent être alambiquées pour être parfaitement rigoureuses. Le succès d’un modèle additif doit être attribué à la présence de populations distinctes d’eau à la surface des protéines et à la gamme énergétique limitée accessible.
  5. Utilisez ce qui suit pour tracer les données (Figure 4) :
    >>> à partir du tracé d’importation nPDyn.plot
    >>> parcelle (échantillon)

5. Analyse des données - rampe de température, balayage élastique à fenêtre fixe (EFWS)

  1. Utilisez une procédure similaire à la section 4 pour normaliser les données de la rampe de température par le signal à la température la plus basse (généralement 10 K) :
    >>> à partir de nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS

    >>> échantillon = IN16B_FWS(
    ... ,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ). processus()

    # normalisation avec les 5 premiers points sur l’observable
    # axe, qui correspondent à la température
    >>> échantillon /= échantillon[:5].moyenne(0)

    # La plage Q de transfert de quantité de mouvement utilisée ici est plus petite
    # car le modèle utilisé n’est valable que pour le Q faible
    >>> échantillon = sample.get_q_range(0,2, 0,8)
  2. Utilisez un modèle gaussien simple pour commencer, dont la largeur est donnée par ce que l’on appelle le déplacement carré moyen (MSD). Générez et ajustez le modèle à l’aide des commandes suivantes :
    >>> importer numpy en tant que np
    >>> à partir de nPDyn.models importer Paramètres, Modèle, Composant

    # a est un facteur d’échelle
    >>> params = Paramètres(
    ... a={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)},
    ... msd={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> modèle = Modèle(params)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... « gaussien »,
    ... lambda x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, Aucun])

    >>> parcelle (échantillon)
    REMARQUE: L’approximation gaussienne est toujours valable pour q2MSD << 1, mais une plage de transfert de quantité de mouvement plus large peut être utilisée pour la comparaison relative entre échantillons. Des modèles plus sophistiqués, qui vont au-delà de l’approximation gaussienne, ont été développés37,38,39.

6. Analyse des données - balayages élastiques et inélastiques à fenêtre fixe (E/IFWS)

  1. Comme à l’étape 4, importez le jeu de données, mais à l’aide de la classe 'IN16B_FWS' :
    >>> à partir de nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS

    >>> échantillon = IN16B_FWS(
    ...
    ... [detGroup=]
    ... ). processus()

    >>> échantillon = sample.get_q_range(0,3, 1,8)
  2. Ajustez les données d’étalonnage et les données d’échantillonnage.
    1. Analyser les données E/IFWS à l’aide d’un MSD40 généralisé ou en les considérant comme des spectres QENS grossiers (n’ayant que quelques points de données sur l’axe de l’énergie). Lorsque E/IFWS est considéré comme un QENS grossier, les modèles utilisés pour QENS sont utilisés pour ajuster l’ensemble de données E/IFWS à la fois (ajustement global des transferts d’énergie et des transferts de quantité de mouvement).
      REMARQUE: Cette dernière solution - utilisant des modèles pour QENS sur les données E/IFWS - est utilisée ici où la dépendance au transfert de quantité de mouvement de la diffusion du centre de masse et de la dynamique interne des protéines est imposée.
    2. Modélisez la dynamique des protéines dans les liquides en utilisant l’Eq (5) suivant ('modelProteinJumpDiff' dans nPDyn):
      Equation 6 (5)
      où R(q,ω) est la fonction de résolution; β un scalaire indépendant pour chaque transfert de quantité de mouvement q; a0 est le facteur de structure incohérente élastique (EISF); Equation 7 un Lorentzien tenant compte de la diffusion du centre de masse avec une largeur donnée par Eq (6); Equation 12 est un Lorentzien qui inclut la diffusion du centre de masse et une contribution suivant le modèle de saut-diffusion14 tenant compte de la dynamique interne (Eq (7); Equation 8 étant le signal ajusté de D2O redimensionné par sa fraction volumique dans l’échantillon.
      γ = Dsq 2 (6)
      Ds étant le coefficient d’autodiffusion.
      Equation 9 (7)
      Di étant le coefficient de diffusion apparent pour la dynamique interne et τ un temps de relaxation pour les mouvements diffusifs.
      >>> de l’importation nPDyn.models.builtins (
      ... modèlePVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... modèleCalibratedD2O,
      ... )

      # Les modèles intégrés utilisent un vecteur colonne de la quantité de mouvement
      # Transférer les valeurs Q
      >>> q = vanadium.q[:, Aucun]

      # le vanadium est monté à l’aide d’un profil pseudo-Voigt
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # pour le D2O pur, un modèle avec une largeur de ligne calibrée
      # pour différentes températures est inclus dans nPDyn
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # ici, l’équation 3 est utilisée pour les échantillons liquides
      # convolution avec fonction de résolution et ajout de
      # L’arrière-plan de D2O se fait automatiquement avec les # arguments fournis
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=vanadium,
      ... bkgd=tampon,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. Tracez les données ajustées en utilisant:
    >>> à partir du tracé d’importation nPDyn.plot
    >>> parcelle (échantillon)

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Representative Results

L’agrégation du lysozyme en particules a été réalisée à 90 °C avec une concentration protéique de 50 mg/mL dans un tampon deutéré (0,1 M NaCl à 10,5). La formation de particules est déclenchée par l’augmentation de la température jusqu’à 90 °C et se produit dans les 6 heures (figure supplémentaire S8). L’acquisition des données a été effectuée sur IN16B, comme décrit dans le protocole ci-dessus (les données sont conservées en permanence par le PEB et accessibles au http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

Un spectre QENS a été acquis à 7 °C pour caractériser pleinement l’état initial. Par la suite, la température a été augmentée à 90 °C (prend généralement ~30 min sur IN16B, figure supplémentaire S9) pour déclencher le processus d’agrégation. La cinétique peut être suivie en utilisant une moyenne mobile des spectres QENS, permettant l’accès à toute la gamme de transfert d’énergie, mais avec une résolution limitée dans le temps. La résolution temporelle peut être améliorée à ~1 min en utilisant EFWS et à ~20 min en utilisant E/IFWS à quatre valeurs de transfert d’énergie5.

Dans l’exemple présenté, nous avons exploré les transferts d’énergie de 0, 0,6, 1,5 et 3 μeV. Les balayages E/IFWS sont acquis en continu pendant le processus d’agrégation, et un spectre QENS a été acquis pour l’état final à 90 °C. Les données E/IFWS ont été corrigées pour l’absorption à l’aide de l’E/IFWS de la cellule vide et normalisées à l’aide des données sur le vanadium.

Pour le lysozyme E/IFWS, nous observons une augmentation du signal dans le temps à un transfert de faible quantité de mouvement et à un transfert d’énergie faible, tandis que le signal à transfert d’énergie élevé et à faible transfert de quantité de mouvement diminue (Figure supplémentaire 10). Cette observation qualitative indique la formation d’objets plus grands, diffusant plus lentement et confirmant que le processus d’agrégation a eu lieu. L’analyse, selon Eq (4), aboutit à un coefficient initial de diffusion du centre de masse de 15 Å2/ns, en accord avec la présence de petits amas protéiques (soutenus par la diffusion dynamique de la lumière et les calculs HYDROPRO 5,41), qui diminue ensuite exponentiellement avec le temps (Figure 5). Le coefficient de diffusion apparent de la dynamique interne reste constant tout au long du processus d’agrégation. Par conséquent, la formation de particules de lysozyme semble se produire en une seule phase d’agrégation. L’absence de changement dans la dynamique interne des protéines suggère que soit la conversion en β croisée et le changement d’énergie associé possible sont trop rapides, soit que d’autres effets moteurs, tels qu’une augmentation de l’entropie du solvant, pourraient dominer pleinement dans la gamme d’énergie sondée.

L’étude de la dynamique de l’eau d’hydratation autour des monomères et des fibres de tau a été réalisée sur SPHERES au Maier-Leibnitz Zentrum (MLZ) à Garching, en Allemagne, en utilisant le protocole décrit ci-dessus pour les échantillons de poudre. Environ 100 mg de poudre de protéine tau deutérée, hydratée à 0,4 g deH2Opar g de protéines, ont été utilisés. Les EFWS ont été acquis lors d’une rampe de température et des spectres QENS à température constante. Les EFWS ont été enregistrés à partir de 20 K et augmentant la température à 300 K à un taux de 0,2 K / min tout en acquérant continuellement des données pendant des balayages de 5 minutes.

Les spectres QENS ont été enregistrés à 20 et 280 K. Les données EFWS ont été ajustées à l’aide d’un gaussien simple sur la plage q de transfert de quantité de mouvement 0,2 Å-1 < q < 0,8 Å-1 pour extraire le TMS (figure supplémentaire S11A). Les valeurs MSD sont supérieures à la limite de validité pour le modèle gaussien. Par conséquent, il est recommandé dans ce cas d’explorer d’autres modèles au-delà de l’approximation gaussienne37,38,39. À des températures supérieures à 220 K, l’eau d’hydratation autour des fibres de tau est significativement plus mobile que l’eau d’hydratation autour des monomères de tau (Figure 6). L’ajustement des données QENS permet aux utilisateurs d’obtenir la largeur de ligne et la contribution relative des mouvements élastiques, rotationnels et translationnels de l’eau d’hydratation dans l’échantillon (figure supplémentaire S11B). Il semble que la fraction de molécules d’eau subissant un mouvement de translation augmente autour des fibres, et que les coefficients de diffusion translationnels et de rotation des molécules d’eau augmentent autour des fibres17,31. En revanche, la dynamique interne ps-ns de la protéine tau, reflétant les mouvements de l’épine dorsale et de la chaîne latérale, n’a pas changé lors de la fibrillation.

Figure 2
Figure 2 : Base d’un porte-échantillon plat en aluminium. (A) Le porte-échantillon plat en aluminium présente une partie centrale exposée aux neutrons où la poudre de protéine est maintenue dans un petit espace - typiquement ~0,3 mm - entre la base et le couvercle. Un fil d’indium peut être utilisé pour l’étanchéité car il résiste aux augmentations de température jusqu’à 90 ° C. En cas de températures plus élevées, un joint en téflon peut être utilisé. (B) La poudre de protéine est placée dans la base du porte-échantillon avec le fil d’indium en place. Le porte-échantillon est placé dans un dessiccateur en présence soit de P2O5 pour le séchage, soit deH2O/D2Opour l’hydratation. De la graisse sous vide est ajoutée pour éviter toute fuite entre le fond et le couvercle du dessiccateur. Le vide peut être utilisé avec prudence pour accélérer le processus de séchage. Il peut être nécessaire de chauffer le fond du dessiccateur pour les échantillons hautement hydrophobes. (C) La solution protéique est placée entre les cylindres intérieur et extérieur. Assurez-vous de ne pas pipeter trop de liquide (il ne devrait pas y avoir de débordement lorsque le porte-échantillon est fermé). Le fil d’indium est placé dans la rainure circulaire. (D) Le bâton d’échantillon (en arrière-plan) permet de contrôler la hauteur et l’orientation de l’échantillon et peut inclure différents contrôleurs et détecteurs pour les environnements d’échantillonnage (température, pression). Le bâtonnet d’échantillon est inséré par le haut du four cryogénique (avant), ce qui permet de contrôler la température pendant l’expérience. Au cours de l’expérience, le faisceau de neutrons frappe généralement le fond du four cryo, comme l’indique le rectangle blanc (la taille du faisceau dépend de la configuration de l’instrument). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Les corrections et la normalisation des données peuvent améliorer l’ajustement. Les données ont été importées à l’aide de nPDyn, comme décrit dans le protocole. À gauche, le jeu de données a été normalisé à l’aide des données du moniteur uniquement. À droite, le signal de la boîte vide a été utilisé avec les coefficients de Paalman-Ping43 pour corriger l’absorption de neutrons par le porte-échantillon. Par la suite, le modèle ajusté pour le signal de vanadium a été intégré indépendamment pour chaque transfert de quantité de mouvement q, et le résultat a été utilisé pour normaliser l’ensemble de données de l’échantillon. Dans les deux diagrammes, S(q,ω) désigne le signal de diffusion, q est le transfert de quantité de mouvement et Equation 3 est le transfert d’énergie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Fenêtre de traçage générée par nPDyn montrant le résultat de l’ajustement. Les données QENS ont été ajustées à l’aide de nPDyn, comme décrit dans le protocole. La fenêtre de traçage permet aux utilisateurs de tracer les données selon différents axes - observables (temps, température ou pression), transfert de quantité de mouvement q ou transfert d’énergie - et des sélecteurs sont disponibles pour naviguer le long des autres axes. Différents types de graphiques sont disponibles, avec le simple 'Plot' présenté en (A) et 'Analysis - q-wise' en (B). Le bouton 'Plot' affiche les différents ensembles de données dans des sous-diagrammes séparés, le bouton 'Comparer' affiche les jeux de données dans le même diagramme, le 'Plot 3D' montre les jeux de données dans différents sous-diagrammes 3D similaires à s, le bouton 'Analysis - q-wise' montre les paramètres ajustés en fonction du transfert de quantité de mouvement q et 'Analysis - observable-wise' montre les paramètres ajustés en fonction de l’observable (temps, température ou pression). Abréviation : QENS = diffusion quasi-élastique des neutrons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : L’agrégation des lysozymes se produit dans un processus en une étape avec une dynamique interne constante. Le lysozyme a été dissous dans le tampon d’agrégation (décrit ailleurs5), et E/IFWS a été acquis tout au long de l’agrégation, qui a été déclenchée par l’augmentation de la température à 90 °C. Après correction de l’absorption avec une cellule vide et normalisation à l’aide du signal de vanadium, les données ont été analysées à l’aide du modèle de diffusion de saut décrit dans le protocole. Le coefficient d’autodiffusion ajusté du centre de masse est tracé en fonction du temps (triangles bleus) avec le coefficient de diffusion apparent pour la dynamique interne (carrés orange). Ce chiffre est tiré de 5. Abréviation : E/IFWS = balayages élastiques et inélastiques à fenêtre fixe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: La dynamique de l’eau d’hydratation est augmentée autour des fibres tau. Les poudres hydratées H2O de fibres tau deutérées et de monomères ont été scellées dans un porte-échantillon plat en aluminium, et les données EFWS ont été acquises lors d’une rampe de température de 20 à 300 K. Après correction de l’absorption avec une cellule vide et normalisation à l’aide du signal de vanadium, les données ont été analysées à l’aide du modèle de diffusion de saut décrit dans le protocole. Cette image a été redessinée en utilisant une plage q plus petite (0,2 < q < 0,8 Å-1) à partir des données de 31. Abréviation : EFWS = balayages élastiques à fenêtre fixe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Photographies de l’instrument IN16B au PEB. (haut) L’instrument IN16B vu de la zone radiocommandée dédiée à l’instrument. Le faisceau entrant se déplace à l’intérieur du guide de neutrons vers la chambre à vide, qui contient la plupart des éléments de l’instrument (hacheur PST, analyseurs, échantillon, détecteurs). (en bas) Intérieur de la chambre à vide. Le hacheur PST est visible, tout comme les analyseurs entourant le four cryogénique contenant l’échantillon. Les détecteurs sont situés derrière le four cryoactif. Avec l’aimable autorisation de Laurent Thion, écliptique. Abréviation : PST = transformation de l’espace de phase. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Croquis de l’IN16B en mode classique (avec entraînement Doppler) et BATS. (A) Le faisceau de neutrons est partiellement monochromatisé par le sélecteur de vitesse. Par la suite, les hacheurs de fond et PST produiront une impulsion de neutrons, à partir de laquelle un profil d’énergie sera sélectionné par le monochromateur Doppler (mode E/IFWS ou QENS). Les neutrons sont ensuite dispersés par l’échantillon, et une seule énergie est réfléchie vers les détecteurs par les analyseurs. Avec l’aimable autorisation de l’ILL. (B) Les hacheurs BATS sont utilisés pour définir une seule impulsion de neutrons avec une gamme d’énergie définie. Le faisceau de neutrons est partiellement monochromatisé par le sélecteur de vitesse. Par la suite, le hacheur de fond éliminera les neutrons indésirables qui n’appartiennent pas à l’impulsion sélectionnée. Les neutrons sont ensuite dispersés par l’échantillon, et une seule énergie est réfléchie vers les détecteurs par les analyseurs. Avec l’aimable autorisation de l’ILL. Abréviations : BATS = spectromètre de rétrodiffusion et de temps de vol; PST = transformation de l’espace de phase; E/IFWS = balayages élastiques et inélastiques à fenêtre fixe; QENS = diffusion quasi-élastique des neutrons; PG = graphite pyrolytique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Le porte-échantillon est fermé rapidement après que la poudre a atteint l’hydratation désirée et scellée. (A) Le porte-échantillon plat est rapidement fermé à l’aide de quatre vis. Un petit écart restera dû au fil d’indium. Les autres vis sont ensuite ajoutées, et le porte-échantillon est scellé lentement en serrant doucement chaque vis plusieurs fois pour permettre à l’indium de se détendre. (B) Le porte-échantillon plat est correctement scellé lorsqu’aucun espace n’est plus visible entre la base du support et le couvercle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S4 : Le porte-échantillon est centré par rapport au faisceau de neutrons. Un porte-échantillon cylindrique a été placé sur le bâtonnet d’échantillon. La position du porte-échantillon est vérifiée de telle sorte que la poutre frappe la partie inférieure du porte-échantillon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S5 : Acquisition d’EFWS suivie de QENS sur IN16B avec NOMAD. (A) Les contrôleurs concernés sont glissés et déposés dans la rampe de lancement comme expliqué dans le protocole (étapes 3.4.1 à 3.4.3). Il peut être nécessaire de cliquer sur le cadenas (icône verte dans le coin supérieur droit - volet vertical) pour obtenir le contrôle de l’interface. (B) Les contrôleurs concernés sont glissés et déposés dans la rampe de lancement comme expliqué dans le protocole (étapes 3.4.4 à 3.4.5). Ici, les deux derniers contrôleurs sont nommés IN16DopplerSettings et Count. Abréviations : QENS = diffusion quasi élastique des neutrons, EFWS = balayages élastiques à fenêtre fixe. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S6 : Mise en place d’une rampe de température et E/IFWS sur IN16B avec NOMAD. (A) Le contrôleur FurnaceCryostat est ajouté dans la rampe de lancement et configuré comme expliqué dans le protocole (étape 3.4.6). (B) Le contrôleur de boucle For est ajouté dans la rampe de lancement et les contrôleurs appropriés y sont insérés et configurés comme expliqué dans le protocole (étape 3.4.7). Abréviation : E/IFWS = balayages élastiques et inélastiques à fenêtre fixe. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S7 : Les cinq premières fonctions de Bessel sphériques expliquent la majeure partie de la contribution rotationnelle de l’eau d’hydratation. Les huit premières fonctions de Bessel sphériques sont tracées à l’aide d’une valeur d = 0,98 Å et des valeurs de transfert de quantité de mouvement q de 0 à 3 Å (lignes de couleur continue). La plage de transfert de quantité de mouvement de 0,3 Å < q < 1,8 Å est délimitée par les lignes pointillées bleues. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S8 : Le lysozyme forme des particules de manière reproductible. Le lysozyme a été dissous dans le tampon d’agrégation (préparé comme décrit dans le protocole, étape 1), et le ThT a été ajouté à une concentration finale de 2 μM pour surveiller la formation de la structure à β croisée en utilisant la fluorescence. Le graphique représente la moyenne de trois mesures indépendantes, et les barres d’erreur sont l’écart-type. L’encart montre une photographie en microscopie à fluorescence des particules formées après 6 h d’agrégation. Barre d’échelle = 20 μm. Ce chiffre est tiré de 5. Abréviation : ThT = thioflavin T. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S9 : Rampe de température rapide telle que disponible sur IN16B. En mode rapide sur IN16B, la température peut être augmentée de 280 K à 363 K en environ 30 min. Ce chiffre est tiré de 5. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S10 : Données E/IFWS sur le lysozyme lors de l’agrégation en particules. Le lysozyme a été dissous dans le tampon d’agrégation (décrit ailleurs5), et E/IFWS a été acquis tout au long de l’agrégation, qui a été déclenchée par l’augmentation de la température à 90 °C. Les données - après correction de l’absorption avec une cellule vide et normalisation utilisant le signal du vanadium - sont tracées en fonction du transfert de quantité de mouvement q et du temps pour les différents transferts d’énergie mesurés, 0 μeV (en haut à gauche), 0,6 μeV (en haut à droite), 1,5 μeV (en bas à gauche) et 3 μeV (en bas à droite). Pour chaque sous-graphique, l’axe vertical correspond au signal de diffusion S(q, ΔE), tracé en fonction du temps expérimental en heures et du transfert de quantité de mouvement q. Ce chiffre est tiré de 5. Abréviation : E/IFWS = balayages élastiques et inélastiques à fenêtre fixe. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S11 : Ajustement des données d’eau d’hydratation de tau. (A) Ajustement des données EFWS à l’aide d’un gaussien. La poudre hydratée H2O de monomères tau deutérés a été scellée dans un porte-échantillon plat en aluminium, et les EFWS ont été acquis lors d’une rampe de température de 20 à 300 K. Les données expérimentales (signal élastique S(q, 0) sur axe vertical - ligne bleue avec barres d’erreur) sont tracées pour la gamme q de transfert de quantité de mouvement 0,2 < q < 0,6 Å-1 avec le gaussen ajusté utilisé pour extraire le MSD. (B) Mouvements de translation et de rotation de l’eau d’hydratation obtenus à partir du raccord QENS. Les poudres hydratées H2O de fibres tau deutérées (à gauche) et de monomères (à droite) ont été scellées dans un porte-échantillon plat en aluminium, et les données QENS ont été acquises à 280 K. Les données expérimentales (intensité S(q,ω) en fonction du transfert d’énergie) pour les fibres (triangles bleus) et les monomères (points verts) sont tracées avec le modèle ajusté (ligne continue noire) et ses composantes, le fond (bleu), la fonction de résolution (vert), les rotations (rouge) et les translations (cyan) pour le transfert de quantité de mouvement q = 0,783 Å-1. Ce chiffre est tiré de 31. Abréviations : QENS = diffusion quasi élastique des neutrons, EFWS = balayages élastiques à fenêtre fixe; TMS = déplacement quadratique moyen. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La spectroscopie neutronique est la seule méthode qui permet de sonder la dynamique ps-ns moyenne d’ensemble des échantillons de protéines, quelle que soit la taille de la protéine ou la complexité de la solution lorsque la deutération est utilisée6. Plus précisément, en sondant l’autodiffusion d’assemblages protéiques en solution, la taille hydrodynamique de ces assemblages peut être déterminée sans ambiguïté. Néanmoins, la méthode est généralement limitée par le faible flux de neutrons, ce qui implique de longs temps d’acquisition et la nécessité de grandes quantités d’échantillon (généralement 100 mg de protéines) pour obtenir un bon rapport signal sur bruit dans le temps de faisceau alloué.

Préparation de l’échantillon (étapes 1 et 2 du protocole). Pour les échantillons à l’état liquide, la concentration minimale pouvant être utilisée est de ~50 mg/mL (des concentrations plus faibles peuvent être utilisées au prix de temps d’acquisition prolongés). Une concentration élevée de protéines est associée à des taux de fibrillation plus rapides, ce qui aide à ajuster la mesure dans le temps de faisceau alloué, mais peut également affecter la voie d’agrégation44. Par conséquent, une caractérisation approfondie des échantillons avec des méthodes complémentaires, telles que la force atomique ou la microscopie électronique, est nécessaire.

Le matériau du porte-échantillon est également un point à prendre en compte lors de la préparation des échantillons car les alliages d’aluminium sont sujets à la corrosion45. Un alliage d’aluminium typique qui présente une bonne résistance à la corrosion et a une faible absorbance neutronique est la norme européenne (EN) AW-6060 [AlMgSi] composée de 98%-98,75% Al, 0,1% Ti, 0,15% Zn, 0,05% Cr, 0,35%-0,6% Mg, 0,1% Mn, 0,1% Cu, 0,1%-0,3% Fe et 0,3%-0,6% Si. La corrosion peut être minimisée par exemple en réduisant le temps passé dans le porte-échantillon ou en utilisant un revêtement protecteur (qui peut ajouter au signal de fond) tel que nickel ou or.

Pour les échantillons de poudre de protéines hydrogénées, la procédure de lyophilisation s’est avérée efficace complétée par une étape dans un dessiccateur en présence de poudreP2O5 pour éliminer autant d’eau légère résiduelle que possible35. Pour les échantillons de poudre, il est également conseillé de caractériser (en utilisant la microscopie à force atomique et la diffraction de poudre aux rayons X) la poudre dans son état final hydraté et d’évaluer l’effet de la deutération, de la lyophilisation et de la diffusion de vapeur sur les états monomère et fibreux. En particulier, la lyophilisation peut casser les fibres, entraînant des segments raccourcis, sans affecter la morphologie. De plus, il a été observé par diffraction de puissance des rayons X qu’un refroidissement lent, au lieu d’un refroidissement flash dans l’azote liquide, pourrait induire la présence de structures de type amyloïde (résultat non publié).

Collecte de données (étape 3 du protocole). Il est conseillé de planifier la collecte de données avec le contact local avant l’expérience (même si cela a été discuté pendant le processus de rédaction de la proposition). Le plan de collecte des données est sujet à des modifications après les premiers scans, en fonction du rapport signal/bruit obtenu. Pour les expériences résolues dans le temps en particulier, l’utilisation de E/IFWS permet une collecte rapide des données - 30 s à 1 min pour la ligne élastique, 4-5 min pour un point de données à 3 μeV5 - mais la gamme des transferts d’énergie accessibles est intrinsèquement limitée. Alternativement, une moyenne mobile des données QENS peut être utilisée46. À cette fin, la nouvelle option de rétrodiffusion et de spectroscopie à temps de vol (BATS) sur IN16B offre un flux plus élevé que l’IN16B classique avec une gamme d’énergie de ±150 μeV (ou plus selon la configuration utilisée) au prix d’une résolution inférieure en énergie11. Par conséquent, l’option BATS est recommandée pour les études résolues dans le temps, en particulier pour des processus tels que l’agrégation amyloïde, qui se déroule sur plusieurs heures.

Analyse des données (étapes 4, 5 et 6 du protocole). La fonction de diffusion S(q,ω) inclut tous les types de mouvements dans l’échantillon, et les modèles décrits dans le protocole ci-dessus sont des approximations. En particulier, pour l’IDP à l’état liquide, les mouvements à grande échelle de la chaîne désordonnée peuvent se produire sur la même longueur et la même échelle de temps que la diffusion du centre de masse de la protéine entière. Par conséquent, l’utilisateur doit garder à l’esprit que la séparation de la diffusion du centre de masse et de la dynamique interne des protéines n’est pas toujours simple. La procédure d’ajustement peut bénéficier d’informations sur la diffusion du centre de masse obtenues par des méthodes complémentaires, de sorte que ce paramètre peut être fixé (en gardant à l’esprit que d’autres méthodes peuvent fournir un coefficient de diffusion collectif associé à différentes échelles de temps et de longueur) pour obtenir un résultat plus robuste pour la dynamique interne.

En plus de la diffusion neutronique, la dynamique d’un système moléculaire peut être caractérisée par la résonance magnétique nucléaire (RMN), qui fournit des informations locales sur les protéines marquées aux isotopes et sur une large gamme d’échelles de temps47,48,49. La méthode a été utilisée avec succès pour étudier les systèmes amyloïdes 48,50,51,52,53, mais ne permet pas aux utilisateurs d’étudier simplement l’eau d’hydratation ou de suivre le processus d’agrégation amyloïde en temps réel en raison de la limitation inhérente à la taille des protéines. Les développements récents de la spectroscopie par résonance paramagnétique électronique (EPR) et de la méthode dérivée de l’EPR La polarisation nucléaire dynamique Overhauser (ODNP) offre une bonne perspective lorsqu’elle est combinée à la diffusion neutronique. En effet, bien que le marquage de spin dirigé sur site (SDSL), EPR et ODNP peuvent sonder la protéine54 et la dynamique d’hydratation55, respectivement, sur l’échelle de temps ps-ns autour de l’étiquette de spin introduite.

Ces méthodes ont été utilisées pour étudier l’agrégation de la protéine tau56,57 et offriront une grande complémentarité avec la diffusion neutronique qui permet d’obtenir des informations similaires, mais moyennées sur l’ensemble de l’échantillon. De plus, la spectroscopie infrarouge peut fournir des informations dynamiques pour les mouvements de haute énergie associés à des modèles structurels spécifiques, mais la complexité de l’environnement protéique (tampon utilisé) peut affecter l’interprétation des données58,59. Les techniques de rétrodiffusion neutronique fournissent une vue unique et complémentaire sur la dynamique de l’eau de protéines et d’hydratation sur l’échelle de temps ps-ns, ainsi que les résultats des méthodes susmentionnées. Ils ne nécessitent pas d’étiquetage spécifique de l’échantillon, la qualité du signal n’est pas sensible à la taille de la protéine et les mesures peuvent être effectuées in vivo ou dans des environnements deutérés très complexes tels que le lysat bactérien deutéré 3,6,7. Comme cette méthode fournit un résultat moyenné par ensemble, elle est bien complétée par des simulations de dynamique moléculaire pour obtenir des informations détaillées sur le système étudié. Les simulations peuvent être facilement validées par une comparaison directe entre l’ensemble de données expérimentales et les spectres théoriques QENS calculés à partir de la trajectoire de simulation à l’aide d’un logiciel tel que mdanse60.

En ce qui concerne les systèmes amyloïdes, la rétrodiffusion neutronique s’est avérée utile pour caractériser la protéine ps-ns et la dynamique de l’eau pour divers systèmes et conditions 5,31,61,62,63,64. En particulier, la rétrodiffusion neutronique a été utilisée pour révéler la corrélation entre la proportion de la séquence protéique impliquée dans la structure de β croisée et l’amplitude du gain d’entropie de l’eau lors de la fibrillation (résultats non publiés). De plus, le développement d’environnements d’échantillons permet l’acquisition simultanée de spectres de neutrons et de données de relaxation diélectrique65 ou de données de diffusion Raman66. De plus, des détecteurs de diffraction sont présents sur IN16B pour obtenir des données structurelles ainsi que des données dynamiques. En outre, le flux de neutrons entrant devrait être amélioré pour le mode BATS de IN16B dans un proche avenir, grâce à l’utilisation du guide de focalisation variable, dont la géométrie peut être adaptée à la demande à la configuration instrumentale utilisée. Pousser plus loin le développement d’un environnement d’échantillonnage et d’une instrumentation sophistiqués permettrait des expériences encore plus complexes à l’avenir, fournissant éventuellement d’autres informations dynamiques et structurelles en même temps.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Michaela Zamponi du Jülich Centre for Neutron Science du Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Allemagne, pour une partie des expériences de diffusion neutronique menées sur l’instrument SPHERES. Ces travaux ont bénéficié des activités du consortium Deuteration Laboratory (DLAB) financé par l’Union européenne dans le cadre des contrats HPRI-2001-50065 et RII3-CT-2003-505925, et de l’activité financée par le UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) au sein de l’Institut Laue Langevin EMBL DLAB sous les subventions GR/R99393/01 et EP/C015452/1. Le soutien apporté par la Commission européenne au titre du 7e programme-cadre par l’intermédiaire de l’action clé « Renforcer l’Espace européen de la recherche, infrastructures de recherche » est reconnu [Contrat 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot et Christian Beck remercient le ministère fédéral de l’Éducation et de la Recherche (BMBF, numéro de subvention 05K19VTB) pour le financement de leurs bourses postdoctorales.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 182
La spectroscopie neutronique à haute résolution pour étudier la dynamique picoseconde-nanoseconde des protéines et de l’eau d’hydratation
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Pounot, K., Appel, M., Beck, C., Weik, M., Schirò, G., Fichou, Y., Seydel, T., Schreiber, F. High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water. J. Vis. Exp. (182), e63664, doi:10.3791/63664 (2022).

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