Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ספקטרוסקופיית נייטרונים ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקה של פיקו-שנייה-ננו-שנייה של חלבונים ומי לחות

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מציעה גישה לא הרסנית ונטולת תוויות לדינמיקה של ps-ns של חלבונים ומי ההידרציה שלהם. תהליך העבודה מוצג עם שני מחקרים על חלבוני עמילואיד: על הדינמיקה שנפתרה בזמן של ליזוזים במהלך צבירה ועל דינמיקת מי ההידרציה של טאו על היווצרות סיבים.

Abstract

פיזור נייטרונים מציע את האפשרות לחקור את הדינמיקה בתוך הדגימות עבור מגוון רחב של אנרגיות באופן לא הרסני וללא תיוג מלבד דאוטריום. בפרט, ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מתעדת את אותות הפיזור במספר זוויות פיזור בו זמנית ומתאימה היטב לחקר הדינמיקה של מערכות ביולוגיות בסקאלת הזמן ps-ns. על ידי שימוש ברכיבי D2O - ואולי גם רכיבי חיץ מפורקים - השיטה מאפשרת ניטור הן של דיפוזיה של מרכז המסה והן של תנועות עמוד השדרה והשרשרת הצידית (דינמיקה פנימית) של חלבונים במצב נוזלי.

בנוסף, ניתן לחקור את דינמיקת מי ההידרציה על ידי שימוש באבקות של חלבונים מחוררים עם H2O. מאמר זה מציג את תהליך העבודה שהופעל במכשיר IN16B במכון Laue-Langevin (ILL) כדי לחקור דינמיקה של חלבונים ומי הידרציה. הכנת דגימות תמיסה ודגימות אבקת חלבון hydrated באמצעות חילופי אדים מוסבר. הליך ניתוח הנתונים עבור דינמיקת מים של חלבונים והידרציה מתואר עבור סוגים שונים של מערכי נתונים (ספקטרום קוואזיאלסטי או סריקות חלונות קבועים) שניתן לקבל על ספקטרומטר פיזור אחורי של נייטרונים.

השיטה מודגמת באמצעות שני מחקרים שכללו חלבוני עמילואיד. הצבירה של ליזוזים לצברים כדוריים בגודל מיקרומטר - חלקיקים מסומנים - מתרחשת בתהליך בן שלב אחד על טווח המרחב והזמן שנבחן על IN16B, בעוד שהדינמיקה הפנימית נותרת ללא שינוי. יתר על כן, הדינמיקה של מי הידרציה של טאו נחקרה על אבקות לחות של חלבון perdeuterated. זה מראה כי תנועות תרגום של מים מופעלות על היווצרות של סיבי עמילואיד. לבסוף, נדונים צעדים קריטיים בפרוטוקול לגבי האופן שבו פיזור נייטרונים ממוקם ביחס לחקר הדינמיקה ביחס לשיטות ביופיזיקליות ניסיוניות אחרות.

Introduction

הנייטרון הוא חלקיק מסיבי וחסר מטען ששימש בהצלחה לאורך השנים לבדיקת דגימות בתחומים שונים, מפיזיקה בסיסית ועד ביולוגיה1. עבור יישומים ביולוגיים, פיזור נייטרונים בזווית קטנה, פיזור נייטרונים בלתי אלסטי, קריסטלוגרפיה ורפלקטומטריה של נייטרונים נמצאים בשימוש נרחב 2,3,4. פיזור נייטרונים קשיח מספק מדידה ממוצעת של הדינמיקה ללא צורך בתיוג ספציפי כשלעצמו, ואיכות אות שאינה תלויה בגודל או בחלבון5. המדידה יכולה להיעשות באמצעות סביבה מורכבת מאוד עבור החלבון הנחקר המחקה את התווך התוך-תאי, כגון ליזט חיידקי או אפילו in vivo 3,6,7. ניתן להשתמש במערכי ניסוי שונים כדי לחקור את הדינמיקה, כלומר i) גישה של זמן טיסה לדינמיקות sub-ps-ps, ii) גישה המעניקה פיזור לאחור לדינמיקות ps-ns, ו-iii) גישה נותנת ספין-הד לדינמיקה מ-ns למאות ns. פיזור אחורי של נייטרונים עושה שימוש בחוק בראג 2d sinθ = nλ, כאשר d הוא המרחק בין מישורים בגביש, θ זווית הפיזור, n סדר הפיזור ו-λ אורך הגל. השימוש בגבישים לפיזור לאחור לכיוון הגלאים מאפשר השגת רזולוציה גבוהה באנרגיה, בדרך כלל ~0.8 μeV. כדי למדוד את חילופי האנרגיה, משתמשים בכונן דופלר הנושא גביש בפיזור לאחור כדי להגדיר ולכוונן את אורך גל הנייטרונים הנכנס 8,9,10 (איור 1), או שניתן להשתמש במערך זמן טיסה במחיר של ירידה ברזולוציית האנרגיה 11.

Figure 1
איור 1: שרטוט של ספקטרומטר פיזור לאחור של נייטרונים עם כונן דופלר. הקרן הנכנסת פוגעת במסוק טרנספורמציית חלל הפאזה (PST)42, המגדיל את השטף במיקום הדגימה. לאחר מכן הוא מפוזר לאחור לכיוון הדגימה על ידי כונן דופלר, אשר בוחר אנרגיה E1 (חץ ציאן). לאחר מכן הנייטרונים מפוזרים על ידי הדגימה (עם אנרגיות שונות המיוצגות על ידי צבע החיצים) והאנלייזרים, העשויים מגבישי Si 111, יפזרו לאחור נייטרונים רק עם אנרגיה ספציפית E0 (חיצים בצבע אדום כאן). לפיכך, העברת התנע q מתקבלת מהמיקום שזוהה של הנייטרון על מערך הגלאים, והעברת האנרגיה מתקבלת מההפרש E1- E0. זמן הטיסה הצפוי לפעימת הנייטרונים המופקת על ידי ה-PST משמש להשלכת האות מהנייטרונים המפוזרים ישירות לעבר צינורות הגלאי. קיצור: PST = טרנספורמציה של מרחב פאזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

עבור ספקטרוסקופיית פיזור לאחור, התרומה העיקרית לאות מדגימות עשירות בפרוטוני מימן, כגון חלבונים, מגיעה מפיזור לא קוהרנטי, שעבורו עוצמת הפיזור Sinc(q, ω) מוצגת על ידי Eq (1)12

Equation 1 (1)

כאשר σinc הוא חתך הרוחב הלא קוהרנטי של היסוד הנחשב, k' הוא הנורמה של וקטור הגל המפוזר, k הנורמה של וקטור הגל הנכנס, q (= k - k') העברת התנע, r j(t) וקטור המיקום של אטום j בזמן t, ו-ω התדר המתאים למעבר האנרגיה בין הנייטרון הנכנס למערכת. הסוגריים הזוויתיים מציינים את ממוצע ההרכב. לפיכך, פיזור לא קוהרנטי בוחן את המתאם העצמי הממוצע של חלקיק בודד של מיקומי אטומים עם זמן ונותן את הדינמיקה העצמית הממוצעת על פני כל האטומים במערכת ומקורות זמן שונים (ממוצע אנסמבל). פונקציית הפיזור היא התמרת פורייה בזמן של פונקציית פיזור הביניים I(q, t), שניתן לראותה כהתמרת פורייה במרחב של פונקציית מתאם ואן הוב המוצגת על ידי Eq (2):

Equation 2 (2)

כאשר ρ(r,t) היא צפיפות ההסתברות למציאת אטום במיקום r ובזמן t 13.

עבור תהליך דיפוזיה פיקיאנית, פונקציית הדיפוזיה העצמית נוצרת (ראו Eq (3)) לאחר התמרת פורייה כפולה בפונקציית פיזור המורכבת מלורנציאן של רוחב קו הנתון על ידי γ = Dq2.

Equation 10 (3)

מודלים מתוחכמים יותר פותחו ונמצאו שימושיים כגון מודל דיפוזיית הקפיצה על ידי Singwi ו- Sjölander עבור ps-ns דינמיקה פנימית של חלבונים14 או מודל הסיבוב על ידי סירס עבור מי הידרציה15,16,17.

במכשיר פיזור אחורי של נייטרונים (NBS) IN16B8,9 ב-ILL, גרנובל, צרפת (איור משלים S1), מערך נפוץ עם חלבונים מורכב מגבישי Si 111 עבור האנלייזרים עם כונן דופלר לכוונון אורך הגל הנכנס (איור משלים S2A), ובכך נותן גישה לטווח העברת התנע ~0.2 Å-1 < q < ~2 Å-1 וטווח העברת אנרגיה של -30 μeV < Equation 3 < 30 μeV - מתאים לטווחי זמן הנעים בין כמה ps לכמה ns ומרחקים של כמה Å. בנוסף, IN16B מציע את האפשרות לבצע סריקות גמישות ובלתי אלסטיות של חלונות קבועים (E/IFWS)10, הכוללות איסוף נתונים בהעברת אנרגיה קבועה. מכיוון שהשטף מוגבל בעבודה עם נייטרונים, E/IFWS מאפשר למקסם את השטף להעברת אנרגיה אחת, ובכך מקצר את זמן הרכישה הדרוש לקבלת יחס אות לרעש מספק. אפשרות עדכנית יותר היא מצב ספקטרומטר פיזור לאחור וזמן טיסה (BATS)11, המאפשר מדידה של מגוון רחב של העברות אנרגיה, (למשל, -150 μeV < < Equation 3 150 μeV), עם שטף גבוה יותר מאשר עם כונן דופלר, אך במחיר של רזולוציית אנרגיה נמוכה יותר (איור משלים S2B).

תכונה חשובה של פיזור נייטרונים היא שחתך הרוחב הלא קוהרנטי σinc הוא בעל ערך גבוה פי 40 עבור מימן מאשר עבור דאוטריום, והוא זניח עבור יסודות אחרים הנמצאים בדרך כלל בדגימות ביולוגיות. לכן, ניתן לחקור את הדינמיקה של חלבונים בסביבה נוזלית באמצעות מאגר deuterated, ומצב האבקה מאפשר לחקור דינמיקה פנימית של חלבונים עם אבקת חלבון מוקשה hydrated עם D 2 O, או המחקר של מים הידרציה עבוראבקת חלבון perdeuterated hydrated עם H2O. במצב נוזלי, פיזור אחורי של נייטרונים מאפשר בדרך כלל גישה בו זמנית לדיפוזיה העצמית של מרכז המסה של חלבונים (דיפוזיה מסוג פיקיאן) ולדינמיקה הפנימית שלהם. אלה האחרונים הם תנועות עמוד השדרה ושרשרת הצד המתוארות בדרך כלל על ידי מה שנקרא מודל דיפוזיה קפיצה או אחרים 3,18. באבקות חלבון מוקשה, דיפוזיית החלבון נעדרת ויש למדל רק דינמיקה פנימית. עבור מי הידרציה, התרומות של תנועות תרגומיות וסיבוביות של מולקולות מים מציגות תלות שונה בהעברת התנע q, המאפשרת את ההבחנה ביניהן בתהליך ניתוח הנתונים17.

מאמר זה מדגים את שיטת הפיזור לאחור של נייטרונים באמצעות מחקר של חלבונים שנמצאו מסוגלים להתפתח, להצטבר לצורה קנונית המורכבת מערימות של β-גדילים - מה שמכונה תבנית β צולבת19,20 - וליצור סיבים מוארכים. זהו מה שנקרא צבירה עמילואיד, אשר נחקר בהרחבה בשל תפקידו המרכזי בהפרעות נוירודגנרטיביות כגון אלצהיימר או פרקינסון21,22. המחקר של חלבוני העמילואיד מונע גם על ידי התפקיד הפונקציונלי שהם יכולים למלא 23,24 או הפוטנציאל הגבוה שלהם לפיתוח ביו-חומרים חדשים25. הדטרמיננטים הפיזיקוכימיים של צבירת העמילואיד עדיין אינם ברורים, ואין תיאוריה כללית של צבירת עמילואיד, למרות התקדמות עצומה במהלך השנים האחרונות21,26.

צבירת עמילואיד מרמזת על שינויים במבנה החלבון וביציבותו עם הזמן, שהמחקר שלהם מרמז באופן טבעי על דינמיקה, הקשורה ליציבות קונפורמציה של חלבונים, תפקוד חלבונים ונוף אנרגיית חלבון27. דינמיקה קשורה ישירות ליציבות של מצב מסוים באמצעות התרומה האנטרופית עבור התנועות המהירות ביותר28, ותפקוד החלבונים יכול להתקיים על ידי תנועות בסקאלות זמן שונות, החל מ-sub-ps עבור חלבונים רגישים לאור29 ועד ms עבור תנועות תחום, אשר ניתן להקל על ידי דינמיקה פיקו-שנייה-ננו-שנייה30.

יוצגו שתי דוגמאות לשימוש בספקטרוסקופיית פיזור לאחור של נייטרונים לחקר חלבוני עמילואיד, אחת במצב נוזלי לחקר דינמיקה של חלבונים ואחת במצב אבקה רוויית לחות לחקר דינמיקת מי הידרציה. הדוגמה הראשונה נוגעת לצבירה של ליזוזים לכדורים בגודל מיקרומטר (הנקראים חלקיקים) ואחריה בזמן אמת5, והשנייה השוואה של דינמיקת מים במצבים טבעיים ומצטברים של החלבון האנושי טאו31.

ליזוזים הוא אנזים המעורב בהגנה החיסונית ומורכב משאריות של 129 חומצות אמינו. ליזוזים יכול ליצור חלקיקים בחיץ מפורק ב pD של 10.5 ובטמפרטורה של 90 ° C. עם פיזור נייטרונים, הראינו כי התפתחות הזמן של מקדם הדיפוזיה של מרכז המסה של ליזוזים עוקבת אחר הקינטיקה המעריכית היחידה של תיאופלבין T פלואורסצנטי (בדיקה פלואורסצנטית המשמשת לניטור היווצרות תבניות β צולבות עמילואיד32), מה שמצביע על כך שהיווצרות מבני על חלקיקיים ותבניות β צולבות מתרחשות בשלב אחד עם אותו קצב. יתר על כן, הדינמיקה הפנימית נשארה קבועה לאורך כל תהליך הצבירה, אשר ניתן להסביר או על ידי שינוי קונפורמציה מהיר שלא ניתן לצפות בו על מכשירי NBS, או על ידי היעדר שינוי משמעותי באנרגיה הפנימית של החלבונים בעת הצבירה.

החלבון האנושי טאו הוא חלבון בעל הפרעה מהותית (IDP) המורכב מ-441 חומצות אמינו עבור מה שמכונה איזופורם 2N4R, אשר מעורב באופן בולט במחלת אלצהיימר33. באמצעות פיזור לאחור של נייטרונים על אבקות של חלבון טאו מפורר, הראינו כי דינמיקת מי הידרציה מוגברת במצב הסיבים, כאשר אוכלוסייה גבוהה יותר של מולקולות מים עוברות תנועות תרגומיות. התוצאה מצביעה על כך שעלייה באנטרופיית מי הידרציה עשויה להניע את פרפור העמילואיד של טאו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכינו את החיץ המנוטרל לחלבונים במצב נוזלי

  1. ממיסים את כל רכיבי המאגר ב-D2O טהור.
  2. אם אלקטרודת ה- pH כוילתה ב- H2O, התאם את ה- pD בהתאם לנוסחה pD = pH + 0.4 באמצעות NaOD או DCl34.
    הערה: השימוש ב-D 2O במקום ב-H2O עשוי להשפיע על מסיסות החלבון, וייתכן שיהיה צורך להתאים את תנאי החיץ (למשל, על ידי שינוי קל בריכוז המלח).

2. הכינו את האבקות H2O-hydrated של חלבון perdeuterated

  1. הכינו את מחזיק המדגם.
    1. נקו היטב מחזיק דגימת אלומיניום שטוח עם חותם חוט אינדיום וברגים עם מים ואתנול ותנו לו להתייבש.
      הערה: נעשה שימוש במחזיק מדגם שטוח כך שניתן לפזר את האבקה באופן הומוגני על פני השטח. כמות האבקה צריכה להספיק כך שניתן יהיה לשמור עליה בין הקירות ולא תיפול כאשר מחזיק הדגימה ממוקם אנכית.
    2. שקול את החלקים השונים של מחזיק הדגימה - תחתית, מכסה וחוט אינדיום - בנפרד על איזון מדויק.
    3. הניחו את אטם חוט האינדיום בקוטר 1 מ"מ בחריץ של החלק התחתון של מחזיק הדגימה, והשאירו חפיפה קטנה במקום שבו שני הקצוות מתחברים (איור 2A).
    4. הניחו כמות מתאימה של חלבון ליופילי (בדרך כלל ~ 100 מ"ג חלבון) כך שהוא ימלא את המשטח הפנימי של החלק התחתון של מחזיק הדגימה.
  2. הוסיפו לחות לאבקת החלבון.
    1. הניחו את מחזיק הדגימה במייבש עם צלחת פטרי המכילה אבקת P2O5 למשך 24 שעות כדי לייבש לחלוטין את אבקת החלבון35 (איור 2B). שקלו את החלק התחתון היבש של מחזיק הדגימה המכיל את חותם האינדיום ואת האבקה היבשה כדי לקבל mיבש.
      זהירות: אבקת P2O5 היא קורוזיבי מאוד.
    2. הסר את P 2 O5 מן מייבש ולשים צלחת פטרי עם D2O בפנים. לשלוט על המסה של האבקה באופן קבוע כדי לבדוק את רמת הידרציה h = m hyd / m יבש שבו mhyd ו mיבש הם המסה של אבקתhydrated אבקה יבשה, בהתאמה.
      הערה: עבור חלבונים הידרופוביים מאוד כגון אינסולין, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את הטמפרטורה בתוך מייבש כדי לקבל לחץ אדים גבוה יותר ולהגיע לרמת ההידרציה הרצויה h.
    3. חזור על שלבים 2.2.1 ו- 2.2.2 לפחות שלוש פעמים כדי להמיר כראוי את כל המימנים הניתנים להחלפה לדאוטרונים.
      הערה: לחלופין, מחזורים של ייבוש בהקפאה והמסה ב-D2O טהור עשויים לשמש להחלפת H/D טובה יותר, בתנאי שהחלבון אינו מושפע מכך.
    4. לחות את האבקה מעט מעל לרמה הרצויה, לתת לחלק התחתון של מחזיק הדגימה עם חוט אינדיום ואבקה hydrated להישאר על איזון דיוק, ולחכות המסה לרדת לאט לערך הרצוי כדי לקבל את היעד h (בדרך כלל 0.2-0.4 אם חלבון כדורי בגודל בינוני הוא להיות מכוסה על ידי שכבת הידרציה אחת שלמה).
    5. הניחו במהירות את המכסה על החלק התחתון וסגרו תחילה את מחזיק הדגימה עם ארבעה ברגים כדי לעצור את חילוף האדים (איור משלים S3A).
    6. הניחו והדקו את כל הברגים הנותרים עד שלא ייראה רווח בין החלק התחתון למכסה (איור משלים S3B).
    7. שקלו את מחזיק הדגימה האטום כדי לבדוק אם יש אובדן הידרציה פוטנציאלי כתוצאה מדליפות לאחר ניסוי הנייטרונים.

3. בצע את ניסוי פיזור הנייטרונים הלא קוהרנטי

  1. לדון ולבדוק שוב את תצורת המכשיר הדרוש לניסוי עם איש הקשר המקומי כמה שבועות לפני זמן הקרן שהוקצה.
  2. הכן את דגימת המצב הנוזלי.
    1. ממיסים את החלבון במאגר המפורק.
    2. לקבוע את נפח הנוזל המתאים שיש להכניס למחזיק הדגימה באמצעות מים (יש לוודא שאין הצפה כאשר מחזיק הדגימה סגור; איור 2C).
      הערה: השלבים הבאים (3.3 ו-3.4) מתארים ניסוי שנערך על ספקטרומטר NBS IN16B ב-ILL8,9, תוך שימוש בתנור קריופורנס כסביבת דגימה. מערכת בקרת המכשירים תשתנה ממכשיר אחד למשנהו, אך עקרונות העבודה יישארו זהים.
  3. הכנס את הדגימה.
    1. יבשו היטב את מקל הדגימה (איור 2D), והוציאו את הדגימה הקודמת, אם קיימת, לאחר שבדקתם שמנת הקרינה המייננת נמוכה מ-100 μSv/h לפני הטיפול בחומר כלשהו (ב-ILL).
    2. הניחו את הדגימה, בדקו אם יש מרכוז נכון ביחס למרכז הקרן (איור משלים S4), והכניסו את מוט הדגימה לתנור ההקפאה (איור 2D). הפעל את משאבת הוואקום כדי להגיע לפחות מ 10-3 בר, ולשטוף את האוויר בתוך תנור ההקפאה על ידי חזרה על שלוש הפעמים הבאות: מלא את התנור בגז הליום עד שיגיע ללחץ אטמוספרי, והסר את הגז שוב באמצעות משאבת הוואקום.
      הערה: במקרה של מחזיק מדגם שטוח, מחזיק הדגימה חייב להיות מכוון בזווית של 45° ביחס לקרן הנכנסת. טווח העברת התנע השימושי יכול להיות מופחת עקב ספיגה ופיזור על ידי התא. בולם נייטרונים חזק כגון קדמיום יכול לשמש כדי להסוות חלקים מסוימים של מחזיק הדגימה (למשל, ברגים, חלקים עבים).
    3. הציגו קצת גז הליום בתנור ההקפאה כך שהלחץ הוא ~ 0.05 בר.
  4. רכישת נתונים (למשל, באמצעות NOMAD על IN16B ב- ILL, ההנחה היא שהמשתמש מעדיף טמפרטורה של 200 K לפני רכישת ספקטרום נויטרונים קוואזיאלסטי (QENS), ואז E/IFWS במהלך כבש טמפרטורה ל- 310 K ב- 0.5 K לדקה ולבסוף QENS ב- 310 K).
    1. באמצעות NOMAD, בכרטיסייה ביצוע, גרור ושחרר בקר FurnaceCryostat במשטח השיגור. כוונו את הטמפרטורה ל 200 K. השתמש במצב מהיר ופסק זמן של 30 דקות כך שלטמפרטורה יהיה זמן להתייצב. לחץ על סמל החצים המסתובבים כדי להפעיל אותו ברקע כך שניתן יהיה להשיג נתונים במהלך ירידת הטמפרטורה.
    2. גרור ושחרר את בקר IN16DopplerSettings , הגדר את פרופיל המהירות למהירות מדויקת שנקבעה על ידי Max ΔE, ערך של 0.00 μeV ו- 128 ערוצים כדי לקבל תצורת EFWS.
    3. גרור ושחרר בקר ספירה , מלא את השדה כתוביות בשם המאפשר זיהוי קל של הנתונים, והגדר 60 חזרות של סריקות של 30 שניות (איור משלים S5A).
    4. גרור ושחרר בקר IN16DopplerSettings , הגדר את פרופיל המהירות לסינוס שנקבע על ידי מהירות עם ערך של 4.5 m/s ו- 2,048 ערוצים כדי לקבל תצורת QENS.
    5. גרור ושחרר בקר ספירה עם 4 חזרות של סריקות של 30 דקות (איור משלים S5B).
    6. עבור רמפת הטמפרטורה, גרור ושחרר בקר FurnaceCryostat , הגדר את הטמפרטורה ל- 310 K, הגדר את Ramp ל - SetPoint עם Δ = 0.05 K ו- 6 שניות. השתמש בפסק זמן של 220 דקות (איור משלים S6A).
    7. השתמש בלולאה עם 65 חזרות. בפנים, הכנס בקר IN16DopplerSettings כמו בשלב 3.4.2, ואחריו ספירה אחת של 30 שניות. לאחר מכן, הכנס IN16DopplerSettings, כפי שתואר קודם לכן, אך באמצעות היסט אנרגיה של 1.5 μeV ו - 1,024 ערוצים ואחריו ספירה אחת של 3 דקות (איור משלים S6B).
    8. כדי לרכוש את ה-QENS האחרון ב-310K, גרור ושחרר את בקרי IN16DopplerSettings ו-Count שתצורתם הוגדרה כמתואר בשלבים 3.4.4 ו-3.4.5, בהתאמה.
    9. לחץ על לחצן התחל (משולש ימני בתחתית החלון) כדי להפעיל את הסקריפט.
      הערה: כל ניסוי ידרוש רכישת נתוני כיול; כלומר, התא הריק לצורך תיקוני חיסור או בליעה, החיץ לבדו בטמפרטורות השונות המשמשות למדל את הרקע, ומדידה של ונדיום (או שווה ערך, הדגימה בטמפרטורה של 10 K ומטה) כדי לקבל את פונקציית הרזולוציה של המכשיר.

4. ניתוח נתונים - QENS

  1. ייבוא ערכת הנתונים באמצעות שיטת 'IN16B_QENS.process()' בתוכנת Python nPDyn v3.x36
    >>>> מייבוא nPDyn.dataParsers IN16B_QENS

    מדגם >>> = IN16B_QENS(
    ... <נתיב לקבצי נתונים>
    ... [detGroup=... פורמט>]
    ... ). תהליך()

    מדגם >>> = sample.get_q_range(0.3, 1.8)
  2. בצע תיקוני נתונים (אופציונלי) באמצעות הפקודות הבאות (עיין בתיעוד של nPDyn לקבלת מידע נוסף, איור 3):
    #it מניח כי נתונים עבור תא ריק, ונדיום וחיץ
    # יובאו כבר במערך נתונים שנקרא 'empty_cell', 'ונדיום',
    # ו- 'buffer', בהתאמה.

    # עבור חיסור תאים ריקים עם גורם שינוי קנה מידה
    # (שגיאות מופצות באופן אוטומטי)
    מדגם >>> = מדגם - 0.95 * empty_cell

    # לתיקון באמצעות מקדם Paalman-Ping
    # (בלעדי הדדית עם הדוגמה לעיל)
    מדגם >>> = sample.absorptionCorrection(empty_cell)

    # לנורמליזציה
    מדגם >>> = sample.normalize(vanadium)

    # לקשירה לאורך ציר נצפה
    # נצפה הוא זמן הצבירה כאן
    מדגם >>> = מדגם.bin(3, ציר=0)
  3. התאם את נתוני הכיול. ניתן להתקין את מערך הנתונים - דגימות, תאים ריקים, מאגר מפורק (במידת הצורך) וונדיום באמצעות מודלים מובנים או מודל המוגדר על-ידי המשתמש (ראה תיעוד nPDyn):
    >>> מייבוא nPDyn.models.builtins (
    ... דגםPVoigt,
    ... דגםמים,
    ... דגם מכוילD2O,
    ...     )

    # מודלים מובנים משתמשים בווקטור עמודה של התנע
    # העברת ערכי Q
    >>> q = vanadium.q[:, ללא]

    # הוונדיום מצויד באמצעות פרופיל פסאודו-Voigt
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. השתמש במודל המובנה עבור מי הידרציה שנקרא 'modelWater'. מודל זה קורא כפי שמוצג על-ידי Eq (4)17
    Equation 4 (4)
    כאשר0,r ו-t הם סקלרים המסבירים את התרומה היחסית של אות אלסטי, תנועות סיבוב ותנועות תרגומיות, בהתאמה; j1(qd) היא פונקציית בסל כדורית מסדרl th, כאשר q היא העברת התנע; d מרחק O-H במולקולת המים; δ(ω) היא הדלתא של דיראק, אשר מוכפלת על ידי EISF כאן; N היא הסדר הגבוה ביותר של פונקציית בסל הכדורית המשמשת (בדרך כלל ~5); Equation 5 ו Equation 11 - הן תנועות סיבוב לורנציאניות ותנועות תרגומיות, בהתאמה; b(q) הוא מונח רקע שטוח. פונקציות בסל הכדוריות נותנות את התרומה היחסית של כל מצב תנע זוויתי של מולקולות המים, והמספר N נקבע על בסיס תחום q העברת התנע. במקרה של ספקטרומטר NBS טיפוסי, המונחים עד N=4 מסבירים כמעט לחלוטין את האות (איור משלים S7).
    # כאן, משוואה 2 משמשת למי הידרציה
    # פיתול עם פונקציית רזולוציה ותוספת של
    # רקע D2O נעשה באופן אוטומטי עם
    # סיפק ארגומנטים
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=ונדיום,
    ... bkgd=חיץ,
    ... volume_fraction_bkgd=0.95
    ... )
    הערה: התרומות של תנועות סיבוביות ותרגומיות צריכות להיות מפותלות כדי להיות קפדניות לחלוטין. את הצלחתו של מודל תוספים יש לייחס לנוכחות אוכלוסיות שונות של מים על פני השטח החלבוני ולטווח האנרגיה המוגבל הנגיש.
  5. השתמש באפשרויות הבאות כדי להתוות את הנתונים (איור 4):
    >>> מ- nPDyn.plot import plot
    >>> עלילה (מדגם)

5. ניתוח נתונים - רמפת טמפרטורה, סריקות חלון קבוע אלסטי (EFWS)

  1. השתמש בהליך דומה לסעיף 4 כדי לנרמל את נתוני הטמפרטורה לפי האות בטמפרטורה הנמוכה ביותר (בדרך כלל 10 K):
    >>> מייבוא nPDyn.dataParsers IN16B_FWS

    מדגם >>> = IN16B_FWS(
    ... <נתיב לקבצי נתונים>,
    ... detGroup=[detGroup=<קובץ קיבוץ מספרים שלמים או גלאי בתבנית XML>]
    ... ). תהליך()

    # נורמליזציה עם 5 הנקודות הראשונות על הנצפה
    ציר #, המתאים לטמפרטורה
    מדגם >>> /= מדגם[:5].mean(0)

    # טווח Q של העברת המומנטום המשמש כאן קטן יותר
    # מכיוון שהמודל שבו נעשה שימוש תקף עבור q נמוך בלבד
    מדגם >>> = sample.get_q_range(0.2, 0.8)
  2. השתמש במודל גאוסיאני פשוט כדי להתחיל, שרוחבו נתון על ידי מה שמכונה תזוזה בריבוע ממוצע (MSD). בנה והתאם את המודל באמצעות הפקודות הבאות:
    >>> לייבא numpy כ- NP
    >>> מ- nPDyn.models ייבוא פרמטרים, מודל, רכיב

    # a הוא גורם קנה מידה
    >>> params = פרמטרים(
    ... a={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)},
    ... msd={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)}
    ... )

    מודל >>> = מודל (פרמות)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... 'גאוסיאני',
    ... Lambda X, A, MSD: A * NP.EXP(-X ** 2 * MSD / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, ללא])

    >>> עלילה (מדגם)
    הערה: קירוב גאוס מתקיים תמיד עבור q2MSD << 1, אך ניתן להשתמש בטווח העברת תנע רחב יותר להשוואה יחסית בין דגימות. מודלים מתוחכמים יותר, החורגים מקירוב גאוס, פותחו37,38,39.

6. ניתוח נתונים - סריקות גמישות ולא אלסטיות עם חלונות קבועים (E/IFWS)

  1. בדומה לשלב 4, יבא את ערכת הנתונים אך באמצעות המחלקה 'IN16B_FWS':
    >>> מייבוא nPDyn.dataParsers IN16B_FWS

    מדגם >>> = IN16B_FWS(
    ... <נתיב לקבצי נתונים>
    ... [detGroup=<קובץ קיבוץ מספרים שלמים או גלאי בתבנית XML>]
    ... ). תהליך()

    מדגם >>> = sample.get_q_range(0.3, 1.8)
  2. התאם את נתוני הכיול ואת הנתונים לדוגמה.
    1. נתח את נתוני E/IFWS באמצעות MSD40 כללי או על ידי התייחסות אליהם כספקטרום QENS גס (שיש רק כמה נקודות נתונים על ציר האנרגיה). כאשר E/IFWS נתפס כ-QENS גס, מודלים המשמשים ל-QENS משמשים כדי להתאים את כל מערך הנתונים של E/IFWS בבת אחת (התאמה גלובלית של העברות אנרגיה והעברות מומנטום).
      הערה: הפתרון האחרון - שימוש במודלים עבור QENS על נתוני E/IFWS - משמש כאן במקום שבו נכפית התלות בהעברת המומנטום של דיפוזיה של מרכז המסה ודינמיקה פנימית של חלבונים.
    2. מודל דינמיקה של חלבונים בנוזלים באמצעות Eq (5) הבא ('modelProteinJumpDiff' ב- nPDyn):
      Equation 6 (5)
      כאשר R(q,ω) היא פונקציית הרזולוציה; β סקלר בלתי תלוי עבור כל העברת תנע q; 0 הוא גורם המבנה האלסטי הלא קוהרנטי (EISF); Equation 7 חשבונאות לורנציאנית לדיפוזיה של מרכז מסה עם רוחב נתון על ידי Eq (6); Equation 12 הוא לורנציאן הכולל דיפוזיה של מרכז מסה ותרומה בעקבות מודל דיפוזיית קפיצה14 המביא בחשבון דינמיקה פנימית (Eq (7); Equation 8 להיות האות המותאם מ D2O מחדש על ידי חלק נפח שלה בדגימה.
      γ = Dsq2 (6)
      Ds הוא מקדם הדיפוזיה העצמית.
      Equation 9 (7)
      Di הוא מקדם הדיפוזיה הנראה לעין עבור דינמיקה פנימית ו-τ זמן הרפיה עבור תנועות דיפוזיות.
      >>> מייבוא nPDyn.models.builtins (
      ... דגםPVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... דגם מכוילD2O,
      ... )

      # מודלים מובנים משתמשים בווקטור עמודה של התנע
      # העברת ערכי Q
      >>> q = vanadium.q[:, ללא]

      # הוונדיום מצויד באמצעות פרופיל פסאודו-Voigt
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # עבור D2O טהור, דגם עם רוחב קו מכויל
      # עבור טמפרטורות שונות כלול ב- nPDyn
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # כאן, משוואה 3 משמשת עבור דגימות נוזל
      # פיתול עם פונקציית רזולוציה ותוספת של
      # רקע D2O מתבצע באופן אוטומטי עם הארגומנטים שסופקו #
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=ונדיום,
      ... bkgd=חיץ,
      ... volume_fraction_bkgd=0.95
      ... )
  3. התווה את הנתונים המותאמים באמצעות:
    >>> מ- nPDyn.plot import plot
    >>> עלילה (מדגם)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הצבירה של ליזוזים לחלקיקים בוצעה ב 90 ° C עם ריכוז חלבון של 50 מ"ג / מ"ל בחיץ deuterated (0.1 M NaCl ב pD 10.5). היווצרות חלקיקים מופעלת על-ידי עליית הטמפרטורה ל-90°C ומתרחשת תוך 6 שעות (איור משלים S8). איסוף הנתונים בוצע ב-IN16B, כמתואר בפרוטוקול לעיל (הנתונים נאספים לצמיתות על ידי ה-ILL ונגישים ב-http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

ספקטרום QENS נרכש ב 7 ° C כדי לאפיין באופן מלא את המצב הראשוני. לאחר מכן, הטמפרטורה הועלתה ל 90 ° C (בדרך כלל לוקח ~ 30 דקות על IN16B, איור משלים S9) כדי להפעיל את תהליך הצבירה. ניתן לעקוב אחר הקינטיקה באמצעות ממוצע הזזה של ספקטרום QENS, המאפשר גישה לטווח המלא של העברת אנרגיה, אך עם רזולוציה מוגבלת בזמן. ניתן לשפר את רזולוציית הזמן ל~1 דקות באמצעות EFWS ול~20 דקות באמצעות E/IFWS בארבעה ערכי העברת אנרגיה5.

בדוגמה שהוצגה, בחנו העברות אנרגיה של 0, 0.6, 1.5 ו-3 μeV. סריקות E/IFWS נרכשות ברציפות במהלך תהליך הצבירה, וספקטרום QENS נרכש למצב הסופי ב-90°C. נתוני E/IFWS תוקנו לקליטה באמצעות E/IFWS של התא הריק ונורמלו באמצעות נתוני הוונדיום.

עבור ליזואנזים E/IFWS, אנו רואים עלייה של האות בזמן בהעברת תנע נמוכה והעברת אנרגיה נמוכה, בעוד שהאות בהעברת אנרגיה גבוהה והעברת תנע נמוכה פוחת (איור משלים 10). תצפית איכותית זו מצביעה על היווצרות עצמים גדולים יותר, המתפזרים לאט יותר ומאשרים כי תהליך הצבירה התרחש. הניתוח, על פי Eq (4), מביא למקדם דיפוזיה התחלתי של מרכז מסה של 15 Å2/ns, בהתאם לנוכחותם של צבירי חלבונים קטנים (הנתמכים על ידי פיזור אור דינמי וחישובי HYDROPRO 5,41), אשר פוחתים באופן אקספוננציאלי עם הזמן (איור 5). מקדם הדיפוזיה לכאורה עבור דינמיקה פנימית נשאר קבוע לאורך כל תהליך הצבירה. לפיכך, נראה כי היווצרות חלקיקי ליזוזים מתרחשת בשלב צבירה יחיד. היעדר שינוי בדינמיקה הפנימית של חלבונים מצביע על כך שההמרה ל-cross-β והשינוי האפשרי הקשור באנרגיה מהירים מדי, או שהשפעות מניעות אחרות, כגון עלייה באנטרופיה של ממסים, עשויות להיות דומיננטיות לחלוטין בטווח האנרגיה שנבדק.

המחקר של דינמיקת מי הידרציה סביב מונומרים וסיבים של טאו בוצע על SPHERES במרכז מאייר-לייבניץ (MLZ) בגרכינג, גרמניה, תוך שימוש בפרוטוקול המתואר לעיל עבור דגימות אבקה. נעשה שימוש בכ-100 מ"ג אבקת חלבון טאו מפורקת, שעברה הידרציה של 0.4 גרם H2O לגרם חלבון. EFWS נרכשו במהלך רמפת טמפרטורה וספקטרום QENS בטמפרטורה קבועה. ה-EFWS תועדו החל מ-20 K והעלו את הטמפרטורה ל-300 K בקצב של 0.2 K/min תוך איסוף נתונים רציף במהלך 5 דקות סריקות.

ספקטרום QENS תועד ב-20 וב-280K. נתוני ה-EFWS הותקנו באמצעות גאוסיאן פשוט על פני טווח העברת התנע q 0.2 Å-1 < q <-0.8 Å-1 כדי לחלץ את MSD (איור משלים S11A). ערכי MSD הם מעל מגבלת התוקף עבור מודל גאוס. לפיכך, מומלץ במקרה זה לחקור מודלים אחרים מעבר לקירוב גאוס37,38,39. בטמפרטורות גבוהות מ-220K, מי ההידרציה סביב סיבי טאו ניידים יותר באופן משמעותי ממי הידרציה סביב מונומרים של טאו (איור 6). התאמת נתוני QENS מאפשרת למשתמשים לקבל את רוחב הקו ואת התרומה היחסית של תנועות אלסטיות, סיבוביות ותרגומיות של מי הידרציה בדגימה (איור משלים S11B). נראה כי החלק של מולקולות מים העוברות תנועה תרגומית גדל סביב סיבים, ומקדמי דיפוזיה תרגומיים וסיבוביים של מולקולות מים מוגדלים סביב סיבים17,31. לעומת זאת, הדינמיקה הפנימית של החלבון טאו, המשקפת את תנועות עמוד השדרה והשרשרת הצידית, לא השתנתה עם הפרפור.

Figure 2
איור 2: בסיס של מחזיק דגימת אלומיניום שטוח. (A) מחזיק דגימת האלומיניום השטוח מציג חלק מרכזי החשוף לנייטרונים שבו אבקת החלבון נשמרת בתוך רווח קטן - בדרך כלל ~0.3 מ"מ - בין הבסיס למכסה. ניתן להשתמש בחוט אינדיום לאיטום מכיוון שהוא מתנגד לעליית הטמפרטורה עד 90 מעלות צלזיוס. במקרה של טמפרטורות גבוהות יותר, ניתן להשתמש באטם טפלון. (B) אבקת החלבון מונחת בבסיס מחזיק הדגימה עם חוט אינדיום במקומו. מחזיק הדגימה ממוקם במייבש בנוכחות P 2 O5 לייבוש או H 2 O/D2O O להידרציה. מוסיפים שומן ואקום כדי למנוע דליפה בין התחתית למכסה של המייבש. ניתן להשתמש בוואקום בזהירות כדי להאיץ את תהליך הייבוש. חימום תחתית מייבש עשוי להידרש עבור דגימות הידרופוביות מאוד. (C) תמיסת החלבון ממוקמת בין הצילינדר הפנימי והחיצוני. יש להקפיד לא לצלול יותר מדי נוזלים (לא אמורה להיות הצפה כאשר מחזיק הדגימה סגור). חוט האינדיום ממוקם בחריץ העגול. (D) מוט הדגימה (ברקע) מספק שליטה על גובה הדגימה וכיוונה ויכול לכלול בקרים וגלאים שונים לסביבות דגימה (טמפרטורה, לחץ). מקל הדגימה מוכנס מראש התנור הקריופורנס (הקדמי), המספק שליטה על הטמפרטורה במהלך הניסוי. במהלך הניסוי, קרן הנייטרונים פוגעת בדרך כלל בתחתית הקריופורנס, כפי שמצוין על ידי המלבן הלבן (גודל הקרן תלוי בתצורת המכשיר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תיקוני נתונים ונורמליזציה עשויים לשפר את ההתאמה. הנתונים יובאו באמצעות nPDyn, כמתואר בפרוטוקול. משמאל, מערך הנתונים נורמל באמצעות הנתונים של הצג בלבד. מימין, נעשה שימוש באות של הפחית הריקה יחד עם מקדמי Paalman-Ping43 כדי לתקן את בליעת הנייטרונים ממחזיק הדגימה. לאחר מכן, המודל המותאם לאות הוונדיום שולב באופן עצמאי עבור כל העברת תנע q, והתוצאה שימשה לנרמול מערך הנתונים של המדגם. בשתי החליקות, S(q,ω) מציין את אות הפיזור, q הוא העברת התנע ו Equation 3 - הוא העברת האנרגיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: חלון שרטוט שנוצר על-ידי nPDyn המציג את תוצאת ההתאמה. נתוני QENS הותאמו באמצעות nPDyn, כמתואר בפרוטוקול. חלון ההתווייה מאפשר למשתמשים להתוות את הנתונים לאורך צירים שונים - נצפים (זמן, טמפרטורה או לחץ), q העברת תנע או העברת אנרגיה - והבוררים זמינים לניווט לאורך הצירים האחרים. קיימים סוגים שונים של חלקות, כאשר ה'עלילה' הפשוטה מוצגת ב-(A) ו-'Analysis - q-wise' ב-(B). כפתור 'התוויית' מציג את מערכי הנתונים השונים בחלקות משנה נפרדות, כפתור 'השווה' מציג את מערכי הנתונים באותה חלקה, כפתור 'התוויית תלת מימד' מציג את מערכי הנתונים בתת-חלקות תלת-ממדיות שונות הדומות ל-s, כפתור 'ניתוח - q-wise' מציג את הפרמטרים המותאמים כפונקציה של העברת מומנטום q ו- 'Analysis - ניתן לצפייה-חכם' מציג את הפרמטרים המותאמים כפונקציה של נצפה (זמן, טמפרטורה או לחץ). קיצור: QENS = פיזור נייטרונים קוואזיאלסטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: צבירת ליזוזים מתרחשת בתהליך חד-שלבי עם דינמיקה פנימית קבועה. הליזוזים הומס במאגר הצבירה (המתואר במקום אחר5), ו- E/IFWS נרכש במהלך הצבירה, אשר הופעלה על ידי העלאת הטמפרטורה ל -90 מעלות צלזיוס. לאחר תיקון בליעה עם תא ריק ונורמליזציה באמצעות אות הוונדיום, נותחו הנתונים באמצעות מודל דיפוזיית הקפיצה כמתואר בפרוטוקול. מקדם הדיפוזיה העצמית של מרכז המסה מתואר כפונקציה של זמן (משולשים כחולים) יחד עם מקדם הדיפוזיה הנראה לעין עבור דינמיקה פנימית (ריבועים כתומים). נתון זה הוא מ 5. קיצור: E/IFWS = סריקות חלון קבוע אלסטיות ולא אלסטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: דינמיקת מי הידרציה מוגברת סביב סיבי טאו. אבקות H2O-hydrated של סיבי טאו ומונומרים מפורקים נאטמו במחזיק דגימת אלומיניום שטוח, ונתוני EFWS נרכשו במהלך כבש טמפרטורה מ -20 עד 300 K. לאחר תיקון בליעה עם תא ריק ונורמליזציה באמצעות אות הוונדיום, נותחו הנתונים באמצעות מודל דיפוזיית הקפיצה כמתואר בפרוטוקול. תמונה זו צוירה מחדש באמצעות טווח q קטן יותר (0.2 < q < 0.8 Å-1) מנתונים מ- 31. קיצור: EFWS = סריקות גמישות עם חלונות קבועים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: תצלומים של המכשיר IN16B ב- ILL. (למעלה) המכשיר IN16B כפי שנראה מהאזור מבוקר הקרינה המוקדש למכשיר. הקרן הנכנסת נעה בתוך מדריך הנייטרונים אל תא הוואקום, המכיל את רוב מרכיבי המכשיר (מסוק PST, אנלייזרים, דגימה, גלאים). (למטה) פנים תא הוואקום. מסוק ה-PST גלוי לעין וכך גם המנתחים המקיפים את תנור ההקפאה המכיל את הדגימה. הגלאים ממוקמים מאחורי ההקפאה. באדיבות Laurent Thion, ecliptique. קיצור: PST = טרנספורמציה של מרחב פאזה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: סקיצה של IN16B במצב קלאסי (עם כונן דופלר) ובמצב BATS. (A) קרן הנייטרונים מונוכרומטית חלקית על-ידי בורר המהירות. לאחר מכן, מסוקי הרקע וה-PST יפיקו פולס נייטרונים, שממנו ייבחר פרופיל אנרגיה על ידי מונוכרומטור דופלר (מצב E/IFWS או QENS). לאחר מכן הנייטרונים מפוזרים על ידי הדגימה, ואנרגיה אחת מוחזרת לעבר הגלאים על ידי האנלייזרים. באדיבות ה-ILL. (B) מסוקי BATS משמשים להגדרת פולס נייטרונים יחיד עם טווח אנרגיה מוגדר. קרן הנייטרונים מונוכרומטית בחלקה על ידי בורר המהירות. לאחר מכן, מסוק הרקע יסיר נייטרונים לא רצויים שאינם שייכים לפולס שנבחר. לאחר מכן הנייטרונים מפוזרים על ידי הדגימה, ואנרגיה אחת מוחזרת לעבר הגלאים על ידי האנלייזרים. באדיבות ה-ILL. קיצורים: BATS = פיזור לאחור וספקטרומטר זמן טיסה; PST = טרנספורמציה של מרחב פאזה; E/IFWS = סריקות חלון קבוע אלסטיות ולא אלסטיות; QENS = פיזור נויטרונים קוואזיאלסטי; PG = גרפיט פירוליטי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: מחזיק הדגימה נסגר במהירות לאחר שהאבקה הגיעה ללחות הרצויה ואטומה. (A) מחזיק הדגימה השטוח נסגר במהירות באמצעות ארבעה ברגים. פער קטן יישאר בגלל חוט האינדיום. לאחר מכן מוסיפים את שאר הברגים, ומחזיק הדגימה נאטם באיטיות על ידי הידוק עדין של כל בורג מספר פעמים כדי לאפשר לאינדיום להירגע. (B) מחזיק הדגימה השטוח אטום כראוי כאשר כבר לא נראה רווח בין בסיס המחזיק לבין המכסה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S4: מחזיק הדגימה ממורכז ביחס לקרן הנייטרונים. מחזיק דגימה גלילי הונח על מקל הדגימה. מיקומו של מחזיק הדגימה נבדק כך שהקרן פוגעת בחלק התחתון של המחזיק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S5: רכישת EFWS ואחריה QENS ב-IN16B עם NOMAD. (א) הבקרים הרלוונטיים נגררים ומשוחררים לתוך כן השיגור כמוסבר בפרוטוקול (שלבים 3.4.1 עד 3.4.3). ייתכן שיהיה צורך ללחוץ על המנעול (סמל ירוק בפינה השמאלית העליונה - חלונית אנכית) כדי לקבל שליטה על הממשק. (ב) הבקרים הרלוונטיים נגררים ומשוחררים אל כן השיגור כמוסבר בפרוטוקול (שלבים 3.4.4 עד 3.4.5). כאן, שני הבקרים האחרונים נקראים IN16DopplerSettings ו - Count. קיצורים: QENS = פיזור נייטרונים קוואזיאלסטי, EFWS = סריקות חלון קבוע אלסטי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S6: הגדרת רמפת טמפרטורה ו-E/IFWS ב-IN16B עם NOMAD. (A) בקר FurnaceCryostat נוסף במשטח השיגור ומוגדר כמוסבר בפרוטוקול (שלב 3.4.6). (B) בקר הלולאה For מתווסף למשטח השיגור והבקרים הרלוונטיים מוכנסים לתוכו ומוגדרים כמוסבר בפרוטוקול (שלב 3.4.7). קיצור: E/IFWS = סריקות חלון קבוע אלסטיות ולא אלסטיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S7: חמש פונקציות בסל הכדוריות הראשונות מסבירות את רוב התרומה הסיבובית של מי הידרציה. שמונה פונקציות בסל הכדוריות הראשונות משורטטות באמצעות ערך d = 0.98 Å וערכים של העברת תנע q מ-0 עד 3 Å (קווים בצבע אחיד). טווח העברת התנע של 0.3 Å < q < 1.8 Å תחום על ידי הקווים הכחולים המנוקדים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S8: ליזוזים יוצר חלקיקים. ליזוזים הומס במאגר הצבירה (שהוכן כמתואר בפרוטוקול, שלב 1), ו-ThT נוסף לריכוז סופי של 2 מיקרומטר כדי לעקוב אחר היווצרות מבנה צולב β באמצעות פלואורסצנטיות. העלילה מייצגת את הממוצע של שלוש מדידות עצמאיות, וקווי השגיאה הם סטיית התקן. הכניסה מראה צילום מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של החלקיקים שנוצרו לאחר 6 שעות של צבירה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. נתון זה הוא מ 5. קיצור: ThT = thioflavin T. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S9: רמפת טמפרטורה מהירה כפי שזמינה ב-IN16B. במצב המהיר ב- IN16B, ניתן להגדיל את הטמפרטורה מ- 280 K ל- 363 K תוך כ- 30 דקות. נתון זה הוא מ 5. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S10: נתוני E/IFWS על ליזוזים במהלך צבירה לחלקיקים. הליזוזים הומס במאגר הצבירה (המתואר במקום אחר5), ו- E/IFWS נרכש במהלך הצבירה, אשר הופעלה על ידי העלאת הטמפרטורה ל -90 מעלות צלזיוס. הנתונים - לאחר תיקון בליעה עם תא ריק ונורמליזציה באמצעות אות של ונדיום - משורטטים כנגד העברת התנע q וזמן עבור העברת האנרגיה השונים שנמדדו, 0 μeV (שמאל עליון), 0.6 μeV (ימין עליון), 1.5 μeV (למטה משמאל) ו 3 μeV (למטה מימין). עבור כל תת-חלקה, הציר האנכי מתאים לאות הפיזור S(q, ΔE), המשורטט כנגד זמן הניסוי בשעות והעברת התנע q. נתון זה הוא מ 5. קיצור: E/IFWS = סריקות חלון קבוע אלסטיות ולא אלסטיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S11: התאמת נתוני מי הידרציה של טאו. (A) התאמה של נתוני EFWS באמצעות גאוס. אבקת H2O-hydrated של מונומרים טאו deuterated נאטמה במחזיק דגימת אלומיניום שטוח, ו- EFWS נרכשו במהלך כבש טמפרטורה מ 20 עד 300 K. נתוני הניסוי (אות אלסטי S(q, 0) על ציר אנכי-כחול עם קווי שגיאה) משורטטים עבור טווח העברת התנע q 0.2 < q < 0.6 Å-1 יחד עם גאוסיאן המותאם המשמש לחילוץ MSD. (B) תנועות תרגומיות וסיבוביות של מי הידרציה המתקבלות מהתאמת QENS. אבקות H2O-hydrated של סיבי טאו מפורקים (משמאל) ומונומרים (מימין) נאטמו במחזיק דגימת אלומיניום שטוח, ונתוני QENS נרכשו במהירות של 280K. נתוני הניסוי (עוצמה S(q,ω) כפונקציה של העברת אנרגיה) עבור סיבים (משולשים כחולים) ומונומרים (נקודות ירוקות) משורטטים יחד עם המודל המותאם (קו מוצק שחור) ומרכיביו, רקע (כחול), פונקציית רזולוציה (ירוק), סיבובים (אדום) ותרגומים (ציאן) עבור העברת התנע q = 0.783 Å-1. נתון זה הוא מ 31. קיצורים: QENS = פיזור נייטרונים קוואזיאלסטי, EFWS = סריקות חלון קבוע אלסטי; MSD = תזוזה בריבוע. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ספקטרוסקופיית נויטרונים היא השיטה היחידה המאפשרת לחקור את הדינמיקה הממוצעת של ps-ns של דגימות חלבון, ללא קשר לגודל החלבון או למורכבות התמיסה כאשר משתמשים בדאוטרציה6. באופן ספציפי, על ידי בדיקת דיפוזיה עצמית של מכלולי חלבונים בתמיסה, ניתן לקבוע באופן חד משמעי את הגודל ההידרודינמי של מכלולים כאלה. עם זאת, השיטה מוגבלת בדרך כלל על ידי שטף נייטרונים נמוך, אשר מרמז על זמני רכישה ארוכים ואת הדרישה של כמויות גבוהות של דגימה (בדרך כלל 100 מ"ג של חלבון) כדי לקבל יחס אות לרעש טוב בתוך זמן הקרן שהוקצה.

הכנת דוגמאות (פרוטוקול שלבים 1 ו -2). עבור דגימות מצב נוזלי, הריכוז המינימלי שניתן להשתמש בו הוא ~ 50 מ"ג / מ"ל (ריכוזים נמוכים יותר ניתן להשתמש במחיר של זמני רכישה ממושכים). ריכוז חלבון גבוה קשור לקצבי פרפור מהירים יותר, מה שעוזר להתאים את המדידה בזמן הקרן המוקצה, אך יכול להשפיע גם על מסלול הצבירה44. לפיכך, יש צורך באפיון דגימה יסודי בשיטות משלימות, כגון כוח אטומי או מיקרוסקופ אלקטרונים.

החומר של מחזיק הדגימה הוא גם נקודה שיש להתייחס אליה בעת הכנת הדגימות כמו סגסוגות אלומיניום כפופים קורוזיה45. סגסוגת אלומיניום טיפוסית המציגה עמידות טובה בפני קורוזיה ובעלת ספיגת נייטרונים נמוכה היא הנורמה האירופית (EN) AW-6060 [AlMgSi] העשויה מ- 98%-98.75% Al, 0.1% Ti, 0.15% Zn, 0.05% Cr, 0.35%-0.6% Mg, 0.1% Mn, 0.1% Cu, 0.1%-0.3% Fe ו- 0.3%-0.6% Si. ניתן למזער קורוזיה למשל על ידי הפחתת הזמן במחזיק הדגימה או באמצעות ציפוי מגן (שיכול להוסיף לאות הרקע) כגון ניקל או זהב.

עבור דגימות אבקה של חלבונים מוקשים, הליך הייבוש בהקפאה הוכח כמושלם ביעילות עם שלב בייבוש בנוכחות אבקת P2O5 כדי להסיר כמה שיותר מים קלים שיוריים35. עבור דגימות אבקה, מומלץ גם לאפיין (באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי ועקיפה של אבקת רנטגן) את האבקה במצבה הסופי והלח ולהעריך את ההשפעה של דאוטרציה, ייבוש בהקפאה ודיפוזיה של אדים הן על מצב מונומר והן על מצב סיבים. בפרט, ייבוש בהקפאה יכול לשבור את הסיבים, וכתוצאה מכך מקטעים מקוצרים, מבלי להשפיע על המורפולוגיה. יתר על כן, זה כבר נצפה על ידי עקיפה כוח רנטגן כי קירור איטי, במקום קירור הבזק בחנקן נוזלי, יכול לגרום לנוכחות של מבנים דמויי עמילואיד (תוצאה שלא פורסמה).

איסוף נתונים (שלב פרוטוקול 3). מומלץ לתכנן את איסוף הנתונים עם איש הקשר המקומי לפני הניסוי (גם אם הוא נדון בתהליך כתיבת ההצעה). תוכנית איסוף הנתונים כפופה לשינויים לאחר הסריקות הראשונות, בהתאם ליחס האות לרעש המתקבל. עבור ניסויים שנפתרו בזמן במיוחד, השימוש ב- E/IFWS מאפשר איסוף נתונים מהיר - 30 שניות עד דקה עבור הקו האלסטי, 4-5 דקות עבור נקודת נתונים ב- 3 μeV5 - אך טווח העברות האנרגיה הנגישות מוגבל מטבעו. לחלופין, ניתן להשתמש בממוצע הזזה של נתוני QENS46. לשם כך, האפשרות החדשה של פיזור לאחור וספקטרוסקופיית זמן טיסה (BATS) ב- IN16B מציעה שטף גבוה יותר מה- IN16B הקלאסי עם טווח אנרגיה של ±150 μeV (או גבוה יותר, בהתאם לתצורה בה נעשה שימוש) במחיר של רזולוציה נמוכה יותר באנרגיה11. לכן, אופציית BATS מומלצת למחקרים שנפתרו בזמן, במיוחד עבור תהליכים כגון צבירת עמילואיד, המתרחשת על פני מספר שעות.

ניתוח נתונים (שלבי פרוטוקול 4, 5 ו- 6). פונקציית הפיזור S(q,ω) כוללת את כל סוגי התנועות בדגימה, והמודלים המתוארים בפרוטוקול לעיל הם קירובים. בפרט, עבור IDP במצב נוזלי, התנועות בקנה מידה גדול של השרשרת הלא מסודרת יכולות להתרחש על פני אותו אורך וציר זמן כמו דיפוזיה במרכז המסה של החלבון כולו. לפיכך, על המשתמש לזכור כי ההפרדה בין דיפוזיה של מרכז המסה לבין דינמיקה פנימית של חלבונים אינה תמיד פשוטה. הליך ההתאמה יכול להפיק תועלת ממידע על דיפוזיה של מרכז מסה המתקבל בשיטות משלימות, כך שניתן לתקן פרמטר זה (תוך התחשבות בכך ששיטות אחרות יכולות לספק מקדם דיפוזיה קולקטיבי הקשור לסקאלות זמן ואורך שונות) כדי להשיג תוצאה חזקה יותר עבור דינמיקה פנימית.

בנוסף לפיזור נייטרונים, הדינמיקה של מערכת מולקולרית יכולה להיות מאופיינת בתהודה מגנטית גרעינית (NMR), המספקת מידע מקומי על חלבונים המסומנים באיזוטופים ועל טווח רחב של טווחי זמן47,48,49. השיטה שימשה בהצלחה לחקר מערכות עמילואיד 48,50,51,52,53 אך אינה מאפשרת למשתמשים פשוט ללמוד מי הידרציה או לעקוב אחר תהליך צבירת העמילואיד בזמן אמת בשל המגבלה המובנית על גודל החלבון. התפתחויות אחרונות בספקטרוסקופיית תהודה פאראמגנטית אלקטרונית (EPR) ובשיטה הנגזרת מ-EPR Overhauser dynamic nuclear polarization (ODNP) מציעות פרספקטיבה טובה בשילוב עם פיזור נייטרונים. ואכן, למרות תיוג ספין מכוון אתר (SDSL), EPR ו- ODNP יכולים לבדוק חלבון54 ודינמיקת הידרציה55, בהתאמה, על ציר הזמן ps-ns סביב תווית הספין המוצגת.

שיטות אלה שימשו לחקר הצבירה של חלבון טאו56,57 ויציעו השלמה רבה עם פיזור נייטרונים שיכולים לקבל מידע דומה, אך בממוצע על פני כל הדגימה. יתר על כן, ספקטרוסקופיה אינפרא אדומה יכולה לספק מידע דינמי עבור תנועות אנרגיה גבוהה הקשורות לדפוסים מבניים ספציפיים, אך המורכבות של סביבת החלבון (חיץ בשימוש) יכולה להשפיע על פירוש נתונים58,59. טכניקות הפיזור לאחור של נייטרונים מספקות מבט ייחודי ומשלים על דינמיקת המים של חלבונים והידרציה בסקאלת הזמן של ps-ns יחד עם תוצאות מהשיטות שהוזכרו לעיל. הם אינם דורשים תיוג ספציפי של הדגימה, איכות האות אינה רגישה לגודל החלבון, וניתן לבצע מדידות in vivo או בסביבות מורכבות מאוד, deuterated כגון ליזט חיידקי deuterated 3,6,7. מכיוון ששיטה זו מספקת תוצאה ממוצעת של הרכב, היא משלימה היטב על ידי סימולציות דינמיקה מולקולרית כדי לקבל מידע על פרטים אטומיים על המערכת הנחקרת. ניתן לאמת בקלות את הסימולציות על ידי השוואה ישירה בין מערך הנתונים הניסיוני לבין ספקטרום QENS התיאורטי המחושב ממסלול הסימולציה באמצעות תוכנה כגון mdanse60.

לגבי מערכות עמילואיד, פיזור לאחור של נייטרונים הוכח כיעיל לאפיון הדינמיקה של חלבון ps-ns ומים עבור מערכות ותנאים שונים 5,31,61,62,63,64. בפרט, נעשה שימוש בפיזור לאחור של נייטרונים כדי לחשוף את המתאם בין החלק היחסי של רצף החלבונים המעורב במבנה הצולב-β לבין המשרעת של רווח אנטרופיית המים בעת פרפור (תוצאות שלא פורסמו). יתר על כן, פיתוח סביבות דגימה מאפשר רכישה בו זמנית של ספקטרום נייטרונים ונתוני הרפיה דיאלקטריים65 או נתוני פיזור ראמאן66. יתר על כן, גלאי עקיפה נמצאים ב- IN16B כדי לקבל נתונים מבניים יחד עם נתונים דינמיים. בנוסף, שטף הנייטרונים הנכנס צפוי להשתפר עבור מצב BATS של IN16B בעתיד הקרוב, הודות לשימוש במה שמכונה מדריך מיקוד משתנה, שהגיאומטריה שלו ניתנת להתאמה לפי דרישה למערך האינסטרומנטלי בו נעשה שימוש. דחיפה נוספת של פיתוח סביבת דגימה מתוחכמת ומכשור תאפשר ניסויים מורכבים עוד יותר בעתיד, ואולי אף תספק מידע דינמי ומבני נוסף בעת ובעונה אחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים אסירי תודה למיכאלה זמפוני במרכז יוליך למדעי הנייטרונים במרכז היינץ מאייר-לייבניץ, גרכינג, גרמניה, על חלק מניסויי פיזור הנייטרונים שנערכו במכשיר SPHERES. עבודה זו הפיקה תועלת מפעילויות קונסורציום מעבדת Deuteration Laboratory (DLAB) הממומן על ידי האיחוד האירופי תחת חוזים HPRI-2001-50065 ו- RII3-CT-2003-505925, ומפעילות במימון מועצת המחקר להנדסה ומדעי הפיזיקה בבריטניה (EPSRC) במסגרת Institut Laue Langevin EMBL DLAB תחת מענקים GR/R99393/01 ו- EP/C015452/1. תמיכה על ידי הנציבות האירופית במסגרת תוכנית המסגרת השביעית באמצעות פעולת המפתח: חיזוק אזור המחקר האירופי, תשתיות מחקר מוכרת [חוזה 226507 (NMI3)]. קווין פואנו וכריסטיאן בק מודים למשרד הפדרלי לחינוך ומחקר (BMBF, מענק מספר 05K19VTB) על מימון מלגות הפוסט-דוקטורט שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
  2. Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. Acta Crystallographica Section D. 74 (8), 715-726 (2018).
  3. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7 (2019).
  4. Martel, A., et al. Membrane permeation versus amyloidogenicity: A multitechnique study of islet amyloid polypeptide interaction with model membranes. Journal of the American Chemical Society. 139 (1), 137-148 (2017).
  5. Pounot, K., et al. Tracking internal and global diffusive dynamics during protein aggregation by high-resolution neutron spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (15), 6299-6304 (2020).
  6. Grimaldo, M., et al. Protein short-time diffusion in a naturally crowded environment. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (8), 1709-1715 (2019).
  7. Jasnin, M., Stadler, A., Tehei, M., Zaccai, G. Specific cellular water dynamics observed in vivo by neutron scattering and NMR. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10154-10160 (2010).
  8. Frick, B. The neutron backscattering spectrometer IN16 at ILL-high energy resolution with high intensity and excellent signal-to-noise ratio. Neutron News. 13 (2), 15-22 (2002).
  9. Frick, B., Mamontov, E., van Eijck, L., Seydel, T. Recent backscattering instrument developments at the ILL and SNS. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 224 (1-2), 33-60 (2010).
  10. Frick, B., Combet, J., van Eijck, L. New possibilities with inelastic fixed window scans and linear motor Doppler drives on high resolution neutron backscattering spectrometers. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 669, 7-13 (2012).
  11. Appel, M., Frick, B., Magerl, A. A flexible high speed pulse chopper system for an inverted neutron time-of-flight option on backscattering spectrometers. Scientific Reports. 8 (1), 13580 (2018).
  12. Squires, G. L. Introduction to the theory of thermal neutron scattering. , Dover Publications. Mineola N.Y. (1996).
  13. Bee, M. Quasielastic neutron scattering. , Available from: http://inis.iaea.org/Search/search.aspx?orig_q=RN:20038756 (1988).
  14. Singwi, K. S., Sjölander, A. Diffusive motions in water and cold neutron scattering. Physical Review. 119 (3), 863-871 (1960).
  15. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear diatomic liquids: i. free rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1279-1297 (1966).
  16. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear liquid: ii. hindered rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1299-1311 (1966).
  17. Schirò, G., et al. Translational diffusion of hydration water correlates with functional motions in folded and intrinsically disordered proteins. Nature Communications. 6, 6490 (2015).
  18. Grimaldo, M., et al. Hierarchical molecular dynamics of bovine serum albumin in concentrated aqueous solution below and above thermal denaturation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (6), 4645-4655 (2015).
  19. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 16 (11), 673-677 (1968).
  20. Bonar, L., Cohen, A. S., Skinner, M. M. Characterization of the Amyloid Fibril as a Cross-β Protein. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 131 (4), 1373-1375 (1969).
  21. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  22. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  23. Maji, S. K., et al. Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science. 325 (5938), 328-332 (2009).
  24. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  25. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. 28 (31), 6546-6561 (2016).
  26. Stephens, A. D., Kaminski Schierle, G. S. The role of water in amyloid aggregation kinetics. Current Opinion in Structural Biology. 58, 115-123 (2019).
  27. Adamcik, J., Mezzenga, R. Amyloid polymorphism in the protein folding and aggregation energy landscape. Angewandte Chemie International Edition. 57 (28), 8370-8382 (2018).
  28. Liu, Z., et al. Entropic contribution to enhanced thermal stability in the thermostable P450 CYP119. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10049-10058 (2018).
  29. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2018).
  30. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
  31. Fichou, Y., et al. Hydration water mobility is enhanced around tau amyloid fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), 6365-6370 (2015).
  32. Burns, J., Pennock, C. A., Stoward, P. J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. The Journal of Pathology and Bacteriology. 94 (2), 337-344 (1967).
  33. Iqbal, K., Liu, F., Gong, C. -X., Grundke-Iqbal, I. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies. Current Alzheimer Research. 7 (8), 656-664 (2010).
  34. Krȩżel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  35. Dolman, M., Halling, P. J., Moore, B. D., Waldron, S. How dry are anhydrous enzymes? Measurement of residual and buried 18O-labeled water molecules using mass spectrometry. Biopolymers. 41 (3), 313-321 (1997).
  36. Pounot, K. kpounotnPDyn: v3.0.0. Zenodo. , (2021).
  37. Yi, Z., Miao, Y., Baudry, J., Jain, N., Smith, J. C. Derivation of mean-square displacements for protein dynamics from elastic incoherent neutron scattering. Journal of Physical Chemistry B. 116 (16), 5028-5036 (2012).
  38. Peters, J., Kneller, G. R. Motional heterogeneity in human acetylcholinesterase revealed by a non-Gaussian model for elastic incoherent neutron scattering. The Journal of Chemical Physics. 139 (16), 165102 (2013).
  39. Zeller, D., Telling, M. T. F., Zamponi, M., García Sakai, V., Peters, J. Analysis of elastic incoherent neutron scattering data beyond the Gaussian approximation. The Journal of Chemical Physics. 149 (23), 234908 (2018).
  40. Roosen-Runge, F., Seydel, T. A generalized mean-squared displacement from inelastic fixed window scans of incoherent neutron scattering as a model-free indicator of anomalous diffusion confinement. EPJ Web of Conferences. 83, 02015 (2015).
  41. Ortega, A., Amorós, D., García de la Torre, J. Prediction of hydrodynamic and other solution properties of rigid proteins from atomic- and residue-level models. Biophysical Journal. 101 (4), 892-898 (2011).
  42. Hennig, M., Frick, B., Seydel, T. IUCr Optimum velocity of a phase-space transformer for cold-neutron backscattering spectroscopy. Journal of Applied Crystallography. 44 (3), 467-472 (2011).
  43. Paalman, H. H., Pings, C. J. Numerical evaluation of X-ray absorption factors for cylindrical samples and annular sample cells. Journal of Applied Physics. 33 (8), 2635-2639 (1962).
  44. Ow, S. -Y., Dunstan, D. E. The effect of concentration, temperature and stirring on hen egg white lysozyme amyloid formation. Soft Matter. 9 (40), 9692-9701 (2013).
  45. Tominaga, T., Sahara, M., Kawakita, Y., Nakagawa, H., Yamada, T. Evaluation of sample cell materials for aqueous solutions used in quasi-elastic neutron scattering measurements. Journal of Applied Crystallography. 54 (6), 1631-1640 (2021).
  46. Beck, C., et al. Following protein dynamics in real time during crystallization. Crystal Growth & Design. 19 (12), 7036-7045 (2019).
  47. Smith, A. A., Testori, E., Cadalbert, R., Meier, B. H., Ernst, M. Characterization of fibril dynamics on three timescales by solid-state NMR. Journal of Biomolecular NMR. 65 (3-4), 171-191 (2016).
  48. Wang, T., Jo, H., DeGrado, W. F., Hong, M. Water distribution, dynamics, and interactions with Alzheimer's β-amyloid fibrils investigated by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 139 (17), 6242-6252 (2017).
  49. Rezaei-Ghaleh, N., Giller, K., Becker, S., Zweckstetter, M. Effect of zinc dinding on β-amyloid structure and dynamics: Implications for Aβ aggregation. Biophysical Journal. 101 (5), 1202-1211 (2011).
  50. Vugmeyster, L., et al. Fast motions of key methyl groups in amyloid-β fibrils. Biophysical Journal. 111 (10), 2135-2148 (2016).
  51. Yang, X., Wang, B., Hoop, C. L., Williams, J. K., Baum, J. NMR unveils an N-terminal interaction interface on acetylated-α-synuclein monomers for recruitment to fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (18), (2021).
  52. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human α-synuclein. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (5), 409-415 (2016).
  53. Karamanos, T. K., Kalverda, A. P., Thompson, G. S., Radford, S. E. Mechanisms of amyloid formation revealed by solution NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 88-89, 86-104 (2015).
  54. Lai, Y. -C., Kuo, Y. -H., Chiang, Y. -W. Identifying protein conformational dynamics using spin-label ESR. Chemistry - An Asian Journal. 14 (22), 3981-3991 (2019).
  55. Franck, J. M., Han, S. Overhauser dynamic nuclear polarization for the study of hydration dynamics, explained. Methods in Enzymology. 615, 131-175 (2019).
  56. Pavlova, A., et al. Protein structural and surface water rearrangement constitute major events in the earliest aggregation stages of tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 127-136 (2016).
  57. Lin, Y., et al. Liquid-liquid phase separation of tau driven by hydrophobic interaction facilitates fibrillization of tau. bioRxiv. , (2020).
  58. Decatur, S. M. Elucidation of residue-level structure and dynamics of polypeptides via isotope-edited infrared spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 39 (3), 169-175 (2006).
  59. Chatani, E., Tsuchisaka, Y., Masuda, Y., Water Tsenkova, R. molecular system dynamics associated with amyloidogenic nucleation as revealed by real time near infrared spectroscopy and aquaphotomics. PLoS One. 9 (7), 101997 (2014).
  60. Goret, G., Aoun, B., Pellegrini, E. MDANSE: An interactive analysis environment for molecular dynamics simulations. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (1), 1-5 (2017).
  61. Fujiwara, S., et al. Internal dynamics of a protein that forms the amyloid fibrils observed by neutron scattering. Journal of the Physical Society of Japan. 82, Suppl A (2013).
  62. Schiró, G., et al. Neutron scattering reveals enhanced protein dynamics in concanavalin a amyloid fibrils. Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (8), 992-996 (2012).
  63. Pounot, K., et al. Zinc determines dynamical properties and aggregation kinetics of human insulin. Biophysical Journal. 120 (5), 886-898 (2021).
  64. Fujiwara, S., et al. Dynamic properties of human α-synuclein related to propensity to amyloid fibril formation. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3229-3245 (2019).
  65. Sanz, A., et al. High-pressure cell for simultaneous dielectric and neutron spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 89 (2), 023904 (2018).
  66. Adams, M. A., et al. Simultaneous neutron scattering and Raman scattering. Applied Spectroscopy. 63 (7), 727-732 (2009).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 182
ספקטרוסקופיית נייטרונים ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקה של פיקו-שנייה-ננו-שנייה של חלבונים ומי לחות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pounot, K., Appel, M., Beck, C.,… More

Pounot, K., Appel, M., Beck, C., Weik, M., Schirò, G., Fichou, Y., Seydel, T., Schreiber, F. High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water. J. Vis. Exp. (182), e63664, doi:10.3791/63664 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter