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Biochemistry

प्रोटीन और हाइड्रेशन पानी के पिकोसेकंड-नैनोसेकंड डायनामिक्स का अध्ययन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोटीन और उनके हाइड्रेशन पानी के पीएस-एनएस गतिशीलता के लिए एक गैर-विनाशकारी और लेबल-मुक्त पहुंच प्रदान करता है। वर्कफ़्लो को एमिलॉयड प्रोटीन पर दो अध्ययनों के साथ प्रस्तुत किया गया है: एकत्रीकरण के दौरान लाइसोजाइम की समय-हल गतिशीलता पर और फाइबर गठन पर ताऊ के जलयोजन जल गतिशीलता पर।

Abstract

न्यूट्रॉन प्रकीर्णन एक गैर-विनाशकारी तरीके से और ड्यूटेरियम के अलावा अन्य लेबलिंग के बिना ऊर्जा की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए नमूनों के भीतर गतिशीलता की जांच करने की संभावना प्रदान करता है। विशेष रूप से, न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोस्कोपी एक साथ कई प्रकीर्णन कोणों पर प्रकीर्णन संकेतों को रिकॉर्ड करता है और पीएस-एनएस टाइमस्केल पर जैविक प्रणालियों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। डी2ओ-और संभवतः ड्यूरेटेड बफर घटकों को नियोजित करके- विधि तरल अवस्था में प्रोटीन के केंद्र-द्रव्यमान प्रसार और रीढ़ और साइड-चेन गति (आंतरिक गतिशीलता) दोनों की निगरानी की अनुमति देती है।

इसके अतिरिक्त, हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता का अध्ययन एच2ओ के साथ हाइड्रेटेड परड्यूरेटेड प्रोटीन के पाउडर को नियोजित करके किया जा सकता है। यह पेपर प्रोटीन और हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता की जांच के लिए इंस्टीट्यूट लाउ-लैंगविन (आईएल) में उपकरण आईएन 16 बी पर नियोजित वर्कफ़्लो प्रस्तुत करता है। वाष्प विनिमय का उपयोग करके समाधान नमूने और हाइड्रेटेड प्रोटीन पाउडर के नमूने तैयार करने को समझाया गया है। प्रोटीन और हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता दोनों के लिए डेटा विश्लेषण प्रक्रिया विभिन्न प्रकार के डेटासेट (क्वासिइलास्टिक स्पेक्ट्रा या फिक्स्ड-विंडो स्कैन) के लिए वर्णित है जिसे न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोमीटर पर प्राप्त किया जा सकता है।

विधि को अमाइलॉइड प्रोटीन से जुड़े दो अध्ययनों के साथ चित्रित किया गया है। लाइसोजाइम का एकत्रीकरण μm आकार के गोलाकार समुच्चय-निरूपित कणों में होता है- IN16B पर जांच की गई अंतरिक्ष और समय सीमा पर एक-चरण यी प्रक्रिया में होता है, जबकि आंतरिक गतिशीलता अपरिवर्तित रहती है। इसके अलावा, ताऊ के हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता का अध्ययन परड्यूरेटेड प्रोटीन के हाइड्रेटेड पाउडर पर किया गया था। यह दिखाया गया है कि अमाइलॉइड फाइबर के गठन पर पानी की ट्रांसलेशनल गतियां सक्रिय होती हैं। अंत में, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों पर चर्चा की जाती है कि अन्य प्रयोगात्मक बायोफिज़िकल विधियों के संबंध में गतिशीलता के अध्ययन के संबंध में न्यूट्रॉन प्रकीर्णन कैसे तैनात किया जाता है।

Introduction

न्यूट्रॉन एक चार्ज-लेस और विशाल कण है जिसका उपयोग मौलिक भौतिकी से जीव विज्ञान1 तक विभिन्न क्षेत्रों में नमूनों की जांच के लिए वर्षों से सफलतापूर्वक किया गया है। जैविक अनुप्रयोगों के लिए, छोटे-कोण न्यूट्रॉन प्रकीर्णन, इनलेस्टिक न्यूट्रॉन प्रकीर्णन, और न्यूट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी और रिफ्लेक्टोमेट्री का बड़े पैमानेपर उपयोग किया जाता है2,3,4। इनलेस्टिक न्यूट्रॉन प्रकीर्णन विशिष्ट लेबलिंग की आवश्यकता के बिना गतिशीलता का एक पहनावा-औसत माप प्रदान करता है, और एक संकेत गुणवत्ता जो आकार या प्रोटीन5 पर निर्भर नहीं करती है। माप अध्ययन के तहत प्रोटीन के लिए एक अत्यधिक जटिल वातावरण का उपयोग करके किया जा सकता है जो इंट्रासेल्युलर माध्यम की नकल करता है, जैसे कि ड्यूरेटेड बैक्टीरियल लाइसेट या यहां तक कि विवो 3,6,7 में भी। गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक सेटअपों का उपयोग किया जा सकता है, अर्थात् i) उड़ान का समय-उप-पीएस-पीएस गतिशीलता तक पहुंच प्रदान करना, ii) बैकस्कैटरिंग-पीएस-एनएस गतिशीलता तक पहुंच प्रदान करना, और iii) स्पिन-इको-एनएस से सैकड़ों एनएस तक गतिशीलता तक पहुंच प्रदान करना। न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग ब्रैग के नियम 2 d sinø = n' का उपयोग करता है, जहां d एक क्रिस्टल में विमानों के बीच की दूरी है, प्रकीर्णन कोण, n प्रकीर्णन क्रम और o तरंग दैर्ध्य है। डिटेक्टरों की ओर बैकस्कैटरिंग के लिए क्रिस्टल का उपयोग ऊर्जा में उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने की अनुमति देता है, आमतौर पर ~ 0.8 μeV। ऊर्जा विनिमय को मापने के लिए, या तो बैकस्कैटरिंग में एक क्रिस्टल ले जाने वाले डॉपलर ड्राइव का उपयोग आने वाले न्यूट्रॉन तरंग दैर्ध्य 8,9,10 (चित्रा 1) को परिभाषित करने और ट्यून करने के लिए किया जाता है, या ऊर्जा रिज़ॉल्यूशन11 में कमी की कीमत पर टाइम-ऑफ-फ्लाइट सेटअप का उपयोग किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: डॉपलर ड्राइव के साथ न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोमीटर का स्केच। आने वाली बीम फेज स्पेस ट्रांसफॉर्मेशन (पीएसटी) हेलिकॉप्टर42 से टकराती है, जो सैंपल पोजिशन पर फ्लक्स को बढ़ा देती है। फिर इसे डॉपलर ड्राइव द्वारा नमूने की ओर वापस बिखेर दिया जाता है, जो एक ऊर्जा ई1 (सियान तीर) का चयन करता है। न्यूट्रॉन तब नमूने द्वारा बिखरे हुए होते हैं (तीर ों के रंग द्वारा दर्शाए गए विभिन्न ऊर्जाओं के साथ) और एसआई 111 क्रिस्टल से बने विश्लेषक, केवल एक विशिष्ट ऊर्जा ई0 (लाल रंग के तीर यहां) के साथ न्यूट्रॉन को बैकस्कैटर करेंगे। इसलिए, संवेग स्थानांतरण क्यू डिटेक्टर सरणी पर न्यूट्रॉन की पता लगाई गई स्थिति से प्राप्त किया जाता है, और ऊर्जा हस्तांतरण अंतर ई1- ई0 से प्राप्त किया जाता है। पीएसटी द्वारा उत्पादित न्यूट्रॉन पल्स के लिए अपेक्षित उड़ान के समय का उपयोग डिटेक्टर ट्यूबों की ओर सीधे बिखरे न्यूट्रॉन से सिग्नल को त्यागने के लिए किया जाता है। संक्षिप्त नाम: पीएसटी = चरण अंतरिक्ष परिवर्तन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए, हाइड्रोजन प्रोटॉन युक्त नमूने, जैसे प्रोटीन से संकेत में मुख्य योगदान असंगत प्रकीर्णन से आता है, जिसके लिए प्रकीर्णन तीव्रता एसइंक (क्यू, ) को ईक्यू (1)12 द्वारा दिखाया गया है।

Equation 1 (1)

जहाँ σइंक तत्व का असंगत क्रॉस-सेक्शन माना जाता है, k बिखरे हुए वेववेक्टर का आदर्श है, k आने वाले वेववेक्टर का आदर्श है, q (= k - k') संवेग अंतरण, r j(t) समय t पर परमाणु j का स्थिति वेक्टर है, और आने वाले न्यूट्रॉन और सिस्टम के बीच ऊर्जा हस्तांतरण के अनुरूप आवृत्ति है। कोणीय कोष्ठक पहनावा औसत को दर्शाता है। इसलिए, असंगत प्रकीर्णन समय के साथ परमाणु स्थितियों के समरूप-औसत एकल-कण आत्म-सहसंबंध की जांच करता है और सिस्टम में सभी परमाणुओं और विभिन्न समय उत्पत्ति (पहनावा औसत) पर औसत आत्म-गतिशीलता देता है। प्रकीर्णन फ़ंक्शन मध्यवर्ती प्रकीर्णन फ़ंक्शन I (q, t) के समय में फूरियर ट्रांसफॉर्म है, जिसे Eq (2) द्वारा दिखाए गए वैन होव सहसंबंध फ़ंक्शन के स्थान में फूरियर ट्रांसफॉर्म के रूप में देखा जा सकता है:

Equation 2 (2)

जहां स्थिति r और समय t13 पर एक परमाणु को खोजने की संभाव्यता घनत्व है।

एक फिकियन प्रसार प्रक्रिया के लिए, स्व-प्रसार फ़ंक्शन का परिणाम (Eq (3)) एक प्रकीर्णन फ़ंक्शन में डबल फूरियर ट्रांसफॉर्म के बाद होता है जिसमें γ = Dq2 द्वारा दी गई लाइन चौड़ाई का लोरेंत्ज़ियन होता है।

Equation 10 (3)

अधिक परिष्कृत मॉडल विकसित किए गए और उपयोगी पाए गए जैसे कि पीएस-एनएस आंतरिक प्रोटीन गतिशीलता14 के लिए सिंगवी और स्जोलैंडर द्वारा कूद प्रसार मॉडल या हाइड्रेशन पानी15,16,17 के लिए सियर्स द्वारा रोटेशन मॉडल।

आईएल, ग्रेनोबल, फ्रांस (पूरक चित्रा एस 1) में न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग (एनबीएस) उपकरण आईएन 16 बी8,9 पर, आमतौर पर प्रोटीन के साथ उपयोग किए जाने वाले सेटअप में आने वाली तरंग दैर्ध्य (पूरक चित्रा एस 2 ए) को ट्यून करने के लिए डॉपलर ड्राइव के साथ विश्लेषक के लिए एसआई 111 क्रिस्टल होते हैं, जिससे गति हस्तांतरण सीमा ~ 0.2 A-1 < q < ~ 2 A-1 और -30 μeV की ऊर्जा हस्तांतरण सीमा तक पहुंच मिलती है< Equation 3 < 30 μeV- कुछ ps से लेकर कुछ ns तक के टाइमस्केल और कुछ A की दूरी के अनुरूप है। इसके अलावा, IN16B लोचदार और इनलेस्टिक फिक्स्ड-विंडो स्कैन (E / IFWS) 10 करने की संभावना प्रदान करता है, जिसमें एक निश्चित ऊर्जा हस्तांतरण पर डेटा अधिग्रहण शामिल है। चूंकि न्यूट्रॉन के साथ काम करते समय फ्लक्स सीमित होता है, इसलिए ई / आईएफडब्ल्यूएस एक ऊर्जा हस्तांतरण के लिए प्रवाह को अधिकतम करने की अनुमति देता है, इस प्रकार संतोषजनक सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए आवश्यक अधिग्रहण समय को कम करता है। एक और हालिया विकल्प बैकस्कैटरिंग और टाइम-ऑफ-फ्लाइट स्पेक्ट्रोमीटर (बीएटीएस) मोड11 है, जो डॉपलर ड्राइव की तुलना में उच्च प्रवाह के साथ ऊर्जा हस्तांतरण की एक विस्तृत श्रृंखला (जैसे, -150 μeV < Equation 3 < 150 μeV) के माप की अनुमति देता है, फिर भी कम ऊर्जा रिज़ॉल्यूशन (पूरक चित्रा S2B) की लागत पर।

न्यूट्रॉन प्रकीर्णन का एक महत्वपूर्ण गुण यह है किइंक σ असंगत क्रॉस सेक्शन में ड्यूटेरियम की तुलना में हाइड्रोजन के लिए 40 गुना अधिक मूल्य होता है और आमतौर पर जैविक नमूनों में पाए जाने वाले अन्य तत्वों के लिए नगण्य होता है। इसलिए, एक तरल वातावरण में प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन ड्यूरेटेड बफर का उपयोग करके किया जा सकता है, और पाउडर अवस्था डी 2 ओ के साथ हाइड्रेटेड हाइड्रोजनीकृत प्रोटीन पाउडर के साथ प्रोटीन आंतरिक गतिशीलता के अध्ययनकी अनुमति देती है, या एच2ओ के साथ हाइड्रेटेड प्रोटीन पाउडर के लिए हाइड्रेशन पानी का अध्ययन करती है। तरल अवस्था में, न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग आमतौर पर प्रोटीन (फिकियन-प्रकार प्रसार) और उनकी आंतरिक गतिशीलता के केंद्र-द्रव्यमान आत्म-प्रसार तक पहुंचने की अनुमति देता है। उत्तरार्द्ध रीढ़ की हड्डी और साइड-चेन गतियां हैं जिन्हें आमतौर पर तथाकथित कूद प्रसार मॉडल या अन्य 3,18 द्वारा वर्णित किया जाता है। हाइड्रोजनीकृत प्रोटीन पाउडर में, प्रोटीन प्रसार अनुपस्थित है और केवल आंतरिक गतिशीलता को मॉडलिंग करने की आवश्यकता है। हाइड्रेशन पानी के लिए, पानी के अणुओं के ट्रांसलेशनल और घूर्णी गति का योगदान गति हस्तांतरण क्यू पर एक अलग निर्भरता प्रस्तुत करता है, जो डेटा विश्लेषण प्रक्रिया17 में उनके भेद की अनुमति देता है।

यह पेपर न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग विधि को प्रोटीन के अध्ययन के साथ दिखाता है जो β-स्ट्रैंड के ढेर से युक्त एक कैननिकल रूप में एकत्रित होते हैं- तथाकथित क्रॉस-β पैटर्न19,20- और लम्बी फाइबर बनाते हैं। यह तथाकथित अमाइलॉइड एकत्रीकरण है, जिसका अल्जाइमर या पार्किंसंस रोग21,22 जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में इसकी केंद्रीय भूमिका के कारण बड़े पैमाने पर अध्ययन किया जाता है। अमाइलॉइड प्रोटीन का अध्ययन उस कार्यात्मक भूमिका से भी प्रेरित है जो वे 23,24 या उपन्यास बायोमैटेरियल्स25 के विकास के लिए उनकी उच्च क्षमता निभा सकते हैं। अमाइलॉइड एकत्रीकरण के भौतिक रासायनिक निर्धारक अस्पष्ट रहते हैं, और पिछले वर्षों21,26 के दौरान जबरदस्त प्रगति के बावजूद अमाइलॉइड एकत्रीकरण का कोई सामान्य सिद्धांत उपलब्ध नहीं है।

अमाइलॉइड एकत्रीकरण का तात्पर्य समय के साथ प्रोटीन संरचना और स्थिरता में परिवर्तन से है, जिसका अध्ययन स्वाभाविक रूप से गतिशीलता का तात्पर्य है, जो प्रोटीन रचना स्थिरता, प्रोटीन फ़ंक्शन और प्रोटीन ऊर्जा परिदृश्य27 से जुड़ा हुआ है। डायनामिक्स को सबसे तेज गति28 के लिए एंट्रोपिक योगदान के माध्यम से एक विशिष्ट राज्य की स्थिरता से सीधे जोड़ा जाता है, और प्रोटीन फ़ंक्शन को डोमेन गतियों के लिए प्रकाश-संवेदनशील प्रोटीन29 से एमएस के लिए उप-पीएस से विभिन्न टाइमस्केल पर गति द्वारा बनाए रखा जा सकता है, जिसे पिकोसेकंड-नैनोसेकंड डायनामिक्स30 द्वारा सुविधाजनक बनाया जा सकता है।

अमाइलॉइड प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करने के दो उदाहरण प्रस्तुत किए जाएंगे, एक प्रोटीन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए तरल अवस्था में और एक हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए हाइड्रेटेड पाउडर अवस्था में। पहला उदाहरण लाइसोजाइम के एकत्रीकरण को μm आकार के गोले (जिसे कण कहा जाता है) में वास्तविक समय5 में पालन किया जाता है, और दूसरा मानव प्रोटीन ताऊ31 के देशी और समेकित राज्यों में पानी की गतिशीलता की तुलना से संबंधित है।

लाइसोजाइम प्रतिरक्षा रक्षा में शामिल एक एंजाइम है और 129 अमीनो एसिड अवशेषों से बना है। लाइसोजाइम 10.5 के पीएच पर और 90 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर ड्यूरेटेड बफर में कण बना सकता है। न्यूट्रॉन प्रकीर्णन के साथ, हमने दिखाया कि लाइसोजाइम के केंद्र-द्रव्यमान प्रसार गुणांक का समय विकास थियोफ्लेविन टी फ्लोरेसेंस (एक फ्लोरोसेंट जांच जिसका उपयोग एमिलॉयड क्रॉस-β पैटर्न32 के गठन की निगरानी के लिए किया जाता है) के एकल घातीय कैनेटीक्स का अनुसरण करता है, यह दर्शाता है कि गठन कण सुपरस्ट्रक्चर और क्रॉस-β पैटर्न एक ही दर के साथ एक ही चरण में होते हैं। इसके अलावा, एकत्रीकरण प्रक्रिया के दौरान आंतरिक गतिशीलता स्थिर रही, जिसे या तो एक तेजी से संवहन परिवर्तन द्वारा समझाया जा सकता है जिसे एनबीएस उपकरणों पर नहीं देखा जा सकता है, या एकत्रीकरण पर प्रोटीन आंतरिक ऊर्जा में महत्वपूर्ण परिवर्तन की अनुपस्थिति से।

मानव प्रोटीन ताऊ एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन (आईडीपी) है जिसमें तथाकथित 2 एन 4 आर आइसोफॉर्म के लिए 441 अमीनो एसिड शामिल हैं, जो विशेष रूप से अल्जाइमर रोग33 में शामिल है। पर्ड्यूरेटेड प्रोटीन ताऊ के पाउडर पर न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि फाइबर अवस्था में हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता बढ़ जाती है, जिसमें ट्रांसलेशनल गति से गुजरने वाले पानी के अणुओं की उच्च आबादी होती है। परिणाम बताते हैं कि हाइड्रेशन वाटर एन्ट्रॉपी में वृद्धि ताऊ के एमिलॉयड फाइब्रिलेशन को चला सकती है।

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Protocol

1. तरल अवस्था में प्रोटीन के लिए ड्यूरेटेड बफर तैयार करें

  1. शुद्ध डी2ओ में बफर के सभी घटकों को घोलें।
  2. यदि पीएच इलेक्ट्रोड को एच2ओ में कैलिब्रेट किया गया था, तो एनएओडी या डीसीएल34 का उपयोग करके सूत्र पीडी = पीएच + 0.4 के अनुसार पीडी को समायोजित करें।
    नोट: एच 2 ओ के बजायडी2ओ का उपयोग प्रोटीन घुलनशीलता को प्रभावित कर सकता है और बफर स्थितियों को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है, (उदाहरण के लिए, नमक एकाग्रता में मामूली बदलाव से)।

2. परड्यूरेटेड प्रोटीन के एच2ओ-हाइड्रेटेड पाउडर तैयार करें

  1. नमूना धारक तैयार करें।
    1. एक फ्लैट एल्यूमीनियम नमूना धारक को उसके इंडियम तार सील और पानी और इथेनॉल के साथ स्क्रू के साथ अच्छी तरह से साफ करें और इसे सूखने दें।
      नोट: एक फ्लैट नमूना धारक का उपयोग इस तरह किया जाता है कि पाउडर को सतह पर समरूप रूप से वितरित किया जा सकता है। पाउडर की मात्रा पर्याप्त होनी चाहिए ताकि इसे दीवारों के बीच बनाए रखा जा सके और नमूना धारक को लंबवत रखने पर यह न गिरे।
    2. नमूना धारक-नीचे, ढक्कन और इंडियम तार के विभिन्न हिस्सों को एक सटीक संतुलन पर अलग-अलग तौलें।
    3. नमूना धारक के निचले हिस्से के खांचे में 1 मिमी इंडियम तार सील रखें, एक छोटा ओवरलैप छोड़ दें जहां दो छोर जुड़ते हैं (चित्रा 2 ए)।
    4. लियोफिलाइज्ड प्रोटीन (आमतौर पर ~ 100 मिलीग्राम प्रोटीन) की एक उचित मात्रा रखें ताकि यह नमूना धारक के निचले हिस्से की आंतरिक सतह को भर दे।
  2. प्रोटीन पाउडर को हाइड्रेट करें।
    1. प्रोटीन पाउडर35 (चित्रा 2 बी) को पूरी तरह से सूखने के लिए 24 घंटे के लिए पी2ओ5 पाउडर युक्त पेट्री डिश के साथ नमूना धारक को एक डेसिकेटर में रखें। एमड्राई प्राप्त करने के लिए इंडियम सील और सूखे पाउडर युक्त नमूना धारक के सूखे निचले हिस्से का वजन करें।
      सावधानी: पी2ओ5 पाउडर बहुत संक्षारक है।
    2. डेसिकेटर सेपी 2 ओ5 को हटा दें और अंदर डी2ओ के साथ एक पेट्री डिश डालें। हाइड्रेशन स्तर एच = एम हाइड / एम सूखे की जांच करने के लिए नियमित रूप से पाउडर के द्रव्यमान को नियंत्रित करें, जहां एमहाइड और एमड्राई क्रमशः हाइड्रेटेड पाउडर औरसूखे पाउडर का द्रव्यमान हैं।
      नोट: इंसुलिन जैसे अत्यधिक हाइड्रोफोबिक प्रोटीन के लिए, उच्च वाष्प दबाव प्राप्त करने और वांछित जलयोजन स्तर एच तक पहुंचने के लिए डेसिकेटर के अंदर तापमान बढ़ाना आवश्यक हो सकता है।
    3. सभी विनिमेय हाइड्रोजन को ड्यूटेरॉन में ठीक से परिवर्तित करने के लिए चरण 2.2.1 और 2.2.2 को कम से कम तीन बार दोहराएं।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, शुद्ध डी2ओ में फ्रीज-सुखाने और विघटन के चक्रों का उपयोग बेहतर एच / डी विनिमय के लिए किया जा सकता है बशर्ते कि प्रोटीन इससे प्रभावित न हो।
    4. पाउडर को वांछित स्तर से थोड़ा ऊपर हाइड्रेट करें, इंडियम तार और हाइड्रेटेड पाउडर के साथ नमूना धारक के निचले हिस्से को सटीक संतुलन पर रहने दें, और लक्ष्य एच प्राप्त करने के लिए द्रव्यमान को धीरे-धीरे वांछित मूल्य तक कम करने की प्रतीक्षा करें (आमतौर पर 0.2-0.4 यदि मध्यम आकार के गोलाकार प्रोटीन को एक पूर्ण हाइड्रेशन परत द्वारा कवर किया जाना है)।
    5. जल्दी से नीचे के हिस्से पर ढक्कन लगाएं और वाष्प विनिमय (पूरक चित्रा एस 3 ए) को रोकने के लिए नमूना धारक को पहले चार स्क्रू के साथ बंद करें।
    6. सभी शेष स्क्रू रखें और कसें जब तक कि नीचे के हिस्से और ढक्कन के बीच कोई अंतर दिखाई न दे (पूरक चित्रा एस 3 बी)।
    7. न्यूट्रॉन प्रयोग के बाद लीक के माध्यम से किसी भी संभावित जलयोजन हानि की जांच के लिए सील नमूना धारक का वजन करें।

3. असंगत न्यूट्रॉन प्रकीर्णन प्रयोग करें

  1. असाइन किए गए बीमटाइम से कुछ सप्ताह पहले स्थानीय संपर्क के साथ प्रयोग के लिए आवश्यक उपकरण के कॉन्फ़िगरेशन पर चर्चा करें और फिर से जांचें।
  2. तरल अवस्था का नमूना तैयार करें।
    1. प्रोटीन को ड्यूरेटेड बफर में घोलें।
    2. पानी का उपयोग करके नमूना धारक में डाले जाने वाले तरल की उचित मात्रा निर्धारित करें (सुनिश्चित करें कि नमूना धारक बंद होने पर कोई अतिप्रवाह न हो; चित्रा 2 सी)।
      नोट: निम्नलिखित चरण (3.3 और 3.4) आईएल8,9 पर एनबीएस स्पेक्ट्रोमीटर आईएन 16 बी पर किए गए एक प्रयोग का वर्णन करते हैं, जो एक नमूना वातावरण के रूप में क्रायोफर्नेस का उपयोग करते हैं। उपकरण नियंत्रण प्रणाली एक उपकरण से दूसरे में बदल जाएगी, लेकिन कार्य सिद्धांत समान रहते हैं।
  3. नमूना सम्मिलित करें.
    1. नमूना स्टिक (चित्रा 2 डी) को अच्छी तरह से सुखाएं, और किसी भी सामग्री (आईएल पर) को संभालने से पहले आयनीकरण विकिरण खुराक 100 μSv / h से कम है, यह जांचने के बाद पिछले नमूने, यदि कोई हो, को हटा दें।
    2. नमूना रखें, बीम केंद्र (पूरक चित्रा एस 4) के सापेक्ष उचित केंद्रण की जांच करें, और क्रायोफर्नेस (चित्रा 2 डी) में नमूना छड़ी डालें। 10-3 बार से कम तक पहुंचने के लिए वैक्यूम पंप चालू करें, और निम्नलिखित तीन बार दोहराकर क्रायोफर्नेस के अंदर की हवा को बाहर निकालें: वायुमंडलीय दबाव तक पहुंचने तक हीलियम गैस के साथ क्रायोफर्नेस को भरें, और वैक्यूम पंप का उपयोग करके गैस को फिर से हटा दें।
      नोट: एक फ्लैट नमूना धारक के मामले में, नमूना धारक को आने वाली बीम के सापेक्ष 45 ° कोण पर उन्मुख होना चाहिए। सेल द्वारा अवशोषण और प्रकीर्णन के कारण उपयोगी गति हस्तांतरण सीमा को कम किया जा सकता है। कैडमियम जैसे एक मजबूत न्यूट्रॉन अवशोषक का उपयोग नमूना धारक के कुछ हिस्सों (जैसे, पेंच, मोटे भागों) को मुखौटा करने के लिए किया जा सकता है।
    3. क्रायोफर्नेस में कुछ हीलियम गैस का परिचय दें जैसे कि दबाव ~ 0.05 बार है।
  4. डेटा प्राप्त करें (उदाहरण के लिए, आईएल में आईएन 16 बी पर नोमैड का उपयोग करके, यह माना जाता है कि उपयोगकर्ता क्वासिइलास्टिक न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रम (क्यूईएनएस) स्पेक्ट्रम प्राप्त करने से पहले 200 K के तापमान को पसंद करता है, फिर E / IFWS तापमान रैंप के दौरान 0.5 K प्रति मिनट पर 310 K और अंत में 310 K पर QENS पसंद करता है)।
    1. NOMAD का उपयोग करते हुए, निष्पादन टैब में, लॉन्च पैड में एक फर्नेस क्रायोस्टैट नियंत्रक को खींचें और छोड़ें। तापमान 200 K पर सेट करें। फास्ट मोड और 30 मिनट के टाइमआउट का उपयोग करें ताकि तापमान स्थिर होने का समय हो। इसे पृष्ठभूमि में चलाने के लिए घूर्णन तीर आइकन पर क्लिक करें ताकि तापमान में कमी के दौरान डेटा प्राप्त किया जा सके।
    2. IN16डॉप्लरसेटिंग्स नियंत्रक को खींचें और छोड़ें, गति प्रोफ़ाइल को अधिकतम त्रिभुज द्वारा निर्धारित सटीक वेग पर सेट करें, एक EFWS कॉन्फ़िगरेशन प्राप्त करने के लिए 0.00 μeV और 128 चैनलों का मान।
    3. गणना नियंत्रक को खींचें और छोड़ें, उपशीर्षक फ़ील्ड को एक ऐसे नाम से भरें जो डेटा की आसान पहचान की अनुमति देता है, और 30 एस स्कैन (पूरक चित्रा एस 5 ए) के 60 दोहराव सेट करें।
    4. एक IN16डॉप्लरसेटिंग्स नियंत्रक को खींचें और छोड़ें, QENS कॉन्फ़िगरेशन प्राप्त करने के लिए गति प्रोफ़ाइल को 4.5 m/s और 2,048 चैनलों के मान के साथ गति द्वारा सेट किए गए साइन पर सेट करें।
    5. 30 मिनट स्कैन के 4 दोहराव के साथ एक गिनती नियंत्रक को खींचें और छोड़ें (पूरक चित्रा एस 5 बी)।
    6. तापमान रैंप के लिए, फर्नेस क्रायोस्टेट नियंत्रक को खींचें और छोड़ें, तापमान को 310 K पर सेट करें, Regp को SetPoint पर सेट करें जिसमें त्रिभुज = 0.05 K और 6 s हैं। 220 मिनट (पूरक चित्रा एस 6 ए) में से एक समय का उपयोग करें।
    7. 65 दोहराव वाले लूप का उपयोग करें। अंदर, चरण 3.4.2 में एक IN16डॉप्लरसेटिंग नियंत्रक डालें, इसके बाद 30 s की एकल गिनती डालें। इसके बाद, IN16डॉप्लरसेटिंग्स डालें, जैसा कि पहले वर्णित है, लेकिन 1.5 μeV और 1,024 चैनलों के ऊर्जा ऑफसेट का उपयोग करके इसके बाद 3 मिनट (पूरक चित्रा S6B) की एकल गिनती का उपयोग करें।
    8. 310 K पर अंतिम QENS प्राप्त करने के लिए, IN16डॉप्लर सेटिंग्स और काउंट नियंत्रकों को क्रमशः चरण 3.4.4 और 3.4.5 में वर्णित के रूप में कॉन्फ़िगर करके खींचें और छोड़ें।
    9. स्क्रिप्ट चलाने के लिए प्रारंभ बटन (विंडो के नीचे दाहिना त्रिभुज) दबाएँ।
      नोट: प्रत्येक प्रयोग अंशांकन डेटा के अधिग्रहण की आवश्यकता होगी; यही है, घटाव या अवशोषण सुधार के लिए खाली सेल, पृष्ठभूमि को मॉडल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न तापमानों पर अकेले बफर, और उपकरण के रिज़ॉल्यूशन फ़ंक्शन को प्राप्त करने के लिए वैनेडियम (या समकक्ष रूप से, 10 K या उससे कम के तापमान पर नमूना) का माप।

4. डेटा विश्लेषण - क्यूईएनएस

  1. Python सॉफ़्टवेयर nPDyn v3.x36 में 'IN16B_QENS.process()' विधि का उपयोग कर डेटासेट आयात करें
    nPDyn.dataParsers आयात IN16B_QENS से >>>>

    >>> नमूना = IN16B_QENS (
    ... <डेटा फ़ाइलों के लिए पथ>
    ... [detGroup=<पूर्णांक या XML में डिटेक्टर समूहीकरण फ़ाइल
    ... प्रारूप>]
    ... ). प्रक्रिया()

    >>> नमूना = sample.get_q_range(0.3, 1.8)
  2. निम्न आदेशों के साथ डेटा सुधार (वैकल्पिक) निष्पादित करें (अधिक जानकारी के लिए nPDyn का दस्तावेज़ीकरण देखें, चित्रा 3):
    #it माना जाता है कि खाली सेल, वैनेडियम और बफर के लिए डेटा
    # पहले से ही 'empty_cell', 'वैनेडियम' नामक डेटासेट में आयात किए गए थे,
    # और 'बफर', क्रमशः।

    # स्केलिंग फैक्टर के साथ खाली सेल घटाव के लिए।
    # (त्रुटियों को स्वचालित रूप से प्रचारित किया जाता है)
    >>> नमूना = नमूना - 0.95 * empty_cell

    # पालमन-पिंग गुणांक का उपयोग करके सुधार के लिए
    # (ऊपर दिए गए उदाहरण के साथ पारस्परिक रूप से अनन्य)
    >>> नमूना = नमूना.अवशोषण सुधार(empty_cell)

    # सामान्यीकरण के लिए
    >>> नमूना = नमूना.सामान्य (वैनेडियम)

    # अवलोकन योग्य अक्ष के साथ बिनिंग के लिए
    # अवलोकन यी यहां एकत्रीकरण समय है।
    >>> नमूना = नमूना.bin(3, अक्ष = 0)
  3. अंशांकन डेटा फिट करें। डेटासेट-नमूने, खाली सेल, ड्यूरेटेड बफर (यदि आवश्यक हो), और वैनेडियम-अंतर्निहित मॉडल या उपयोगकर्ता-परिभाषित मॉडल का उपयोग करके फिट किया जा सकता है (एनपीडिन प्रलेखन देखें):
    nPDyn.models.Builtins आयात से >>>
    ... modelPVoigt,
    ... मॉडल वाटर,
    ... मॉडल कैलिब्रेटेड डी 2 ओ,
    ...     )

    # अंतर्निहित मॉडल गति के कॉलम वेक्टर का उपयोग करते हैं
    # स्थानांतरण q मान
    >>> q = वैनेडियम.q[:, कोई नहीं]

    # वैनेडियम को एक छद्म-वोइट प्रोफाइल का उपयोग करके फिट किया गया है।
    >>> वैनेडियम.फिट (मॉडलPVoigt(q))
  4. हाइड्रेशन पानी के लिए अंतर्निहित मॉडल का उपयोग करें जिसे 'मॉडलवाटर' कहा जाता है। यह मॉडल Eq (4)17 द्वारा दिखाए गए अनुसार पढ़ता है।
    Equation 4 (4)
    जहां ए0, एआर, और एटी क्रमशः लोचदार संकेत, घूर्णी गति और ट्रांसलेशनल गतियों के सापेक्ष योगदान के लिए जिम्मेदार स्केलर हैं; j1 (qd) lवें क्रम गोलाकार बेसेल फ़ंक्शन है, जिसमें q गति हस्तांतरण है; डी पानी के अणु में ओ-एच दूरी; δ डिराक डेल्टा है, जिसे यहां ईआईएसएफ से गुणा किया जाता है; एन उपयोग किए जाने वाले गोलाकार बेसेल फ़ंक्शन का उच्चतम क्रम है (आमतौर पर ~ 5); Equation 5 और क्रमशः लोरेंत्ज़ियन घूर्णी और Equation 11 ट्रांसलेशनल गतियां हैं; बी (क्यू) एक सपाट पृष्ठभूमि शब्द है। गोलाकार बेसेल फ़ंक्शन पानी के अणुओं के प्रत्येक कोणीय गति अवस्था का सापेक्ष योगदान देते हैं, और संख्या एन को गति हस्तांतरण क्यू-रेंज के आधार पर निर्धारित किया जाता है। एक विशिष्ट एनबीएस स्पेक्ट्रोमीटर के मामले में, एन = 4 तक के शब्द लगभग पूरी तरह से सिग्नल की व्याख्या करते हैं (पूरक चित्रा एस 7)।
    # यहां, समीकरण 2 का उपयोग हाइड्रेशन पानी के लिए किया जाता है।
    # रिज़ॉल्यूशन फ़ंक्शन और जोड़ने के साथ जटिलता
    # D2O पृष्ठभूमि स्वचालित रूप से के साथ किया जाता है
    # प्रदान किए गए तर्क
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... रेस = वैनेडियम,
    ... bkgd = बफर,
    ... volume_fraction_bkgd= 0.95
    ... )
    नोट: घूर्णी और ट्रांसलेशनल गतियों का योगदान पूरी तरह से कठोर होना चाहिए। एक योजक मॉडल की सफलता को प्रोटीन की सतह पर पानी की अलग-अलग आबादी की उपस्थिति और सीमित ऊर्जा सीमा सुलभ होने के लिए जिम्मेदार ठहराया जाना है।
  5. डेटा प्लॉट करने के लिए निम्न का उपयोग करें (चित्रा 4):
    nPDyn.प्लॉट आयात प्लॉट से >>>
    >>> प्लॉट (नमूना)

5. डेटा विश्लेषण - तापमान रैंप, लोचदार फिक्स्ड-विंडो स्कैन (ईएफडब्ल्यूएस)

  1. सबसे कम तापमान (आमतौर पर 10 K) पर सिग्नल द्वारा तापमान रैंप डेटा को सामान्य करने के लिए अनुभाग 4 के समान प्रक्रिया का उपयोग करें:
    nPDyn.dataParsers आयात IN16B_FWS से >>>

    >>> नमूना = IN16B_FWS (
    ... <डेटा फ़ाइलों के लिए पथ>,
    ... detGroup=[detGroup=<पूर्णांक या डिटेक्टर समूहीकरण फ़ाइल XML स्वरूप में>]
    ... ). प्रक्रिया()

    # अवलोकन योग्य पर 5 पहले बिंदुओं के साथ सामान्यीकरण।
    # अक्ष, जो तापमान के अनुरूप है
    >>> नमूना /= नमूना[:5].माध्य (0)

    # यहां उपयोग की जाने वाली गति हस्तांतरण क्यू रेंज छोटी है।
    # जैसा कि उपयोग किया गया मॉडल केवल कम क्यू के लिए मान्य है
    >>> नमूना = sample.get_q_range(0.2, 0.8)
  2. शुरू करने के लिए एक साधारण गॉसियन मॉडल का उपयोग करें, जिसकी चौड़ाई तथाकथित माध्य वर्ग विस्थापन (एमएसडी) द्वारा दी गई है। निम्न आदेशों का उपयोग करके मॉडल बनाएँ और फिट करें:
    >>> आयात संख्या को np के रूप में
    nPDyn.models आयात पैरामीटर, मॉडल, घटक से >>>

    # ए एक स्केलिंग कारक है।
    >>> परम = पैरामीटर(
    ... a={'मान': 1, 'सीमा': (0, np.inf)},
    ... msd={'मान': 1, 'सीमा': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> मॉडल = मॉडल (पैराम्स)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... 'गॉसियन',
    ... लैम्ब्डा एक्स, ए, एमएसडी: ए * एनपी.एक्सपी (-एक्स ** 2 * एमएसडी / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(मॉडल, x=sample.q[:, कोई नहीं])

    >>> प्लॉट (नमूना)
    नोट: गॉसियन सन्निकटन हमेशा क्यू2एमएसडी << 1 के लिए रहता है, लेकिन नमूनों के बीच सापेक्ष तुलना के लिए व्यापक गति हस्तांतरण सीमा का उपयोग किया जा सकता है। अधिक परिष्कृत मॉडल, जो गॉसियन अनुमान से परे जाते हैं,37,38,39 विकसित किए गए हैं।

6. डेटा विश्लेषण - लोचदार और इनलेस्टिक फिक्स्ड-विंडो स्कैन (ई / आईएफडब्ल्यूएस)

  1. चरण 4 के समान, डेटासेट आयात करें लेकिन 'IN16B_FWS' वर्ग का उपयोग करें:
    nPDyn.dataParsers आयात IN16B_FWS से >>>

    >>> नमूना = IN16B_FWS (
    ... <डेटा फ़ाइलों के लिए पथ>
    ... [detGroup=<पूर्णांक या डिटेक्टर समूहीकरण फ़ाइल XML स्वरूप में>]
    ... ). प्रक्रिया()

    >>> नमूना = sample.get_q_range(0.3, 1.8)
  2. अंशांकन डेटा और नमूना डेटा फिट करें।
    1. सामान्यीकृत MSD40 का उपयोग करके या उन्हें मोटे-QENS स्पेक्ट्रा (ऊर्जा अक्ष पर केवल कुछ डेटा बिंदु होने) के रूप में विचार करके E / IFWS डेटा का विश्लेषण करें। जब E/ IFWS को मोटे-QENS के रूप में देखा जाता है, तो QENS के लिए उपयोग किए जाने वाले मॉडल का उपयोग एक बार में पूरे E / IFWS डेटासेट को फिट करने के लिए किया जाता है (ऊर्जा हस्तांतरण और गति हस्तांतरण का वैश्विक फिट)।
      नोट: ई / आईएफडब्ल्यूएस डेटा पर क्यूईएनएस के लिए बाद के समाधान-उपयोग करने वाले मॉडल का उपयोग यहां किया जाता है जहां सेंटर-ऑफ-मास प्रसार और प्रोटीन आंतरिक गतिशीलता की गति हस्तांतरण निर्भरता लगाई जाती है।
    2. निम्नलिखित Eq (5) (nPDyn में 'मॉडलProteinJumpDiff') का उपयोग करके तरल पदार्थों में प्रोटीन गतिशीलता का मॉडल:
      Equation 6 (5)
      जहां आर (क्यू, क्यू) रिज़ॉल्यूशन फ़ंक्शन है; β प्रत्येक संवेग हस्तांतरण q के लिए एक स्केलर स्वतंत्र है; ए0 लोचदार असंगत संरचना कारक (ईआईएसएफ) है; Equation 7 ईक्यू (6) द्वारा दी गई चौड़ाई के साथ केंद्र-द्रव्यमान प्रसार के लिए एक लोरेंत्ज़ियन लेखांकन; Equation 12 एक लोरेंत्ज़ियन है जिसमें केंद्र-द्रव्यमान प्रसार और आंतरिक गतिशीलता (ईक्यू (7) के लिए जंप-डिफ्यूजन मॉडल14 के बाद योगदान शामिल है; Equation 8 नमूने में इसके वॉल्यूम अंश द्वारा पुन: तैयार किए गए डी2ओ से फिट सिग्नल होने के नाते।
      γ = Dsq2 (6)
      डीस्व-प्रसार गुणांक है।
      Equation 9 (7)
      डीआई आंतरिक गतिशीलता के लिए स्पष्ट प्रसार गुणांक है और गति के लिए एक विश्राम समय है।
      nPDyn.models.Builtins आयात से >>>
      ... modelPVoigt,
      ... मॉडल प्रोटीनजंपडिफ,
      ... मॉडल कैलिब्रेटेड डी 2 ओ,
      ... )

      # अंतर्निहित मॉडल गति के कॉलम वेक्टर का उपयोग करते हैं
      # स्थानांतरण q मान
      >>> q = वैनेडियम.q[:, कोई नहीं]

      # वैनेडियम को एक छद्म-वोइट प्रोफाइल का उपयोग करके फिट किया गया है।
      >>> वैनेडियम.फिट (मॉडलPVoigt(q))

      # शुद्ध डी 2 ओ के लिए, कैलिब्रेटेड लाइनविड्थ के साथ एक मॉडल
      # विभिन्न तापमानों के लिए nPDyn में शामिल है
      >>> बफर.फिट (मॉडलकैलिब्रेटेड D2O(q, temp=363))

      # यहां, समीकरण 3 का उपयोग तरल नमूनों के लिए किया जाता है।
      # रिज़ॉल्यूशन फ़ंक्शन और जोड़ने के साथ जटिलता
      # डी 2 ओ पृष्ठभूमि स्वचालित रूप से # प्रदान किए गए तर्कों के साथ की जाती है
      >>> नमूना.फिट (मॉडलProteinJumpDiff(q),
      ... रेस = वैनेडियम,
      ... bkgd = बफर,
      ... volume_fraction_bkgd= 0.95
      ... )
  3. फिट किए गए डेटा का उपयोग करके प्लॉट करें:
    nPDyn.प्लॉट आयात प्लॉट से >>>
    >>> प्लॉट (नमूना)

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Representative Results

कणों में लाइसोजाइम का एकत्रीकरण 90 डिग्री सेल्सियस पर किया गया था, जिसमें 50 मिलीग्राम / एमएल की प्रोटीन एकाग्रता एक ड्यूरेटेड बफर (पीएच 10.5 पर 0.1 एम एनएसीएल) थी। कणों का गठन 90 डिग्री सेल्सियस तक तापमान वृद्धि से शुरू होता है और 6 घंटे के भीतर होता है (पूरक चित्रा एस 8)। डेटा अधिग्रहण IN16B पर किया गया था, जैसा कि ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल में वर्णित है (डेटा स्थायी रूप से IL द्वारा क्यूरेट किया जाता है और http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811 पर सुलभ होता है)।

प्रारंभिक स्थिति को पूरी तरह से चिह्नित करने के लिए 7 डिग्री सेल्सियस पर एक क्यूईएनएस स्पेक्ट्रम का अधिग्रहण किया गया था। इसके बाद, एकत्रीकरण प्रक्रिया को ट्रिगर करने के लिए तापमान को 90 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ा दिया गया (आमतौर पर आईएन 16 बी, पूरक चित्रा एस 9 पर ~ 30 मिनट लगते हैं)। कैनेटीक्स का पालन क्यूईएनएस स्पेक्ट्रा के स्लाइडिंग औसत का उपयोग करके किया जा सकता है, जिससे ऊर्जा हस्तांतरण की पूरी श्रृंखला तक पहुंच की अनुमति मिलती है, फिर भी समय में सीमित रिज़ॉल्यूशन के साथ। ईएफडब्ल्यूएस का उपयोग करके समय रिज़ॉल्यूशन को ~ 1 मिनट तक और ई / आईएफडब्ल्यूएस का उपयोग करके ~ 20 मिनट तक चार ऊर्जाहस्तांतरण मूल्यों 5 पर सुधार किया जा सकता है।

प्रस्तुत उदाहरण में, हमने 0, 0.6, 1.5, और 3 μeV के ऊर्जा हस्तांतरण का पता लगाया। एकत्रीकरण प्रक्रिया के दौरान ई / आईएफडब्ल्यूएस स्कैन लगातार प्राप्त किए जाते हैं, और 90 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम स्थिति के लिए एक क्यूईएनएस स्पेक्ट्रम हासिल किया गया था। ई / आईएफडब्ल्यूएस डेटा को खाली सेल के ई / आईएफडब्ल्यूएस का उपयोग करके अवशोषण के लिए सही किया गया था और वैनेडियम डेटा का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था।

लाइसोजाइम ई / आईएफडब्ल्यूएस के लिए, हम कम गति हस्तांतरण और कम ऊर्जा हस्तांतरण पर समय में सिग्नल की वृद्धि देखते हैं, जबकि उच्च ऊर्जा हस्तांतरण और कम गति हस्तांतरण पर सिग्नल कम हो जाता है (पूरक चित्रा 10)। यह गुणात्मक अवलोकन बड़ी वस्तुओं के गठन को इंगित करता है, अधिक धीरे-धीरे अलग होता है और पुष्टि करता है कि एकत्रीकरण प्रक्रिया हुई थी। समीकरण (4) के अनुसार, विश्लेषण के परिणामस्वरूप छोटे प्रोटीन समूहों (गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन और हाइड्रोप्रो गणना 5,41 द्वारा समर्थित) की उपस्थिति के साथ सहमति में 15 A2/ns का प्रारंभिक केंद्र-द्रव्यमान प्रसार गुणांक होता है, जो बाद में समय के साथ तेजी से घटता है (चित्रा 5)। आंतरिक गतिशीलता के लिए स्पष्ट प्रसार गुणांक एकत्रीकरण प्रक्रिया के दौरान स्थिर रहता है। इसलिए, लाइसोजाइम कणों का गठन एक एकल एकत्रीकरण चरण में होता है। आंतरिक प्रोटीन गतिशीलता में परिवर्तन की अनुपस्थिति से पता चलता है कि या तो क्रॉस-β में रूपांतरण और ऊर्जा में संभावित संबंधित परिवर्तन बहुत तेज हैं या अन्य ड्राइविंग प्रभाव, जैसे कि विलायक एन्ट्रॉपी में वृद्धि, जांच की गई ऊर्जा सीमा के भीतर पूरी तरह से हावी हो सकते हैं।

ताऊ के मोनोमर्स और फाइबर के आसपास हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता का अध्ययन पाउडर नमूनों के लिए ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके जर्मनी के गार्चिंग में मैयर-लीबनिट्ज जेंट्रम (एमएलजेड) में स्फीयर्स पर किया गया था। लगभग 100 मिलीग्राम ड्यूरेटेड ताऊ प्रोटीन पाउडर, 0.4 ग्राम एच2ओ प्रति ग्राम प्रोटीन के लिए हाइड्रेटेड किया गया था, का उपयोग किया गया था। ईएफडब्ल्यूएस को निरंतर तापमान पर तापमान रैंप और क्यूईएनएस स्पेक्ट्रा के दौरान अधिग्रहित किया गया था। ईएफडब्ल्यूएस को 20 K से शुरू किया गया था और 5 मिनट स्कैन के दौरान लगातार डेटा प्राप्त करते हुए 0.2 K / min की दर से तापमान को 300 K तक बढ़ाया गया था।

क्यूईएनएस स्पेक्ट्रा 20 और 280 K पर दर्ज किया गया था। ईएफडब्ल्यूएस डेटा को एमएसडी (पूरक चित्रा एस 11 ए) निकालने के लिए गति हस्तांतरण क्यू रेंज 0.2 ए -1 < क्यू < 0.8 ए -1 पर एक साधारण गॉसियन का उपयोग करके फिट किया गया था। एमएसडी मान गॉसियन मॉडल के लिए वैधता सीमा से ऊपर हैं। इसलिए, इस मामले में गॉसियन अनुमान37,38,39 से परे अन्य मॉडलों का पता लगाने की सिफारिश की जाती है। 220 K से अधिक तापमान पर, ताऊ के तंतुओं के आसपास जलयोजन पानी ताऊ मोनोमर्स (चित्रा 6) के आसपास जलयोजन पानी की तुलना में काफी अधिक गतिशील है। क्यूईएनएस डेटा की फिटिंग उपयोगकर्ताओं को नमूने में हाइड्रेशन पानी के लोचदार, घूर्णी और ट्रांसलेशनल गतियों की लाइनविड्थ और सापेक्ष योगदान प्राप्त करने की अनुमति देती है (पूरक चित्रा एस 11 बी)। ऐसा प्रतीत होता है कि ट्रांसलेशनल गति से गुजरने वाले पानी के अणुओं का अंश तंतुओं के चारों ओर बढ़ जाता है, और पानी के अणुओं के ट्रांसलेशनल और रोटेशन प्रसार गुणांक दोनों फाइबर17,31 के आसपास बढ़ जाते हैं। इसके विपरीत, प्रोटीन ताऊ की पीएस-एनएस आंतरिक गतिशीलता, रीढ़ की हड्डी और साइड-चेन गतियों को दर्शाती है, फाइब्रिलेशन पर नहीं बदलती है।

Figure 2
चित्र 2: एक फ्लैट एल्यूमीनियम नमूना धारक का आधार। (ए) फ्लैट एल्यूमीनियम नमूना धारक न्यूट्रॉन के संपर्क में एक केंद्रीय भाग प्रस्तुत करता है जहां प्रोटीन पाउडर को आधार और ढक्कन के बीच एक छोटे से अंतराल के भीतर बनाए रखा जाता है- आमतौर पर ~ 0.3 मिमी। एक इंडियम तार का उपयोग सीलिंग के लिए किया जा सकता है क्योंकि यह 90 डिग्री सेल्सियस तक तापमान वृद्धि का प्रतिरोध करता है। उच्च तापमान के मामले में, टेफ्लॉन सील का उपयोग किया जा सकता है। (बी) प्रोटीन पाउडर को इंडियम तार के साथ नमूना धारक के आधार में रखा जाता है। नमूना धारक को सुखाने के लिए या तो पी 2 ओ5 या हाइड्रेशन के लिए एच 2 ओ / डी2ओ कीउपस्थिति में एक डेसिकेटर में रखा जाता है। निर्वात ग्रीस को नीचे और डिसिकेटर के ढक्कन के बीच किसी भी रिसाव से बचने के लिए जोड़ा जाता है। वैक्यूम का उपयोग सुखाने की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए सावधानी के साथ किया जा सकता है। अत्यधिक हाइड्रोफोबिक नमूनों के लिए डेसिकेटर के तल को गर्म करने की आवश्यकता हो सकती है। (सी) प्रोटीन समाधान आंतरिक और बाहरी सिलेंडरों के बीच रखा जाता है। सुनिश्चित करें कि बहुत अधिक तरल पिपेट न करें (नमूना धारक बंद होने पर कोई अतिप्रवाह नहीं होना चाहिए)। इंडियम तार को गोलाकार नाली में रखा गया है। (डी) नमूना स्टिक (पृष्ठभूमि में) नमूना ऊंचाई और अभिविन्यास पर नियंत्रण प्रदान करता है और नमूना वातावरण (तापमान, दबाव) के लिए विभिन्न नियंत्रकों और डिटेक्टरों को शामिल कर सकता है। नमूना छड़ी क्रायोफर्नेस (सामने) के शीर्ष से डाली जाती है, जो प्रयोग के दौरान तापमान के लिए नियंत्रण प्रदान करती है। प्रयोग के दौरान, न्यूट्रॉन बीम आमतौर पर क्रायोफर्नेस के तल से टकराता है, जैसा कि सफेद आयत द्वारा इंगित किया गया है (बीम का आकार उपकरण विन्यास पर निर्भर करता है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डेटा सुधार और सामान्यीकरण फिट में सुधार कर सकते हैं। प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एनपीडिन का उपयोग करके डेटा आयात किया गया था। बाएं, डेटासेट को केवल मॉनिटर के डेटा का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था। दाएं, नमूना धारक से न्यूट्रॉन अवशोषण के लिए सही करने के लिए पालमन-पिंग गुणांक43 के साथ खाली कैन के संकेत का उपयोग किया गया था। इसके बाद, वैनेडियम सिग्नल के लिए फिट किए गए मॉडल को प्रत्येक गति हस्तांतरण क्यू के लिए स्वतंत्र रूप से एकीकृत किया गया था, और परिणाम का उपयोग नमूना डेटासेट को सामान्य करने के लिए किया गया था। दोनों भूखंडों में, S (q, q) प्रकीर्णन संकेत को दर्शाता है, q गति हस्तांतरण है, और Equation 3 ऊर्जा हस्तांतरण है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एनपीडिन द्वारा उत्पन्न प्लॉटिंग विंडो फिट का परिणाम दिखाती है। क्यूईएनएस डेटा को एनपीडिन का उपयोग करके फिट किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है। प्लॉटिंग विंडो उपयोगकर्ताओं को विभिन्न अक्षों-अवलोकन योग्य (समय, तापमान या दबाव), गति हस्तांतरण क्यू या ऊर्जा हस्तांतरण के साथ डेटा प्लॉट करने की अनुमति देती है- और चयनकर्ता अन्य अक्षों के साथ नेविगेट करने के लिए उपलब्ध हैं। विभिन्न प्रकार के भूखंड उपलब्ध हैं, जिसमें (ए) में प्रस्तुत सरल 'प्लॉट' और (बी) में 'विश्लेषण - क्यू-वार' है। 'प्लॉट' बटन अलग-अलग सबप्लॉट में अलग-अलग डेटासेट दिखाता है, 'तुलना' बटन एक ही प्लॉट में डेटासेट दिखाता है, '3 डी प्लॉट' एस के समान विभिन्न 3 डी सबप्लॉट में डेटासेट दिखाता है, 'विश्लेषण - क्यू-वाइज' बटन फिट किए गए मापदंडों को गति हस्तांतरण क्यू और 'विश्लेषण - अवलोकन योग्य-वार' के कार्य के रूप में दिखाता है।' फिट किए गए मापदंडों को अवलोकन योग्य (समय, तापमान या दबाव) के कार्य के रूप में दिखाता है। संक्षिप्त नाम: क्यूईएनएस = क्वासिइलास्टिक न्यूट्रॉन प्रकीर्णन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: लाइसोजाइम एकत्रीकरण निरंतर आंतरिक गतिशीलता के साथ एक-चरण यी प्रक्रिया में होता है। लाइसोजाइम को एकत्रीकरण बफर (5 में वर्णित) में भंग कर दिया गया था, और ई / आईएफडब्ल्यूएस को पूरे एकत्रीकरण में अधिग्रहित किया गया था, जिसे तापमान को 90 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाकर ट्रिगर किया गया था। एक खाली सेल के साथ अवशोषण सुधार और वैनेडियम सिग्नल का उपयोग करके सामान्यीकरण के बाद, प्रोटोकॉल में वर्णित जंप डिफ्यूजन मॉडल का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। फिट किए गए केंद्र-द्रव्यमान स्व-प्रसार गुणांक को आंतरिक गतिशीलता (नारंगी वर्गों) के लिए स्पष्ट प्रसार गुणांक के साथ समय (नीले त्रिकोण) के कार्य के रूप में प्लॉट किया गया है। यह आंकड़ा 5 से है। संक्षिप्त नाम: ई / आईएफडब्ल्यूएस = लोचदार और इनलेस्टिक फिक्स्ड-विंडो स्कैन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: ताऊ फाइबर के आसपास हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता बढ़ जाती है। ड्यूरेटेड ताऊ फाइबर और मोनोमर्स के एच2ओ-हाइड्रेटेड पाउडर को एक फ्लैट एल्यूमीनियम नमूना धारक में सील कर दिया गया था, और ईएफडब्ल्यूएस डेटा को 20 से 300 के तापमान रैंप के दौरान प्राप्त किया गया था। एक खाली सेल के साथ अवशोषण सुधार और वैनेडियम सिग्नल का उपयोग करके सामान्यीकरण के बाद, प्रोटोकॉल में वर्णित जंप डिफ्यूजन मॉडल का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। इस छवि को 31 से डेटा से एक छोटी क्यू रेंज (0.2 < क्यू < 0.8 ए -1) का उपयोग करके फिर से तैयार किया गया था। संक्षिप्त नाम: ईएफडब्ल्यूएस = लोचदार फिक्स्ड-विंडो स्कैन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: आईएल में उपकरण आईएन 16 बी की तस्वीरें। (शीर्ष) उपकरण IN16B को उपकरण को समर्पित विकिरण-नियंत्रित क्षेत्र से देखा गया है। आने वाली बीम न्यूट्रॉन गाइड के भीतर वैक्यूम कक्ष तक जाती है, जिसमें उपकरण के अधिकांश तत्व (पीएसटी चॉपर, विश्लेषक, नमूना, डिटेक्टर) होते हैं। (नीचे) वैक्यूम कक्ष का इंटीरियर। पीएसटी चॉपर दिखाई दे रहा है क्योंकि नमूने वाले क्रायोफर्नेस के आसपास के विश्लेषक हैं। डिटेक्टर क्रायोफर्नेस के पीछे स्थित हैं। लॉरेंट थिओन के सौजन्य से, एक्लिप्टिक। संक्षिप्त नाम: पीएसटी = चरण अंतरिक्ष परिवर्तन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: शास्त्रीय (डॉपलर ड्राइव के साथ) और बीएटीएस मोड में आईएन 16 बी का स्केच। (ए) न्यूट्रॉन बीम को वेग चयनकर्ता द्वारा आंशिक रूप से मोनोक्रोमैटकिया जाता है। इसके बाद, पृष्ठभूमि और पीएसटी हेलीकॉप्टर एक न्यूट्रॉन पल्स का उत्पादन करेंगे, जिसमें से डॉपलर मोनोक्रोमेटर (ई / आईएफडब्ल्यूएस या क्यूईएनएस मोड) द्वारा एक ऊर्जा प्रोफ़ाइल का चयन किया जाएगा। न्यूट्रॉन तब नमूने द्वारा बिखरे हुए होते हैं, और विश्लेषक द्वारा डिटेक्टरों की ओर एक एकल ऊर्जा परिलक्षित होती है। बीमार के सौजन्य से। (बी) बीएटीएस हेलिकॉप्टरों का उपयोग परिभाषित ऊर्जा सीमा के साथ एकल न्यूट्रॉन पल्स को परिभाषित करने के लिए किया जाता है। न्यूट्रॉन बीम को वेग चयनकर्ता द्वारा आंशिक रूप से मोनोक्रोमैटकिया जाता है। इसके बाद, पृष्ठभूमि चॉपर अवांछित न्यूट्रॉन को हटा देगा जो चयनित पल्स से संबंधित नहीं हैं। न्यूट्रॉन तब नमूने द्वारा बिखरे हुए होते हैं, और विश्लेषक द्वारा डिटेक्टरों की ओर एक एकल ऊर्जा परिलक्षित होती है। बीमार के सौजन्य से। संक्षेप: बीएटीएस = बैकस्कैटरिंग और टाइम-ऑफ-फ्लाइट स्पेक्ट्रोमीटर; पीएसटी = चरण अंतरिक्ष परिवर्तन; ई / आईएफडब्ल्यूएस = लोचदार और इनलेस्टिक फिक्स्ड-विंडो स्कैन; क्यूईएनएस = क्वासिइलास्टिक न्यूट्रॉन प्रकीर्णन; पीजी = पाइरोलाइटिक ग्रेफाइट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: पाउडर वांछित जलयोजन और सील तक पहुंचने के बाद नमूना धारक को जल्दी से बंद कर दिया जाता है। (ए) फ्लैट नमूना धारक को चार स्क्रू का उपयोग करके जल्दी से बंद कर दिया जाता है। इंडियम तार के कारण एक छोटा अंतर बना रहेगा। अन्य स्क्रू तब जोड़े जाते हैं, और इंडियम को आराम करने की अनुमति देने के लिए नमूना धारक को धीरे-धीरे प्रत्येक पेंच को कई बार कसकर सील किया जाता है। (बी) फ्लैट नमूना धारक को ठीक से सील कर दिया जाता है जब धारक आधार और ढक्कन के बीच कोई अंतर दिखाई नहीं देता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 4: नमूना धारक न्यूट्रॉन बीम के संबंध में केंद्रित है। नमूना स्टिक पर एक बेलनाकार नमूना धारक रखा गया है। नमूना धारक की स्थिति की जांच इस तरह की जाती है कि बीम धारक के निचले हिस्से से टकराता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 5: ईएफडब्ल्यूएस का अधिग्रहण और उसके बाद एनओएमएडी के साथ आईएन 16 बी पर क्यूईएनएस। (ए) संबंधित नियंत्रकों को प्रोटोकॉल (चरण 3.4.1 से 3.4.3) में बताए गए अनुसार लॉन्च पैड में खींचकर गिरा दिया जाता है। इंटरफ़ेस पर नियंत्रण प्राप्त करने के लिए लॉक (ऊपरी-दाएं कोने पर हरा आइकन - ऊर्ध्वाधर फलक) पर क्लिक करना आवश्यक हो सकता है। (बी) संबंधित नियंत्रकों को खींचकर लॉन्च पैड में गिरा दिया जाता है जैसा कि प्रोटोकॉल (चरण 3.4.4 से 3.4.5) में समझाया गया है। यहां, अंतिम दो नियंत्रकों को IN16डॉप्लरसेटिंग्स और काउंट नाम दिया गया है। संक्षेप: क्यूईएनएस = क्वासिइलास्टिक न्यूट्रॉन स्कैटरिंग, ईएफडब्ल्यूएस = लोचदार फिक्स्ड-विंडो स्कैन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 6: NOMAD के साथ IN16B पर एक तापमान रैंप और E / IFWS स्थापित करना। (ए) फर्नेस क्रायोस्टेट नियंत्रक लॉन्च पैड में जोड़ा गया है और प्रोटोकॉल (चरण 3.4.6) में बताए गए अनुसार कॉन्फ़िगर किया गया है। (बी) लॉन्च पैड में फॉर लूप कंट्रोलर जोड़ा जाता है और संबंधित नियंत्रकों को इसमें डाला जाता है और प्रोटोकॉल (चरण 3.4.7) में बताए गए अनुसार कॉन्फ़िगर किया जाता है। संक्षिप्त नाम: ई / आईएफडब्ल्यूएस = लोचदार और इनलेस्टिक फिक्स्ड-विंडो स्कैन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 7: पहले पांच गोलाकार बेसेल फ़ंक्शन हाइड्रेशन पानी के अधिकांश घूर्णी योगदान की व्याख्या करते हैं। पहले आठ गोलाकार बेसेल फ़ंक्शंस को मान d = 0.98 O और संवेग स्थानांतरण q के मानों का उपयोग करके 0 से 3 O (ठोस रंगीन रेखाएं) का उपयोग करके प्लॉट किया जाता है। 0.3 A < q < 1.8 O की गति हस्तांतरण सीमा को नीली बिंदीदार रेखाओं द्वारा सीमांकित किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 8: लाइसोजाइम पुन: कण बनाता है। लाइसोजाइम को एकत्रीकरण बफर (प्रोटोकॉल, चरण 1 में वर्णित के रूप में तैयार) में भंग कर दिया गया था, और प्रतिदीप्ति का उपयोग करके क्रॉस-β संरचना के गठन की निगरानी के लिए टीएचटी को 2 μM की अंतिम एकाग्रता में जोड़ा गया था। प्लॉट तीन स्वतंत्र मापों के औसत का प्रतिनिधित्व करता है, और त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन हैं। इनसेट एकत्रीकरण के 6 घंटे के बाद बनने वाले कणों की एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तस्वीर दिखाता है। स्केल बार = 20 μm। यह आंकड़ा 5 से है। संक्षिप्त नाम: ThT = thioflavin T. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 9: आईएन 16 बी पर उपलब्ध तेज तापमान रैंप। IN16B पर फास्ट मोड में, तापमान लगभग 30 मिनट में 280 K से 363 K तक बढ़ाया जा सकता है। यह आंकड़ा 5 से है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 10: कणों में एकत्रीकरण के दौरान लाइसोजाइम पर ई / आईएफडब्ल्यूएस डेटा। लाइसोजाइम को एकत्रीकरण बफर (5 में वर्णित) में भंग कर दिया गया था, और ई / आईएफडब्ल्यूएस को पूरे एकत्रीकरण में अधिग्रहित किया गया था, जिसे तापमान को 90 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाकर ट्रिगर किया गया था। एक खाली सेल के साथ अवशोषण सुधार और वैनेडियम के संकेत का उपयोग करके सामान्यीकरण के बाद डेटा-को मापा गया विभिन्न ऊर्जा हस्तांतरण के लिए गति हस्तांतरण क्यू और समय के खिलाफ प्लॉट किया जाता है, 0 μeV (ऊपरी बाएं), 0.6 μeV (ऊपरी दाएं), 1.5 μeV (निचला बाएं), और 3 μeV (निचला दाएं)। प्रत्येक सबप्लॉट के लिए, ऊर्ध्वाधर अक्ष प्रकीर्णन संकेत एस (क्यू, त्रिभुज) से मेल खाता है, जिसे घंटों में प्रयोगात्मक समय और गति हस्तांतरण क्यू के खिलाफ प्लॉट किया गया है। यह आंकड़ा 5 से है। संक्षिप्त नाम: ई / आईएफडब्ल्यूएस = लोचदार और इनलेस्टिक फिक्स्ड-विंडो स्कैन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 11: ताऊ के जलयोजन जल डेटा की फिटिंग। (ए) गॉसियन का उपयोग करके ईएफडब्ल्यूएस डेटा का फिट। ड्यूरेटेड ताऊ मोनोमर्स के एच2ओ-हाइड्रेटेड पाउडर को एक फ्लैट एल्यूमीनियम नमूना धारक में सील कर दिया गया था, और ईएफडब्ल्यूएस को 20 से 300 के तापमान रैंप के दौरान अधिग्रहित किया गया था। प्रयोगात्मक डेटा (त्रुटि सलाखों के साथ ऊर्ध्वाधर अक्ष-नीली रेखा पर लोचदार संकेत एस (क्यू, 0)) को एमएसडी निकालने के लिए उपयोग किए जाने वाले फिट गॉसियन के साथ गति हस्तांतरण क्यू रेंज 0.2 < क्यू < 0.6 ए -1 के लिए प्लॉट किया जाता है। (बी) क्यूईएनएस फिटिंग से प्राप्त हाइड्रेशन पानी की ट्रांसलेशनल और घूर्णी गति। ड्यूरेटेड ताऊ फाइबर (बाएं) और मोनोमर्स (दाएं) के एच2ओ-हाइड्रेटेड पाउडर को एक फ्लैट एल्यूमीनियम नमूना धारक में सील कर दिया गया था, और क्यूईएनएस डेटा 280 K पर प्राप्त किया गया था। फाइबर (नीले त्रिकोण) और मोनोमर्स (हरे बिंदु) के लिए प्रयोगात्मक डेटा (ऊर्जा हस्तांतरण के कार्य के रूप में तीव्रता एस (क्यू, ?)) को फिट किए गए मॉडल (काली ठोस रेखा) और इसके घटकों, पृष्ठभूमि (नीला), रिज़ॉल्यूशन फ़ंक्शन (हरा), रोटेशन (लाल), और संवेग हस्तांतरण क्यू = 0.783 ए -1 के लिए अनुवाद (सियान) के साथ प्लॉट किया जाता है। यह आंकड़ा 31 का है। संक्षेप: क्यूईएनएस = क्वासिइलास्टिक न्यूट्रॉन स्कैटरिंग, ईएफडब्ल्यूएस = लोचदार फिक्स्ड-विंडो स्कैन; एमएसडी = औसत वर्ग विस्थापन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी एकमात्र विधि है जो प्रोटीन के आकार या समाधान की जटिलता की परवाह किए बिना प्रोटीन नमूनों के पहनावा-औसत पीएस-एनएस गतिशीलता की जांच करने की अनुमति देतीहै। विशेष रूप से, समाधान में प्रोटीन असेंबली के आत्म-प्रसार की जांच करके, ऐसी विधानसभाओं के हाइड्रोडायनामिक आकार को स्पष्ट रूप से निर्धारित किया जा सकता है। बहरहाल, विधि आमतौर पर कम न्यूट्रॉन फ्लक्स द्वारा सीमित होती है, जिसका अर्थ है कि आवंटित बीम समय के भीतर एक अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए लंबे अधिग्रहण समय और उच्च मात्रा में नमूना (आमतौर पर 100 मिलीग्राम प्रोटीन) की आवश्यकता होती है।

नमूना तैयारी (प्रोटोकॉल चरण 1 और 2)। तरल-राज्य नमूनों के लिए, उपयोग की जा सकने वाली न्यूनतम एकाग्रता ~ 50 मिलीग्राम / एमएल है (विस्तारित अधिग्रहण समय की कीमत पर कम सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है)। उच्च प्रोटीन एकाग्रता तेजी से फाइब्रिलेशन दरों से जुड़ी होती है, जो आवंटित बीम समय में माप को फिट करने में मदद करती है लेकिन एकत्रीकरणमार्ग को भी प्रभावित कर सकती है। इसलिए, पूरक विधियों, जैसे परमाणु बल या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ पूरी तरह से नमूना लक्षण वर्णन आवश्यक है।

नमूने तैयार करते समय नमूना धारक की सामग्री भी एक बिंदु है जिसे संबोधित किया जाना चाहिए क्योंकि एल्यूमीनियम मिश्र धातु जंग45 के अधीन हैं। एक विशिष्ट एल्यूमीनियम मिश्र धातु जो संक्षारण के लिए अच्छा प्रतिरोध प्रस्तुत करता है और इसमें कम न्यूट्रॉन अवशोषण होता है, वह यूरोपीय मानदंड (EN) AW-6060 [AlMgSi] है जो 98% -98.75% Al, 0.1% Ti, 0.15% Zn, 0.05% Cr, 0.35% -0.6% Mg, 0.1% Mn, 0.1% Cu, 0.1% -0.3% Fe, और 0.3% -0.6% Si से बना है। निकेल या सोना।

हाइड्रोजनीकृत प्रोटीन के पाउडर के नमूनों के लिए, फ्रीज-सुखाने की प्रक्रिया को पी2ओ5 पाउडर की उपस्थिति में एक डेसिकेटर में एक कदम के साथ कुशलतापूर्वक पूरा किया गया था ताकिजितना संभव हो उतना अवशिष्ट प्रकाश पानी को हटाया जा सके। पाउडर के नमूनों के लिए, यह भी सलाह दी जाती है कि पाउडर को इसकी अंतिम, हाइड्रेटेड अवस्था में चिह्नित (परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और एक्स-रे पाउडर विवर्तन का उपयोग करके) और मोनोमर और फाइबर दोनों राज्यों पर ड्यूटेरेशन, फ्रीज-सुखाने और वाष्प प्रसार के प्रभाव का आकलन करें। विशेष रूप से, फ्रीज-सुखाने से फाइबर टूट सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप आकृति विज्ञान को प्रभावित किए बिना छोटे खंड हो सकते हैं। इसके अलावा, एक्स-रे पावर विवर्तन द्वारा यह देखा गया है कि तरल नाइट्रोजन में फ्लैश कूलिंग के बजाय धीमी गति से ठंडा होना, अमाइलॉइड जैसी संरचनाओं (अप्रकाशित परिणाम) की उपस्थिति को प्रेरित कर सकता है।

डेटा संग्रह (प्रोटोकॉल चरण 3). प्रयोग से पहले स्थानीय संपर्क के साथ डेटा संग्रह की योजना बनाने की सलाह दी जाती है (भले ही प्रस्ताव लेखन प्रक्रिया के दौरान इस पर चर्चा की गई हो)। डेटा संग्रह योजना प्राप्त सिग्नल-टू-शोर अनुपात के आधार पर, पहले स्कैन के बाद परिवर्तनों के अधीन है। विशेष रूप से समय-हल किए गए प्रयोगों के लिए, ई / आईएफडब्ल्यूएस का उपयोग तेजी से डेटा संग्रह की अनुमति देता है - लोचदार रेखा के लिए 30 एस से 1 मिनट, 3 μeV 5 पर डेटा बिंदु के लिए4-5 मिनट- लेकिन सुलभ ऊर्जा हस्तांतरण की सीमा स्वाभाविक रूप से सीमित है। वैकल्पिक रूप से, क्यूईएनएस डेटा का एक स्लाइडिंग औसत46 का उपयोग किया जा सकता है। इसके लिए, आईएन 16 बी पर नया बैकस्कैटरिंग और टाइम-ऑफ-फ्लाइट स्पेक्ट्रोस्कोपी (बीएटीएस) विकल्प शास्त्रीय आईएन 16 बी की तुलना में अधिक प्रवाह प्रदान करता है, जिसमें ऊर्जा11 में कम रिज़ॉल्यूशन की लागत पर ±150 μeV (या उपयोग किए गए कॉन्फ़िगरेशन के आधार पर उच्च) की ऊर्जा की सीमा होती है। इसलिए, समय-हल किए गए अध्ययनों के लिए बीएटीएस विकल्प की सिफारिश की जाती है, विशेष रूप से अमाइलॉइड एकत्रीकरण जैसी प्रक्रियाओं के लिए, जो कई घंटों में होता है।

डेटा विश्लेषण (प्रोटोकॉल चरण 4, 5, और 6). प्रकीर्णन फ़ंक्शन एस (क्यू, ) में नमूने में सभी प्रकार की गतियां शामिल हैं, और उपरोक्त प्रोटोकॉल में वर्णित मॉडल अनुमान हैं। विशेष रूप से, तरल अवस्था में आईडीपी के लिए, अव्यवस्थित श्रृंखला की बड़े पैमाने पर गतियां पूरे प्रोटीन के केंद्र-द्रव्यमान प्रसार के समान लंबाई और समय पर हो सकती हैं। इसलिए, उपयोगकर्ता को यह ध्यान रखना चाहिए कि सेंटर-ऑफ-मास प्रसार और प्रोटीन आंतरिक गतिशीलता का पृथक्करण हमेशा सीधा नहीं होता है। फिटिंग प्रक्रिया पूरक विधियों के माध्यम से प्राप्त केंद्र-द्रव्यमान प्रसार पर जानकारी से लाभ उठा सकती है, जैसे कि इस पैरामीटर को तय किया जा सकता है (यह ध्यान में रखते हुए कि अन्य विधियां विभिन्न समय और लंबाई के पैमाने से जुड़े सामूहिक प्रसार गुणांक प्रदान कर सकती हैं) आंतरिक गतिशीलता के लिए अधिक मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए।

न्यूट्रॉन प्रकीर्णन के अलावा, एक आणविक प्रणाली की गतिशीलता को परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) द्वारा विशेषता दी जा सकती है, जो आइसोटोप-लेबल प्रोटीन पर स्थानीय जानकारी प्रदान करता है और टाइमस्केल47,48,49 की एक विस्तृत श्रृंखला पर प्रदान करता है। विधि का उपयोग एमिलॉयड सिस्टम 48,50,51,52,53 का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है, लेकिन उपयोगकर्ताओं को प्रोटीन आकार पर अंतर्निहित सीमा के कारण वास्तविक समय में हाइड्रेशन पानी का अध्ययन करने या अमाइलॉइड एकत्रीकरण प्रक्रिया का पालन करने की अनुमति नहीं देता है। इलेक्ट्रॉन पैरामैग्नेटिक रेजोनेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईपीआर) और ईपीआर-व्युत्पन्न विधि ओवरहॉसर डायनामिक न्यूक्लियर पोलराइजेशन (ओडीएनपी) में हाल के विकास न्यूट्रॉन प्रकीर्णन के साथ संयुक्त होने पर एक अच्छा परिप्रेक्ष्य प्रदान करते हैं। दरअसल, हालांकि साइट-निर्देशित स्पिन लेबलिंग (एसडीएसएल), ईपीआर और ओडीएनपी पेश किए गए स्पिन लेबल के आसपास पीएस-एनएस टाइमस्केल पर क्रमशः प्रोटीन54 और हाइड्रेशन डायनामिक्स55 की जांच कर सकते हैं।

इन विधियों का उपयोग ताऊ56,57 प्रोटीन के एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए किया गया था और न्यूट्रॉन प्रकीर्णन के साथ महान पूरकता प्रदान करेगा जो समान जानकारी प्राप्त कर सकता है, लेकिन पूरे नमूने पर औसत। इसके अलावा, इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी विशिष्ट संरचनात्मक पैटर्न से जुड़े उच्च-ऊर्जा गतियों के लिए गतिशील जानकारी प्रदान कर सकता है, लेकिन प्रोटीन वातावरण (बफर का उपयोग) की जटिलता डेटा व्याख्या58,59 को प्रभावित कर सकती है। न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग तकनीक उपरोक्त विधियों के परिणामों के साथ-साथ पीएस-एनएस टाइमस्केल पर प्रोटीन और हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता पर एक अद्वितीय और पूरक दृश्य प्रदान करती है। उन्हें नमूने के विशिष्ट लेबलिंग की आवश्यकता नहीं होती है, सिग्नल की गुणवत्ता प्रोटीन के आकार के प्रति संवेदनशील नहीं होती है, और माप विवो या अत्यधिक जटिल, ड्यूरेटेड वातावरण में किया जा सकता है जैसे कि ड्यूरेटेड बैक्टीरियल लाइसेट 3,6,7। चूंकि यह विधि एक पहनावा-औसत परिणाम प्रदान करती है, इसलिए यह अध्ययन के तहत प्रणाली पर परमाणु-विस्तार जानकारी प्राप्त करने के लिए आणविक गतिशीलता सिमुलेशन द्वारा अच्छी तरह से पूरक है। सिमुलेशन को प्रयोगात्मक डेटासेट और सैद्धांतिक क्यूईएनएस स्पेक्ट्रा के बीच सीधी तुलना द्वारा आसानी से मान्य किया जा सकता है जो एमडीएएनएस60 जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सिमुलेशन प्रक्षेपवक्र से गणना की जाती है।

अमाइलॉइड सिस्टम के संबंध में, न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग विभिन्न प्रणालियों और स्थितियों5,31,61,62,63,64 के लिए पीएस-एनएस प्रोटीन और पानी की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए उपयोगी साबित हुआ है। विशेष रूप से, न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग का उपयोग क्रॉस-β संरचना में शामिल प्रोटीन अनुक्रम के अनुपात और फाइब्रिलेशन (अप्रकाशित परिणाम) पर पानी के एन्ट्रॉपी लाभ के आयाम के बीच सहसंबंध को प्रकट करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, नमूना वातावरण का विकास न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रा और या तो ढांकता हुआ विश्राम डेटा65 या रमन प्रकीर्णन डेटा66 के एक साथ अधिग्रहण की अनुमति देता है। इसके अलावा, गतिशील डेटा के साथ संरचनात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए आईएन 16 बी पर विवर्तन डिटेक्टर मौजूद हैं। इसके अतिरिक्त, निकट भविष्य में आईएन 16 बी के बीएटीएस मोड के लिए आने वाले न्यूट्रॉन फ्लक्स में सुधार होने की उम्मीद है, तथाकथित चर फोकसिंग गाइड के उपयोग के लिए धन्यवाद, जिसकी ज्यामिति को उपयोग किए जाने वाले वाद्य सेटअप की मांग पर अनुकूलित किया जा सकता है। परिष्कृत नमूना वातावरण और इंस्ट्रूमेंटेशन के विकास को आगे बढ़ाने से भविष्य में और भी जटिल प्रयोगों की अनुमति मिलेगी, संभवतः एक ही समय में आगे गतिशील और संरचनात्मक जानकारी प्रदान करना।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक उपकरण स्फीयर्स पर किए गए न्यूट्रॉन प्रकीर्णन प्रयोगों के हिस्से के लिए जर्मनी के गार्चिंग के हेंज मैयर-लीबनिट्ज जेंट्रम में जुलिच सेंटर फॉर न्यूट्रॉन साइंस में माइकला ज़म्पोनी के आभारी हैं। इस कार्य को अनुबंध एचपीआरआई-2001-50065 और आरआईआई3-सीटी-2003-505925 के तहत यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित ड्यूटेरेशन लेबोरेटरी (डीएलएबी) कंसोर्टियम की गतिविधियों और अनुदान जीआर/आर 99393/01 और ईपी/C015452/1 के तहत इंस्टीट्यूट लॉ लैंगविन ईएमबीएल डीएलएबी के भीतर यूके इंजीनियरिंग एंड फिजिकल साइंसेज रिसर्च काउंसिल (ईपीएसआरसी) द्वारा वित्त पोषित गतिविधि से लाभ हुआ है। प्रमुख कार्रवाई के माध्यम से 7 वें फ्रेमवर्क कार्यक्रम के तहत यूरोपीय आयोग द्वारा समर्थन: यूरोपीय अनुसंधान क्षेत्र को मजबूत करना, अनुसंधान बुनियादी ढांचे को स्वीकार किया जाता है [अनुबंध 226507 (एनएमआई 3)]। केविन पॉनोट और क्रिश्चियन बेक अपने पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप के वित्तपोषण के लिए संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (बीएमबीएफ, अनुदान संख्या 05के19वीटीबी) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

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References

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Pounot, K., Appel, M., Beck, C., Weik, M., Schirò, G., Fichou, Y., Seydel, T., Schreiber, F. High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water. J. Vis. Exp. (182), e63664, doi:10.3791/63664 (2022).

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