Die Neutronenrückstreuspektroskopie bietet einen zerstörungsfreien und markierungsfreien Zugang zur ps-ns-Dynamik von Proteinen und deren Hydratationswasser. Der Workflow wird anhand von zwei Studien zu Amyloid-Proteinen vorgestellt: zur zeitaufgelösten Dynamik von Lysozym während der Aggregation und zur Hydratationswasserdynamik von Tau bei der Faserbildung.
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Methodenartikel
Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Neutronenstreuung bietet die Möglichkeit, die Dynamik in Proben für einen weiten Energiebereich zerstörungsfrei und ohne andere Markierung als Deuterium zu untersuchen. Insbesondere die Neutronenrückstreuspektroskopie zeichnet die Streusignale bei mehreren Streuwinkeln gleichzeitig auf und eignet sich gut, um die Dynamik biologischer Systeme auf der ps-ns-Zeitskala zu untersuchen. Durch die Verwendung vonD2O- und möglicherweise deuterierten Pufferkomponenten ermöglicht die Methode die Überwachung sowohl der Massenschwerpunktdiffusion als auch der Rückgrat- und Seitenkettenbewegungen (interne Dynamik) von Proteinen im flüssigen Zustand.
Darüber hinaus kann die Dynamik des Hydratationswassers untersucht werden, indem Pulver aus perdeuterierten Proteinen verwendet werden, die mitH2Ohydratisiert sind. In diesem Artikel wird der Arbeitsablauf des Instruments IN16B am Institut Laue-Langevin (ILL) zur Untersuchung der Protein- und Hydratationswasserdynamik vorgestellt. Die Herstellung von Lösungsproben und hydratisierten Proteinpulverproben mittels Dampfaustausch wird erläutert. Das Datenanalyseverfahren sowohl für die Protein- als auch für die Hydratationswasserdynamik wird für verschiedene Arten von Datensätzen (quasielastische Spektren oder Fixed-Window-Scans) beschrieben, die mit einem Neutronenrückstreuspektrometer erhalten werden können.
Die Methode wird anhand von zwei Studien mit Amyloid-Proteinen veranschaulicht. Es wird gezeigt, dass die Aggregation von Lysozym in μm-große sphärische Aggregate - als Partikel bezeichnet - in einem einstufigen Prozess auf dem auf IN16B untersuchten Raum- und Zeitbereich erfolgt, während die interne Dynamik unverändert bleibt. Des Weiteren wurde die Dynamik des Hydratationswassers von Tau an hydratisierten Pulvern aus perdeuteriertem Protein untersucht. Es wird gezeigt, dass Translationsbewegungen von Wasser bei der Bildung von Amyloidfasern aktiviert werden. Abschließend werden kritische Schritte im Protokoll diskutiert, wie die Neutronenstreuung im Hinblick auf die Untersuchung der Dynamik im Vergleich zu anderen experimentellen biophysikalischen Methoden positioniert ist.
Einleitung
Das Neutron ist ein ladungsloses und massereiches Teilchen, das im Laufe der Jahre erfolgreich zur Untersuchung von Proben in verschiedenen Bereichen von der Grundlagenphysik bis zur Biologieeingesetzt wurde 1. Für biologische Anwendungen werden Kleinwinkel-Neutronenstreuung, inelastische Neutronenstreuung sowie Neutronenkristallographie und Reflektometrie häufig eingesetzt 2,3,4. Die inelastische Neutronenstreuung ermöglicht eine ensemblegemittelte Messung der Dynamik, ohne dass eine spezifische Markierung an sich erforderlich ist, und eine Signalqual....
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Protokoll
1. Bereiten Sie den deuterierten Puffer für Proteine im flüssigen Zustand vor
- Alle Bestandteile des Puffers werden in reinemD2Ogelöst.
- Wenn die pH-Elektrode inH2Okalibriert wurde, stellen Sie die pD nach der Formel pD = pH + 0,4 mit NaOD oder DCl34 ein.
HINWEIS: Die Verwendung von D2O anstelle vonH2Okanndie Proteinlöslichkeit beeinträchtigen und die Pufferbedingungen müssen möglicherweise angepasst werden (z. B. durch eine geringfügige Änderung der Salzkonzentration).
2. Bereiten Sie die H2O-hydratisierten Pulve....
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Ergebnisse
Die Aggregation von Lysozym zu partikulären Partikeln erfolgte bei 90 °C mit einer Proteinkonzentration von 50 mg/ml in einem deuterierten Puffer (0,1 M NaCl bei pD 10,5). Die Partikelbildung wird durch den Temperaturanstieg auf 90 °C ausgelöst und erfolgt innerhalb von 6 h (Ergänzungsbild S8). Die Datenerfassung wurde auf IN16B durchgeführt, wie im obigen Protokoll beschrieben (die Daten werden permanent von der Fernleihe kuratiert und sind unter http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811 zugänglich).<.......
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Diskussion
Die Neutronenspektroskopie ist die einzige Methode, die es ermöglicht, die ensemblegemittelte ps-ns-Dynamik von Proteinproben unabhängig von der Größe des Proteins oder der Komplexität der Lösung bei Verwendung der Deuterierung zu untersuchen6. Insbesondere durch die Untersuchung der Selbstdiffusion von Proteinanordnungen in Lösung kann die hydrodynamische Größe solcher Anordnungen eindeutig bestimmt werden. Nichtsdestotrotz ist die Methode in der Regel durch den geringen Neutronenfluss begrenzt, .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren danken Michaela Zamponi vom Jülich Centre for Neutron Science am Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, für einen Teil der Neutronenstreuexperimente, die mit dem Instrument SPHERES durchgeführt wurden. Diese Arbeit profitierte von den Aktivitäten des Konsortiums Deuteration Laboratory (DLAB), das von der Europäischen Union im Rahmen der Verträge HPRI-2001-50065 und RII3-CT-2003-505925 finanziert wurde, sowie von den vom UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) finanzierten Aktivitäten innerhalb des Institut Laue Langevin EMBL DLAB im Rahmen der Zuschüsse GR/R99393/01 und EP/C015452/1. Die Unterstützung durch die Europäische Kommission....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Probenhalter | Nicht im Handel erhältlich. Sie können entweder vom lokalen Ansprechpartner am Gerät bereitgestellt werden oder sie können auf der Grundlage einer technischen Zeichnung hergestellt werden, die vom lokalen Ansprechpartner bereitgestellt werden kann. | ||
| Deuteriumchlorid, 35 Gew.-% in D2O, ≥ 99 Atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
| Deuteriumoxid (D, 99,9 %) | Eurisotop | DLM-4DR-PK | |
| Dow Corning Hochvakuum-Silikonfett | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | |
| Ethanol 96 %, EMSURE Reag. Ph Eur | Sigma-Aldrich | 1.5901 | |
| Glas-Exsikkator | VWR | 75871-660 | |
| Glas-Exsikkatorplatte, 140 mm | VWR | 89038-068 | |
| Indiumdraht, 1,0 mm (0,04 in) Durchmesser, Puratronic, 99,999% | Alfa Aesar | 00470.G1 | |
| Lysozym aus Hühnereiweiß dialysiert, lyophilisiert, Pulver, ~100.000 U/mg | Sigma-Aldrich | 62970 | |
| nPDyn | v3.x | siehe github.com/kpounot/nPDyn, Modellfunktionen für die Anpassung auch in der Software enthalten | |
| OHAUS AX324 Adventurer Waage, interne Kalibrierung | Dutscher | 92641 | |
| Phosphorpentoxid, ReagentPlus, 99% | Sigma-Aldrich | 214701 | |
| Pipette ErgoOne 0,5-10 μ L | Starlab | S7100-0510 | |
| Pipette ErgoOne 100-1.000 μmu; L | Starlab | S7100-1000 | |
| Pipette ErgoOne 20-200 μ L | Starlab | S7100-2200 | |
| Pipettenspitze TipOne 1.000 μ L | Starlab | S1111-6001 | |
| Pipettenspitze TipOne 10 μ L | Starlab | S1111-3200 | |
| Pipettenspitze TipOne 200 μ L | Starlab | S1111-0206 | |
| Natriumdeuteroxidlösung, 40 Gew.-% in D2O, 99,5 Atom-% D | Sigma-Aldrich | 372072 |
Referenzen
- Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
- Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. A....
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Nachdrucke und Genehmigungen
