Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Høyoppløselig nøytronspektroskopi for å studere picosekund-nanosekunddynamikk av proteiner og hydreringsvann

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

Nøytron-tilbakespredningsspektroskopi gir en ikke-destruktiv og etikettfri tilgang til ps-ns-dynamikken til proteiner og deres hydreringsvann. Arbeidsflyten presenteres med to studier på amyloidproteiner: på lysozymets tidsoppløste dynamikk under aggregering og på hydreringsvanndynamikken til tau ved fiberdannelse.

Abstract

Nøytronspredning gir mulighet til å undersøke dynamikken i prøver for et bredt spekter av energier på en ikke-destruktiv måte og uten annen merking enn deuterium. Spesielt registrerer nøytronbackspredningsspektroskopi spredningssignalene ved flere spredningsvinkler samtidig og er godt egnet til å studere dynamikken til biologiske systemer på ps-ns-tidsskalaen. Ved å benytte D2O - og muligens deutererte bufferkomponenter - tillater metoden overvåking av både massesenterdiffusjon og ryggrads- og sidekjedebevegelser (intern dynamikk) av proteiner i flytende tilstand.

I tillegg kan hydreringsvanndynamikk studeres ved å bruke pulver av perdeutererte proteiner hydrert med H2O. Denne artikkelen presenterer arbeidsflyten som brukes på instrumentet IN16B ved Institut Laue-Langevin (ILL) for å undersøke protein- og hydreringsvanndynamikk. Fremstilling av løsningsprøver og hydrerte proteinpulverprøver ved bruk av damputveksling blir forklart. Dataanalyseprosedyren for både protein- og hydreringsvanndynamikk er beskrevet for forskjellige typer datasett (kvasielastiske spektra eller fastvindusskanninger) som kan oppnås på et nøytron-tilbakespredningsspektrometer.

Metoden er illustrert med to studier som involverer amyloidproteiner. Aggregeringen av lysozym i μm størrelse sfæriske aggregater - betegnet partikler - er vist å forekomme i en ett-trinns prosess på rom- og tidsområdet undersøkt på IN16B, mens den interne dynamikken forblir uendret. Videre ble dynamikken i hydreringsvann av tau studert på hydrerte pulver av perdeuterert protein. Det er vist at translasjonsbevegelser av vann aktiveres ved dannelse av amyloidfibre. Til slutt diskuteres kritiske trinn i protokollen om hvordan nøytronspredning er posisjonert med hensyn til studiet av dynamikk i forhold til andre eksperimentelle biofysiske metoder.

Introduction

Nøytronet er en ladningsløs og massiv partikkel som har blitt brukt gjennom årene til å undersøke prøver på ulike felt fra grunnleggende fysikk til biologi1. For biologiske anvendelser er småvinklet nøytronspredning, uelastisk nøytronspredning og nøytronkrystallografi og reflektometri mye brukt 2,3,4. Uelastisk nøytronspredning gir en ensemble-gjennomsnittlig måling av dynamikken uten å kreve spesifikk merking i seg selv, og en signalkvalitet som ikke avhenger av størrelsen eller proteinet5. Målingen kan gjøres ved hjelp av et svært komplekst miljø for proteinet som studeres som etterligner det intracellulære mediet, for eksempel et deuterert bakterielt lysat eller til og med in vivo 3,6,7. Ulike eksperimentelle oppsett kan brukes til å studere dynamikken, nemlig i) time-of-flight-gi tilgang til sub-ps-ps-dynamikk, ii) backscattering-gi tilgang til ps-ns dynamikk, og iii) spin-echo-gi tilgang til dynamikk fra ns til hundrevis av ns. Nøytron-backscattering gjør bruk av Braggs lov 2d sinθ = nλ, hvor d er avstanden mellom plan i en krystall, θ spredningsvinkelen, n spredningsrekkefølgen og λ bølgelengden. Bruken av krystaller for tilbakespredning mot detektorene gjør det mulig å oppnå en høy oppløsning i energi, typisk ~0,8 μeV. For å måle energiutvekslingen brukes enten en Doppler-stasjon som bærer en krystall i tilbakespredning til å definere og justere den innkommende nøytronbølgelengden 8,9,10 (figur 1), eller et flytidsoppsett kan brukes på bekostning av en reduksjon i energioppløsning 11.

Figure 1
Figur 1: Skisse av et nøytron-tilbakespredningsspektrometer med dopplerdrift. Den innkommende strålen treffer faseromtransformasjonen (PST) helikopter42, noe som øker fluksen ved prøveposisjonen. Den blir deretter tilbakespredt mot prøven av Doppler-stasjonen, som velger en energi E1 (cyan pil). Nøytronene blir deretter spredt av prøven (med forskjellige energier representert ved pilens farge) og analysatorene, laget av Si 111-krystaller, vil bare tilbakespre nøytroner med en spesifikk energi E0 (rødfargede piler her). Derfor oppnås momentumoverføringen q fra den oppdagede posisjonen til nøytronet på detektormatrisen, og energioverføringen oppnås fra forskjellen E1- E0. Flytiden som forventes for nøytronpulsen produsert av PST, brukes til å forkaste signalet fra nøytronene spredt direkte mot detektorrørene. Forkortelse: PST = faseromtransformasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For tilbakespredningsspektroskopi kommer hovedbidraget til signalet fra hydrogenprotonrike prøver, slik som proteiner, fra usammenhengende spredning, for hvilken spredningsintensiteten Sinc(q, ω) er vist ved Eq (1)12

Equation 1 (1)

Hvor σinc er det usammenhengende tverrsnittet av elementet som vurderes, er k' normen for den spredte bølgevektoren, k normen for den innkommende bølgevektoren, q (= k - k') momentumoverføringen, r j (t) posisjonsvektoren til atom j på tidspunkt t, og ω frekvensen som tilsvarer energioverføringen mellom det innkommende nøytronet og systemet. Vinkelparentesene angir ensemblegjennomsnittet. Derfor sonderer inkoherent spredning ensemble-gjennomsnittlig enkeltpartikkel selvkorrelasjon av atomposisjoner med tiden og gir selvdynamikken gjennomsnittet over alle atomer i systemet og forskjellige tidsopprinnelser (ensemblegjennomsnitt). Spredningsfunksjonen er Fouriertransformasjonen i tid for den mellomliggende spredningsfunksjonen I (q, t), som kan sees på som Fourier-transformasjonen i rommet til van Hove-korrelasjonsfunksjonen vist ved Eq (2):

Equation 2 (2)

Hvor ρ(r,t) er sannsynlighetstettheten for å finne et atom i posisjon r og tid t 13.

For en Fickian diffusjonsprosess resulterer selvdiffusjonsfunksjonen (se Eq (3)) etter en dobbel Fourier-transformasjon i en spredningsfunksjon bestående av en Lorentzian med linjebredde gitt ved γ = Dq2.

Equation 10 (3)

Mer sofistikerte modeller ble utviklet og funnet nyttige, for eksempel hoppdiffusjonsmodellen av Singwi og Sjölander for ps-ns intern proteindynamikk14 eller rotasjonsmodellen av Sears for hydreringsvann15,16,17.

På nøytronbackscattering-instrumentet (NBS) IN16B8,9 ved ILL, Grenoble, Frankrike (tilleggsfigur S1), består et oppsett som vanligvis brukes med proteiner av Si 111-krystaller for analysatorene med en Doppler-stasjon for innstilling av den innkommende bølgelengden (tilleggsfigur S2A), og gir dermed tilgang til momentumoverføringsområdet ~0,2 Å-1 < q < ~2 Å-1 og energioverføringsområde på -30 μeV < Equation 3 < 30 μeV-tilsvarende tidsskalaer fra noen få ps til noen få ns og avstander på noen få Å. I tillegg tilbyr IN16B muligheten til å utføre elastiske og uelastiske skanninger med faste vinduer (E/IFWS)10, som inkluderer datainnsamling ved en fast energioverføring. Siden fluksen er begrenset ved arbeid med nøytroner, tillater E / IFWS maksimering av fluksen for en energioverføring, og reduserer dermed innsamlingstiden som trengs for å oppnå et tilfredsstillende signal-støyforhold. Et nyere alternativ er backscattering and time-of-flight spectrometer (BATS) modus11, som tillater måling av et bredt spekter av energioverføringer, (f.eks. -150 μeV < < Equation 3 150 μeV), med en høyere fluks enn med Doppler-stasjonen, men på bekostning av en lavere energioppløsning (tilleggsfigur S2B).

En viktig egenskap ved nøytronspredning er at det usammenhengende tverrsnittet σinc har en 40 ganger høyere verdi for hydrogen enn for deuterium og er ubetydelig for andre elementer som ofte finnes i biologiske prøver. Derfor kan dynamikken til proteiner i et flytende miljø studeres ved å bruke en deuterert buffer, og pulvertilstanden tillater studier av enten proteinintern dynamikk med hydrogenert proteinpulver hydrert med D 2 O, eller studiet av hydreringsvann for perdeuterert proteinpulver hydrert med H2O. I flytende tilstand tillater nøytron-backscattering vanligvis samtidig tilgang til massesenteret selvdiffusjon av proteiner (Fickian-type diffusjon) og deres indre dynamikk. Sistnevnte er ryggrads- og sidekjedebevegelser som vanligvis beskrives av den såkalte hoppdiffusjonsmodellen eller andre 3,18. I hydrogenerte proteinpulver er proteindiffusjonen fraværende, og bare intern dynamikk må modelleres. For hydreringsvann presenterer bidragene fra translasjons- og rotasjonsbevegelser av vannmolekyler en annen avhengighet av momentumoverføringen q, noe som gjør det mulig å skille dem i dataanalyseprosessen17.

Dette papiret illustrerer nøytron-backscattering-metoden med studiet av proteiner som ble funnet å kunne utfolde seg, aggregere til en kanonisk form bestående av stabler av β-tråder - det såkalte kryss-β mønsteret19,20 - og danne langstrakte fibre. Dette er den såkalte amyloidaggregeringen, som er grundig studert på grunn av sin sentrale rolle i nevrodegenerative lidelser som Alzheimers eller Parkinsons sykdommer21,22. Studien av amyloidproteinene er også motivert av den funksjonelle rollen de kan spille 23,24 eller deres høye potensial for utvikling av nye biomaterialer25. De fysisk-kjemiske determinantene for amyloidaggregeringen er fortsatt uklare, og ingen generell teori om amyloidaggregering er tilgjengelig, til tross for enorm fremgang de siste årene21,26.

Amyloidaggregering innebærer endringer i proteinstruktur og stabilitet med tiden, hvis studie naturlig innebærer dynamikk, knyttet til proteinkonformasjonsstabilitet, proteinfunksjon og proteinenergilandskap27. Dynamikk er direkte knyttet til stabiliteten til en bestemt tilstand gjennom det entropiske bidraget for de raskeste bevegelsene28, og proteinfunksjonen kan opprettholdes av bevegelser på forskjellige tidsskalaer fra sub-ps for lysfølsomme proteiner29 til ms for domenebevegelser, noe som kan tilrettelegges av picosekund-nanosekunddynamikk30.

To eksempler på bruk av nøytron-tilbakespredningsspektroskopi for å studere amyloidproteiner vil bli presentert, en i flytende tilstand for å studere proteindynamikk og en i hydrert pulvertilstand for å studere hydreringsvanndynamikk. Det første eksemplet gjelder aggregering av lysozym i μm størrelse sfærer (kalt partikler) fulgt i sanntid5, og den andre en sammenligning av vanndynamikk i innfødte og aggregerte tilstander av det humane protein tau31.

Lysozym er et enzym involvert i immunforsvar og består av 129 aminosyrerester. Lysozym kan danne partikler i deuterert buffer ved pD på 10,5 og ved en temperatur på 90 °C. Med nøytronspredning viste vi at tidsutviklingen av lysozymets senter-av-massediffusjonskoeffisient følger den enkle eksponentielle kinetikken til tioflavin T-fluorescens (en fluorescerende sonde som brukes til å overvåke dannelsen av amyloid kryss-β mønstre32), noe som indikerer at dannelsespartikkelformige overbygninger og kryss-β-mønstre forekommer i et enkelt trinn med samme hastighet. Videre forble den interne dynamikken konstant gjennom aggregeringsprosessen, noe som kan forklares enten ved en rask konformasjonsendring som ikke kan observeres på NBS-instrumenter, eller ved fravær av signifikant endring i proteinintern energi ved aggregering.

Det humane proteinet tau er et egenordnet protein (IDP) som består av 441 aminosyrer for den såkalte 2N4R isoformen, som er spesielt involvert i Alzheimers sykdom33. Ved å bruke nøytron-backscattering på pulver av perdeuterert protein tau, viste vi at hydreringsvanndynamikken økes i fibertilstanden, med en høyere populasjon av vannmolekyler som gjennomgår translasjonsbevegelser. Resultatet antyder at en økning i hydreringsvannentropi kan drive amyloidflimmer av tau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered den deutererte bufferen for proteiner i flytende tilstand

  1. Oppløs alle komponentene i bufferen i ren D2O.
  2. Hvis pH-elektroden ble kalibrert i H2O, juster pD i henhold til formelen pD = pH + 0,4 ved bruk av NaOD eller DCl34.
    MERK: Bruk av D 2 Oi stedet for H2O kan påvirke proteinløseligheten og bufferbetingelsene må kanskje tilpasses (f.eks. ved en liten endring i saltkonsentrasjonen).

2. Klargjør H2O-hydrerte pulver av perdeuterert protein

  1. Forbered prøveholderen.
    1. Rengjør en flat aluminiumsprøveholder grundig med indiumtrådtetning og skruer med vann og etanol og la den tørke.
      MERK: En flat prøveholder brukes slik at pulveret kan fordeles homogent over overflaten. Mengden pulver skal være tilstrekkelig slik at det kan opprettholdes mellom veggene og faller ikke når prøveholderen plasseres vertikalt.
    2. Vei de forskjellige delene av prøveholderens bunn, lokk og indiumtråd separat på en presisjonsvekt.
    3. Plasser 1 mm indiumtrådtetning i sporet på den nederste delen av prøveholderen, og la det være en liten overlapping der de to endene går sammen (figur 2A).
    4. Plasser en passende mengde lyofilisert protein (vanligvis ~ 100 mg protein) slik at den fyller den indre overflaten av den nederste delen av prøveholderen.
  2. Hydrater proteinpulveret.
    1. Legg prøveholderen i en tørketrommel med en petriskål inneholdende P2O5 pulver i 24 timer for å tørke proteinpulveret helt35 (figur 2B). Vei den tørre bunndelen av prøveholderen som inneholder indiumforseglingen og det tørre pulveret for å oppnå mtørr.
      FORSIKTIG: P2O5 pulver er veldig etsende.
    2. Fjern P 2 O5 fra tørketrommelen og legg en petriskål med D2O inni. Kontroller massen av pulveret regelmessig for å kontrollere hydratiseringsnivået h = m hyd / m tørr hvor mhyd og mtørr er massen av henholdsvis hydratisert pulver og tørt pulver.
      MERK: For svært hydrofobe proteiner som insulin, kan det være nødvendig å øke temperaturen inne i tørketrommelen for å få et høyere damptrykk og nå ønsket hydreringsnivå h.
    3. Gjenta trinn 2.2.1 og 2.2.2 minst tre ganger for å konvertere alle utskiftbare hydrogener til deuteroner.
      MERK: Alternativt kan sykluser med frysetørking og oppløsning i ren D2O brukes til bedre H/D-utveksling, forutsatt at proteinet ikke påvirkes av det.
    4. Hydrater pulveret til litt over ønsket nivå, la den nederste delen av prøveholderen med indiumtråd og hydratisert pulver forbli på presisjonsbalansen, og vent til massen synker sakte til ønsket verdi for å få målet h (typisk 0,2-0,4 hvis et mellomstort kuleprotein skal dekkes av ett komplett hydreringslag).
    5. Sett lokket raskt på den nederste delen og lukk prøveholderen først med fire skruer for å stoppe damputvekslingen (tilleggsfigur S3A).
    6. Plasser og stram alle gjenværende skruer til det ikke er synlig mellomrom mellom den nederste delen og lokket (tilleggsfigur S3B).
    7. Vei den forseglede prøveholderen for å se etter potensielt hydreringstap via lekkasjer etter nøytroneksperimentet.

3. Utfør det usammenhengende nøytronspredningseksperimentet

  1. Diskuter og dobbeltsjekk konfigurasjonen av instrumentet som trengs for eksperimentet med den lokale kontakten noen uker før den tildelte stråletiden.
  2. Forbered væsketilstandsprøven.
    1. Løs opp proteinet i den deutererte bufferen.
    2. Bestem passende væskevolum som skal settes i prøveholderen ved hjelp av vann (sørg for at det ikke er overløp når prøveholderen er lukket; Figur 2C).
      MERK: Følgende trinn (3.3 og 3.4) beskriver et eksperiment utført på NBS-spektrometeret IN16B ved ILL8,9, ved bruk av en kryoovn som prøvemiljø. Instrumentstyringssystemet vil endres fra det ene instrumentet til det andre, men arbeidsprinsippene forblir de samme.
  3. Sett inn eksemplet.
    1. Tørk prøvestiften grundig (figur 2D), og fjern den eventuelle forrige prøven etter å ha kontrollert at den ioniserende stråledosen er lavere enn 100 μSv/t før du håndterer noe materiale (ved ILL).
    2. Plasser prøven, kontroller riktig sentrering i forhold til strålesenteret (tilleggsfigur S4), og sett prøvepinnen inn i kryoovnen (figur 2D). Slå på vakuumpumpen for å nå mindre enn 10-3 bar, og skyll ut luften inne i kryoovnen ved å gjenta følgende tre ganger: fyll kryoovnen med heliumgass til atmosfærisk trykk er nådd, og fjern gassen igjen ved hjelp av vakuumpumpen.
      MERK: I tilfelle en flat prøveholder, må prøveholderen være orientert i en 45 ° vinkel i forhold til den innkommende strålen. Det nyttige momentoverføringsområdet kan reduseres på grunn av absorpsjon og spredning av cellen. En sterk nøytronabsorber som kadmium kan brukes til å maskere visse deler av prøveholderen (f.eks. skruer, tykke deler).
    3. Innfør noe heliumgass i kryoovnen slik at trykket er ~0,05 bar.
  4. Innhent data (f.eks. ved bruk av NOMAD på IN16B ved ILL, antas det at brukeren foretrekker en temperatur på 200 K før han anskaffer et kvasielastisk nøytronspektrum (QENS) spektrum, deretter E / IFWS under en temperaturrampe til 310 K ved 0,5 K per minutt og til slutt en QENS ved 310 K).
    1. Bruk NOMAD, i utførelsesfanen , dra og slipp en FurnaceCryostat-kontroller i Launch Pad. Sett temperaturen til 200 K. Bruk hurtigmodus og et tidsavbrudd på 30 min slik at temperaturen får tid til å stabilisere seg. Klikk på ikonet for roterende piler for å kjøre det i bakgrunnen slik at data kan hentes under temperaturreduksjonen.
    2. Dra og slipp IN16DopplerSettings-kontrolleren , sett hastighetsprofilen til Nøyaktig hastighet satt av Max ΔE, en verdi på 0,00 μeV og 128 kanaler for å få en EFWS-konfigurasjon.
    3. Dra og slipp en tellekontroller , fyll ut undertekstfeltet med et navn som gjør det enkelt å identifisere dataene, og angi 60 repetisjoner av 30 s-skanninger (tilleggsfigur S5A).
    4. Dra og slipp en IN16DopplerSettings-kontroller , sett hastighetsprofilen til Sine satt etter hastighet med en verdi på 4,5 m / s og 2,048 kanaler for å få en QENS-konfigurasjon.
    5. Dra og slipp en tellekontroller med 4 repetisjoner på 30 minutter skanninger (tilleggsfigur S5B).
    6. For temperaturrampen, dra og slipp en FurnaceCryostat-kontroller , sett temperaturen til 310 K, sett rampe til SetPoint med Δ = 0,05 K og 6 s. Bruk en timeout på 220 min (tilleggsfigur S6A).
    7. Bruk en for-sløyfe med 65 repetisjoner. Sett inn en IN16DopplerSettings-kontroller som i trinn 3.4.2, etterfulgt av en enkelt telling på 30 s. Deretter setter du inn IN16DopplerSettings, som beskrevet tidligere, men ved hjelp av en energiforskyvning på 1,5 μeV og 1,024 kanaler etterfulgt av et enkelt antall på 3 minutter (tilleggsfigur S6B).
    8. For å skaffe deg den siste QENS ved 310 K, dra og slipp IN16DopplerSettings og Count-kontrollere konfigurert som beskrevet i henholdsvis trinn 3.4.4 og 3.4.5.
    9. Trykk på startknappen (høyre trekant nederst i vinduet) for å kjøre skriptet.
      MERK: Hvert eksperiment vil kreve innsamling av kalibreringsdata; det vil si den tomme cellen for subtraksjons- eller absorpsjonskorreksjoner, bufferen alene ved de forskjellige temperaturene som brukes til å modellere bakgrunnen, og en måling av vanadium (eller tilsvarende, prøven ved en temperatur på 10 K eller lavere) for å oppnå instrumentets oppløsningsfunksjon.

4. Dataanalyse - QENS

  1. Importer datasettet ved hjelp av metoden 'IN16B_QENS.process()' i Python-programvaren nPDyn v3.x36
    >>>> fra nPDyn.dataParsers import IN16B_QENS

    >>> utvalg = IN16B_QENS(
    ...
    ... [detGroup=... format>]
    ... ). prosess()

    >>> utvalg = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Utfør datakorrigeringer (valgfritt) med følgende kommandoer (se dokumentasjonen til nPDyn for mer informasjon, figur 3):
    #it antas at data for tomcelle, vanadium og buffer
    # ble importert allerede i datasettet kalt 'empty_cell', 'vanadium',
    # og 'buffer', henholdsvis.

    # for tom celle subtraksjon med en skaleringsfaktor
    # (feil overføres automatisk)
    >>> utvalg = utvalg - 0, 95 * empty_cell

    # for korreksjon ved hjelp av Paalman-Ping-koeffisient
    # (gjensidig utelukkende med eksemplet ovenfor)
    >>> sample = sample.absorptionCorrection(empty_cell)

    # for normalisering
    >>> prøve = prøve.normaliser(vanadium)

    # for binning langs observerbar akse
    # Observerbar er aggregeringstiden her
    >>> utvalg = utvalg.bin(3, akse = 0)
  3. Få plass til kalibreringsdataene. Datasettprøvene, tomcelle, deuterert buffer (om nødvendig) og vanadium kan monteres ved hjelp av innebygde modeller eller en brukerdefinert modell (se nPDyn-dokumentasjon):
    >>> fra nPDyn.models.builtins import (
    ... modellPVoigt,
    ... modellVann,
    ... modellKalibrertD2O,
    ...     )

    # Innebygde modeller bruker en kolonnevektor av momentumet
    # Overfør Q-verdier
    >>> q = vanadium.q[:, Ingen]

    # vanadiumet er utstyrt med en pseudo-Voigt-profil
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. Bruk den innebygde modellen for hydreringsvann kalt 'modelWater'. Denne modellen lyder som vist av Eq (4) 17
    Equation 4 (4)
    Hvor a0, enr og ent er skalarer som står for det relative bidraget fra henholdsvis elastisk signal, rotasjonsbevegelser og translasjonsbevegelser; j1 (qd) er lth orden sfærisk Bessel-funksjon, med q som momentumoverføringen; d O-H-avstanden i vannmolekylet; δ(ω) er Dirac-deltaet, som multipliseres med EISF her; N er den høyeste rekkefølgen av den sfæriske Bessel-funksjonen som brukes (vanligvis ~5); Equation 5 og er henholdsvis Lorentzian rotasjons- og Equation 11 translasjonsbevegelser; b(q) er et flatt bakgrunnsbegrep. De sfæriske Bessel-funksjonene gir det relative bidraget til hver vinkelmomenttilstand til vannmolekylene, og tallet N bestemmes basert på momentumoverføringen q-området. Når det gjelder et typisk NBS-spektrometer, forklarer betingelsene opp til N = 4 nesten helt signalet (tilleggsfigur S7).
    # Her brukes ligning 2 for hydreringsvann
    # Konvolusjon med oppløsningsfunksjon og tillegg av
    # D2O bakgrunnen gjøres automatisk med
    # Ga argumenter
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=vanadium,
    ... bkgd=buffer,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    MERK: Bidragene fra rotasjons- og translasjonsbevegelser bør være innviklede for å være helt strenge. Suksessen til en additiv modell skal tilskrives tilstedeværelsen av forskjellige populasjoner av vann på proteinoverflaten og det begrensede energiområdet som er tilgjengelig.
  5. Bruk følgende til å tegne inn dataene (figur 4):
    >>> fra importplottet nPDyn.plot
    >>> plott (utvalg)

5. Dataanalyse - temperaturrampe, elastiske fastvindusskanninger (EFWS)

  1. Bruk en prosedyre som ligner på avsnitt 4 for å normalisere temperaturrampedataene ved signalet ved laveste temperatur (vanligvis 10 K):
    >>> fra nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS

    >>> utvalg = IN16B_FWS(
    ... ,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ). prosess()

    # normalisering med de 5 første punktene på den observerbare
    # akse, som tilsvarer temperaturen
    >>> utvalg /= utvalg[:5].gjennomsnitt(0)

    # Momentumoverføringen Q-området som brukes her er mindre
    # som modellen som brukes er gyldig for lav q bare
    >>> utvalg = sample.get_q_range(0,2; 0,8)
  2. Bruk en enkel gaussisk modell for å starte, hvis bredde er gitt ved den såkalte gjennomsnittlige kvadrerte forskyvningen (MSD). Bygg og tilpass modellen ved hjelp av følgende kommandoer:
    >>> importere numpy som np
    >>> fra nPDyn.models importere parametere, modell, komponent

    # A er en skaleringsfaktor
    >>> params = Parametere(
    ... a={'verdi': 1, 'grenser': (0, np.inf)},
    ... msd={'verdi': 1, 'grenser': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> modell = modell(paramer)
    >>> model.addComponent(
    ... 'gaussisk',
    ... lambda x, a, msd: a * np.exp (-x ** 2 * msd / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(modell, x=sample.q[:, Ingen])

    >>> plott (utvalg)
    MERK: Den gaussiske tilnærmingen holder alltid for q2MSD << 1, men bredere momentoverføringsområde kan brukes til relativ sammenligning mellom prøver. Mer sofistikerte modeller, som går utover den gaussiske tilnærmingen, har blitt utviklet37,38,39.

6. Dataanalyse - elastiske og uelastiske skanninger med faste vinduer (E / IFWS)

  1. I likhet med trinn 4 importerer du datasettet, men bruker IN16B_FWS-klassen:
    >>> fra nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS

    >>> utvalg = IN16B_FWS(
    ...
    ... [detGroup=]
    ... ). prosess()

    >>> utvalg = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Få plass til kalibreringsdataene og eksempeldataene.
    1. Analysere E/IFWS-data ved hjelp av en generalisert MSD40 eller ved å betrakte dem som grov-QENS-spektre (som bare har noen få datapunkter på energiaksen). Når E/IFWS betraktes som grov-QENS, brukes modeller som brukes til QENS for å passe hele E/IFWS-datasettet samtidig (global tilpasning av energioverføringer og momentumoverføringer).
      MERK: Sistnevnte løsningsmodeller for QENS på E/IFWS-data brukes her hvor momentumoverføringsavhengigheten av massesenterdiffusjon og proteinintern dynamikk pålegges.
    2. Modellere proteindynamikk i væsker ved å bruke følgende Eq (5) ('modelProteinJumpDiff' i nPDyn):
      Equation 6 (5)
      Hvor R(q,ω) er oppløsningsfunksjonen; β en skalar uavhengig for hver momentumoverføring q; en0 er den elastiske inkoherente strukturfaktoren (EISF); Equation 7 en Lorentzian som regner med massespredning med en bredde gitt ved Eq (6); Equation 12 er en Lorentzian som inkluderer massediffusjonssenter og et bidrag etter hoppdiffusjonsmodellen14 som regner med intern dynamikk (Eq (7); Equation 8 er det monterte signalet fra D2O reskalert av volumfraksjonen i prøven.
      γ = Dsq2 (6)
      Ds er selvdiffusjonskoeffisienten.
      Equation 9 (7)
      Di er den tilsynelatende diffusjonskoeffisienten for intern dynamikk og τ en avslapningstid for diffusive bevegelser.
      >>> fra nPDyn.models.builtins import (
      ... modellPVoigt,
      ... modellProteinJumpDiff,
      ... modellKalibrertD2O,
      ... )

      # Innebygde modeller bruker en kolonnevektor av momentumet
      # Overfør Q-verdier
      >>> q = vanadium.q[:, Ingen]

      # vanadiumet er utstyrt med en pseudo-Voigt-profil
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # for ren D2O, en modell med kalibrert linjebredde
      # for forskjellige temperaturer er inkludert i nPDyn
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # Her brukes ligning 3 for væskeprøver
      # Konvolusjon med oppløsningsfunksjon og tillegg av
      # D2O bakgrunnen gjøres automatisk med # gitt argumenter
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=vanadium,
      ... bkgd=buffer,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. Plott de tilpassede dataene ved hjelp av:
    >>> fra importplottet nPDyn.plot
    >>> plott (utvalg)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aggregering av lysozym til partikler ble utført ved 90 °C med en proteinkonsentrasjon på 50 mg/ml i en deuterert buffer (0,1 M NaCl ved pD 10,5). Dannelsen av partikler utløses av temperaturøkningen til 90 °C og skjer innen 6 timer (tilleggsfigur S8). Datainnsamlingen ble utført på IN16B, som beskrevet i protokollen ovenfor (dataene er permanent kuratert av ILL og tilgjengelig på http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

Et QENS-spektrum ble ervervet ved 7 °C for å karakterisere den opprinnelige tilstanden fullt ut. Deretter ble temperaturen økt til 90 °C (tar vanligvis ~30 min på IN16B, tilleggsfigur S9) for å utløse aggregeringsprosessen. Kinetikken kan følges ved hjelp av et glidende gjennomsnitt av QENS-spektra, noe som gir tilgang til hele spekteret av energioverføring, men med begrenset oppløsning i tide. Tidsoppløsningen kan forbedres til ~1 min ved bruk av EFWS og til ~20 min ved bruk av E/IFWS ved fire energioverføringsverdier5.

I eksemplet som ble presentert, utforsket vi energioverføringer på 0, 0,6, 1,5 og 3 μeV. E/IFWS-skanningene samles inn kontinuerlig under aggregeringsprosessen, og et QENS-spektrum ble samlet inn for den endelige tilstanden ved 90 °C. E/IFWS-dataene ble korrigert for absorpsjon ved bruk av E/IFWS i tomcellen og normalisert ved hjelp av vanadiumdata.

For lysozymet E/IFWS observerer vi en økning av signalet i tid ved lav momentumoverføring og lav energioverføring, mens signalet ved høy energioverføring og lav momentumoverføring avtar (tilleggsfigur 10). Denne kvalitative observasjonen indikerer dannelsen av større objekter, diffunderer langsommere og bekrefter at aggregeringsprosessen fant sted. Analysen, ifølge Eq (4), resulterer i en initiell senter-av-massediffusjonskoeffisient på 15 Å2/ns, i samsvar med tilstedeværelsen av små proteinklynger (støttet av dynamisk lysspredning og HYDROPRO-beregninger 5,41), som deretter reduseres eksponentielt over tid (figur 5). Den tilsynelatende diffusjonskoeffisienten for intern dynamikk forblir konstant gjennom hele aggregeringsprosessen. Derfor synes dannelsen av lysozympartikler å forekomme i en enkelt aggregeringsfase. Fraværet av endring i intern proteindynamikk antyder at enten konverteringen til kryss-β og den mulige tilknyttede endringen i energi er for rask, eller at andre drivende effekter, for eksempel en økning i løsningsmiddelentropi, kan være fullt dominerende innenfor energiområdet som er undersøkt.

Studien av hydreringsvanndynamikk rundt monomerer og fibre av tau ble utført på SPHERES ved Maier-Leibnitz Zentrum (MLZ) i Garching, Tyskland, ved bruk av protokollen beskrevet ovenfor for pulverprøver. Omtrent 100 mg deuterert tauproteinpulver, hydrert til 0,4 gH2O/g protein, ble brukt. EFWS ble samlet inn under en temperaturrampe og QENS-spektra ved konstant temperatur. EFWS ble registrert fra 20 K og økte temperaturen til 300 K med en hastighet på 0,2 K/min mens den kontinuerlig samlet inn data i løpet av 5 minutters skanninger.

QENS-spektrene ble registrert ved 20 og 280 K. EFWS-dataene ble montert ved hjelp av en enkel gaussisk over momentumoverføringen q-området 0,2 Å-1 < q < 0,8 Å-1 for å trekke ut MSD (tilleggsfigur S11A). MSD-verdiene er over gyldighetsgrensen for den gaussiske modellen. Derfor anbefales det i dette tilfellet å utforske andre modeller utover den gaussiske tilnærmingen37,38,39. Ved temperaturer høyere enn 220 K er hydratiseringsvannet rundt fibrene av tau betydelig mer mobilt enn hydreringsvann rundt tau-monomerer (figur 6). Montering av QENS-data gjør det mulig for brukere å oppnå linjebredde og relative bidrag fra elastiske, roterende og translasjonsbevegelser av hydreringsvann i prøven (tilleggsfigur S11B). Det ser ut til at fraksjonen av vannmolekyler som gjennomgår translasjonsbevegelse økes rundt fibre, og både translasjons- og rotasjonsdiffusjonskoeffisienter av vannmolekyler økes rundt fibre17,31. I motsetning til dette endret ikke ps-ns indre dynamikk av proteinet tau, som reflekterer ryggrads- og sidekjedebevegelser, ved flimmer.

Figure 2
Figur 2: Bunnen av en flat aluminiumsprøveholder. (A) Den flate aluminiumsprøveholderen presenterer en sentral del utsatt for nøytronene der proteinpulveret opprettholdes i et lite gap - typisk ~ 0,3 mm - mellom basen og lokket. En indiumtråd kan brukes til tetting da den motstår temperaturøkninger opp til 90 °C. Ved høyere temperaturer kan en teflonforsegling brukes. (B) Proteinpulveret plasseres i bunnen av prøveholderen med indiumtråden på plass. Prøveholderen plasseres i tørketrommel i nærvær av enten P 2 O5 for tørking eller H 2 O / D2Ofor hydrering. Vakuumfett tilsettes for å unngå lekkasje mellom bunnen og lokket på tørkeren. Vakuum kan brukes med forsiktighet for å akselerere tørkeprosessen. Oppvarming av bunnen av tørketrommelen kan være nødvendig for svært hydrofobe prøver. (C) Proteinoppløsningen er plassert mellom indre og ytre sylindere. Pass på at du ikke pipetterer for mye væske (det skal ikke være overløp når prøveholderen er lukket). Indiumtråden er plassert i den sirkulære sporet. (D) Prøvestiften (i bakgrunnen) gir kontroll over prøvens høyde og retning og kan inkludere forskjellige kontrollere og detektorer for prøvemiljøer (temperatur, trykk). Prøvepinnen settes inn fra toppen av kryoovnen (foran), som gir kontroll over temperaturen under forsøket. Under forsøket treffer nøytronstrålen vanligvis bunnen av kryoovnen, som indikert av det hvite rektangelet (størrelsen på strålen avhenger av instrumentkonfigurasjonen). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Datakorreksjoner og normalisering kan forbedre tilpasningen. Dataene ble importert ved hjelp av nPDyn, som beskrevet i protokollen. Venstre ble datasettet normalisert bare ved hjelp av dataene på skjermen. Til høyre ble signalet fra den tomme boksen brukt sammen med Paalman-Ping-koeffisientene43 for å korrigere for nøytronabsorpsjon fra prøveholderen. Deretter ble den monterte modellen for vanadiumsignalet integrert uavhengig for hver momentumoverføring q, og resultatet ble brukt til å normalisere prøvedatasettet. I begge plottene betegner S(q,ω) spredningssignalet, q er momentumoverføringen, og Equation 3 er energioverføringen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Plottevindu generert av nPDyn som viser resultatet av tilpasningen. QENS-dataene ble montert ved hjelp av nPDyn, som beskrevet i protokollen. Plottevinduet lar brukerne plotte dataene langs forskjellige akser - observerbar (tid, temperatur eller trykk), momentumoverføring q eller energioverføring - og velgere er tilgjengelige for å navigere langs de andre aksene. Ulike typer tomter er tilgjengelige, med den enkle 'Plot' presentert i (A) og 'Analyse - q-wise' i (B). 'Plot'-knappen viser de forskjellige datasettene i separate delplott, 'Sammenlign'-knappen viser datasettene i samme plott, '3D-plottet' viser datasettene i forskjellige 3D-underplott som ligner på s, 'Analyse - q-wise'-knappen viser de tilpassede parametrene som funksjonen til momentumoverføring q og 'Analyse - observerbar-klok' viser de tilpassede parametrene som funksjonen til observerbar (tid, temperatur eller trykk). Forkortelse: QENS = kvasielastisk nøytronspredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Lysozymaggregering skjer i en ett-trinns prosess med konstant intern dynamikk. Lysozymet ble oppløst i aggregeringsbufferen (beskrevet andre steder5), og E/IFWS ble ervervet under aggregeringen, som ble utløst ved å øke temperaturen til 90 °C. Etter absorpsjonskorreksjon med tom celle og normalisering ved bruk av vanadiumsignalet ble dataene analysert ved hjelp av hoppdiffusjonsmodellen som beskrevet i protokollen. Den monterte massesenter-selvdiffusjonskoeffisienten er plottet som en funksjon av tid (blå trekanter) sammen med den tilsynelatende diffusjonskoeffisienten for intern dynamikk (oransje firkanter). Dette tallet er fra 5. Forkortelse: E/IFWS = elastiske og uelastiske skanninger med faste vinduer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Hydreringsvanndynamikk økes rundt tau-fibre. H2O-hydrerte pulver av deutererte taufibre og monomerer ble forseglet i en flat aluminiumsprøveholder, og EFWS-data ble samlet inn under en temperaturrampe fra 20 til 300 K. Etter absorpsjonskorreksjon med tom celle og normalisering ved bruk av vanadiumsignalet ble dataene analysert ved hjelp av hoppdiffusjonsmodellen som beskrevet i protokollen. Dette bildet ble tegnet på nytt med et mindre q-område (0,2 < q < 0,8 Å-1) fra data fra 31. Forkortelse: EFWS = elastiske skanninger med fast vindu. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur S1: Fotografier av instrumentet IN16B ved ILL. (øverst) Instrumentet IN16B sett fra den strålingskontrollerte sonen dedikert til instrumentet. Den innkommende strålen beveger seg innenfor nøytronføringen til vakuumkammeret, som inneholder de fleste elementene i instrumentet (PST-helikopter, analysatorer, prøve, detektorer). (nederst) Innsiden av vakuumkammeret. PST-helikopteret er synlig, det samme er analysatorene som omgir kryoovnen som inneholder prøven. Detektorene er plassert bak kryoovnen. Gjengitt med tillatelse fra Laurent Thion, ecliptique. Forkortelse: PST = faseromtransformasjon. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S2: Skisse av IN16B i klassisk (med Doppler-stasjon) og BATS-modus. (A) Nøytronstrålen er delvis monokromatisert av hastighetsvelgeren. Deretter vil bakgrunnen og PST-hakkerne produsere en nøytronpuls, hvorfra en energiprofil vil bli valgt av Doppler-monokromatatoren (E / IFWS eller QENS-modus). Nøytronene spres deretter av prøven, og en enkelt energi reflekteres mot detektorene av analysatorene. Gjengitt med tillatelse fra ILL. (B) BATS-hakkerne brukes til å definere en enkelt nøytronpuls med et definert energiområde. Nøytronstrålen er delvis monokromatisert av hastighetsvelgeren. Deretter vil bakgrunnshakkeren fjerne uønskede nøytroner som ikke tilhører den valgte pulsen. Nøytronene spres deretter av prøven, og en enkelt energi reflekteres mot detektorene av analysatorene. Gjengitt med tillatelse fra ILL. Forkortelser: BATS = backscattering og time-of-flight spektrometer; PST = faseromtransformasjon; E/IFWS = elastiske og uelastiske skanninger med faste vinduer; QENS = kvasielastisk nøytronspredning; PG = pyrolytisk grafitt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S3: Prøveholderen lukkes raskt etter at pulveret har nådd ønsket hydrering og forsegles. (A) Den flate prøveholderen lukkes raskt med fire skruer. Et lite gap vil forbli på grunn av indiumtråden. De andre skruene tilsettes deretter, og prøveholderen forsegles sakte ved å stramme hver skrue forsiktig flere ganger for å la indiumet slappe av. (B) Den flate prøveholderen er forsvarlig forseglet når det ikke lenger er synlig mellomrom mellom holderbunnen og lokket. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S4: Prøveholderen er sentrert i forhold til nøytronstrålen. En sylindrisk prøveholder er plassert på prøvepinnen. Posisjonen til prøveholderen kontrolleres slik at strålen treffer den nederste delen av holderen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S5: Oppkjøp av EFWS etterfulgt av QENS på IN16B med NOMAD. (A) De relevante kontrollerne dras og slippes inn i Launch Pad som forklart i protokollen (trinn 3.4.1 til 3.4.3). Det kan være nødvendig å klikke på låsen (grønt ikon øverst til høyre - vertikal rute) for å få kontroll over grensesnittet. (B) De relevante kontrollerne dras og slippes inn i Launch Pad som forklart i protokollen (trinn 3.4.4 til 3.4.5). Her heter de to siste kontrollerne IN16DopplerSettings og Count. Forkortelser: QENS = kvasielastisk nøytronspredning, EFWS = elastiske fastvindusskanninger. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S6: Sette opp en temperaturrampe og E / IFWS på IN16B med NOMAD. (A) FurnaceCryostat-kontrolleren legges til i Launch Pad og konfigureres som forklart i protokollen (trinn 3.4.6). (B) For loop-kontrolleren legges til i Launch Pad og relevante kontrollere settes inn i den og konfigureres som forklart i protokollen (trinn 3.4.7). Forkortelse: E/IFWS = elastiske og uelastiske skanninger med faste vinduer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S7: De fem første sfæriske Bessel-funksjonene forklarer det meste av rotasjonsbidraget til hydreringsvann. De første åtte sfæriske Bessel-funksjonene er plottet ved hjelp av en verdi d = 0,98 Å og verdier av momentumoverføring q fra 0 til 3 Å (ensfargede linjer). Momentumoverføringsområdet på 0,3 Å < q < 1,8 Å er avgrenset av de blå stiplede linjene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S8: Lysozym danner reproduserbare partikler. Lysozym ble oppløst i aggregeringsbufferen (fremstilt som beskrevet i protokollen, trinn 1), og ThT ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 2 μM for å overvåke dannelsen av kryss-β struktur ved hjelp av fluorescens. Plottet representerer gjennomsnittet av tre uavhengige målinger, og feilfeltene er standardavviket. Innfellingen viser et fluorescensmikroskopifotografi av partiklene dannet etter 6 timers aggregering. Skala bar = 20 μm. Dette tallet er fra 5. Forkortelse: ThT = thioflavin T. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S9: Rask temperaturrampe som tilgjengelig på IN16B. I hurtigmodus på IN16B kan temperaturen økes fra 280 K til 363 K på ca. 30 minutter. Dette tallet er fra 5. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S10: E/IFWS-data om lysozym ved aggregering til partikler. Lysozymet ble oppløst i aggregeringsbufferen (beskrevet andre steder5), og E/IFWS ble ervervet under aggregeringen, som ble utløst ved å øke temperaturen til 90 °C. Data-etter absorpsjonskorreksjon med en tom celle og normalisering ved hjelp av signalet fra vanadium-er plottet mot momentumoverføring q og tid for den forskjellige energioverføringen målt, 0 μeV (øverst til venstre), 0,6 μeV (øverst til høyre), 1,5 μeV (nederst til venstre) og 3 μeV (nederst til høyre). For hvert delplott tilsvarer den vertikale aksen spredningssignalet S(q, ΔE), plottet mot eksperimentell tid i timer og momentumoverføringen q. Dette tallet er fra 5. Forkortelse: E/IFWS = elastiske og uelastiske skanninger med faste vinduer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S11: Montering av hydreringsvanndata for tau. (A) Tilpasning av EFWS-dataene ved hjelp av en gaussisk. H2O-hydrert pulver av deutererte tau-monomerer ble forseglet i en flat aluminiumsprøveholder, og EFWS ble anskaffet under en temperaturrampe fra 20 til 300 K. De eksperimentelle dataene (elastisk signal S(q, 0) på vertikal akseblå linje med feilfelt) er plottet for momentumoverføringen q-området 0,2 < q < 0,6 Å-1 sammen med den monterte gaussiske som brukes til å trekke ut MSD. (B) Translasjons- og rotasjonsbevegelser av hydratiseringsvann oppnådd fra QENS-tilpasning. H2O-hydrerte pulver av deutererte taufibre (venstre) og monomerer (høyre) ble forseglet i en flat aluminiumprøveholder, og QENS-data ble anskaffet ved 280 K. De eksperimentelle dataene (intensitet S (q, ω) som funksjon av energioverføring) for fibre (blå trekanter) og monomerer (grønne prikker) er plottet sammen med den monterte modellen (svart solid linje) og dens komponenter, bakgrunn (blå), oppløsningsfunksjon (grønn), rotasjoner (rød) og oversettelser (cyan) for momentumoverføringen q = 0,783 Å-1. Dette tallet er fra 31. Forkortelser: QENS = kvasielastisk nøytronspredning, EFWS = elastiske fastvindusskanninger; MSD = gjennomsnittlig kvadrert forskyvning. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nøytronspektroskopi er den eneste metoden som gjør det mulig å undersøke ensemble-gjennomsnittlig ps-ns-dynamikk av proteinprøver uavhengig av størrelsen på proteinet eller kompleksiteten til løsningen når deuterasjon brukes6. Spesielt, ved å undersøke selvdiffusjon av proteinsammensetninger i løsning, kan den hydrodynamiske størrelsen på slike samlinger entydig bestemmes. Likevel er metoden vanligvis begrenset av den lave nøytronfluksen, noe som innebærer lange innsamlingstider og kravet om høye mengder prøve (typisk 100 mg protein) for å oppnå et godt signal-støyforhold innenfor den tildelte stråletiden.

Prøvepreparering (protokolltrinn 1 og 2). For væsketilstandsprøver er minimumskonsentrasjonen som kan brukes ~ 50 mg / ml (lavere konsentrasjoner kan brukes på bekostning av utvidede innsamlingstider). Høy proteinkonsentrasjon er assosiert med raskere fibrilleringshastigheter, noe som hjelper med å tilpasse målingen i den tildelte stråletiden, men kan påvirke aggregeringsveien for44. Derfor er grundig prøvekarakterisering med komplementære metoder, som atomkraft eller elektronmikroskopi, nødvendig.

Materialet til prøveholderen er også et punkt som skal tas opp ved fremstilling av prøvene, da aluminiumslegeringer er utsatt for korrosjon45. En typisk aluminiumslegering som gir god motstand mot korrosjon og har lav nøytronabsorbans er den europeiske normen (EN) AW-6060 [AlMgSi] laget av 98% -98,75% Al, 0,1% Ti, 0,15% Zn, 0,05% Cr, 0,35% -0,6% Mg, 0,1% Mn, 0,1% Cu, 0,1% -0,3% Fe og 0,3% -0,6% Si. Korrosjon kan minimeres for eksempel ved å redusere tiden i prøveholderen eller bruke et beskyttende belegg (som kan legge til bakgrunnssignalet) som nikkel eller gull.

For pulverprøver av hydrogenerte proteiner ble frysetørkingsprosedyren vist å være effektivt fullført med et trinn i en tørker i nærvær av P2O5 pulver for å fjerne så mye gjenværende lett vann som mulig35. For pulverprøver anbefales det også å karakterisere (ved bruk av atomkraftmikroskopi og røntgenpulverdiffraksjon) pulveret i sin endelige, hydrerte tilstand og vurdere effekten av deuterasjon, frysetørking og dampdiffusjon på både monomer og fibertilstander. Spesielt kan frysetørking bryte fibrene, noe som resulterer i forkortede segmenter uten å påvirke morfologien. Videre har det blitt observert ved røntgenkraftdiffraksjon at langsom avkjøling, i stedet for flashkjøling i flytende nitrogen, kan indusere tilstedeværelsen av amyloidlignende strukturer (upublisert resultat).

Datainnsamling (protokoll trinn 3). Det anbefales å planlegge datainnsamlingen med den lokale kontakten før eksperimentet (selv om det har blitt diskutert under forslagsskrivingsprosessen). Datainnsamlingsplanen kan endres etter de første skanningene, avhengig av signal-støy-forholdet som er oppnådd. Spesielt for tidsoppløste eksperimenter gir bruk av E/IFWS mulighet for rask datainnsamling – 30 s til 1 min for den elastiske linjen, 4–5 minutter for et datapunkt ved 3 μeV5 – men utvalget av tilgjengelige energioverføringer er iboende begrenset. Alternativt kan et glidende gjennomsnitt av QENS-data brukes46. For dette formål tilbyr det nye alternativet for tilbakespredning og flyspektroskopi (BATS) på IN16B en høyere fluks enn den klassiske IN16B med en energirekke på ±150 μeV (eller høyere avhengig av konfigurasjonen som brukes) på bekostning av lavere oppløsning i energi11. Derfor anbefales BATS-alternativet for tidsløste studier, spesielt for prosesser som amyloidaggregering, som foregår over flere timer.

Dataanalyse (protokolltrinn 4, 5 og 6). Spredningsfunksjonen S(q,ω) inkluderer alle typer bevegelser i prøven, og modellene beskrevet i protokollen ovenfor er tilnærminger. Spesielt for IDP i flytende tilstand kan de store bevegelsene i den uordnede kjeden forekomme over samme lengde og tidsskala som massediffusjonen av hele proteinet. Derfor bør brukeren huske på at separasjonen av massespredning og proteinintern dynamikk ikke alltid er grei. Tilpasningsprosedyren kan dra nytte av informasjon om massesenterdiffusjon oppnådd via komplementære metoder, slik at denne parameteren kan fikses (husk at andre metoder kan gi en kollektiv diffusjonskoeffisient assosiert med forskjellige tids- og lengdeskalaer) for å oppnå et mer robust resultat for intern dynamikk.

I tillegg til nøytronspredning kan dynamikken i et molekylært system karakteriseres ved kjernemagnetisk resonans (NMR), som gir lokal informasjon om isotopmerkede proteiner og på et bredt spekter av tidsskalaer47,48,49. Metoden har blitt brukt med hell for å studere amyloidsystemer 48,50,51,52,53, men tillater ikke brukere å bare studere hydreringsvann eller følge amyloidaggregeringsprosessen i sanntid på grunn av den iboende begrensningen på proteinstørrelsen. Nylige utviklinger innen elektronparamagnetisk resonansspektroskopi (EPR) og EPR-avledet metode Overhauser dynamisk kjernepolarisering (ODNP) gir et godt perspektiv når det kombineres med nøytronspredning. Faktisk, selv om stedsrettet spinnmerking (SDSL), EPR og ODNP kan undersøke henholdsvis protein54 og hydreringsdynamikk55 på ps-ns-tidsskalaen rundt den introduserte spinnetiketten.

Disse metodene ble brukt til å studere aggregeringen av tau56,57-proteinet og vil gi stor komplementaritet med nøytronspredning som kan oppnå lignende informasjon, men gjennomsnittet over hele prøven. Videre kan infrarød spektroskopi gi dynamisk informasjon for høyenergibevegelser assosiert med spesifikke strukturelle mønstre, men kompleksiteten i proteinmiljøet (buffer brukt) kan påvirke datatolkning58,59. Nøytron-backscattering-teknikkene gir et unikt og komplementært syn på protein- og hydreringsvanndynamikk på ps-ns-tidsskalaen sammen med resultater fra de nevnte metodene. De krever ikke spesifikk merking av prøven, signalkvaliteten er ikke følsom for proteinets størrelse, og målinger kan gjøres in vivo eller i svært komplekse, deutererte miljøer som deuterert bakteriell lysat 3,6,7. Siden denne metoden gir et ensemble-gjennomsnittlig resultat, kompletteres det godt med molekyldynamikksimuleringer for å oppnå atomdetaljerinformasjon om systemet som studeres. Simuleringene kan enkelt valideres ved en direkte sammenligning mellom det eksperimentelle datasettet og de teoretiske QENS-spektrene beregnet fra simuleringsbanen ved hjelp av programvare som mdanse60.

Når det gjelder amyloidsystemer, har nøytron-backscattering vist seg nyttig for å karakterisere ps-ns protein og vanndynamikk for ulike systemer og forhold 5,31,61,62,63,64. Spesielt ble nøytron-backscattering brukt til å avsløre korrelasjonen mellom andelen av proteinsekvensen involvert i kryss-β-strukturen og amplituden av vannentropigevinsten ved fibrillering (upubliserte resultater). Videre tillater utvikling av prøvemiljøer samtidig innsamling av nøytronspektra og enten dielektriske relaksasjonsdata65 eller Raman-spredningsdata66. Videre er diffraksjonsdetektorer tilstede på IN16B for å oppnå strukturelle data sammen med dynamiske data. I tillegg forventes den innkommende nøytronfluksen å bli forbedret for BATS-modusen til IN16B i nær fremtid, takket være bruken av den såkalte variable fokuseringsguiden, hvis geometri kan tilpasses på forespørsel til instrumentoppsettet som brukes. Å skyve utviklingen av sofistikert prøvemiljø og instrumentering videre vil tillate enda mer komplekse eksperimenter i fremtiden, muligens levere ytterligere dynamisk og strukturell informasjon samtidig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige for Michaela Zamponi ved Jülich Centre for Neutron Science ved Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Tyskland, for en del av nøytronspredningseksperimentene som ble utført på instrumentet SPHERES. Dette arbeidet har dratt nytte av aktivitetene til Deuteration Laboratory (DLAB) konsortiet finansiert av EU under kontraktene HPRI-2001-50065 og RII3-CT-2003-505925, og fra UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) -finansiert aktivitet innenfor Institut Laue Langevin EMBL DLAB under Grants GR / R99393/01 og EP / C015452 / 1. Støtte fra EU-kommisjonen under det 7. rammeprogrammet gjennom Key Action: Strengthening the European Research Area, Research Infrastructures er anerkjent [Contract 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot og Christian Beck takker det føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF, stipendnummer 05K19VTB) for finansiering av deres postdoktorale stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
  2. Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. Acta Crystallographica Section D. 74 (8), 715-726 (2018).
  3. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7 (2019).
  4. Martel, A., et al. Membrane permeation versus amyloidogenicity: A multitechnique study of islet amyloid polypeptide interaction with model membranes. Journal of the American Chemical Society. 139 (1), 137-148 (2017).
  5. Pounot, K., et al. Tracking internal and global diffusive dynamics during protein aggregation by high-resolution neutron spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (15), 6299-6304 (2020).
  6. Grimaldo, M., et al. Protein short-time diffusion in a naturally crowded environment. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (8), 1709-1715 (2019).
  7. Jasnin, M., Stadler, A., Tehei, M., Zaccai, G. Specific cellular water dynamics observed in vivo by neutron scattering and NMR. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10154-10160 (2010).
  8. Frick, B. The neutron backscattering spectrometer IN16 at ILL-high energy resolution with high intensity and excellent signal-to-noise ratio. Neutron News. 13 (2), 15-22 (2002).
  9. Frick, B., Mamontov, E., van Eijck, L., Seydel, T. Recent backscattering instrument developments at the ILL and SNS. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 224 (1-2), 33-60 (2010).
  10. Frick, B., Combet, J., van Eijck, L. New possibilities with inelastic fixed window scans and linear motor Doppler drives on high resolution neutron backscattering spectrometers. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 669, 7-13 (2012).
  11. Appel, M., Frick, B., Magerl, A. A flexible high speed pulse chopper system for an inverted neutron time-of-flight option on backscattering spectrometers. Scientific Reports. 8 (1), 13580 (2018).
  12. Squires, G. L. Introduction to the theory of thermal neutron scattering. , Dover Publications. Mineola N.Y. (1996).
  13. Bee, M. Quasielastic neutron scattering. , Available from: http://inis.iaea.org/Search/search.aspx?orig_q=RN:20038756 (1988).
  14. Singwi, K. S., Sjölander, A. Diffusive motions in water and cold neutron scattering. Physical Review. 119 (3), 863-871 (1960).
  15. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear diatomic liquids: i. free rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1279-1297 (1966).
  16. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear liquid: ii. hindered rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1299-1311 (1966).
  17. Schirò, G., et al. Translational diffusion of hydration water correlates with functional motions in folded and intrinsically disordered proteins. Nature Communications. 6, 6490 (2015).
  18. Grimaldo, M., et al. Hierarchical molecular dynamics of bovine serum albumin in concentrated aqueous solution below and above thermal denaturation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (6), 4645-4655 (2015).
  19. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 16 (11), 673-677 (1968).
  20. Bonar, L., Cohen, A. S., Skinner, M. M. Characterization of the Amyloid Fibril as a Cross-β Protein. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 131 (4), 1373-1375 (1969).
  21. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  22. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  23. Maji, S. K., et al. Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science. 325 (5938), 328-332 (2009).
  24. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  25. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. 28 (31), 6546-6561 (2016).
  26. Stephens, A. D., Kaminski Schierle, G. S. The role of water in amyloid aggregation kinetics. Current Opinion in Structural Biology. 58, 115-123 (2019).
  27. Adamcik, J., Mezzenga, R. Amyloid polymorphism in the protein folding and aggregation energy landscape. Angewandte Chemie International Edition. 57 (28), 8370-8382 (2018).
  28. Liu, Z., et al. Entropic contribution to enhanced thermal stability in the thermostable P450 CYP119. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10049-10058 (2018).
  29. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2018).
  30. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
  31. Fichou, Y., et al. Hydration water mobility is enhanced around tau amyloid fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), 6365-6370 (2015).
  32. Burns, J., Pennock, C. A., Stoward, P. J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. The Journal of Pathology and Bacteriology. 94 (2), 337-344 (1967).
  33. Iqbal, K., Liu, F., Gong, C. -X., Grundke-Iqbal, I. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies. Current Alzheimer Research. 7 (8), 656-664 (2010).
  34. Krȩżel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  35. Dolman, M., Halling, P. J., Moore, B. D., Waldron, S. How dry are anhydrous enzymes? Measurement of residual and buried 18O-labeled water molecules using mass spectrometry. Biopolymers. 41 (3), 313-321 (1997).
  36. Pounot, K. kpounotnPDyn: v3.0.0. Zenodo. , (2021).
  37. Yi, Z., Miao, Y., Baudry, J., Jain, N., Smith, J. C. Derivation of mean-square displacements for protein dynamics from elastic incoherent neutron scattering. Journal of Physical Chemistry B. 116 (16), 5028-5036 (2012).
  38. Peters, J., Kneller, G. R. Motional heterogeneity in human acetylcholinesterase revealed by a non-Gaussian model for elastic incoherent neutron scattering. The Journal of Chemical Physics. 139 (16), 165102 (2013).
  39. Zeller, D., Telling, M. T. F., Zamponi, M., García Sakai, V., Peters, J. Analysis of elastic incoherent neutron scattering data beyond the Gaussian approximation. The Journal of Chemical Physics. 149 (23), 234908 (2018).
  40. Roosen-Runge, F., Seydel, T. A generalized mean-squared displacement from inelastic fixed window scans of incoherent neutron scattering as a model-free indicator of anomalous diffusion confinement. EPJ Web of Conferences. 83, 02015 (2015).
  41. Ortega, A., Amorós, D., García de la Torre, J. Prediction of hydrodynamic and other solution properties of rigid proteins from atomic- and residue-level models. Biophysical Journal. 101 (4), 892-898 (2011).
  42. Hennig, M., Frick, B., Seydel, T. IUCr Optimum velocity of a phase-space transformer for cold-neutron backscattering spectroscopy. Journal of Applied Crystallography. 44 (3), 467-472 (2011).
  43. Paalman, H. H., Pings, C. J. Numerical evaluation of X-ray absorption factors for cylindrical samples and annular sample cells. Journal of Applied Physics. 33 (8), 2635-2639 (1962).
  44. Ow, S. -Y., Dunstan, D. E. The effect of concentration, temperature and stirring on hen egg white lysozyme amyloid formation. Soft Matter. 9 (40), 9692-9701 (2013).
  45. Tominaga, T., Sahara, M., Kawakita, Y., Nakagawa, H., Yamada, T. Evaluation of sample cell materials for aqueous solutions used in quasi-elastic neutron scattering measurements. Journal of Applied Crystallography. 54 (6), 1631-1640 (2021).
  46. Beck, C., et al. Following protein dynamics in real time during crystallization. Crystal Growth & Design. 19 (12), 7036-7045 (2019).
  47. Smith, A. A., Testori, E., Cadalbert, R., Meier, B. H., Ernst, M. Characterization of fibril dynamics on three timescales by solid-state NMR. Journal of Biomolecular NMR. 65 (3-4), 171-191 (2016).
  48. Wang, T., Jo, H., DeGrado, W. F., Hong, M. Water distribution, dynamics, and interactions with Alzheimer's β-amyloid fibrils investigated by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 139 (17), 6242-6252 (2017).
  49. Rezaei-Ghaleh, N., Giller, K., Becker, S., Zweckstetter, M. Effect of zinc dinding on β-amyloid structure and dynamics: Implications for Aβ aggregation. Biophysical Journal. 101 (5), 1202-1211 (2011).
  50. Vugmeyster, L., et al. Fast motions of key methyl groups in amyloid-β fibrils. Biophysical Journal. 111 (10), 2135-2148 (2016).
  51. Yang, X., Wang, B., Hoop, C. L., Williams, J. K., Baum, J. NMR unveils an N-terminal interaction interface on acetylated-α-synuclein monomers for recruitment to fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (18), (2021).
  52. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human α-synuclein. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (5), 409-415 (2016).
  53. Karamanos, T. K., Kalverda, A. P., Thompson, G. S., Radford, S. E. Mechanisms of amyloid formation revealed by solution NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 88-89, 86-104 (2015).
  54. Lai, Y. -C., Kuo, Y. -H., Chiang, Y. -W. Identifying protein conformational dynamics using spin-label ESR. Chemistry - An Asian Journal. 14 (22), 3981-3991 (2019).
  55. Franck, J. M., Han, S. Overhauser dynamic nuclear polarization for the study of hydration dynamics, explained. Methods in Enzymology. 615, 131-175 (2019).
  56. Pavlova, A., et al. Protein structural and surface water rearrangement constitute major events in the earliest aggregation stages of tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 127-136 (2016).
  57. Lin, Y., et al. Liquid-liquid phase separation of tau driven by hydrophobic interaction facilitates fibrillization of tau. bioRxiv. , (2020).
  58. Decatur, S. M. Elucidation of residue-level structure and dynamics of polypeptides via isotope-edited infrared spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 39 (3), 169-175 (2006).
  59. Chatani, E., Tsuchisaka, Y., Masuda, Y., Water Tsenkova, R. molecular system dynamics associated with amyloidogenic nucleation as revealed by real time near infrared spectroscopy and aquaphotomics. PLoS One. 9 (7), 101997 (2014).
  60. Goret, G., Aoun, B., Pellegrini, E. MDANSE: An interactive analysis environment for molecular dynamics simulations. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (1), 1-5 (2017).
  61. Fujiwara, S., et al. Internal dynamics of a protein that forms the amyloid fibrils observed by neutron scattering. Journal of the Physical Society of Japan. 82, Suppl A (2013).
  62. Schiró, G., et al. Neutron scattering reveals enhanced protein dynamics in concanavalin a amyloid fibrils. Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (8), 992-996 (2012).
  63. Pounot, K., et al. Zinc determines dynamical properties and aggregation kinetics of human insulin. Biophysical Journal. 120 (5), 886-898 (2021).
  64. Fujiwara, S., et al. Dynamic properties of human α-synuclein related to propensity to amyloid fibril formation. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3229-3245 (2019).
  65. Sanz, A., et al. High-pressure cell for simultaneous dielectric and neutron spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 89 (2), 023904 (2018).
  66. Adams, M. A., et al. Simultaneous neutron scattering and Raman scattering. Applied Spectroscopy. 63 (7), 727-732 (2009).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 182
Høyoppløselig nøytronspektroskopi for å studere picosekund-nanosekunddynamikk av proteiner og hydreringsvann
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pounot, K., Appel, M., Beck, C.,… More

Pounot, K., Appel, M., Beck, C., Weik, M., Schirò, G., Fichou, Y., Seydel, T., Schreiber, F. High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water. J. Vis. Exp. (182), e63664, doi:10.3791/63664 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter