Summary
中子背散射光谱法提供了对蛋白质及其水合水合的ps-ns动力学的无损和无标记访问。该工作流程介绍了两项关于淀粉样蛋白的研究：关于溶菌酶在聚集过程中的时间分辨动力学和纤维形成时tau的水合水动力学。
Abstract
中子散射提供了以非破坏性方式探测样品内各种能量的动力学的可能性，并且不需要标记氘以外的其他标记。特别是中子背散射光谱同时记录多个散射角的散射信号，非常适合在ps-ns时间尺度上研究生物系统的动力学。通过使用D2O和可能的氘代缓冲液组分，该方法可以监测液态蛋白质的质心扩散以及骨架和侧链运动（内部动力学）。
此外，可以通过使用用H2O水合的全氘代蛋白质粉末来研究水合水动力学。本文介绍了劳埃-朗格文研究所 （ILL） 的仪器 IN16B 上采用的工作流程，用于研究蛋白质和水合水动力学。解释了使用蒸汽交换的溶液样品和水合蛋白粉样品的制备。蛋白质和水合水动力学的数据分析程序针对可以在中子背散射光谱仪上获得的不同类型的数据集（准弹性光谱或固定窗口扫描）进行了描述。
该方法通过两项涉及淀粉样蛋白的研究来说明。溶菌酶聚集成μm大小的球形聚集体 - 表示颗粒 - 显示在IN16B探测的空间和时间范围内的一步过程中发生，而内部动力学保持不变。此外，还研究了tau水合水合水在全氘化蛋白水合粉末上的动力学。结果表明，水的平移运动在淀粉样纤维形成时被激活。最后，讨论了协议中的关键步骤，即中子散射相对于其他实验生物物理方法的动力学研究如何定位。
Introduction
中子是一种无电荷的大质量粒子，多年来已成功用于探测从基础物理学到生物学1等各个领域的样品。对于生物应用，小角中子散射，非弹性中子散射以及中子晶体学和反射计被广泛使用2,3,4。非弹性中子散射提供了动力学的集合平均测量，而不需要特定的标记本身，并且信号质量不依赖于大小或蛋白质5。对于模拟细胞内培养基的所研究蛋白质，例如氘代细菌裂解物甚至体内3,6,7，可以使用高度复杂的环境进行测量。可以使用不同的实验装置来研究动力学，即i）飞行时间访问sub-ps-ps动力学，ii）反向散射-访问ps-ns动力学，以及iii）自旋回波访问从ns到数百ns的动力学。中子反向散射利用布拉格定律 2d sinθ = nλ，其中 d 是晶体中平面之间的距离，θ 是散射角，n 是散射阶数，λ 是波长。使用晶体向检测器进行反向散射可以实现高分辨率的能量，通常为~0.8μeV。为了测量能量交换，可以使用携带反向散射晶体的多普勒驱动器来定义和调整入射中子波长8,9,10（图1），或者可以使用飞行时间设置，但代价是能量分辨率降低11。
图 1：带多普勒驱动器的中子背散射光谱仪的草图。入射光束撞击相空间变换（PST）斩波器42，这增加了样品位置的通量。然后通过多普勒驱动器将其反向散射到样品，多普勒驱动器选择能量E1（青色箭头）。然后中子被样品散射（箭头的颜色表示不同的能量），由Si 111晶体制成的分析仪只会反向散射具有特定能量E0的中子（此处为红色箭头）。因此，动量传递q是从探测器阵列上中子的检测位置获得的，能量转移是从差值E1- E0获得的。PST产生的中子脉冲的预期飞行时间用于丢弃直接散射到探测器管的中子的信号。缩写：PST = 相空间变换。请点击此处查看此图的大图。
对于背散射光谱，富含氢质子的样品（如蛋白质）信号的主要贡献来自非相干散射，其散射强度 Sinc（q， ω） 由方程 （1）12 表示
（1）
其中σinc是所考虑元素的非相干截面，k'是散射波矢量的范数，k是入射波矢量的范数，q（= k - k'）是动量传递，r j（t）是原子j在时间t的位置矢量，ω是对应于入射中子和系统之间能量转移的频率。尖括号表示融合平均值。因此，非相干散射探测原子位置随时间的集合平均单粒子自相关性，并给出系统中所有原子和不同时间起源的自动力学平均值（集合平均值）。散射函数是中间散射函数 I（q， t） 在时间上的傅里叶变换，可以看作是方程 （2） 所示的范霍夫相关函数在空间中的傅里叶变换：
（二）
其中 ρ（r，t） 是在位置 r 和时间t 13 处找到原子的概率密度。
对于菲克扩散过程，自扩散函数在散射函数中进行双傅里叶变换后产生（参见方程（3）），散射函数由γ = Dq2给出的线宽洛伦兹组成。
（三）
开发了更复杂的模型并发现有用，例如Singwi和Sjölander用于ps-ns内部蛋白质动力学14的跳跃扩散模型或Sears用于水合水15,16,17的旋转模型。
在法国格勒诺布尔ILL的中子背散射（NBS）仪器IN16B8,9上（补充图S1），蛋白质常用的设置由Si 111晶体组成，用于分析仪的Si 111晶体，带有用于调整入射波长的多普勒驱动器（补充图S2A），从而可以访问动量转移范围~0.2 Å-1 < q < ~2 Å-1和-30μeV的能量转移范围< 
< 30 μeV - 对应于从几ps到几ns的时间尺度和几Å的距离。此外，IN16B还提供了执行弹性和非弹性固定窗口扫描（E/IFWS）10的可能性，其中包括固定能量传输的数据采集。由于在处理中子时通量受到限制，E/IFWS允许在一次能量转移中最大化通量，从而减少获得令人满意的信噪比所需的采集时间。最近的选择是反向散射和飞行时间光谱仪（BATS）模式11，它允许测量广泛的能量传输（例如，-150μeV< <150μeV），具有比多普勒驱动器更高的通量，但代价是能量分辨率较低（补充图S2B）。
中子散射的一个重要特性是，inc σ非相干截面的氢值比氘高40倍，对于生物样品中常见的其他元素可以忽略不计。因此，可以使用氘代缓冲液研究液体环境中蛋白质的动力学，并且粉末状态允许研究用D 2 O水合的氢化蛋白粉的蛋白质内部动力学，或研究用H2O水合的全氘化蛋白粉的水合水。在液态下，中子背散射通常允许同时访问蛋白质的质心自扩散（Fickian型扩散）及其内部动力学。后者是骨干和侧链运动，通常由所谓的跳跃扩散模型或其他模型描述 3,18.在氢化蛋白粉中，不存在蛋白质扩散，只需要对内部动力学进行建模。对于水合水，水分子的平移和旋转运动的贡献对动量传递q具有不同的依赖性，这使得它们在数据分析过程中得以区分17。
本文通过研究蛋白质来说明中子背散射方法，这些蛋白质被发现能够展开，聚集成由β链堆栈组成的规范形式 - 所谓的交叉β模式19,20 - 并形成细长的纤维。这就是所谓的淀粉样蛋白聚集，由于其在阿尔茨海默氏症或帕金森病等神经退行性疾病中的核心作用而被广泛研究21,22。淀粉样蛋白的研究还受到它们可以发挥的功能作用23,24或其在开发新型生物材料方面的高潜力的动机25。淀粉样蛋白聚集的物理化学决定因素尚不清楚，尽管在过去几年中取得了巨大进展，但没有淀粉样蛋白聚集的一般理论可用21,26。
淀粉样蛋白聚集意味着蛋白质结构和稳定性随时间的变化，其研究自然意味着动力学，与蛋白质构象稳定性、蛋白质功能和蛋白质能量景观27 有关。动力学通过对最快运动28的熵贡献与特定状态的稳定性直接相关，蛋白质功能可以通过从光敏蛋白29 的sub-ps到域运动的ms的各种时间尺度上的运动来维持，这可以通过皮秒-纳秒动力学30来促进。
将介绍两个使用中子背散射光谱研究淀粉样蛋白的例子，一个在液态研究蛋白质动力学，另一个在水合粉末状态下研究水合水动力学。第一个示例涉及实时将溶菌酶聚集成μm大小的球体（称为颗粒）5，第二个示例比较人类蛋白质tau31的天然和聚集状态下的水动力学。
溶菌酶是一种参与免疫防御的酶，由129个氨基酸残基组成。溶菌酶可以在pD为10.5和温度为90°C的氘代缓冲液中形成颗粒。 通过中子散射，我们发现溶菌酶质心扩散系数的时间演变遵循硫黄素T荧光（用于监测淀粉样蛋白交叉β模式形成的荧光探针32）的单指数动力学，表明形成颗粒上层结构和交叉β模式以相同的速率在单个步骤中发生。此外，内部动力学在整个聚集过程中保持不变，这可以通过在NBS仪器上无法观察到的快速构象变化来解释，或者可以通过聚集时蛋白质内能没有显着变化来解释。
人类蛋白tau是一种固有的无序蛋白（IDP），由441个氨基酸组成，用于所谓的2N4R亚型，其主要参与阿尔茨海默病33。在全氘化蛋白tau粉末上使用中子反向散射，我们发现在纤维状态下水合水动力学增加，更多的水分子群经历平移运动。结果表明，水合水熵的增加可能驱动tau的淀粉样蛋白颤动。
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Protocol
1. 为液态蛋白质制备氘代缓冲液
- 将缓冲液的所有组分溶解在纯D2O中。
- 如果pH电极在H2O中校准，则使用NaOD或DCl 34根据公式pD = pH + 0.4调节pD。
注意：使用D 2 O代替H2O可能会影响蛋白质溶解度，可能需要调整缓冲条件（例如，盐浓度的轻微变化）。
2. 制备 H2O 水合蛋白粉末
- 准备样品架。
- 用水和乙醇彻底清洁带有铟线密封和螺钉的扁平铝样品架，并使其干燥。
注意：使用扁平样品架，使粉末可以均匀地分布在表面上。粉末的量应足够，使其可以保持在壁之间，并且在垂直放置样品架时不会掉落。 - 在精密天平上分别称量样品架底部、盖子和铟丝的不同部分。
- 将 1 mm 铟线密封件放在样品架底部的凹槽中，在两端连接处留出小重叠（图 2A）。
- 放置适量的冻干蛋白（通常~100mg蛋白质），使其充满样品架底部的内表面。
- 用水和乙醇彻底清洁带有铟线密封和螺钉的扁平铝样品架，并使其干燥。
- 将蛋白粉水合。
- 将样品架置于带有含有P2O5 粉末的培养皿的干燥器中24小时以完全干燥蛋白粉35 （图2B）。称取装有铟密封和干粉的样品架的干燥底部，得到m干粉。
注意：P2O5 粉末具有很强的腐蚀性。 - 从干燥器中取出P 2 O5，并在里面放入装有D2O的培养皿。定期控制粉末的质量，以检查水合水平h = mhyd / m干燥，其中mhyd和m干燥分别是水合粉末和干粉的质量。
注意：对于胰岛素等高度疏水的蛋白质，可能需要提高干燥器内部的温度以获得更高的蒸气压并达到所需的水合水平h。 - 重复步骤2.2.1和2.2.2至少三次，将所有可交换的氢正确转化为氘。
注意：或者，如果蛋白质不受其影响，则可以使用纯D2O中的冷冻干燥和溶解循环来获得更好的H / D交换。 - 将粉末水合至略高于所需水平，让带有铟丝和水合粉末的样品架底部保持在精密天平上，并等待质量缓慢降低到所需值以获得目标h（如果要用一个完整的水合层覆盖中等大小的球状蛋白，则通常为0.2-0.4）。
- 快速将盖子放在底部，先用四个螺钉关闭样品架以停止蒸汽交换（补充图S3A）。
- 放置并拧紧所有剩余的螺钉，直到底部和盖子之间没有可见的间隙（补充图S3B）。
- 称量密封的样品架，以检查中子实验后是否有任何潜在的水合损失。
- 将样品架置于带有含有P2O5 粉末的培养皿的干燥器中24小时以完全干燥蛋白粉35 （图2B）。称取装有铟密封和干粉的样品架的干燥底部，得到m干粉。
3. 进行非相干中子散射实验
- 在指定的光束时间前几周与当地联系人讨论并仔细检查实验所需仪器的配置。
- 准备液态样品。
- 将蛋白质溶解在氘代缓冲液中。
- 用水确定要放入样品架的适当液体体积（确保样品架关闭时没有溢出; 图 2C）。
注意：以下步骤（3.3和3.4）描述了在ILL 8,9的NBS光谱仪IN16B上进行的实验，使用低温炉作为样品环境。仪器控制系统将从一个仪器更改为另一个仪器，但工作原理保持不变。
- 插入示例。
- 彻底干燥样品棒（图2D），并在处理任何材料（在ILL处）检查电离辐射剂量低于100μSv / h后取出先前的样品（如果有）。
- 放置样品，检查相对于光束中心是否正确居中（补充图S4），然后将样品棒插入低温炉（图2D）。打开真空泵达到小于10-3 巴，通过重复以下三次将低温炉内的空气冲洗掉：用氦气填充低温炉，直到达到大气压，然后使用真空泵再次除去气体。
注意：如果是平坦的样品架，样品架必须相对于入射光束成 45° 角。由于细胞的吸收和散射，有用的动量传递范围可能会减小。强中子吸收剂（如镉）可用于掩盖样品架的某些部分（例如螺钉、厚部件）。 - 在低温炉中引入一些氦气，使压力为~0.05巴。
- 采集数据（例如，在 ILL 的 IN16B 上使用 NOMAD，假设用户在获取准弹性中子光谱 （QENS） 光谱之前更喜欢 200 K 的温度，然后在温度斜坡期间以每分钟 0.5 K 的速度升至 310 K，最后在 310 K 时使用 QENS）。
- 使用NOMAD，在执行选项卡中，将炉低温恒温器控制器拖放到启动板中。将温度设置为 200 K。使用快速模式和 30 分钟的超时，以便温度有时间稳定下来。单击旋转箭头图标在后台运行它，以便在温度降低期间获取数据。
- 拖放IN16DopplerSettings控制器，将速度曲线设置为最大ΔE设置的精确速度，值为0.00μeV和128个通道以获得EFWS配置。
- 拖放 计数 控制器，用易于识别数据的名称填充 字幕 字段，并设置 60 次重复 30 秒扫描 （补充图 S5A）。
- 拖放IN16DopplerSettings控制器，将速度曲线设置为正弦，由速度设置，值为4.5 m/s，2,048通道，即可获得QENS配置。
- 拖放 计数控制器 ，重复 4 次 30 分钟扫描 （补充图 S5B）。
- 对于温度斜坡，拖放炉低温恒温器控制器，将温度设置为 310 K，将斜坡设置为设定点，Δ = 0.05 K 和 6 秒。使用220分钟的超时（补充图S6A）。
- 使用 for 循环进行 65 次重复。在里面，按照步骤3.4.2插入IN16DopplerSettings控制器，然后单次计数30秒。随后，插入IN16多普勒设置，如前所述，但使用1.5μeV的能量偏移和1,024个通道，然后进行3分钟的单次计数（补充图S6B）。
- 要获取 310 K 的最后一个 QENS，请拖放 IN16DopplerSettings 和 Count 控制器，分别按照步骤 3.4.4 和 3.4.5 中所述进行配置。
- 按 开始 按钮（窗口底部的直角三角形）以运行脚本。
注意：每个实验都需要采集校准数据;也就是说，空单元用于减法或吸收校正，单独使用缓冲液在不同温度下用于模拟背景，以及测量钒（或等效地，在10 K或更低的温度下测量样品）以获得仪器的分辨率函数。
4. 数据分析 - QENS
- 在 Python 软件 nPDyn v3.x36 中使用 'IN16B_QENS.process（）' 方法导入数据集
>>>> from nPDyn.dataParsers import IN16B_QENS
>>>样本 = IN16B_QENS（
...<数据文件的路径>
...[detGroup=...格式>]
... ).进程（）
>>>样本 = sample.get_q_range（0.3， 1.8） - 使用以下命令执行数据更正（可选）（有关详细信息，请参阅 nPDyn 的文档， 图 3）：
#it 假定空电池、钒和缓冲液的数据
# 已经在名为“empty_cell”、“钒”的数据集中导入，
# 和 'buffer' 分别。
# 表示使用比例因子进行空单元格减法
# （错误会自动传播）
>>>样本 = 样本 - 0.95 * empty_cell
# 使用包乐平系数进行校正
# （与上面的例子互斥）
>>>样本 = 样本.吸收校正（empty_cell）
# 用于规范化
>>>样品 = 样品标准化（钒）
# 用于沿可观察轴进行分箱
# 可观察的是这里的聚合时间
>>>样本 = 样本.bin（3，轴=0） - 拟合校准数据。数据集样本、空细胞、氘代缓冲液（如果需要）和钒可以使用内置模型或用户定义的模型进行拟合（参见 nPDyn 文档）：
>>> 从 nPDyn.models.builtins import （
...模型PVoigt，
...模型水，
...模型校准D2O，
... )
# 内置模型使用动量的列向量
# 传输 q 值
>>> q = 钒.q[：， 无]
# 钒使用伪 Voigt 轮廓安装
>>> vanadium.fit（modelPVoigt（q）） - 使用称为“模型水”的内置水合水模型。该模型如方程（4）17所示
（四）
其中0、r 和t 是标量，分别考虑弹性信号、旋转运动和平移运动的相对贡献;j1（qd） 是 l阶 球面贝塞尔函数，q 是动量传递;d 水分子中的O-H距离;δ（ω） 是狄拉克三角洲，此处乘以 EISF;N 是所用球形贝塞尔函数的最高阶数（通常为 ~5）;
分别 
是洛伦兹旋转和平移运动; b（q） 是一个平面背景项。球形贝塞尔函数给出了水分子每个角动量状态的相对贡献，数字N是根据动量传递q范围确定的。在典型的NBS光谱仪的情况下，高达N = 4的项几乎完全解释了信号（补充图S7）。
# 这里，公式 2 用于水合水
# 卷积与解析函数和添加
# D2O 背景自动完成
# 提供的参数
>>> sample.fit（modelWater（q），
...res=钒，
...bkgd=缓冲区，
...volume_fraction_bkgd=0.95
... )
注意：旋转和平移运动的贡献应该复杂，以达到完全严谨的程度。添加剂模型的成功归因于蛋白质表面存在不同的水种群和有限的能量范围。 - 使用以下命令绘制数据（图 4）：
>>> 来自 nPDyn.plot 导入图
>>>图（样本）
（四）
分别 
是洛伦兹旋转和平移运动; b（q） 是一个平面背景项。球形贝塞尔函数给出了水分子每个角动量状态的相对贡献，数字N是根据动量传递q范围确定的。在典型的NBS光谱仪的情况下，高达N = 4的项几乎完全解释了信号（补充图S7）。5. 数据分析 - 温度斜坡、弹性固定窗口扫描 （EFWS）
- 使用类似于第4节的过程，在最低温度（通常为10 K）下通过信号对温度斜坡数据进行归一化：
>>> from nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS
>>>样本 = IN16B_FWS（
...<数据文件的路径>，
...detGroup=[detGroup=]
... ).进程（）
# 对可观察量的 5 个前点进行归一化
# 轴，对应于温度
>>>样本 /= 样本[：5].均值（0）
# 这里使用的动量传递Q范围较小
# 因为使用的模型仅对低 q 有效
>>>样本 = sample.get_q_range（0.2， 0.8） - 使用一个简单的高斯模型开始，其宽度由所谓的均方位移（MSD）给出。使用以下命令生成并拟合模型：
>>> 将 numpy 导入为 NP
从nPDyn.models导入>>>参数，模型，组件
# a 是比例因子
>>>参数 = 参数（
...a={'value'： 1， 'bounds'： （0， np.inf）}，
...msd={'value'： 1， 'bounds'： （0， np.inf）}
... )
>>>模型 = 模型（参数）
>>> model.addComponent（Component（
...“高斯”，
...lambda x， a， msd： a * np.exp（-x ** 2 * msd / 6）
... ))
>>> sample.fit（model， x=sample.q[：， None]）
>>>图（样本）
注意：高斯近似始终适用于q2MSD<<1，但更宽的动量传递范围可用于样品之间的相对比较。更复杂的模型，超越高斯近似，已经开发出来37,38,39.
6. 数据分析 - 弹性和非弹性固定窗口扫描 （E/IFWS）
- 与步骤 4 类似，导入数据集，但使用 'IN16B_FWS' 类：
>>> from nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS
>>>样本 = IN16B_FWS（
...<数据文件的路径>
...[detGroup=]
... ).进程（）
>>>样本 = sample.get_q_range（0.3， 1.8） - 拟合校准数据和样品数据。
- 使用广义MSD40 或将其视为粗QENS光谱（在能量轴上只有几个数据点）来分析E / IFWS数据。当E/IFWS被视为粗QENS时，用于QENS的模型用于一次拟合整个E / IFWS数据集（能量转移和动量转移的全局拟合）。
注意：后一种解决方案（使用E/IFWS数据上的QENS模型）在这里使用，其中施加了质心扩散和蛋白质内部动力学的动量传递依赖性。 - 使用以下方程（5）（nPDyn中的“modelProteinJumpDiff”）对液体中的蛋白质动力学进行建模：
（五）
其中 R（q，ω） 是分辨率函数;β每个动量传递 q 的标量无关; a0 为弹性非相干结构因子 （EISF）;
一个洛伦兹解释质心扩散，宽度由方程（6）给出; 
是一个洛伦兹，包括质心扩散和跳跃扩散模型14 之后的贡献，考虑了内部动力学（方程 （7）; 
是来自 D2O 的拟合信号，由其在样品中的体积分数重新缩放。
γ = Dsq2 （6）
Ds是自扩散系数。
（七）
Di 是内部动力学的表观扩散系数， τ 是扩散运动的弛豫时间。
>>> 从 nPDyn.models.builtins import （
...模型PVoigt，
...模型蛋白质跳跃差异，
...模型校准D2O，
... )
# 内置模型使用动量的列向量
# 传输 q 值
>>> q = 钒.q[：， 无]
# 钒使用伪 Voigt 轮廓安装
>>> vanadium.fit（modelPVoigt（q））
# 表示纯 D2O，具有校准线宽的模型
# 对于不同的温度包含在 nPDyn 中
>>> buffer.fit（modelCalibratedD2O（q， temp=363））
# 此处，公式 3 用于液体样品
# 卷积与解析函数和添加
# D2O 背景是使用 # 提供的参数自动完成的
>>> sample.fit（modelProteinJumpDiff（q），
...res=钒，
...bkgd=缓冲区，
...volume_fraction_bkgd=0.95
... )
- 使用广义MSD40 或将其视为粗QENS光谱（在能量轴上只有几个数据点）来分析E / IFWS数据。当E/IFWS被视为粗QENS时，用于QENS的模型用于一次拟合整个E / IFWS数据集（能量转移和动量转移的全局拟合）。
- 使用以下方法绘制拟合数据：
>>> 来自 nPDyn.plot 导入图
>>>图（样本）
（五）
一个洛伦兹解释质心扩散，宽度由方程（6）给出; 
是一个洛伦兹，包括质心扩散和跳跃扩散模型14 之后的贡献，考虑了内部动力学（方程 （7）; 
是来自 D2O 的拟合信号，由其在样品中的体积分数重新缩放。
（七）Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在氘代缓冲液（0.1 M NaCl，pD 10.5）中，在90°C下以50mg / mL的蛋白质浓度将溶菌酶聚集到颗粒中。颗粒的形成由温度升高至90°C触发，并在6小时内发生（补充图S8）。数据采集是在IN16B上进行的，如上述协议中所述（数据由馆际互借永久管理，可在 http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811 访问）。
在7 °C下获得QENS光谱以充分表征初始状态。随后，将温度升至90°C（在IN16B上通常需要~30分钟， 补充图S9）以触发聚集过程。可以使用QENS光谱的滑动平均值来跟踪动力学，从而可以访问整个能量转移范围，但时间分辨率有限。在四个能量转移值5下，使用EFWS可以将时间分辨率提高到~1分钟，使用E / IFWS可以提高到~20分钟。
在所展示的示例中，我们探索了0、0.6、1.5和3μeV的能量转移。在聚集过程中连续采集E/IFWS扫描，并在90 °C下采集最终状态的QENS光谱。 使用空电池的E / IFWS校正E / IFWS数据以进行吸收，并使用钒数据归一化。
对于溶菌酶E / IFWS，我们观察到在低动量转移和低能量转移时信号的时间增加，而高能量转移和低动量转移时的信号减少（补充图10）。这种定性观察表明形成了更大的物体，扩散得更慢，并证实了聚集过程发生了。根据方程（4），分析得出的初始质心扩散系数为15 Å2 / ns，与小蛋白质簇的存在一致（由动态光散射和HYDROPRO计算5,41支持），然后随着时间的推移呈指数下降（图5）。内部动力学的表观扩散系数在整个聚集过程中保持不变。因此，溶菌酶颗粒的形成似乎发生在单个聚集阶段。内部蛋白质动力学没有变化表明，要么转化为交叉β和可能相关的能量变化太快，要么其他驱动效应，如溶剂熵的增加，可能在探测的能量范围内完全占主导地位。
在德国加兴Maier-Leibnitz Zentrum（MLZ）的SPHERES上使用上述粉末样品方案对tau单体和纤维周围的水合水动力学进行了研究。使用约100mg氘代tau蛋白粉，水合为每g蛋白质0.4gH2O。EFWS是在温度上升过程中获得的，QENS光谱是在恒温下获得的。记录EFWS从20 K开始，以0.2 K/min的速率将温度升高至300 K，同时在5 min扫描期间连续采集数据。
QENS光谱记录在20和280 K。EFWS数据在动量传递q范围0.2 Å-1
图 2：扁平铝制样品架的底座。 （A）扁平铝样品架呈现暴露在中子的中心部分，其中蛋白粉保持在底座和盖子之间的小间隙内 - 通常为~0.3毫米。铟丝可用于密封，因为它可以抵抗高达90°C的温度升高。 在较高温度的情况下，可以使用特氟龙密封件。（B）将蛋白粉放置在样品架的底座上，铟丝就位。将样品架置于干燥器中，存在P 2 O5进行干燥，或存在H2O/ D 2O进行水合。添加真空润滑脂以避免干燥器底部和盖子之间的任何泄漏。可以谨慎使用真空来加速干燥过程。对于高度疏水的样品，可能需要加热干燥器的底部。（C）蛋白质溶液放置在内筒和外筒之间。确保不要移液过多（关闭样品架时不应溢出）。铟丝放置在圆形凹槽中。（D）样品棒（在后台）提供对样品高度和方向的控制，并且可以包括用于样品环境（温度，压力）的不同控制器和检测器。样品棒从低温炉的顶部（正面）插入，可在实验过程中控制温度。在实验过程中，中子束通常会撞击低温炉的底部，如白色矩形所示（束的大小取决于仪器配置）。请点击此处查看此图的大图。
图 3：数据更正和归一化可能会改善拟合。 数据是使用 nPDyn 导入的，如协议中所述。 左边，数据集仅使用监视器的数据进行规范化。 右图，空罐的信号与Paalman-Ping系数43 一起使用，以校正样品架的中子吸收。随后，针对每个动量传递q独立积分钒信号的拟合模型，并将结果用于对样本数据集进行归一化。在这两个图中，S（q，ω）表示散射信号，q是动量传递， 是能量传递。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：由 nPDyn 生成的绘图窗口，显示拟合结果。QENS数据使用nPDyn拟合，如协议中所述。绘图窗口允许用户沿不同的轴绘制数据 - 可观察（时间，温度或压力），动量传递q或能量传递 - 并且选择器可用于沿其他轴导航。有不同类型的图可用，（A）中提供了简单的“图”，（B）中提供了“分析-q-wise”。“绘图”按钮在单独的子图中显示不同的数据集，“比较”按钮显示同一图中的数据集，“3D 图”显示不同 3D 子图中的数据集，类似于 s，“分析 - q-wise”按钮显示拟合参数作为动量传递 q 和“分析 - 可观察”的函数' 将拟合参数显示为可观察（时间、温度或压力）的函数。缩写：QENS = 准弹性中子散射。请点击此处查看此图的大图。
图 5：溶菌酶聚集发生在具有恒定内部动力学的一步过程中。 将溶菌酶溶解在聚集缓冲液中（参见5），并且在整个聚集过程中获得E / IFWS，这是通过将温度升高至90°C触发的。 在用空电池进行吸收校正并使用钒信号归一化后，使用协议中所述的跳跃扩散模型分析数据。拟合质心自扩散系数与内部动力学的表观扩散系数（橙色方块）一起绘制为时间的函数（蓝色三角形）。这个数字来自 5。缩写：E/IFWS = 弹性和非弹性固定窗口扫描。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：tau纤维周围的水合水动力学增加。将氘代tau纤维和单体的H2O水合粉末密封在扁平铝样品架中，并在20至300 K的温度上升期间获取EFWS数据。在用空电池进行吸收校正并使用钒信号归一化后，使用协议中所述的跳跃扩散模型分析数据。该图像是使用来自 31 的数据中的较小 q 范围（0.2 < q < 0.8 Å-1）重新绘制的。缩写：EFWS = 弹性固定窗口扫描。请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：仪器IN16B在ILL的照片。（上） 从仪器专用于仪器的辐射控制区看到的仪器IN16B。入射光束在中子导轨内传播到真空室，真空室包含仪器的大部分元件（PST 斩波器、分析仪、样品、探测器）。 （下） 真空室内部。PST斩波器可见，装有样品的低温炉周围的分析仪也可见。探测器位于低温炉后面。由Laurent Thion提供，日食。缩写：PST = 相空间变换。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：经典（带多普勒驱动）和BATS模式下IN16B的草图。 （A）中子束通过速度选择器部分单色化。随后，背景和PST斩波器将产生中子脉冲，多普勒单色器将从中选择能量分布（E / IFWS或QENS模式）。然后中子被样品散射，单个能量被分析仪反射到探测器。由病房提供。（B）BATS斩波器用于定义具有定义能量范围的单个中子脉冲。中子束通过速度选择器部分单色化。随后，背景斩波器将去除不属于所选脉冲的不需要的中子。然后中子被样品散射，单个能量被分析仪反射到探测器。由病房提供。缩写：BATS = 背散射和飞行时间光谱仪;PST = 相空间变换;E/IFWS = 弹性和非弹性固定窗口扫描;QENS = 准弹性中子散射;PG = 热解石墨。 请点击此处下载此文件。
补充图S3：粉末达到所需的水合并密封后，样品架迅速关闭。 （A） 使用四个螺钉快速关闭扁平样品架。由于铟线，将保持小间隙。然后加入其他螺钉，并通过轻轻拧紧每个螺钉几次以使铟放松来缓慢密封样品架。（B） 当支架底座和盖子之间不再有可见的间隙时，扁平样品架正确密封。 请点击此处下载此文件。
补充图S4：样品架相对于中子束居中。 样品棒上放置了一个圆柱形样品架。检查样品架的位置，使光束撞击支架的底部。 请点击此处下载此文件。
补充图S5：收购EFWS，然后与NOMAD一起收购IN16B上的QENS。 （A） 按照协议中的说明将相关控制器拖放到 启动板 中（步骤 3.4.1 至 3.4.3）。可能需要单击锁（右上角的绿色图标 - 垂直窗格）才能获得对界面的控制。（B） 按照协议中的说明将相关控制器拖放到 启动板 中（步骤 3.4.4 至 3.4.5）。在这里，最后两个控制器被命名为 IN16DopplerSettings 和 Count。缩写：QENS = 准弹性中子散射，EFWS = 弹性固定窗口扫描。 请点击此处下载此文件。
补充图S6：使用NOMAD在IN16B上设置温度斜坡和E / IFWS。（A） 炉低温恒温器控制器添加到发射台中，并按照协议中的说明进行配置（步骤3.4.6）。（B） 在启动板中添加 For 循环控制器，并将相关控制器插入其中并按照协议中的说明进行配置（步骤 3.4.7）。缩写：E/IFWS = 弹性和非弹性固定窗口扫描。请点击此处下载此文件。
补充图S7：前五个球形贝塞尔函数解释了水合水的大部分旋转贡献。 前八个球面贝塞尔函数使用值 d = 0.98 Å 和动量传递 q 的值从 0 到 3 Å（实心彩色线）绘制。0.3 Å < q < 1.8 Å 的动量传递范围由蓝色虚线分隔。 请点击此处下载此文件。
补充图S8：溶菌酶可重复地形成颗粒。 将溶菌酶溶解在聚集缓冲液中（如方案步骤1中所述制备），并将ThT加入至终浓度为2μM，以使用荧光监测跨β结构的形成。该图表示三个独立测量值的平均值，误差线是标准偏差。插图显示了聚集6小时后形成的颗粒的荧光显微镜照片。比例尺 = 20 μm。这个数字来自 5。缩写：ThT = 硫黄素 T. 请点击这里下载此文件。
补充图S9：IN16B上提供的快速升温。 在IN16B的 快速 模式下，温度可以在大约30分钟内从280 K增加到363 K。这个数字来自 5。 请点击此处下载此文件。
补充图S10：溶菌酶在聚集成颗粒过程中的E / IFWS数据。 将溶菌酶溶解在聚集缓冲液中（参见5），并且在整个聚集过程中获得E / IFWS，这是通过将温度升高至90°C触发的。 数据 - 使用空电池进行吸收校正和使用钒信号归一化 - 根据测量的不同能量转移的动量传递q和时间绘制，0 μeV（左上），0.6μeV（右上），1.5μeV（左下）和3μeV（右下）。对于每个子图，纵轴对应于散射信号 S（q， ΔE），绘制与实验时间（以小时为单位）和动量传递 q 的关系图。这个数字来自 5。缩写：E/IFWS = 弹性和非弹性固定窗口扫描。 请点击此处下载此文件。
补充图S11：tau水合水数据拟合。（A） 使用高斯拟合 EFWS 数据。将氘代tau单体的H2O-水合粉末密封在扁平铝样品架中，并在20至300 K的温度斜坡期间获得EFWS。绘制了动量传递q范围0.2 < q < 0.6 Å-1的动量传递q范围（带误差线的垂直轴蓝色线上的弹性信号S（q，0））以及用于提取MSD的拟合高斯。（B）从QENS拟合中获得的水合水的平移和旋转运动。将氘代tau纤维（左）和单体（右）的H2O水合粉末密封在扁平铝样品架中，并在280 K下获取QENS数据。将纤维（蓝色三角形）和单体（绿点）的实验数据（强度 S（q，ω） 作为能量传递的函数）与拟合模型（黑色实线）及其分量、背景（蓝色）、分辨率函数（绿色）、旋转（红色）和平移（青色）一起绘制，用于动量传递 q = 0.783 Å-1。这个数字来自31。缩写：QENS = 准弹性中子散射，EFWS = 弹性固定窗口扫描;MSD = 均方位移。请点击此处下载此文件。
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Discussion
中子光谱是唯一允许探测蛋白质样品的集合平均ps-ns动力学的方法，无论使用氘代时蛋白质的大小或溶液的复杂性如何6。具体来说，通过探测溶液中蛋白质组装体的自扩散，可以明确地确定这种组装体的流体动力学尺寸。尽管如此，该方法通常受到低中子通量的限制，这意味着采集时间长，并且需要大量样品（通常为100 mg蛋白质）才能在分配的光束时间内获得良好的信噪比。
样品制备（方案步骤1和2）。 对于液态样品，可以使用的最低浓度为 ~50 mg/mL（使用较低的浓度可以延长采集时间）。高蛋白浓度与更快的颤动速率相关，这有助于在分配的光束时间内拟合测量值，但也会影响聚集途径44。因此，有必要使用互补方法（例如原子力或电子显微镜）进行彻底的样品表征。
样品架的材料也是制备样品时要解决的一点，因为铝合金会受到腐蚀45.具有良好耐腐蚀性和低中子吸光度的典型铝合金是欧洲标准 （EN） AW-6060 [AlMgSi]，由 98%-98.75% 铝、0.1% 钛、0.15% 锌、0.05% 铬、0.35%-0.6% 镁、0.1% 锰、0.1% 铜、0.1%-0.3% 铁和 0.3%-0.6% 硅制成。 例如，通过减少样品架中的时间或使用保护涂层（可以增加背景信号），例如镍或金。
对于氢化蛋白质的粉末样品，冷冻干燥程序被证明在P2O5 粉末存在下通过干燥器中的步骤有效地完成，以尽可能多地去除残留的轻水35。对于粉末样品，还建议（使用原子力显微镜和X射线粉末衍射）表征粉末的最终水合状态，并评估氘化，冷冻干燥和蒸汽扩散对单体和纤维状态的影响。特别是，冷冻干燥会破坏纤维，导致片段缩短，而不会影响形态。此外，通过X射线功率衍射观察到，在液氮中缓慢冷却而不是闪蒸冷却可能会引起淀粉样样结构的存在（未发表的结果）。
数据收集（协议步骤3）。 建议在实验之前与当地联系人一起计划数据收集（即使在提案撰写过程中已经讨论过）。数据收集计划在第一次扫描后可能会发生变化，具体取决于获得的信噪比。特别是对于时间分辨实验，使用 E/IFWS 可以快速收集数据 - 弹性线为 30 秒至 1 分钟，3 μeV5 的数据点为 4-5 分钟，但可访问的能量转移范围本质上是有限的。或者，可以使用QENS数据的滑动平均值46。为此，IN16B 上的新反向散射和飞行时间光谱 （BATS） 选项提供了比经典 IN16B 更高的通量，能量范围为 ±150 μeV（或更高，具体取决于所使用的配置），但代价是能量分辨率较低 11。因此，建议将 BATS 选项用于时间分辨研究，特别是对于淀粉样蛋白聚集等过程，该过程持续数小时。
数据分析（协议步骤 4、5 和 6）。 散射函数 S（q，ω） 包括样品中所有类型的运动，上述协议中描述的模型是近似值。特别是，对于液态的IDP，无序链的大规模运动可以在与整个蛋白质的质心扩散相同的长度和时间尺度上发生。因此，用户应该记住，质心扩散和蛋白质内部动力学的分离并不总是那么简单。拟合过程可以从通过互补方法获得的质心扩散信息中受益，因此可以固定此参数（请记住，其他方法可以提供与不同时间和长度尺度相关的集体扩散系数），以获得更可靠的内部动力学结果。
除了中子散射之外，分子系统的动力学还可以通过核磁共振（NMR）来表征，它提供了同位素标记蛋白质和各种时间尺度的局部信息47,48,49。该方法已成功用于研究淀粉样蛋白系统48,50,51,52,53，但由于蛋白质大小的固有限制，用户无法简单地研究水合水或实时跟踪淀粉样蛋白聚集过程。电子顺磁共振波谱（EPR）和EPR衍生方法Overhauser动态核极化（ODNP）的最新发展与中子散射相结合时提供了良好的前景。事实上，虽然定点自旋标记（SDSL），EPR和ODNP可以分别在引入的自旋标记周围的ps-ns时间尺度上探测蛋白质54和水合动力学55。
这些方法用于研究tau56,57蛋白的聚集，并将提供与中子散射的巨大互补性，中子散射可以获得类似的信息，但在整个样品上取平均值。此外，红外光谱可以为与特定结构模式相关的高能运动提供动态信息，但蛋白质环境（使用的缓冲区）的复杂性会影响数据解释58,59。中子背散射技术提供了ps-ns时间尺度上蛋白质和水合水动力学的独特和互补视图以及上述方法的结果。它们不需要对样品进行特异性标记，信号质量对蛋白质的大小不敏感，并且可以在体内或高度复杂的氘代环境中（如氘代细菌裂解物3,6,7）中进行测量。由于该方法提供了集成平均结果，因此可以很好地补充分子动力学模拟，以获得所研究系统的原子细节信息。通过将实验数据集与使用mdanse60等软件从模拟轨迹计算的理论QENS光谱之间的直接比较，可以轻松验证仿真。
关于淀粉样蛋白系统，中子背散射已被证明可用于表征各种系统和条件的ps-ns蛋白质和水动力学5,31,61,62,63,64。特别是，中子背散射用于揭示跨β结构中涉及的蛋白质序列比例与颤动时水熵增益幅度之间的相关性（未发表的结果）。此外，样品环境的发展允许同时采集中子光谱和介电弛豫数据65或拉曼散射数据66。此外，IN16B上还存在衍射检测器，以获取结构数据和动态数据。此外，由于使用了所谓的可变聚焦导轨，预计在不久的将来，IN16B的BATS模式将改善入射中子通量，其几何形状可以根据需要适应所使用的仪器设置。进一步推动复杂样品环境和仪器的开发将允许将来进行更复杂的实验，同时可能提供进一步的动力学和结构信息。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者感谢德国加兴Heinz Maier-Leibnitz Zentrum的Jülich中子科学中心的Michaela Zamponi在仪器SPHERES上进行的部分中子散射实验。这项工作得益于欧洲联盟根据HPRI-2001-50065和RII3-CT-2003-505925合同资助的氘实验室（DLAB）财团的活动，以及英国工程和物理科学研究理事会（EPSRC）在劳厄·朗格文研究所EMBL实验室内根据赠款GR/R99393/01和EP/C015452/1资助的活动。欧盟委员会在第7个框架计划下通过关键行动提供支持：加强欧洲研究领域，研究基础设施得到认可[合同226507（NMI3）]。Kevin Pounot和Christian Beck感谢联邦教育和研究部（BMBF，批准号05K19VTB）资助他们的博士后奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum sample holder | Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact. | ||
| Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 |
|
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Eurisotop | DLM-4DR-PK | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | |
| Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur | Sigma-Aldrich | 1.5901 | |
| Glass dessicator | VWR | 75871-660 | |
| Glass dessicator plate, 140 mm | VWR | 89038-068 | |
| Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% | Alfa Aesar | 00470.G1 | |
| Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg | Sigma-Aldrich | 62970 | |
| nPDyn | v3.x | see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software | |
| OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration | Dutscher | 92641 | |
| Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% | Sigma-Aldrich | 214701 | |
| Pipette ErgoOne 0.5-10 μL | Starlab | S7100-0510 | |
| Pipette ErgoOne 100-1,000 μL | Starlab | S7100-1000 | |
| Pipette ErgoOne 20-200 μL | Starlab | S7100-2200 | |
| Pipette tip TipOne 1,000 μL | Starlab | S1111-6001 | |
| Pipette tip TipOne 10 μL | Starlab | S1111-3200 | |
| Pipette tip TipOne 200 μL | Starlab | S1111-0206 | |
| Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D | Sigma-Aldrich | 372072 |
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