Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Neutronspektroskopi med høj opløsning til undersøgelse af picosekund-nanosekunddynamik af proteiner og hydreringsvand

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

Neutron backscattering spektroskopi giver en ikke-destruktiv og etiketfri adgang til ps-ns dynamikken i proteiner og deres hydreringsvand. Arbejdsprocessen præsenteres med to undersøgelser af amyloidproteiner: på lysozyms tidsopløste dynamik under aggregering og på hydreringsvanddynamikken i tau ved fiberdannelse.

Abstract

Neutronspredning giver mulighed for at undersøge dynamikken i prøver for en bred vifte af energier på en ikke-destruktiv måde og uden anden mærkning end deuterium. Især registrerer neutron backscattering spektroskopi spredningssignalerne ved flere spredningsvinkler samtidigt og er velegnet til at studere dynamikken i biologiske systemer på ps-ns tidsskalaen. Ved at anvende D2O- og muligvis deutererede bufferkomponenter muliggør metoden overvågning af både massecenterdiffusion og rygrads- og sidekædebevægelser (intern dynamik) af proteiner i flydende tilstand.

Derudover kan hydreringsvanddynamikken studeres ved at anvende pulvere af perdeutererede proteiner hydreret medH2O. Dette papir præsenterer arbejdsgangen anvendt på instrumentet IN16B på Institut Laue-Langevin (ILL) for at undersøge protein- og hydreringsvanddynamik. Fremstillingen af opløsningsprøver og hydratiserede proteinpulverprøver ved hjælp af dampudveksling forklares. Dataanalyseproceduren for både protein- og hydreringsvanddynamik er beskrevet for forskellige typer datasæt (kvasielastiske spektre eller scanninger med fast vindue), der kan opnås på et neutronbackscattering-spektrometer.

Metoden illustreres med to studier med amyloidproteiner. Aggregeringen af lysozym i sfæriske aggregater i μm-størrelse - betegnet partikler - er vist at forekomme i en ettrinsproces på rum- og tidsintervallet undersøgt på IN16B, mens den interne dynamik forbliver uændret. Endvidere blev dynamikken i hydreringsvand af tau undersøgt på hydratiserede pulvere af perdeutereret protein. Det er vist, at translationelle bevægelser af vand aktiveres ved dannelsen af amyloidfibre. Endelig diskuteres kritiske trin i protokollen om, hvordan neutronspredning er placeret med hensyn til studiet af dynamik med hensyn til andre eksperimentelle biofysiske metoder.

Introduction

Neutronen er en ladningsfri og massiv partikel, der med succes er blevet brugt gennem årene til at undersøge prøver på forskellige områder fra grundlæggende fysik til biologi1. Til biologiske anvendelser anvendes småvinkel neutronspredning, uelastisk neutronspredning og neutronkrystallografi og reflektometri i vid udstrækning 2,3,4. Uelastisk neutronspredning giver en ensemble-gennemsnitlig måling af dynamikken uden at kræve specifik mærkning i sig selv og en signalkvalitet, der ikke afhænger af størrelsen eller proteinet5. Målingen kan udføres ved hjælp af et meget komplekst miljø for det undersøgte protein, der efterligner det intracellulære medium, såsom et deutereret bakterielt lysat eller endda in vivo 3,6,7. Forskellige eksperimentelle opsætninger kan bruges til at studere dynamikken, nemlig i) time-of-flight-giver adgang til sub-ps-ps-dynamik, ii) backscattering-giver adgang til ps-ns-dynamik og iii) spin-ekko-giver adgang til dynamik fra ns til hundredvis af ns. Neutron backscattering gør brug af Braggs lov 2d sinθ = nλ, hvor d er afstanden mellem planer i en krystal, θ spredningsvinklen, n spredningsrækkefølgen og λ bølgelængden. Brugen af krystaller til backscattering mod detektorerne giver mulighed for at opnå en høj opløsning i energi, typisk ~ 0,8 μeV. For at måle energiudvekslingen bruges enten et Doppler-drev, der bærer en krystal i backscattering, til at definere og indstille den indkommende neutronbølgelængde 8,9,10 (figur 1), eller en time-of-flight-opsætning kan bruges på bekostning af et fald i energiopløsning 11.

Figure 1
Figur 1: Skitse af et neutron backscattering spektrometer med et Doppler-drev. Den indkommende stråle rammer faserumstransformationen (PST) chopper42, hvilket øger fluxen ved prøvepositionen. Det spredes derefter tilbage mod prøven af Doppler-drevet, som vælger en energi E1 (cyanpil). Neutronerne spredes derefter af prøven (med forskellige energier repræsenteret af pilenes farve), og analysatorerne, der er lavet af Si 111-krystaller, vil kun backscatter neutroner med en bestemt energi E0 (rødfarvede pile her). Derfor opnås momentumoverførslen q fra neutronens detekterede position på detektorarrayet, og energioverførslen opnås fra forskellen E1- E0. Den forventede flyvetid for neutronpulsen produceret af PST bruges til at kassere signalet fra neutronerne spredt direkte mod detektorrørene. Forkortelse: PST = fase rumtransformation. Klik her for at se en større version af denne figur.

For backscattering-spektroskopi kommer hovedbidraget til signalet fra hydrogenprotonrige prøver, såsom proteiner, fra usammenhængende spredning, for hvilken spredningsintensiteten Sinc(q, ω) er vist ved Eq (1)12

Equation 1 (1)

Hvor σinc er det usammenhængende tværsnit af det betragtede element, er k' normen for den spredte bølgevektor, k normen for den indkommende bølgevektor, q (= k - k') momentumoverførslen, r j (t) positionsvektoren for atom j på tidspunktet t og ω frekvensen svarende til energioverførslen mellem den indkommende neutron og systemet. Vinkelbeslagene angiver ensemblegennemsnittet. Derfor undersøger usammenhængende spredning den ensemble-gennemsnitlige enkeltpartikel-selvkorrelation af atompositioner med tiden og giver selvdynamikken i gennemsnit over alle atomer i systemet og forskellige tidsoprindelser (ensemblegennemsnit). Spredningsfunktionen er Fouriertransformationen i tid af den mellemliggende spredningsfunktion I(q, t), der kan ses som Fouriertransformationen i rummet af van Hove-korrelationsfunktionen vist ved Eq (2):

Equation 2 (2)

Hvor ρ(r,t) er sandsynlighedstætheden for at finde et atom i position r og tid t 13.

For en fickiansk diffusionsproces resulterer selvdiffusionsfunktionen (se Eq (3)) efter en dobbelt Fourier-transformation i en spredningsfunktion bestående af en Lorentzian med linjebredde givet ved γ = Dq2.

Equation 10 (3)

Mere sofistikerede modeller blev udviklet og fundet nyttige, såsom springdiffusionsmodellen af Singwi og Sjölander til ps-ns interne proteindynamik14 eller rotationsmodellen af Sears til hydreringsvand15,16,17.

På neutron backscattering (NBS) instrumentet IN16B 8,9 ved ILL, Grenoble, Frankrig (supplerende figur S1), består en opsætning, der almindeligvis anvendes med proteiner, af Si 111-krystaller til analysatorerne med et Doppler-drev til tuning af den indkommende bølgelængde (supplerende figur S2A), hvilket giver adgang til momentumoverførselsområdet ~ 0,2 Å-1 < q < ~ 2 Å-1 og energioverførselsområdet på -30 μeV < Equation 3 < 30 μeV - svarende til tidsskalaer fra nogle få ps til nogle få ns og afstande på nogle få Å. Derudover giver IN16B mulighed for at udføre elastiske og uelastiske fastvinduesscanninger (E/IFWS)10, som omfatter dataindsamling ved en fast energioverførsel. Da fluxen er begrænset, når man arbejder med neutroner, tillader E/IFWS maksimering af fluxen for en energioverførsel, hvilket reducerer den anskaffelsestid, der er nødvendig for at opnå et tilfredsstillende signal-støj-forhold. En nyere mulighed er backscattering og time-of-flight spektrometer (BATS) mode11, som muliggør måling af en lang række energioverførsler (f.eks. -150 μeV < < Equation 3 150 μeV) med en højere flux end med Doppler-drevet, men på bekostning af en lavere energiopløsning (supplerende figur S2B).

En vigtig egenskab ved neutronspredning er, at det usammenhængende tværsnit σinc har en 40 gange højere værdi for hydrogen end for deuterium og er ubetydelig for andre grundstoffer, der almindeligvis findes i biologiske prøver. Derfor kan dynamikken af proteiner i et flydende miljø studeres ved hjælp af en deutereret buffer, og pulvertilstanden muliggør undersøgelse af enten proteinets indre dynamik med hydrogeneret proteinpulver hydreret med D 2 Oeller undersøgelsen af hydreringsvand til perdeutereret proteinpulver hydreret med H2O. I flydende tilstand tillader neutron backscattering typisk samtidig adgang til massecentrets selvdiffusion af proteiner (Fickian-type diffusion) og deres interne dynamik. Sidstnævnte er rygrads- og sidekædebevægelser, der normalt beskrives af den såkaldte springdiffusionsmodel eller andre 3,18. I hydrogeneret proteinpulver er proteindiffusionen fraværende, og kun intern dynamik skal modelleres. For hydreringsvand præsenterer bidragene fra translationelle og rotationsbevægelser af vandmolekyler en anden afhængighed af momentumoverførslen q, hvilket muliggør deres sondring i dataanalyseprocessen17.

Dette papir illustrerer neutron backscattering metoden med undersøgelsen af proteiner, der viste sig at være i stand til at udfolde sig, aggregere i en kanonisk form bestående af stakke af β-strenge - det såkaldte cross-β mønster 19,20 - og danne aflange fibre. Dette er den såkaldte amyloidaggregering, som er grundigt undersøgt på grund af dens centrale rolle i neurodegenerative lidelser som Alzheimers eller Parkinsons sygdomme21,22. Undersøgelsen af amyloidproteinerne er også motiveret af den funktionelle rolle, de kan spille 23,24 eller deres store potentiale for udvikling af nye biomaterialer25. De fysisk-kemiske determinanter for amyloidaggregeringen forbliver uklare, og der findes ingen generel teori om amyloidaggregering på trods af enorme fremskridt i de seneste år21,26.

Amyloidaggregering indebærer ændringer i proteinstruktur og stabilitet med tiden, hvis undersøgelse naturligt indebærer dynamik, knyttet til proteinkonformationsstabilitet, proteinfunktion og proteinenergilandskab27. Dynamik er direkte knyttet til stabiliteten af en bestemt tilstand gennem det entropiske bidrag til de hurtigste bevægelser28, og proteinfunktionen kan opretholdes af bevægelser på forskellige tidsskalaer fra sub-ps for lysfølsomme proteiner29 til ms for domænebevægelser, hvilket kan lettes af picosekund-nanosekund dynamik30.

To eksempler på anvendelse af neutron backscattering spektroskopi til at studere amyloidproteiner vil blive præsenteret, et i flydende tilstand for at studere proteindynamik og et i hydratiseret pulvertilstand for at studere hydreringsvanddynamik. Det første eksempel vedrører aggregering af lysozym i μm-store kugler (kaldet partikler) efterfulgt i realtid5, og det andet en sammenligning af vanddynamik i indfødte og aggregerede tilstande af det humane protein tau31.

Lysozym er et enzym involveret i immunforsvaret og består af 129 aminosyrerester. Lysozym kan danne partikler i deutereret buffer ved pD på 10,5 og ved en temperatur på 90 °C. Med neutronspredning viste vi, at tidsudviklingen af lysozyms center-of-mass diffusionskoefficient følger den enkelte eksponentielle kinetik af thioflavin T-fluorescens (en fluorescerende sonde, der bruges til at overvåge dannelsen af amyloid cross-β mønstre32), hvilket indikerer, at formationspartikeloverbygningerne og tvær-β mønstre forekommer i et enkelt trin med samme hastighed. Desuden forblev den interne dynamik konstant gennem hele aggregeringsprocessen, hvilket kan forklares enten ved en hurtig konformationsændring, der ikke kan observeres på NBS-instrumenter, eller ved fraværet af signifikant ændring i proteinintern energi ved aggregering.

Det humane protein tau er et iboende forstyrret protein (IDP) bestående af 441 aminosyrer til den såkaldte 2N4R-isoform, som især er involveret i Alzheimers sygdom33. Ved hjælp af neutron backscattering på pulvere af perdeutereret protein tau viste vi, at hydreringsvanddynamikken øges i fibertilstanden, med en højere population af vandmolekyler, der gennemgår translationelle bevægelser. Resultatet tyder på, at en stigning i hydreringsvandentropi kan drive amyloidflimmer af tau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered den deutererede buffer til proteiner i flydende tilstand

  1. Alle bufferens bestanddele opløses i ren D2O.
  2. Hvis pH-elektroden blev kalibreret i H2O, justeres pD i henhold til formlen pD = pH + 0,4 ved hjælp af NaOD eller DCl34.
    BEMÆRK: Brug af D 2O i stedet for H2O kan påvirke proteinopløseligheden, og bufferbetingelserne skal muligvis tilpasses (f.eks. ved en lille ændring i saltkoncentrationen).

2. Forbered H2O-hydreret pulver af perdeutereret protein

  1. Klargør prøveholderen.
    1. Rengør en flad aluminiumsprøveholder grundigt med dens indiumtrådforsegling og skruer med vand og ethanol, og lad den tørre.
      BEMÆRK: Der anvendes en flad prøveholder, således at pulveret kan fordeles homogent over overfladen. Pulvermængden skal være tilstrækkelig til, at den kan holdes mellem væggene og ikke falder ned, når prøveholderen placeres lodret.
    2. De forskellige dele af prøveholderens bund, låg og indiumtråd vejes separat på en præcisionsvægt.
    3. Indiumtrådtætningen anbringes i rillen på prøveholderens nederste del, således at der er en lille overlapning, hvor de to ender forbindes (figur 2A).
    4. Der anbringes en passende mængde frysetørret protein (typisk ~100 mg protein), således at det fylder den indre overflade af den nederste del af prøveholderen.
  2. Hydrat proteinpulveret.
    1. Prøveholderen anbringes i en ekssikkator med en petriskål indeholdendeP2O5-pulveri 24 timer for at tørre proteinpulveret35 fuldstændigt (figur 2B). Den tørre bunddel af prøveholderen indeholdende indiumforseglingen og tørpulveret afvejes for at opnåm tør.
      FORSIGTIG: P2O5 pulver er meget ætsende.
    2. Fjern P 2 O5 fra ekssikkatoren og læg en petriskål med D2O indeni. Kontroller pulverets masse regelmæssigt for at kontrollere hydratiseringsniveauet h = m hyd / mtørt, hvor mhyd og mtørt er massen af henholdsvis det hydratiserede pulver og det tørre pulver.
      BEMÆRK: For stærkt hydrofobe proteiner såsom insulin kan det være nødvendigt at øge temperaturen inde i ekssikkatoren for at få et højere damptryk og nå det ønskede hydreringsniveau h.
    3. Trin 2.2.1 og 2.2.2 gentages mindst tre gange for korrekt omdannelse af alle udskiftelige hydrogener til deuteroner.
      BEMÆRK: Alternativt kan cyklusser med frysetørring og opløsning i ren D2O anvendes til bedre H/D-udveksling, forudsat at proteinet ikke påvirkes af det.
    4. Hydrat pulveret til lidt over det ønskede niveau, lad den nederste del af prøveholderen med indiumtråden og hydreret pulver forblive på præcisionsbalancen, og vent på, at massen falder langsomt til den ønskede værdi for at få målet h (typisk 0,2-0,4, hvis et mellemstort kugleformet protein skal dækkes af et komplet hydreringslag).
    5. Sæt hurtigt låget på den nederste del, og luk prøveholderen først med fire skruer for at stoppe dampudvekslingen (supplerende figur S3A).
    6. Anbring og stram alle resterende skruer, indtil der ikke er noget synligt mellemrum mellem den nederste del og låget (supplerende figur S3B).
    7. Vej den forseglede prøveholder for at kontrollere for eventuelt hydreringstab via lækager efter neutroneksperimentet.

3. Udfør det usammenhængende neutronspredningseksperiment

  1. Diskuter og dobbelttjek konfigurationen af det instrument, der er nødvendigt til eksperimentet, med den lokale kontakt nogle uger før den tildelte stråletid.
  2. Klargør væsketilstandsprøven.
    1. Opløs proteinet i den deutererede buffer.
    2. Ved hjælp af vand bestemmes, hvilken passende mængde væske der skal hældes i prøveholderen (sørg for, at der ikke er overløb, når prøveholderen er lukket; Figur 2C).
      BEMÆRK: Følgende trin (3.3 og 3.4) beskriver et eksperiment udført på NBS-spektrometeret IN16B ved ILL 8,9 med anvendelse af en kryoovn som prøvemiljø. Instrumentstyringssystemet skifter fra det ene instrument til det andet, men arbejdsprincipperne forbliver de samme.
  3. Indsæt prøven.
    1. Prøvestokken (figur 2D) tørres grundigt, og den eventuelle foregående prøve fjernes efter kontrol af, at den ioniserende strålingsdosis er lavere end 100 μSv/h, før der håndteres noget materiale (ved ILL).
    2. Prøven placeres, det kontrolleres, om den er centreret korrekt i forhold til strålemidten (supplerende figur S4), og prøvestiften anbringes i kryoovnen (figur 2D). Tænd vakuumpumpen, så den når mindre end 10-3 bar, og skyl luften ud inde i kryoovnen ved at gentage følgende tre gange: Fyld kryoovnen med heliumgas, indtil atmosfærisk tryk er nået, og fjern gassen igen ved hjælp af vakuumpumpen.
      BEMÆRK: Hvis der er tale om en flad prøveholder, skal prøveholderen vende i en vinkel på 45° i forhold til det indgående lysbundt. Det nyttige momentumoverførselsområde kunne reduceres på grund af absorption og spredning af cellen. En stærk neutronabsorber såsom cadmium kan bruges til at maskere visse dele af prøveholderen (f.eks. skruer, tykke dele).
    3. Der indføres noget heliumgas i kryoovnen, således at trykket er ~0,05 bar.
  4. Indhent data (f.eks. ved hjælp af NOMAD på IN16B ved ILL, antages det, at brugeren foretrækker en temperatur på 200 K, før han erhverver et kvasielastisk neutronspektrum (QENS) spektrum, derefter E / IFWS under en temperaturrampe til 310 K ved 0,5 K pr. Min og endelig en QENS ved 310 K).
    1. Brug NOMAD til at trække og slippe en FurnaceCryostat-controller i affyringsrampen på udførelsesfanen. Indstil temperaturen til 200 K. Brug hurtig tilstand og en timeout på 30 minutter, så temperaturen har tid til at stabilisere sig. Klik på ikonet for roterende pile for at køre det i baggrunden, så data kan erhverves under temperaturfaldet.
    2. Træk og slip IN16DopplerSettings-controlleren , indstil hastighedsprofilen til Nøjagtig hastighed indstillet af Max ΔE, en værdi på 0,00 μeV og 128 kanaler for at opnå en EFWS-konfiguration.
    3. Træk og slip en tællecontroller , udfyld feltet Undertekst med et navn, der gør det nemt at identificere dataene, og indstil 60 gentagelser af 30 s scanninger (supplerende figur S5A).
    4. Træk og slip en IN16DopplerSettings-controller , indstil hastighedsprofilen til Sine indstillet af Speed med en værdi på 4,5 m/s og 2.048 kanaler for at opnå en QENS-konfiguration.
    5. Træk og slip en tællecontroller med 4 gentagelser af 30 minutters scanninger (supplerende figur S5B).
    6. For temperaturrampen skal du trække og slippe en FurnaceCryostat-controller , indstille temperaturen til 310 K, indstille Ramp til SetPoint med Δ = 0,05 K og 6 s. Brug en tid ud af 220 min (supplerende figur S6A).
    7. Brug en for løkke med 65 gentagelser. Indvendigt skal du indsætte en IN16DopplerSettings-controller som i trin 3.4.2 efterfulgt af et enkelt antal på 30 sekunder. Indsæt derefter IN16DopplerSettings som beskrevet tidligere, men med en energiforskydning på 1,5 μeV og 1.024 kanaler efterfulgt af et enkelt antal på 3 min (supplerende figur S6B).
    8. For at hente den sidste QENS ved 310 K skal du trække og slippe IN16DopplerSettings og Count-controllere , der er konfigureret som beskrevet i henholdsvis trin 3.4.4 og 3.4.5.
    9. Tryk på startknappen (højre trekant nederst i vinduet) for at køre scriptet.
      BEMÆRK: Hvert eksperiment kræver erhvervelse af kalibreringsdata; det vil sige den tomme celle til subtraktions- eller absorptionskorrektioner, bufferen alene ved de forskellige temperaturer, der bruges til at modellere baggrunden, og en måling af vanadium (eller tilsvarende prøven ved en temperatur på 10 K eller lavere) for at opnå instrumentets opløsningsfunktion.

4. Dataanalyse - QENS

  1. Importér datasættet ved hjælp af metoden 'IN16B_QENS.process()' i Python-softwaren nPDyn v3.x36
    >>>> fra nPDyn.dataParsers importerer IN16B_QENS

    >>> prøve = IN16B_QENS(
    ...
    ... [detGroup=... format>]
    ... ). proces()

    >>> prøve = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Udfør datarettelser (valgfrit) med følgende kommandoer (se dokumentationen til nPDyn for at få flere oplysninger, figur 3):
    #it antages, at data for tom celle, vanadium og buffer
    # blev importeret allerede i datasæt kaldet 'empty_cell', 'vanadium',
    # og 'buffer', henholdsvis.

    # til tom cellesubtraktion med en skaleringsfaktor
    # (fejl overføres automatisk)
    >>> prøve = prøve - 0, 95 * empty_cell

    # til korrektion ved hjælp af Paalman-Ping-koefficient
    # (gensidigt udelukker eksemplet ovenfor)
    >>> prøve = prøve.absorptionKorrektion(empty_cell)

    # til normalisering
    >>> prøve = prøve.normaliser (vanadium)

    # til binning langs observerbar akse
    # observerbar er aggregeringstiden her
    >>> prøve = prøve.bin(3, akse=0)
  3. Tilpas kalibreringsdataene. Datasættet - prøver, tom celle, deutereret buffer (hvis nødvendigt) og vanadium - kan tilpasses ved hjælp af indbyggede modeller eller en brugerdefineret model (se nPDyn-dokumentation):
    >>> fra nPDyn.models.builtins import (
    ... modelPVoigt,
    ... modelVand,
    ... modelCalibratedD2O,
    ...     )

    # indbyggede modeller bruger en søjlevektor af momentum
    # Overfør Q-værdier
    >>> q = vanadium.q[:, Ingen]

    # vanadium monteres ved hjælp af en pseudo-Voigt profil
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. Brug den indbyggede model til hydreringsvand kaldet 'modelWater'. Denne model lyder som vist ved Eq (4)17
    Equation 4 (4)
    Hvor a0, ar og at er skalarer, der tegner sig for det relative bidrag fra henholdsvis elastiske signaler, rotationsbevægelser og translationelle bevægelser; j1 (qd) er denl'te ordens sfæriske Bessel-funktion, hvor q er momentumoverførslen; d O-H-afstanden i vandmolekylet δ(ω) er Dirac-deltaet, som ganges med EISF her; N er den højeste orden af den anvendte sfæriske Bessel-funktion (typisk ~5); Equation 5 og er henholdsvis Lorentzian rotations- og Equation 11 translationelle bevægelser; b(q) er et fladt baggrundsudtryk. De sfæriske Bessel-funktioner giver det relative bidrag fra hver vinkelmomenttilstand af vandmolekylerne, og tallet N bestemmes ud fra momentumoverførselsområdet q-området. I tilfælde af et typisk NBS-spektrometer forklarer udtrykkene op til N = 4 næsten udelukkende signalet (supplerende figur S7).
    # Her bruges ligning 2 til hydreringsvand
    # konvolution med opløsningsfunktion og tilføjelse af
    # D2O-baggrund udføres automatisk med
    # leverede argumenter
    >>> sample.fit(modelVand(q),
    ... res=vanadium,
    ... bkgd=buffer,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    BEMÆRK: Bidragene fra rotations- og translationelle bevægelser skal være indviklede for at være helt strenge. Succesen med en additivmodel skal tilskrives tilstedeværelsen af forskellige vandpopulationer på proteinoverfladen og det begrænsede energiområde, der er tilgængeligt.
  5. Brug følgende til at afbilde dataene (figur 4):
    >>> fra nPDyn.plot import plot
    >>> plot(prøve)

5. Dataanalyse - temperaturrampe, elastiske scanninger med fast vindue (EFWS)

  1. Brug en procedure svarende til afsnit 4 til at normalisere temperaturrampedataene ved signalet ved den laveste temperatur (typisk 10 K):
    >>> fra nPDyn.dataParsere importerer IN16B_FWS

    >>> prøve = IN16B_FWS(
    ... ,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ). proces()

    # normalisering med de 5 første punkter på det observerbare
    # akse, som svarer til temperaturen
    >>> prøve /= prøve[:5].middelværdi(0)

    # Momentum Transfer Q-området, der bruges her, er mindre
    # da den anvendte model kun gælder for lav q
    >>> prøve = sample.get_q_range(0,2; 0,8)
  2. Brug en simpel gaussisk model til at starte, hvis bredde er givet ved den såkaldte gennemsnitlige kvadrerede forskydning (MSD). Byg og tilpas modellen ved hjælp af følgende kommandoer:
    >>> importerer numpy som np
    >>> fra nPDyn.models importere parametre, model, komponent

    # A er en skaleringsfaktor
    >>> params = Parametre(
    ... a={'værdi': 1, 'grænser': (0, np.inf)},
    ... msd={'værdi': 1, 'grænser': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> model = Model (params)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... »Gaussisk«
    ... lambda x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, Ingen])

    >>> plot(prøve)
    BEMÆRK: Den gaussiske tilnærmelse gælder altid for q2MSD << 1, men bredere momentumoverførselsområde kan bruges til relativ sammenligning mellem prøver. Mere sofistikerede modeller, der går ud over den gaussiske tilnærmelse, er blevet udviklet37,38,39.

6. Dataanalyse - elastiske og uelastiske scanninger med faste vinduer (E/IFWS)

  1. I lighed med trin 4 skal du importere datasættet, men bruge klassen "IN16B_FWS":
    >>> fra nPDyn.dataParsere importerer IN16B_FWS

    >>> prøve = IN16B_FWS(
    ...
    ... [detGroup=]
    ... ). proces()

    >>> prøve = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Tilpas kalibreringsdataene og prøvedataene.
    1. Analyser E/IFWS-dataene ved hjælp af en generaliseret MSD40 eller ved at betragte dem som grove QENS-spektre (med kun få datapunkter på energiaksen). Når E/IFWS betragtes som grov-QENS, bruges modeller, der bruges til QENS, til at passe hele E/IFWS-datasættet på én gang (global tilpasning af energioverførsler og momentumoverførsler).
      BEMÆRK: Sidstnævnte løsningsmodeller for QENS på E/IFWS-data anvendes her, hvor momentumoverførselsafhængigheden af massecenterdiffusion og proteinintern dynamik pålægges.
    2. Modellere proteindynamikken i væsker ved hjælp af følgende Eq (5) (»modelProteinJumpDiff« i nPDyn):
      Equation 6 (5)
      hvor R(q,ω) er opløsningsfunktionen; β en skalar uafhængig for hver momentumoverførsel q; a0 er den elastiske usammenhængende strukturfaktor (EISF) Equation 7 en Lorentzian, der tegner sig for massecenterdiffusion med en bredde givet ved Eq (6); Equation 12 er en Lorentzian, der inkluderer massecenterdiffusion og et bidrag efter springdiffusionsmodellen14 , der tager højde for intern dynamik (Eq (7); Equation 8 er det tilpassede signal fra D2O omskaleret med dets volumenfraktion i prøven.
      γ = Dsq2 (6)
      Ds er selvdiffusionskoefficienten.
      Equation 9 (7)
      Di er den tilsyneladende diffusionskoefficient for intern dynamik og τ en afslapningstid for diffusive bevægelser.
      >>> fra nPDyn.models.builtins import (
      ... modelPVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... modelCalibratedD2O,
      ... )

      # indbyggede modeller bruger en søjlevektor af momentum
      # Overfør Q-værdier
      >>> q = vanadium.q[:, Ingen]

      # vanadium monteres ved hjælp af en pseudo-Voigt profil
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # for ren D2O, en model med kalibreret linjebredde
      # for forskellige temperaturer er inkluderet i nPDyn
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # Her bruges ligning 3 til flydende prøver
      # konvolution med opløsningsfunktion og tilføjelse af
      # D2O-baggrund udføres automatisk med de # angivne argumenter
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=vanadium,
      ... bkgd=buffer,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. De tilpassede data plottes ved hjælp af:
    >>> fra nPDyn.plot import plot
    >>> plot(prøve)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aggregeringen af lysozym i partikler blev udført ved 90 °C med en proteinkoncentration på 50 mg/ml i en deutereret buffer (0,1 M NaCl ved pD 10,5). Dannelsen af partikler udløses af temperaturstigningen til 90 °C og sker inden for 6 timer (supplerende figur S8). Dataindsamlingen blev udført på IN16B, som beskrevet i protokollen ovenfor (data er permanent kurateret af ILL og tilgængelige på http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

Et QENS-spektrum blev erhvervet ved 7 °C for fuldt ud at karakterisere den oprindelige tilstand. Derefter blev temperaturen øget til 90 °C (tager typisk ~30 min på IN16B, supplerende figur S9) for at udløse aggregeringsprocessen. Kinetikken kan følges ved hjælp af et glidende gennemsnit af QENS-spektre, hvilket giver adgang til hele spektret af energioverførsel, men med en begrænset opløsning i tid. Tidsopløsningen kan forbedres til ~1 min ved hjælp af EFWS og til ~20 min ved E/IFWS ved fire energioverførselsværdier5.

I det præsenterede eksempel undersøgte vi energioverførsler på 0, 0,6, 1,5 og 3 μeV. E/IFWS-scanningerne indsamles løbende under aggregeringsprocessen, og der blev erhvervet et QENS-spektrum for den endelige tilstand ved 90 °C. E/IFWS-dataene blev korrigeret for absorption ved hjælp af E/IFWS i den tomme celle og normaliseret ved hjælp af vanadiumdataene.

For lysozym E/IFWS observerer vi en stigning i signalet i tid ved lav momentumoverførsel og lav energioverførsel, mens signalet ved høj energioverførsel og lav momentumoverførsel falder (supplerende figur 10). Denne kvalitative observation indikerer dannelsen af større objekter, diffunderer langsommere og bekræfter, at aggregeringsprocessen fandt sted. Analysen resulterer ifølge Eq (4) i en indledende massecenterdiffusionskoefficient på 15 Å2/ns i overensstemmelse med tilstedeværelsen af små proteinklynger (understøttet af dynamisk lysspredning og HYDROPRO-beregninger 5,41), som derefter eksponentielt falder over tid (figur 5). Den tilsyneladende diffusionskoefficient for intern dynamik forbliver konstant gennem hele aggregeringsprocessen. Derfor synes dannelsen af lysozympartikler at forekomme i en enkelt aggregeringsfase. Fraværet af ændringer i den interne proteindynamik tyder på, at enten omdannelsen til cross-β og den mulige tilknyttede ændring i energi er for hurtig, eller at andre drivende virkninger, såsom en stigning i opløsningsmiddelentropi, kan dominere fuldt ud inden for det undersøgte energiområde.

Undersøgelsen af hydreringsvanddynamik omkring monomerer og fibre af tau blev udført på SPHERES ved Maier-Leibnitz Zentrum (MLZ) i Garching, Tyskland, ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor for pulverprøver. Ca. 100 mg deutereret tau-proteinpulver, hydreret til 0,4 gH2Opr. g protein, blev anvendt. EFWS blev erhvervet under en temperaturrampe og QENS-spektre ved konstant temperatur. EFWS blev registreret fra 20 K og øgede temperaturen til 300 K med en hastighed på 0,2 K / min, mens den kontinuerligt indsamlede data under 5 minutters scanninger.

QENS-spektrene blev registreret ved 20 og ved 280 K. EFWS-dataene blev tilpasset ved hjælp af en simpel gaussisk over momentumoverførslen q-området 0,2 Å-1 < q < 0,8 Å-1 for at udtrække MSD (supplerende figur S11A). MSD-værdierne ligger over gyldighedsgrænsen for den gaussiske model. Derfor anbefales det i dette tilfælde at udforske andre modeller ud over den gaussiske tilnærmelse37,38,39. Ved temperaturer højere end 220 K er hydreringsvandet omkring tau-fibre betydeligt mere mobilt end hydreringsvand omkring tau-monomerer (figur 6). Tilpasningen af QENS-data giver brugerne mulighed for at opnå linjebredden og det relative bidrag fra elastiske, roterende og translationelle bevægelser af hydreringsvand i prøven (supplerende figur S11B). Det ser ud til, at fraktionen af vandmolekyler, der gennemgår translationel bevægelse, øges omkring fibre, og både translationelle og rotationsdiffusionskoefficienter for vandmolekyler øges omkring fibre 17,31. I modsætning hertil ændrede ps-ns interne dynamik i proteintau, der reflekterede rygrads- og sidekædebevægelser, ikke ved fibrillering.

Figure 2
Figur 2: Bunden af en flad aluminiumsprøveholder. (A) Den flade aluminiumsprøveholder præsenterer en central del udsat for neutronerne, hvor proteinpulveret holdes inden for et lille mellemrum - typisk ~ 0,3 mm - mellem basen og låget. En indiumtråd kan bruges til tætning, da den modstår temperaturstigninger op til 90 °C. I tilfælde af højere temperaturer kan en teflonforsegling anvendes. B) Proteinpulveret anbringes i bunden af prøveholderen med indiumtråden på plads. Prøveholderen anbringes i en ekssikkator under tilstedeværelse af enten P2O5 til tørring ellerH2O/D2O til hydrering. Vakuumfedt tilsættes for at undgå lækage mellem bunden og låget på ekssikkatoren. Vakuum kan bruges med forsigtighed til at fremskynde tørringsprocessen. Det kan være nødvendigt at opvarme bunden af ekssikkatoren til stærkt hydrofobe prøver. (C) Proteinopløsningen anbringes mellem de indre og ydre cylindre. Sørg for ikke at pipette for meget væske (der må ikke være overløb, når prøveholderen er lukket). Indiumtråden placeres i den cirkulære rille. (D) Prøvepinden (i baggrunden) giver kontrol over prøvens højde og retning og kan omfatte forskellige regulatorer og detektorer til prøvemiljøer (temperatur, tryk). Prøvepinden indsættes fra toppen af kryoovnen (foran), som giver kontrol over temperaturen under eksperimentet. Under eksperimentet rammer neutronstrålen normalt bunden af kryoovnen, som angivet med det hvide rektangel (strålens størrelse afhænger af instrumentkonfigurationen). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Datakorrektioner og normalisering kan forbedre tilpasningen. Dataene blev importeret ved hjælp af nPDyn, som beskrevet i protokollen. Til venstre blev datasættet kun normaliseret ved hjælp af dataene fra skærmen. Til højre blev signalet fra den tomme dåse brugt sammen med Paalman-Ping-koefficienterne43 til at korrigere for neutronabsorption fra prøveholderen. Derefter blev den tilpassede model for vanadiumsignalet integreret uafhængigt for hver momentumoverførsel q, og resultatet blev brugt til at normalisere prøvedatasættet. I begge plots betegner S(q,ω) spredningssignalet, q er momentumoverførslen og Equation 3 er energioverførslen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Afbildningsvindue genereret af nPDyn, der viser resultatet af tilpasningen. QENS-dataene blev tilpasset ved hjælp af nPDyn, som beskrevet i protokollen. Afbildningsvinduet giver brugerne mulighed for at plotte dataene langs forskellige akser - observerbare (tid, temperatur eller tryk), momentumoverførsel q eller energioverførsel - og selektorer er tilgængelige for at navigere langs de andre akser. Der findes forskellige typer plot, hvor det enkle »plot« præsenteres i (A) og »analyse - q-wise« i (B). Knappen 'Plot' viser de forskellige datasæt i separate underplots, knappen 'Sammenlign' viser datasættene i samme plot, '3D-plottet' viser datasættene i forskellige 3D-underplots svarende til s, knappen 'Analyse - q-wise' viser de tilpassede parametre som funktionen af momentumoverførsel q og 'Analyse - observerbar - observerbar' viser de tilpassede parametre som funktion af observerbar (tid, temperatur eller tryk). Forkortelse: QENS = kvasielastisk neutronspredning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Lysozymaggregering sker i en et-trins proces med konstant intern dynamik. Lysozymet blev opløst i aggregeringsbufferen (beskrevet andetsteds5), og E/IFWS blev erhvervet under aggregering, hvilket blev udløst ved at øge temperaturen til 90 °C. Efter absorptionskorrektion med en tom celle og normalisering ved anvendelse af vanadiumsignalet blev dataene analyseret ved hjælp af springdiffusionsmodellen som beskrevet i protokollen. Den monterede selvdiffusionskoefficient for massecentrum afbildes som en funktion af tiden (blå trekanter) sammen med den tilsyneladende diffusionskoefficient for intern dynamik (orange firkanter). Dette tal er fra 5. Forkortelse: E/IFWS = elastiske og uelastiske scanninger med fast vindue. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Hydreringsvanddynamikken øges omkring tau-fibre. H2O-hydratiserede pulvere af deutererede taufibre og monomerer blev forseglet i en flad aluminiumsprøveholder, og EFWS-data blev erhvervet under en temperaturrampe fra 20 til 300 K. Efter absorptionskorrektion med en tom celle og normalisering ved anvendelse af vanadiumsignalet blev dataene analyseret ved hjælp af springdiffusionsmodellen som beskrevet i protokollen. Dette billede blev gentegnet ved hjælp af et mindre q-område (0,2 < q < 0,8 Å-1) fra data fra 31. Forkortelse: EFWS = elastiske scanninger med fast vindue. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Fotografier af instrumentet IN16B ved ILL. (øverst) Instrumentet IN16B set fra den strålingskontrollerede zone, der er dedikeret til instrumentet. Den indkommende stråle bevæger sig inden for neutronstyringen til vakuumkammeret, som indeholder de fleste af instrumentets elementer (PST-helikopter, analysatorer, prøve, detektorer). (nederst) Det indre af vakuumkammeret. PST-helikopteren er synlig, ligesom analysatorerne omkring kryoovnen, der indeholder prøven. Detektorerne er placeret bag kryoovnen. Venligst udlånt af Laurent Thion, ecliptique. Forkortelse: PST = fase rumtransformation. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Skitse af IN16B i klassisk (med Doppler-drev) og BATS-tilstand. (A) Neutronstrålen monokromatiseres delvis af hastighedsvælgeren. Derefter vil baggrunds- og PST-helikopterne producere en neutronpuls, hvorfra en energiprofil vælges af Doppler-monokromatoren (E / IFWS eller QENS-tilstand). Neutronerne spredes derefter af prøven, og en enkelt energi reflekteres mod detektorerne af analysatorerne. Venligst udlånt af ILL. (B) BATS-helikopterne bruges til at definere en enkelt neutronpuls med et defineret energiområde. Neutronstrålen monokromatiseres delvist af hastighedsvælgeren. Derefter fjerner baggrundshakkeren uønskede neutroner, der ikke tilhører den valgte puls. Neutronerne spredes derefter af prøven, og en enkelt energi reflekteres mod detektorerne af analysatorerne. Venligst udlånt af ILL. Forkortelser: BATS = backscattering og time-of-flight-spektrometer; PST = fase rumtransformation; E/IFWS = elastiske og uelastiske scanninger med faste vinduer; QENS = kvasielastisk neutronspredning; PG = pyrolytisk grafit. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Prøveholderen lukkes hurtigt, efter at pulveret har nået den ønskede hydrering og forsegles. (A) Den flade prøveholder lukkes hurtigt med fire skruer. Et lille hul forbliver på grund af indiumtråden. De andre skruer tilsættes derefter, og prøveholderen forsegles langsomt ved forsigtigt at stramme hver skrue flere gange for at lade indiumet slappe af. (B) Den flade prøveholder er forseglet forsvarligt, når der ikke længere er noget synligt mellemrum mellem holderens bund og låget. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: Prøveholderen er centreret i forhold til neutronstrålen. En cylindrisk prøveholder er anbragt på prøvepinden. Prøveholderens position kontrolleres således, at bjælken rammer holderens nederste del. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S5: Erhvervelse af EFWS efterfulgt af QENS på IN16B med NOMAD. (A) De relevante controllere trækkes og slippes ind i affyringsrampen som forklaret i protokollen (trin 3.4.1 til 3.4.3). Det kan være nødvendigt at klikke på låsen (grønt ikon øverst til højre - lodret rude) for at få kontrol over grænsefladen. (B) De relevante controllere trækkes og slippes ind i affyringsrampen som forklaret i protokollen (trin 3.4.4 til 3.4.5). Her hedder de sidste to controllere IN16DopplerSettings og Count. Forkortelser: QENS = kvasielastisk neutronspredning, EFWS = elastiske scanninger med fast vindue. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S6: Opsætning af en temperaturrampe og E / IFWS på IN16B med NOMAD. (A) FurnaceCryostat-regulatoren tilføjes i affyringsrampen og konfigureres som forklaret i protokollen (trin 3.4.6). (B) For loop-controlleren tilføjes i affyringsrampen , og relevante controllere indsættes i den og konfigureres som forklaret i protokollen (trin 3.4.7). Forkortelse: E/IFWS = elastiske og uelastiske scanninger med fast vindue. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S7: De første fem sfæriske Bessel-funktioner forklarer det meste af hydreringsvandets rotationsbidrag. De første otte sfæriske Bessel-funktioner afbildes ved hjælp af en værdi d = 0,98 Å og værdier for momentumoverførsel q fra 0 til 3 Å (ensfarvede linjer). Momentumoverførselsområdet på 0,3 Å < q < 1,8 Å er afgrænset af de blå stiplede linjer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S8: Lysozym danner reproducerbart partikler. Lysozym blev opløst i aggregeringsbufferen (fremstillet som beskrevet i protokollen, trin 1), og ThT blev tilsat til en slutkoncentration på 2 μM for at overvåge dannelsen af tvær-β struktur ved hjælp af fluorescens. Plottet repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige målinger, og fejlbjælkerne er standardafvigelsen. Indsatsen viser et fluorescensmikroskopifotografi af de partikler, der dannes efter 6 timers aggregering. Skalabjælke = 20 μm. Dette tal er fra 5. Forkortelse: ThT = thioflavin T. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S9: Hurtig temperaturrampe som tilgængelig på IN16B. I hurtig tilstand på IN16B kan temperaturen øges fra 280 K til 363 K på cirka 30 min. Dette tal er fra 5. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S10: E/IFWS-data om lysozym under aggregering i partikler. Lysozymet blev opløst i aggregeringsbufferen (beskrevet andetsteds5), og E/IFWS blev erhvervet under aggregering, hvilket blev udløst ved at øge temperaturen til 90 °C. Data-efter absorptionskorrektion med en tom celle og normalisering ved hjælp af vanadiumsignalet - plottes mod momentumoverførsel q og tid for den forskellige målte energioverførsel, 0 μeV (øverst til venstre), 0,6 μeV (øverst til højre), 1,5 μeV (nederst til venstre) og 3 μeV (nederst til højre). For hvert delplot svarer den lodrette akse til spredningssignalet S(q, ΔE), plottet mod forsøgstiden i timer og momentumoverførslen q. Dette tal er fra 5. Forkortelse: E/IFWS = elastiske og uelastiske scanninger med fast vindue. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S11: Montering af hydreringsvanddata for tau. (A) Tilpasning af EFWS-dataene ved hjælp af en gaussisk. H2O-hydreret pulver af deutererede tau-monomerer blev forseglet i en flad aluminiumsprøveholder, og EFWS blev erhvervet under en temperaturrampe fra 20 til 300 K. De eksperimentelle data (elastisk signal S(q, 0) på lodret akseblå linje med fejlbjælker) afbildes for momentumoverførselsområdet q-området 0,2 < q < 0,6 Å-1 sammen med den monterede gaussiske, der bruges til at udtrække MSD. (B) Translationelle og roterende bevægelser af hydreringsvand opnået fra QENS-montering. H2O-hydratiserede pulvere af deutererede tau-fibre (venstre) og monomerer (højre) blev forseglet i en flad aluminiumsprøveholder, og QENS-data blev erhvervet ved 280 K. De eksperimentelle data (intensitet S (q, ω) som funktion af energioverførsel) for fibre (blå trekanter) og monomerer (grønne prikker) plottes sammen med den monterede model (sort solid linje) og dens komponenter, baggrund (blå), opløsningsfunktion (grøn), rotationer (rød) og oversættelser (cyan) for momentumoverførslen q = 0,783 Å-1. Dette tal er fra 31. Forkortelser: QENS = kvasielastisk neutronspredning, EFWS = elastiske scanninger med fast vindue; MSD = gennemsnitlig kvadreret forskydning. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neutronspektroskopi er den eneste metode, der gør det muligt at undersøge proteinprøvers ensemble-gennemsnitlige ps-ns-dynamik uanset proteinets størrelse eller opløsningens kompleksitet, når deuteration anvendes6. Specifikt ved at undersøge selvdiffusion af proteinsamlinger i opløsning kan den hydrodynamiske størrelse af sådanne samlinger entydigt bestemmes. Ikke desto mindre er metoden almindeligvis begrænset af den lave neutronflux, hvilket indebærer lange erhvervelsestider og behovet for store mængder prøve (typisk 100 mg protein) for at opnå et godt signal-støj-forhold inden for den tildelte stråletid.

Prøveforberedelse (protokoltrin 1 og 2). For væsketilstandsprøver er den mindste koncentration, der kan anvendes, ~ 50 mg / ml (lavere koncentrationer kan anvendes på bekostning af forlængede erhvervelsestider). Høj proteinkoncentration er forbundet med hurtigere fibrilleringshastigheder, hvilket hjælper med at tilpasse målingen i den tildelte stråletid, men kan også påvirke aggregeringsvejen44. Derfor er grundig prøvekarakterisering med komplementære metoder, såsom atomkraft eller elektronmikroskopi, nødvendig.

Prøveholderens materiale er også et punkt, der skal tages i betragtning ved forberedelsen af prøverne, da aluminiumlegeringer udsættes for korrosion45. En typisk aluminiumslegering, der giver god korrosionsbestandighed og har lav neutronabsorbans, er den europæiske norm (EN) AW-6060 [AlMgSi] lavet af 98% -98,75% Al, 0,1% Ti, 0,15% Zn, 0,05% Cr, 0,35%-0,6% Mg, 0,1% Mn, 0,1% Cu, 0,1% -0,3% Fe og 0,3% -0,6% Si. Korrosion kan minimeres for eksempel ved at reducere tiden i prøveholderen eller bruge en beskyttende belægning (som kan føje til baggrundssignalet) såsom nikkel eller guld.

For pulverprøver af hydrogenerede proteiner blev frysetørringsproceduren effektivt afsluttet med et trin i en ekssikkator under tilstedeværelse af P2O5-pulver for atfjerne så meget resterende let vand som muligt35. For pulverprøver anbefales det også at karakterisere (ved hjælp af atomkraftmikroskopi og røntgenpulverdiffraktion) pulveret i dets endelige, hydratiserede tilstand og vurdere effekten af deuteration, frysetørring og dampdiffusion på både monomer- og fibertilstande. Især kan frysetørring bryde fibrene, hvilket resulterer i forkortede segmenter uden at påvirke morfologien. Desuden er det blevet observeret ved røntgeneffektdiffraktion, at langsom afkøling i stedet for flashkøling i flydende nitrogen kunne fremkalde tilstedeværelsen af amyloidlignende strukturer (ikke offentliggjort resultat).

Dataindsamling (protokoltrin 3). Det tilrådes at planlægge dataindsamlingen med den lokale kontakt forud for eksperimentet (selvom det er blevet diskuteret under forslagsskrivningsprocessen). Dataindsamlingsplanen kan ændres efter de første scanninger afhængigt af det opnåede signal-støj-forhold. Især til tidsopløste eksperimenter giver brugen af E/IFWS mulighed for hurtig dataindsamling - 30 s til 1 min for den elastiske linje, 4-5 min for et datapunkt ved 3 μeV5 - men rækkevidden af tilgængelige energioverførsler er i sagens natur begrænset. Alternativt kan et glidende gennemsnit af QENS-data bruges46. Til dette formål tilbyder den nye backscattering og time-of-flight-spektroskopi (BATS) på IN16B en højere flux end den klassiske IN16B med et energiområde på ±150 μeV (eller højere afhængigt af den anvendte konfiguration) på bekostning af lavere opløsning i energi11. Derfor anbefales BATS-indstillingen til tidsopløste undersøgelser, især for processer som amyloidaggregering, der finder sted over flere timer.

Dataanalyse (protokoltrin 4, 5 og 6). Spredningsfunktionen S(q,ω) omfatter alle typer bevægelser i prøven, og modellerne beskrevet i ovenstående protokol er approksimationer. Især for IDP i flydende tilstand kan de store bevægelser af den uordnede kæde forekomme over samme længde og tidsskala som massecenterdiffusionen af hele proteinet. Derfor skal brugeren huske på, at adskillelsen af massecenterdiffusion og proteinintern dynamik ikke altid er ligetil. Tilpasningsproceduren kan drage fordel af information om massecenterdiffusion opnået via komplementære metoder, således at denne parameter kan fastsættes (idet man husker på, at andre metoder kan tilvejebringe en kollektiv diffusionskoefficient forbundet med forskellige tids- og længdeskalaer) for at opnå et mere robust resultat for intern dynamik.

Ud over neutronspredning kan dynamikken i et molekylært system karakteriseres ved kernemagnetisk resonans (NMR), som giver lokal information om isotopmærkede proteiner og på en lang række tidsskalaer47,48,49. Metoden er blevet brugt med succes til at studere amyloidsystemer 48,50,51,52,53, men tillader ikke brugere blot at studere hydreringsvand eller følge amyloidaggregeringsprocessen i realtid på grund af den iboende begrænsning af proteinstørrelsen. Den seneste udvikling inden for elektronparamagnetisk resonansspektroskopi (EPR) og den EPR-afledte metode Overhauser dynamisk nuklear polarisering (ODNP) giver et godt perspektiv, når det kombineres med neutronspredning. Selvom site-directed spin labeling (SDSL), EPR og ODNP kan sonde henholdsvis protein54 og hydreringsdynamik55 på ps-ns tidsskalaen omkring den introducerede spin-etiket.

Disse metoder blev brugt til at studere aggregeringen af tau56,57-proteinet og vil tilbyde stor komplementaritet med neutronspredning, der kan opnå lignende information, men som gennemsnit over hele prøven. Desuden kan infrarød spektroskopi give dynamisk information til højenergibevægelser forbundet med specifikke strukturelle mønstre, men kompleksiteten af proteinmiljøet (anvendt buffer) kan påvirke datafortolkning58,59. Neutron backscattering teknikkerne giver et unikt og komplementært syn på protein og hydrering vand dynamik på ps-ns tidsskala sammen med resultater fra de førnævnte metoder. De kræver ikke specifik mærkning af prøven, signalkvaliteten er ikke følsom over for proteinets størrelse, og målinger kan udføres in vivo eller i meget komplekse, deutererede miljøer såsom deutereret bakterielysat 3,6,7. Da denne metode giver et ensemble-gennemsnitligt resultat, suppleres det godt med molekylære dynamiksimuleringer for at opnå atomisk detaljeret information om det undersøgte system. Simuleringerne kan let valideres ved en direkte sammenligning mellem det eksperimentelle datasæt og de teoretiske QENS-spektre beregnet ud fra simuleringsbanen ved hjælp af software som mdanse60.

Med hensyn til amyloidsystemer har neutron backscattering vist sig nyttig til at karakterisere ps-ns protein og vanddynamik for forskellige systemer og tilstande 5,31,61,62,63,64. Især blev neutron backscattering brugt til at afsløre sammenhængen mellem andelen af proteinsekvensen involveret i cross-β strukturen og amplituden af vandentropiforøgelsen ved fibrillering (upublicerede resultater). Desuden tillader udvikling af prøvemiljøer samtidig erhvervelse af neutronspektre og enten dielektriske afslapningsdata65 eller Raman-spredningsdata66. Desuden er diffraktionsdetektorer til stede på IN16B for at opnå strukturelle data sammen med dynamiske data. Derudover forventes den indkommende neutronflux at blive forbedret til BATS-tilstanden i IN16B i den nærmeste fremtid takket være brugen af den såkaldte variable fokuseringsguide, hvis geometri efter behov kan tilpasses den anvendte instrumentelle opsætning. At skubbe udviklingen af sofistikeret prøvemiljø og instrumentering yderligere ville give mulighed for endnu mere komplekse eksperimenter i fremtiden og muligvis levere yderligere dynamisk og strukturel information på samme tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takker Michaela Zamponi ved Jülich Centre for Neutron Science ved Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Tyskland, for en del af neutronspredningseksperimenterne udført på instrumentet SPHERES. Dette arbejde har nydt godt af aktiviteterne i konsortiet Deuteration Laboratory (DLAB), der finansieres af Den Europæiske Union i henhold til kontrakterne HPRI-2001-50065 og RII3-CT-2003-505925, og af UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC)-finansierede aktiviteter inden for Institut Laue Langevin EMBL DLAB under tilskud GR/R99393/01 og EP/C015452/1. Støtte fra Europa-Kommissionen under det 7. rammeprogram gennem nøgleaktionen: styrkelse af det europæiske forskningsrum, forskningsinfrastrukturer anerkendes [kontrakt 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot og Christian Beck takker Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF, bevillingsnummer 05K19VTB) for finansiering af deres postdoc-stipendier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
  2. Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. Acta Crystallographica Section D. 74 (8), 715-726 (2018).
  3. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7 (2019).
  4. Martel, A., et al. Membrane permeation versus amyloidogenicity: A multitechnique study of islet amyloid polypeptide interaction with model membranes. Journal of the American Chemical Society. 139 (1), 137-148 (2017).
  5. Pounot, K., et al. Tracking internal and global diffusive dynamics during protein aggregation by high-resolution neutron spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (15), 6299-6304 (2020).
  6. Grimaldo, M., et al. Protein short-time diffusion in a naturally crowded environment. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (8), 1709-1715 (2019).
  7. Jasnin, M., Stadler, A., Tehei, M., Zaccai, G. Specific cellular water dynamics observed in vivo by neutron scattering and NMR. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10154-10160 (2010).
  8. Frick, B. The neutron backscattering spectrometer IN16 at ILL-high energy resolution with high intensity and excellent signal-to-noise ratio. Neutron News. 13 (2), 15-22 (2002).
  9. Frick, B., Mamontov, E., van Eijck, L., Seydel, T. Recent backscattering instrument developments at the ILL and SNS. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 224 (1-2), 33-60 (2010).
  10. Frick, B., Combet, J., van Eijck, L. New possibilities with inelastic fixed window scans and linear motor Doppler drives on high resolution neutron backscattering spectrometers. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 669, 7-13 (2012).
  11. Appel, M., Frick, B., Magerl, A. A flexible high speed pulse chopper system for an inverted neutron time-of-flight option on backscattering spectrometers. Scientific Reports. 8 (1), 13580 (2018).
  12. Squires, G. L. Introduction to the theory of thermal neutron scattering. , Dover Publications. Mineola N.Y. (1996).
  13. Bee, M. Quasielastic neutron scattering. , Available from: http://inis.iaea.org/Search/search.aspx?orig_q=RN:20038756 (1988).
  14. Singwi, K. S., Sjölander, A. Diffusive motions in water and cold neutron scattering. Physical Review. 119 (3), 863-871 (1960).
  15. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear diatomic liquids: i. free rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1279-1297 (1966).
  16. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear liquid: ii. hindered rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1299-1311 (1966).
  17. Schirò, G., et al. Translational diffusion of hydration water correlates with functional motions in folded and intrinsically disordered proteins. Nature Communications. 6, 6490 (2015).
  18. Grimaldo, M., et al. Hierarchical molecular dynamics of bovine serum albumin in concentrated aqueous solution below and above thermal denaturation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (6), 4645-4655 (2015).
  19. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 16 (11), 673-677 (1968).
  20. Bonar, L., Cohen, A. S., Skinner, M. M. Characterization of the Amyloid Fibril as a Cross-β Protein. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 131 (4), 1373-1375 (1969).
  21. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  22. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  23. Maji, S. K., et al. Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science. 325 (5938), 328-332 (2009).
  24. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  25. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. 28 (31), 6546-6561 (2016).
  26. Stephens, A. D., Kaminski Schierle, G. S. The role of water in amyloid aggregation kinetics. Current Opinion in Structural Biology. 58, 115-123 (2019).
  27. Adamcik, J., Mezzenga, R. Amyloid polymorphism in the protein folding and aggregation energy landscape. Angewandte Chemie International Edition. 57 (28), 8370-8382 (2018).
  28. Liu, Z., et al. Entropic contribution to enhanced thermal stability in the thermostable P450 CYP119. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10049-10058 (2018).
  29. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2018).
  30. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
  31. Fichou, Y., et al. Hydration water mobility is enhanced around tau amyloid fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), 6365-6370 (2015).
  32. Burns, J., Pennock, C. A., Stoward, P. J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. The Journal of Pathology and Bacteriology. 94 (2), 337-344 (1967).
  33. Iqbal, K., Liu, F., Gong, C. -X., Grundke-Iqbal, I. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies. Current Alzheimer Research. 7 (8), 656-664 (2010).
  34. Krȩżel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  35. Dolman, M., Halling, P. J., Moore, B. D., Waldron, S. How dry are anhydrous enzymes? Measurement of residual and buried 18O-labeled water molecules using mass spectrometry. Biopolymers. 41 (3), 313-321 (1997).
  36. Pounot, K. kpounotnPDyn: v3.0.0. Zenodo. , (2021).
  37. Yi, Z., Miao, Y., Baudry, J., Jain, N., Smith, J. C. Derivation of mean-square displacements for protein dynamics from elastic incoherent neutron scattering. Journal of Physical Chemistry B. 116 (16), 5028-5036 (2012).
  38. Peters, J., Kneller, G. R. Motional heterogeneity in human acetylcholinesterase revealed by a non-Gaussian model for elastic incoherent neutron scattering. The Journal of Chemical Physics. 139 (16), 165102 (2013).
  39. Zeller, D., Telling, M. T. F., Zamponi, M., García Sakai, V., Peters, J. Analysis of elastic incoherent neutron scattering data beyond the Gaussian approximation. The Journal of Chemical Physics. 149 (23), 234908 (2018).
  40. Roosen-Runge, F., Seydel, T. A generalized mean-squared displacement from inelastic fixed window scans of incoherent neutron scattering as a model-free indicator of anomalous diffusion confinement. EPJ Web of Conferences. 83, 02015 (2015).
  41. Ortega, A., Amorós, D., García de la Torre, J. Prediction of hydrodynamic and other solution properties of rigid proteins from atomic- and residue-level models. Biophysical Journal. 101 (4), 892-898 (2011).
  42. Hennig, M., Frick, B., Seydel, T. IUCr Optimum velocity of a phase-space transformer for cold-neutron backscattering spectroscopy. Journal of Applied Crystallography. 44 (3), 467-472 (2011).
  43. Paalman, H. H., Pings, C. J. Numerical evaluation of X-ray absorption factors for cylindrical samples and annular sample cells. Journal of Applied Physics. 33 (8), 2635-2639 (1962).
  44. Ow, S. -Y., Dunstan, D. E. The effect of concentration, temperature and stirring on hen egg white lysozyme amyloid formation. Soft Matter. 9 (40), 9692-9701 (2013).
  45. Tominaga, T., Sahara, M., Kawakita, Y., Nakagawa, H., Yamada, T. Evaluation of sample cell materials for aqueous solutions used in quasi-elastic neutron scattering measurements. Journal of Applied Crystallography. 54 (6), 1631-1640 (2021).
  46. Beck, C., et al. Following protein dynamics in real time during crystallization. Crystal Growth & Design. 19 (12), 7036-7045 (2019).
  47. Smith, A. A., Testori, E., Cadalbert, R., Meier, B. H., Ernst, M. Characterization of fibril dynamics on three timescales by solid-state NMR. Journal of Biomolecular NMR. 65 (3-4), 171-191 (2016).
  48. Wang, T., Jo, H., DeGrado, W. F., Hong, M. Water distribution, dynamics, and interactions with Alzheimer's β-amyloid fibrils investigated by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 139 (17), 6242-6252 (2017).
  49. Rezaei-Ghaleh, N., Giller, K., Becker, S., Zweckstetter, M. Effect of zinc dinding on β-amyloid structure and dynamics: Implications for Aβ aggregation. Biophysical Journal. 101 (5), 1202-1211 (2011).
  50. Vugmeyster, L., et al. Fast motions of key methyl groups in amyloid-β fibrils. Biophysical Journal. 111 (10), 2135-2148 (2016).
  51. Yang, X., Wang, B., Hoop, C. L., Williams, J. K., Baum, J. NMR unveils an N-terminal interaction interface on acetylated-α-synuclein monomers for recruitment to fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (18), (2021).
  52. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human α-synuclein. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (5), 409-415 (2016).
  53. Karamanos, T. K., Kalverda, A. P., Thompson, G. S., Radford, S. E. Mechanisms of amyloid formation revealed by solution NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 88-89, 86-104 (2015).
  54. Lai, Y. -C., Kuo, Y. -H., Chiang, Y. -W. Identifying protein conformational dynamics using spin-label ESR. Chemistry - An Asian Journal. 14 (22), 3981-3991 (2019).
  55. Franck, J. M., Han, S. Overhauser dynamic nuclear polarization for the study of hydration dynamics, explained. Methods in Enzymology. 615, 131-175 (2019).
  56. Pavlova, A., et al. Protein structural and surface water rearrangement constitute major events in the earliest aggregation stages of tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 127-136 (2016).
  57. Lin, Y., et al. Liquid-liquid phase separation of tau driven by hydrophobic interaction facilitates fibrillization of tau. bioRxiv. , (2020).
  58. Decatur, S. M. Elucidation of residue-level structure and dynamics of polypeptides via isotope-edited infrared spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 39 (3), 169-175 (2006).
  59. Chatani, E., Tsuchisaka, Y., Masuda, Y., Water Tsenkova, R. molecular system dynamics associated with amyloidogenic nucleation as revealed by real time near infrared spectroscopy and aquaphotomics. PLoS One. 9 (7), 101997 (2014).
  60. Goret, G., Aoun, B., Pellegrini, E. MDANSE: An interactive analysis environment for molecular dynamics simulations. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (1), 1-5 (2017).
  61. Fujiwara, S., et al. Internal dynamics of a protein that forms the amyloid fibrils observed by neutron scattering. Journal of the Physical Society of Japan. 82, Suppl A (2013).
  62. Schiró, G., et al. Neutron scattering reveals enhanced protein dynamics in concanavalin a amyloid fibrils. Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (8), 992-996 (2012).
  63. Pounot, K., et al. Zinc determines dynamical properties and aggregation kinetics of human insulin. Biophysical Journal. 120 (5), 886-898 (2021).
  64. Fujiwara, S., et al. Dynamic properties of human α-synuclein related to propensity to amyloid fibril formation. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3229-3245 (2019).
  65. Sanz, A., et al. High-pressure cell for simultaneous dielectric and neutron spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 89 (2), 023904 (2018).
  66. Adams, M. A., et al. Simultaneous neutron scattering and Raman scattering. Applied Spectroscopy. 63 (7), 727-732 (2009).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 182
Neutronspektroskopi med høj opløsning til undersøgelse af picosekund-nanosekunddynamik af proteiner og hydreringsvand
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pounot, K., Appel, M., Beck, C.,… More

Pounot, K., Appel, M., Beck, C., Weik, M., Schirò, G., Fichou, Y., Seydel, T., Schreiber, F. High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water. J. Vis. Exp. (182), e63664, doi:10.3791/63664 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter