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Biochemistry

Espectroscopía de neutrones de alta resolución para estudiar la dinámica de picosegundos-nanosegundos de proteínas y agua de hidratación

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

La espectroscopia de retrodispersión de neutrones ofrece un acceso no destructivo y sin etiquetas a la dinámica ps-ns de las proteínas y su agua de hidratación. El flujo de trabajo se presenta con dos estudios sobre proteínas amiloides: sobre la dinámica resuelta en el tiempo de la lisozima durante la agregación y sobre la dinámica del agua de hidratación de tau en la formación de fibra.

Abstract

La dispersión de neutrones ofrece la posibilidad de sondear la dinámica dentro de las muestras para una amplia gama de energías de una manera no destructiva y sin etiquetar más que el deuterio. En particular, la espectroscopia de retrodispersión de neutrones registra las señales de dispersión en múltiples ángulos de dispersión simultáneamente y es muy adecuada para estudiar la dinámica de los sistemas biológicos en la escala de tiempo ps-ns. Al emplear D2O, y posiblemente componentes tampón deuterados, el método permite monitorear tanto la difusión del centro de masa como los movimientos de la columna vertebral y la cadena lateral (dinámica interna) de las proteínas en estado líquido.

Además, la dinámica del agua de hidratación se puede estudiar empleando polvos de proteínas perdeuteradas hidratadas conH2O. Este artículo presenta el flujo de trabajo empleado en el instrumento IN16B en el Institut Laue-Langevin (ILL) para investigar la dinámica del agua de proteínas e hidratación. Se explica la preparación de muestras de solución y muestras de proteína hidratada en polvo mediante intercambio de vapor. El procedimiento de análisis de datos para la dinámica del agua de proteínas e hidratación se describe para diferentes tipos de conjuntos de datos (espectros cuasielásticos o escaneos de ventana fija) que se pueden obtener en un espectrómetro de retrodispersión de neutrones.

El método se ilustra con dos estudios que involucran proteínas amiloides. Se muestra que la agregación de lisozima en agregados esféricos de tamaño μm -partículas denotadas- ocurre en un proceso de un solo paso en el rango de espacio y tiempo sondeado en IN16B, mientras que la dinámica interna permanece sin cambios. Además, se estudió la dinámica del agua de hidratación de tau en polvos hidratados de proteína perdeuterada. Se muestra que los movimientos de traslación del agua se activan tras la formación de fibras amiloides. Finalmente, se discuten los pasos críticos en el protocolo sobre cómo se posiciona la dispersión de neutrones con respecto al estudio de la dinámica con respecto a otros métodos biofísicos experimentales.

Introduction

El neutrón es una partícula masiva y sin carga que se ha utilizado con éxito a lo largo de los años para sondear muestras en diversos campos, desde la física fundamental hasta la biología1. Para aplicaciones biológicas, la dispersión de neutrones de ángulo pequeño, la dispersión inelástica de neutrones y la cristalografía y reflectometría de neutrones se utilizan ampliamente 2,3,4. La dispersión inelástica de neutrones proporciona una medición promediada por conjuntos de la dinámica sin requerir un etiquetado específico per se, y una calidad de señal que no depende del tamaño o la proteína5. La medición se puede hacer utilizando un ambiente altamente complejo para la proteína en estudio que imita el medio intracelular, como un lisado bacteriano deuterado o incluso in vivo 3,6,7. Se pueden usar diferentes configuraciones experimentales para estudiar la dinámica, a saber, i) acceso de tiempo de vuelo a la dinámica sub-ps-ps, ii) acceso de retrodispersión a la dinámica ps-ns, y iii) acceso de spin-echo a la dinámica de ns a cientos de ns. La retrodispersión de neutrones hace uso de la ley de Bragg 2d sinθ = nλ, donde d es la distancia entre planos en un cristal, θ el ángulo de dispersión, n el orden de dispersión y λ la longitud de onda. El uso de cristales para la retrodispersión hacia los detectores permite lograr una alta resolución en energía, típicamente ~ 0.8 μeV. Para medir el intercambio de energía, se utiliza una unidad Doppler que lleva un cristal en retrodispersión para definir y ajustar la longitud de onda de neutrones entrantes 8,9,10 (Figura 1), o se puede usar una configuración de tiempo de vuelo a costa de una disminución en la resolución de energía 11.

Figure 1
Figura 1: Croquis de un espectrómetro de retrodispersión de neutrones con una unidad Doppler. El haz entrante golpea el helicóptero de transformación del espacio de fase (PST)42, lo que aumenta el flujo en la posición de la muestra. Luego se retrodispersa hacia la muestra mediante la unidad Doppler, que selecciona una energía E1 (flecha cian). Los neutrones son dispersados por la muestra (con diferentes energías representadas por el color de las flechas) y los analizadores, hechos de cristales de Si 111, solo dispersarán neutrones con una energía específica E0 (flechas de color rojo aquí). Por lo tanto, la transferencia de momento q se obtiene de la posición detectada del neutrón en la matriz del detector, y la transferencia de energía se obtiene de la diferencia E1- E0. El tiempo de vuelo esperado para el pulso de neutrones producido por el PST se utiliza para descartar la señal de los neutrones dispersos directamente hacia los tubos detectores. Abreviatura: PST = transformación del espacio de fase. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para la espectroscopia de retrodispersión, la principal contribución a la señal de muestras ricas en protones de hidrógeno, como las proteínas, proviene de la dispersión incoherente, para la cual la intensidad de dispersión Sinc(q, ω) se muestra mediante Eq (1)12

Equation 1 (1)

Donde σinc es la sección transversal incoherente del elemento considerado, k' es la norma del vector de onda disperso, k la norma del vector de onda entrante, q (= k - k') la transferencia de momento, r j(t) el vector de posición del átomo j en el tiempo t, y ω la frecuencia correspondiente a la transferencia de energía entre el neutrón entrante y el sistema. Los corchetes angulares denotan el promedio del conjunto. Por lo tanto, la dispersión incoherente sondea la autocorrelación de partículas individuales promediada por conjuntos de las posiciones de los átomos con el tiempo y da la autodinámica promediada sobre todos los átomos en el sistema y diferentes orígenes de tiempo (promedio de conjunto). La función de dispersión es la transformada de Fourier en el tiempo de la función de dispersión intermedia I(q, t), que puede ser vista como la transformada de Fourier en el espacio de la función de correlación de van Hove mostrada por Eq (2):

Equation 2 (2)

Donde ρ(r,t) es la densidad de probabilidad de encontrar un átomo en la posición r y el tiempo t 13.

Para un proceso de difusión fickiano, la función de autodifusión resulta (ver Eq (3)) después de una doble transformada de Fourier en una función de dispersión que consiste en un lorentziano de ancho de línea dado por γ = Dq2.

Equation 10 (3)

Se desarrollaron modelos más sofisticados que se encontraron útiles, como el modelo de difusión de salto de Singwi y Sjölander para la dinámica interna de proteínas ps-ns14 o el modelo de rotación de Sears para el agua de hidratación15,16,17.

En el instrumento de retrodispersión de neutrones (NBS) IN16B8,9 en el ILL, Grenoble, Francia (Figura suplementaria S1), una configuración comúnmente utilizada con proteínas consiste en cristales de Si 111 para los analizadores con un accionamiento Doppler para ajustar la longitud de onda entrante (Figura suplementaria S2A), dando así acceso al rango de transferencia de momento ~0.2 Å-1 < q < ~2 Å-1 y rango de transferencia de energía de -30 μeV < Equation 3 < 30 μeV- correspondiente a escalas de tiempo que van desde unos pocos ps a unos pocos ns y distancias de unos pocos Å. Además, IN16B ofrece la posibilidad de realizar escaneos elásticos e inelásticos de ventana fija (E/IFWS)10, que incluyen la adquisición de datos en una transferencia de energía fija. Como el flujo es limitado cuando se trabaja con neutrones, E/IFWS permite maximizar el flujo para una transferencia de energía, reduciendo así el tiempo de adquisición necesario para obtener una relación señal-ruido satisfactoria. Una opción más reciente es el modo11 del espectrómetro de retrodispersión y tiempo de vuelo (BATS), que permite la medición de una amplia gama de transferencias de energía (por ejemplo, -150 μeV < < Equation 3 150 μeV), con un flujo más alto que con el accionamiento Doppler, pero a costa de una resolución de energía más baja (Figura suplementaria S2B).

Una propiedad importante de la dispersión de neutrones es que la sección transversal incoherente σinc tiene un valor 40 veces mayor para el hidrógeno que para el deuterio y es insignificante para otros elementos que se encuentran comúnmente en muestras biológicas. Por lo tanto, la dinámica de las proteínas en un ambiente líquido se puede estudiar mediante el uso de un tampón deuterado, y el estado del polvo permite el estudio de la dinámica interna de la proteína con proteína en polvo hidrogenada hidratada con D2O, o el estudio del agua de hidratación para la proteína perdeuterada en polvo hidratada conH2O. En estado líquido, la retrodispersión de neutrones permite típicamente el acceso simultáneo a la autodifusión del centro de masa de las proteínas (difusión de tipo fickiano) y su dinámica interna. Estos últimos son movimientos de columna vertebral y de cadena lateral generalmente descritos por el llamado modelo de difusión de salto u otros 3,18. En los polvos de proteína hidrogenada, la difusión de proteínas está ausente y solo se necesita modelar la dinámica interna. Para el agua de hidratación, las contribuciones de los movimientos de traslación y rotación de las moléculas de agua presentan una dependencia diferente de la transferencia de momento q, lo que permite su distinción en el proceso de análisis de datos17.

Este artículo ilustra el método de retrodispersión de neutrones con el estudio de proteínas que se encontraron capaces de desplegarse, agregarse en una forma canónica que consiste en pilas de β hebras -el llamado patrón de β cruzado19,20- y formar fibras alargadas. Se trata de la llamada agregación amiloide, ampliamente estudiada debido a su papel central en trastornos neurodegenerativos como el Alzheimer o el Parkinson21,22. El estudio de las proteínas amiloides también está motivado por el papel funcional que pueden desempeñar 23,24 o su alto potencial para el desarrollo de nuevos biomateriales25. Los determinantes fisicoquímicos de la agregación amiloide siguen sin estar claros, y no se dispone de una teoría general de la agregación amiloide, a pesar del tremendo progreso durante los últimos años21,26.

La agregación amiloide implica cambios en la estructura y estabilidad de las proteínas con el tiempo, cuyo estudio implica naturalmente dinámica, vinculada a la estabilidad de la conformación de proteínas, la función de las proteínas y el paisaje de energía de las proteínas27. La dinámica está directamente relacionada con la estabilidad de un estado específico a través de la contribución entrópica para los movimientos más rápidos28, y la función de la proteína puede ser sostenida por movimientos en varias escalas de tiempo desde sub-ps para proteínas sensibles a la luz29 hasta ms para movimientos de dominio, que pueden ser facilitados por la dinámica de picosegundos-nanosegundos30.

Se presentarán dos ejemplos de uso de la espectroscopia de retrodispersión de neutrones para estudiar proteínas amiloides, uno en estado líquido para estudiar la dinámica de proteínas y otro en estado de polvo hidratado para estudiar la dinámica del agua de hidratación. El primer ejemplo se refiere a la agregación de lisozima en esferas de tamaño μm (llamadas partículas) seguidas en tiempo real5, y el segundo a una comparación de la dinámica del agua en estados nativos y agregados de la proteína humana tau31.

La lisozima es una enzima implicada en la defensa inmune y está compuesta por 129 residuos de aminoácidos. La lisozima puede formar partículas en tampón deuterado a pD de 10,5 y a una temperatura de 90 °C. Con la dispersión de neutrones, demostramos que la evolución temporal del coeficiente de difusión del centro de masa de la lisozima sigue la cinética exponencial única de la fluorescencia de tioflavina T (una sonda fluorescente utilizada para monitorear la formación de patrones de β cruzada amiloide32), lo que indica que la formación de superestructuras particuladas y patrones de β cruzada ocurren en un solo paso con la misma velocidad. Además, la dinámica interna se mantuvo constante durante todo el proceso de agregación, lo que puede explicarse por un cambio conformacional rápido que no se puede observar en los instrumentos NBS, o por la ausencia de un cambio significativo en la energía interna de las proteínas tras la agregación.

La proteína humana tau es una proteína intrínsecamente desordenada (IDP) que consta de 441 aminoácidos para la llamada isoforma 2N4R, que está notablemente involucrada en la enfermedad de Alzheimer33. Usando retrodispersión de neutrones en polvos de proteína tau perdeuterada, demostramos que la dinámica del agua de hidratación aumenta en el estado de fibra, con una mayor población de moléculas de agua sometidas a movimientos de traslación. El resultado sugiere que un aumento en la entropía del agua de hidratación podría conducir a la fibrilación amiloide de tau.

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Protocol

1. Preparar el tampón deuterado para proteínas en estado líquido

  1. Disolver todos los componentes del tampón enD2Opuro.
  2. Si el electrodo de pH se calibró enH2O, ajuste el pD de acuerdo con la fórmula pD = pH + 0.4 usando NaOD o DCl34.
    NOTA: El uso de D2O en lugar deH2Opodría afectar la solubilidad de las proteínas y las condiciones tampón podrían necesitar ser adaptadas (por ejemplo, por un ligero cambio en la concentración de sal).

2. Preparar los polvos hidratados H2O-hidratados de proteína perdeuterada

  1. Prepare el portamuestras.
    1. Limpie a fondo un portamuestras plano de aluminio con su sello de alambre de indio y tornillos con agua y etanol y déjelo secar.
      NOTA: Se utiliza un portamuestras plano de tal manera que el polvo se pueda distribuir homogéneamente sobre la superficie. La cantidad de polvo debe ser suficiente para que pueda mantenerse entre las paredes y no caiga cuando el portamuestras se coloca verticalmente.
    2. Pese las diferentes partes del soporte de la muestra (fondo, tapa y alambre de indio) por separado en una balanza de precisión.
    3. Coloque el sello de alambre de indio de 1 mm en la ranura de la parte inferior del portamuestras, dejando una pequeña superposición donde se unen los dos extremos (Figura 2A).
    4. Coloque una cantidad adecuada de proteína liofilizada (típicamente ~ 100 mg de proteína) de modo que llene la superficie interna de la parte inferior del portamuestras.
  2. Hidrata la proteína en polvo.
    1. Coloque el portamuestras en un desecador con una placa de Petri que contenga polvo deP2O5durante 24 h para secar completamente la proteína en polvo35 (Figura 2B). Pesar la parte inferior seca del portamuestras que contiene el sello de indio y el polvo seco para obtener mseco.
      PRECAUCIÓN: El polvo de P2O5 es muy corrosivo.
    2. Retire elP2O5del desecador y coloque una placa de Petri conD2Odentro. Controle la masa del polvo regularmente para verificar el nivel de hidratación h = m hyd / m seco donde mhyd y m seco son la masa del polvo hidratado y el polvo seco, respectivamente.
      NOTA: Para proteínas altamente hidrófobas como la insulina, puede ser necesario aumentar la temperatura dentro del desecador para obtener una presión de vapor más alta y alcanzar el nivel de hidratación h deseado.
    3. Repita los pasos 2.2.1 y 2.2.2 al menos tres veces para convertir correctamente todos los hidrógenos intercambiables en deuterón.
      NOTA: Alternativamente, los ciclos de liofilización y disolución en D2O puro podrían usarse para un mejor intercambio de H / D siempre que la proteína no se vea afectada por ella.
    4. Hidrate el polvo ligeramente por encima del nivel deseado, deje que la parte inferior del portamuestras con el alambre de indio y el polvo hidratado permanezca en la balanza de precisión, y espere a que la masa disminuya lentamente al valor deseado para obtener el objetivo h (típicamente 0.2-0.4 si una proteína globular de tamaño mediano debe cubrirse con una capa de hidratación completa).
    5. Coloque rápidamente la tapa en la parte inferior y cierre primero el portamuestras con cuatro tornillos para detener el intercambio de vapor (Figura suplementaria S3A).
    6. Coloque y apriete todos los tornillos restantes hasta que no se vea ningún espacio entre la parte inferior y la tapa (Figura suplementaria S3B).
    7. Pese el portamuestras sellado para comprobar si hay una posible pérdida de hidratación por fugas después del experimento con neutrones.

3. Realizar el experimento de dispersión de neutrones incoherente

  1. Discuta y verifique la configuración del instrumento necesario para el experimento con el contacto local algunas semanas antes del tiempo de haz asignado.
  2. Prepare la muestra en estado líquido.
    1. Disuelva la proteína en el tampón deuterado.
    2. Determinar el volumen apropiado de líquido que se colocará en el portamuestras con agua (asegúrese de que no haya desbordamiento cuando el portamuestras esté cerrado; Figura 2C).
      NOTA: Los pasos siguientes (3.3 y 3.4) describen un experimento realizado en el espectrómetro NBS IN16B en el ILL8,9, utilizando un criohorno como entorno de muestra. El sistema de control de instrumentos cambiará de un instrumento a otro, pero los principios de funcionamiento siguen siendo los mismos.
  3. Inserte la muestra.
    1. Seque bien la varilla de muestra (Figura 2D) y retire la muestra anterior, si la hubiera, después de comprobar que la dosis de radiación ionizante es inferior a 100 μSv/h antes de manipular cualquier material (en el ILL).
    2. Coloque la muestra, verifique el centrado adecuado en relación con el centro del haz (Figura suplementaria S4) e inserte la barra de muestra en el criohorno (Figura 2D). Encienda la bomba de vacío para alcanzar menos de 10-3 bar y elimine el aire dentro del criohorno repitiendo las siguientes tres veces: llene el criohorno con gas helio hasta que se alcance la presión atmosférica y retire el gas nuevamente usando la bomba de vacío.
      NOTA: En el caso de un portamuestras plano, el portamuestras debe estar orientado en un ángulo de 45° con respecto al haz entrante. El rango de transferencia de momento útil podría reducirse debido a la absorción y dispersión por parte de la célula. Se puede usar un absorbedor de neutrones fuerte como el cadmio para enmascarar ciertas partes del soporte de la muestra (por ejemplo, tornillos, partes gruesas).
    3. Introducir un poco de gas helio en el criohorno de tal manera que la presión sea ~0,05 bar.
  4. Adquirir datos (por ejemplo, usando NOMAD en IN16B en el ILL, se supone que el usuario prefiere una temperatura de 200 K antes de adquirir un espectro de neutrones cuasielástico (QENS), luego E/IFWS durante una rampa de temperatura a 310 K a 0.5 K por minuto y finalmente un QENS a 310 K).
    1. Con NOMAD, en la pestaña de ejecución, arrastre y suelte un controlador FurnaceCryostat en el Launch Pad. Ajuste la temperatura a 200 K. Utilice el modo rápido y un tiempo de espera de 30 minutos para que la temperatura tenga tiempo de estabilizarse. Haga clic en el icono de flechas giratorias para ejecutarlo en segundo plano, de modo que los datos se puedan adquirir durante la disminución de la temperatura.
    2. Arrastre y suelte el controlador IN16DopplerSettings , establezca el perfil de velocidad en Velocidad precisa establecida por Max ΔE, un valor de 0.00 μeV y 128 canales para obtener una configuración EFWS.
    3. Arrastre y suelte un controlador de recuento , rellene el campo Subtítulo con un nombre que permita una fácil identificación de los datos y establezca 60 repeticiones de escaneos de 30 s (Figura suplementaria S5A).
    4. Arrastre y suelte un controlador IN16DopplerSettings , establezca el perfil de velocidad en Sine establecido por Speed con un valor de 4.5 m / s y 2,048 canales para obtener una configuración QENS.
    5. Arrastre y suelte un controlador de conteo con 4 repeticiones de escaneos de 30 minutos (Figura suplementaria S5B).
    6. Para la rampa de temperatura, arrastre y suelte un controlador FurnaceCryosta , ajuste la temperatura a 310 K, establezca Rampa en SetPoint con Δ = 0.05 K y 6 s. Use un tiempo de 220 minutos (Figura suplementaria S6A).
    7. Usa un bucle for con 65 repeticiones. En el interior, inserte un controlador IN16DopplerSettings como en el paso 3.4.2, seguido de un solo recuento de 30 s. Posteriormente, inserte IN16DopplerSettings, como se describió anteriormente, pero utilizando un desplazamiento de energía de 1,5 μeV y 1.024 canales seguido de un recuento único de 3 min (Figura suplementaria S6B).
    8. Para adquirir el último QENS a 310 K, arrastre y suelte los controladores IN16DopplerSettings y Count configurados como se describe en los pasos 3.4.4 y 3.4.5, respectivamente.
    9. Presione el botón de inicio (triángulo derecho en la parte inferior de la ventana) para ejecutar el script.
      NOTA: Cada experimento requerirá la adquisición de datos de calibración; es decir, la celda vacía para las correcciones de resta o absorción, el tampón solo a las diferentes temperaturas utilizadas para modelar el fondo, y una medición de vanadio (o equivalentemente, la muestra a una temperatura de 10 K o inferior) para obtener la función de resolución del instrumento.

4. Análisis de datos - QENS

  1. Importe el conjunto de datos utilizando el método 'IN16B_QENS.process()' en el software Python nPDyn v3.x36
    >>>> desde nPDyn.dataParsers importar IN16B_QENS

    >>> muestra = IN16B_QENS(
    ...
    ... [detGroup=... formato>]
    ... ). proceso()

    >>> muestra = sample.get_q_range(0.3, 1.8)
  2. Realice correcciones de datos (opcional) con los siguientes comandos (consulte la documentación de nPDyn para obtener más información, figura 3):
    #it se supone que los datos de celda vacía, vanadio y tampón
    # ya se importaron en un conjunto de datos llamado 'empty_cell', 'vanadio',
    # y 'buffer', respectivamente.

    # para restar celdas vacías con un factor de escala
    # (los errores se propagan automáticamente)
    >>> muestra = muestra - 0,95 * empty_cell

    # para corrección usando el coeficiente Paalman-Ping
    # (mutuamente excluyente con el ejemplo anterior)
    >>> sample = sample.absorptionCorrection(empty_cell)

    # para normalización
    >>> muestra = muestra.normalizar(vanadio)

    # para agrupar a lo largo del eje observable
    # observable es el tiempo de agregación aquí
    >>> muestra = muestra.bin(3, eje=0)
  3. Ajuste los datos de calibración. El conjunto de datos (muestras, celda vacía, tampón deuterado (si es necesario) y vanadio) se puede ajustar utilizando modelos integrados o un modelo definido por el usuario (consulte la documentación de nPDyn):
    >>> desde nPDyn.models.builtins import (
    ... modeloPVoigt,
    ... modelWater,
    ... modeloCalibratedD2O,
    ...     )

    # Los modelos incorporados utilizan un vector columna del momento
    # transferir valores q
    >>> q = vanadio.q[:, Ninguno]

    # el vanadio se ajusta utilizando un perfil pseudo-Voigt
    >>> vanadium.fit(modeloPVoigt(q))
  4. Utilice el modelo incorporado para el agua de hidratación llamado 'modelWater'. Este modelo se lee como se muestra en Eq (4)17
    Equation 4 (4)
    Donde un0, unar y unat son escalares que representan la contribución relativa de la señal elástica, los movimientos de rotación y los movimientos de traslación, respectivamente; j1(qd) es la función de Bessel esféricade orden l , siendo q la transferencia de momento; d la distancia O-H en la molécula de agua; δ(ω) es el delta de Dirac, que se multiplica por la EISF aquí; N es el orden más alto de la función de Bessel esférica utilizada (típicamente ~5); Equation 5 y Equation 11 son los movimientos rotacionales y traslacionales lorentzianos, respectivamente; b(q) es un término de fondo plano. Las funciones esféricas de Bessel dan la contribución relativa de cada estado de momento angular de las moléculas de agua, y el número N se determina en función del rango q de transferencia de momento. En el caso de un espectrómetro NBS típico, los términos hasta N = 4 explican casi por completo la señal (Figura suplementaria S7).
    # Aquí, la ecuación 2 se usa para el agua de hidratación
    # Convolución con función de resolución y adición de
    # El fondo D2O se realiza automáticamente con el botón
    # Argumentos proporcionados
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=vanadio,
    ... bkgd=buffer,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    NOTA: Las contribuciones de los movimientos rotacionales y de traslación deben ser complicadas para ser perfectamente rigurosas. El éxito de un modelo aditivo debe atribuirse a la presencia de distintas poblaciones de agua en la superficie de la proteína y al limitado rango de energía accesible.
  5. Utilice lo siguiente para trazar los datos (figura 4):
    >>> de nPDyn.plot import plot
    >>> parcela(muestra)

5. Análisis de datos: rampa de temperatura, escaneos elásticos de ventana fija (EFWS)

  1. Utilice un procedimiento similar a la sección 4 para normalizar los datos de rampa de temperatura mediante la señal a la temperatura más baja (normalmente 10 K):
    >>> desde nPDyn.dataParsers importar IN16B_FWS

    >>> muestra = IN16B_FWS(
    ... ,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ). proceso()

    # normalización con los 5 primeros puntos en el observable
    # eje, que corresponde a la temperatura
    >>> muestra /= muestra[:5].mean(0)

    # El rango Q de transferencia de momento utilizado aquí es más pequeño
    # ya que el modelo utilizado es válido solo para q bajo
    >>> muestra = sample.get_q_range(0.2, 0.8)
  2. Utilice un modelo gaussiano simple para comenzar, cuyo ancho está dado por el llamado desplazamiento cuadrático medio (MSD). Compile y ajuste el modelo mediante los siguientes comandos:
    >>> importar numpy como np
    >>> desde nPDyn.models importar parámetros, modelo, componente

    # a es un factor de escala
    >>> params = Parámetros(
    ... a={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)},
    ... msd={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> model = Modelo(parámetros)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... «gaussiano»,
    ... lambda x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, None])

    >>> parcela(muestra)
    NOTA: La aproximación gaussiana siempre es válida para q2MSD << 1, pero se puede usar un rango de transferencia de momento más amplio para la comparación relativa entre muestras. Se han desarrollado modelos más sofisticados, que van más allá de la aproximación gaussiana37,38,39.

6. Análisis de datos: escaneos de ventana fija elásticos e inelásticos (E/IFWS)

  1. Similar al paso 4, importe el conjunto de datos pero usando la clase 'IN16B_FWS':
    >>> desde nPDyn.dataParsers importar IN16B_FWS

    >>> muestra = IN16B_FWS(
    ...
    ... [detGroup=]
    ... ). proceso()

    >>> muestra = sample.get_q_range(0.3, 1.8)
  2. Ajuste los datos de calibración y los datos de muestra.
    1. Analice los datos E/IFWS utilizando un MSD40 generalizado o considerándolos como espectros QENS gruesos (que tienen solo unos pocos puntos de datos en el eje de energía). Cuando E/IFWS se considera QENS grueso, los modelos utilizados para QENS se utilizan para ajustar todo el conjunto de datos E/IFWS a la vez (ajuste global de transferencias de energía y transferencias de impulso).
      NOTA: La última solución, que utiliza modelos para QENS en datos E/IFWS, se utiliza aquí donde se impone la dependencia de transferencia de momento de la difusión del centro de masa y la dinámica interna de las proteínas.
    2. Modele la dinámica de proteínas en líquidos utilizando el siguiente Eq (5) ('modelProteinJumpDiff' en nPDyn):
      Equation 6 (5)
      Donde R(q,ω) es la función de resolución; β un escalar independiente para cada transferencia de momento q; a0 es el factor de estructura incoherente elástica (EISF); Equation 7 un lorentziano que explica la difusión del centro de masa con una anchura dada por Eq (6); Equation 12 es un lorentziano que incluye la difusión del centro de masa y una contribución siguiendo el modelo de difusión de salto14 que tiene en cuenta la dinámica interna (Eq (7); Equation 8 siendo la señal ajustada de D2O reescalada por su fracción de volumen en la muestra.
      γ = Dsq2 (6)
      Ds es el coeficiente de autodifusión.
      Equation 9 (7)
      Di es el coeficiente de difusión aparente para la dinámica interna y τ un tiempo de relajación para los movimientos difusivos.
      >>> desde nPDyn.models.builtins import (
      ... modeloPVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... modeloCalibratedD2O,
      ... )

      # Los modelos incorporados utilizan un vector columna del momento
      # transferir valores q
      >>> q = vanadio.q[:, Ninguno]

      # el vanadio se ajusta utilizando un perfil pseudo-Voigt
      >>> vanadium.fit(modeloPVoigt(q))

      # para D2O puro, un modelo con ancho de línea calibrado
      # para diferentes temperaturas está incluido en nPDyn
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # Aquí, la ecuación 3 se usa para muestras líquidas
      # Convolución con función de resolución y adición de
      # El fondo D2O se realiza automáticamente con los # argumentos proporcionados
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=vanadio,
      ... bkgd=buffer,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. Trazar los datos ajustados utilizando:
    >>> de nPDyn.plot import plot
    >>> parcela(muestra)

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Representative Results

La agregación de lisozima en partículas se realizó a 90 °C con una concentración de proteína de 50 mg/mL en un tampón deuterado (0,1 M NaCl a pD 10,5). La formación de partículas se desencadena por el aumento de la temperatura a 90 °C y se produce dentro de las 6 h (Figura suplementaria S8). La adquisición de datos se realizó en IN16B, como se describe en el protocolo anterior (los datos son seleccionados permanentemente por el ILL y accesibles en http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

Se adquirió un espectro QENS a 7 °C para caracterizar completamente el estado inicial. Posteriormente, la temperatura se incrementó a 90 ° C (normalmente toma ~ 30 minutos en IN16B, Figura Suplementaria S9) para desencadenar el proceso de agregación. La cinética se puede seguir utilizando un promedio móvil de espectros QENS, lo que permite el acceso a todo el rango de transferencia de energía, pero con una resolución limitada en el tiempo. La resolución de tiempo se puede mejorar a ~ 1 minuto usando EFWS y a ~ 20 minutos usando E / IFWS a cuatro valores de transferencia de energía5.

En el ejemplo presentado, exploramos transferencias de energía de 0, 0.6, 1.5 y 3 μeV. Los escaneos E/IFWS se adquieren continuamente durante el proceso de agregación, y se adquirió un espectro QENS para el estado final a 90 °C. Los datos E/IFWS se corrigieron para la absorción utilizando el E/IFWS de la celda vacía y se normalizaron utilizando los datos de vanadio.

Para la lisozima E/IFWS, observamos un aumento de la señal en el tiempo a baja transferencia de momento y baja transferencia de energía, mientras que la señal a alta transferencia de energía y baja transferencia de momento disminuye (Figura suplementaria 10). Esta observación cualitativa indica la formación de objetos más grandes, difundiéndose más lentamente y confirmando que el proceso de agregación tuvo lugar. El análisis, según Eq (4), da como resultado un coeficiente inicial de difusión del centro de masa de 15 Å2/ns, de acuerdo con la presencia de pequeños grupos de proteínas (apoyados por dispersión dinámica de luz y cálculos HYDROPRO 5,41), que luego disminuye exponencialmente con el tiempo (Figura 5). El coeficiente de difusión aparente para la dinámica interna permanece constante durante todo el proceso de agregación. Por lo tanto, la formación de partículas de lisozima parece ocurrir en una sola fase de agregación. La ausencia de cambios en la dinámica interna de las proteínas sugiere que la conversión a β cruzada y el posible cambio asociado en la energía son demasiado rápidos o que otros efectos impulsores, como un aumento en la entropía del solvente, podrían estar dominando completamente dentro del rango de energía investigado.

El estudio de la dinámica del agua de hidratación alrededor de monómeros y fibras de tau se realizó en SPHERES en el Maier-Leibnitz Zentrum (MLZ) en Garching, Alemania, utilizando el protocolo descrito anteriormente para muestras de polvo. Se utilizaron aproximadamente 100 mg de proteína tau en polvo deuterada, hidratada a 0,4 g deH2Opor g de proteína. Los EFWS se adquirieron durante una rampa de temperatura y espectros QENS a temperatura constante. El EFWS se registró a partir de 20 K y aumentando la temperatura a 300 K a una velocidad de 0,2 K / min mientras se adquirían datos continuamente durante los escaneos de 5 minutos.

Los espectros QENS se registraron a 20 y a 280 K. Los datos de EFWS se ajustaron utilizando un rango gaussiano simple sobre el rango q de transferencia de momento 0.2 Å-1 < q < 0.8 Å-1 para extraer el MSD (Figura suplementaria S11A). Los valores de MSD están por encima del límite de validez para el modelo gaussiano. Por lo tanto, se recomienda en este caso explorar otros modelos más allá de la aproximación gaussiana37,38,39. A temperaturas superiores a 220 K, el agua de hidratación alrededor de las fibras de tau es significativamente más móvil que el agua de hidratación alrededor de los monómeros tau (Figura 6). El ajuste de los datos QENS permite a los usuarios obtener el ancho de línea y la contribución relativa de los movimientos elásticos, rotacionales y de traslación del agua de hidratación en la muestra (Figura suplementaria S11B). Parece que la fracción de moléculas de agua que experimentan movimiento de traslación aumenta alrededor de las fibras, y los coeficientes de difusión de traslación y rotación de las moléculas de agua aumentan alrededor de las fibras17,31. En contraste, la dinámica interna ps-ns de la proteína tau, que refleja los movimientos de la columna vertebral y la cadena lateral, no cambió tras la fibrilación.

Figure 2
Figura 2: Base de un portamuestras plano de aluminio. (A) El portamuestras plano de aluminio presenta una parte central expuesta a los neutrones donde la proteína en polvo se mantiene dentro de un pequeño espacio, típicamente ~ 0.3 mm, entre la base y la tapa. Se puede utilizar un alambre de indio para el sellado, ya que resiste aumentos de temperatura de hasta 90 °C. En caso de temperaturas más altas, se puede usar un sello de teflón. (B) La proteína en polvo se coloca en la base del portamuestras con el alambre de indio en su lugar. El portamuestras se coloca en un desecador en presencia de P 2 O5 para secado o H 2 O/D2O parahidratación. Se añade grasa al vacío para evitar cualquier fuga entre la parte inferior y la tapa del desecador. El vacío se puede utilizar con precaución para acelerar el proceso de secado. Puede ser necesario calentar la parte inferior del desecador para muestras altamente hidrófobas. (C) La solución proteica se coloca entre los cilindros interior y exterior. Asegúrese de no pipetear demasiado líquido (no debe haber desbordamiento cuando el portamuestras está cerrado). El alambre de indio se coloca en la ranura circular. (D) La barra de muestra (en el fondo) proporciona control sobre la altura y orientación de la muestra y puede incluir diferentes controladores y detectores para entornos de muestra (temperatura, presión). La barra de muestra se inserta desde la parte superior del criohorno (frente), lo que proporciona control para la temperatura durante el experimento. Durante el experimento, el haz de neutrones generalmente golpea el fondo del criohorno, como lo indica el rectángulo blanco (el tamaño del haz depende de la configuración del instrumento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Las correcciones de datos y la normalización pueden mejorar el ajuste. Los datos se importaron utilizando nPDyn, como se describe en el protocolo. A la izquierda, el conjunto de datos se normalizó utilizando solo los datos del monitor. A la derecha, se utilizó la señal de la lata vacía junto con los coeficientes de Paalman-Ping43 para corregir la absorción de neutrones del portamuestras. Posteriormente, el modelo ajustado para la señal de vanadio se integró de forma independiente para cada transferencia de momento q, y el resultado se utilizó para normalizar el conjunto de datos de la muestra. En ambos gráficos, S(q,ω) denota la señal de dispersión, q es la transferencia de momento, y Equation 3 es la transferencia de energía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Ventana de trazado generada por nPDyn que muestra el resultado del ajuste. Los datos de QENS se ajustaron utilizando nPDyn, como se describe en el protocolo. La ventana de trazado permite a los usuarios trazar los datos a lo largo de diferentes ejes -observables (tiempo, temperatura o presión), transferencia de momento q o transferencia de energía- y hay selectores disponibles para navegar a lo largo de los otros ejes. Hay diferentes tipos de gráficos disponibles, con el simple 'Gráfico' presentado en (A) y 'Análisis - q-wise' en (B). El botón 'Gráfico' muestra los diferentes conjuntos de datos en subgráficos separados, el botón 'Comparar' muestra los conjuntos de datos en el mismo gráfico, el 'Gráfico 3D' muestra los conjuntos de datos en diferentes subgráficos 3D similares a s, el botón 'Análisis - q-wise' muestra los parámetros ajustados como la función de la transferencia de momento q y 'Análisis - observable-wise' muestra los parámetros ajustados como la función de observable (tiempo, temperatura o presión). Abreviatura: QENS = dispersión de neutrones cuasielástica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: La agregación de lisozimas ocurre en un proceso de un solo paso con dinámica interna constante. La lisozima se disolvió en el tampón de agregación (descrito en otra parte5), y E/IFWS se adquirió a lo largo de la agregación, que se activó al aumentar la temperatura a 90 °C. Después de la corrección de absorción con una celda vacía y la normalización utilizando la señal de vanadio, los datos se analizaron utilizando el modelo de difusión de salto como se describe en el protocolo. El coeficiente de autodifusión del centro de masa ajustado se traza en función del tiempo (triángulos azules) junto con el coeficiente de difusión aparente para la dinámica interna (cuadrados naranjas). Esta cifra es de 5. Abreviatura: E/IFWS = escaneos elásticos e inelásticos de ventana fija. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: La dinámica del agua de hidratación aumenta alrededor de las fibras tau. Los polvos hidratados de H2O de fibras tau deuteradas y monómeros se sellaron en un soporte de muestra de aluminio plano, y los datos de EFWS se adquirieron durante una rampa de temperatura de 20 a 300 K. Después de la corrección de absorción con una celda vacía y la normalización utilizando la señal de vanadio, los datos se analizaron utilizando el modelo de difusión de salto como se describe en el protocolo. Esta imagen se redibujó utilizando un rango q más pequeño (0,2 < q < 0,8 Å-1) a partir de datos de 31. Abreviatura: EFWS = escaneos elásticos de ventana fija. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Fotografías del instrumento IN16B en el ILL. (arriba) El instrumento IN16B visto desde la zona controlada por radiación dedicada al instrumento. El haz entrante viaja dentro de la guía de neutrones a la cámara de vacío, que contiene la mayoría de los elementos del instrumento (helicóptero PST, analizadores, muestra, detectores). (abajo) Interior de la cámara de vacío. El helicóptero PST es visible al igual que los analizadores que rodean el criohorno que contiene la muestra. Los detectores están ubicados detrás del criohorno. Cortesía de Laurent Thion, ecliptique. Abreviatura: PST = transformación del espacio de fase. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Croquis de IN16B en los modos clásico (con accionamiento Doppler) y BATS. (A) El haz de neutrones es parcialmente monocromatizado por el selector de velocidad. Posteriormente, los helicópteros de fondo y PST producirán un pulso de neutrones, del cual se seleccionará un perfil de energía mediante el monocromador Doppler (modo E/IFWS o QENS). Los neutrones son dispersados por la muestra, y una sola energía es reflejada hacia los detectores por los analizadores. Cortesía del ILL. (B) Los helicópteros BATS se utilizan para definir un solo pulso de neutrones con un rango de energía definido. El haz de neutrones es parcialmente monocromatizado por el selector de velocidad. Posteriormente, el helicóptero de fondo eliminará los neutrones no deseados que no pertenecen al pulso seleccionado. Los neutrones son dispersados por la muestra, y una sola energía es reflejada hacia los detectores por los analizadores. Cortesía del ILL. Abreviaturas: BATS = espectrómetro de retrodispersión y tiempo de vuelo; PST = transformación del espacio de fase; E/IFWS = escaneos de ventana fija elásticos e inelásticos; QENS = dispersión de neutrones cuasielástica; PG = grafito pirolítico. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S3: El portamuestras se cierra rápidamente después de que el polvo haya alcanzado la hidratación deseada y se haya sellado. (A) El soporte de muestra plano se cierra rápidamente con cuatro tornillos. Quedará una pequeña brecha debido al alambre de indio. Luego se agregan los otros tornillos y el portamuestras se sella lentamente apretando suavemente cada tornillo varias veces para permitir que el indio se relaje. (B) El portamuestras plano está sellado correctamente cuando ya no hay espacio visible entre la base del soporte y la tapa. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S4: El portamuestras está centrado con respecto al haz de neutrones. Se ha colocado un portamuestras cilíndrico en la varilla de muestra. La posición del portamuestras se comprueba de tal manera que la viga golpee la parte inferior del soporte. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S5: Adquisición de EFWS seguido de QENS en IN16B con NOMAD. (A) Los controladores relevantes se arrastran y sueltan en la plataforma de lanzamiento como se explica en el protocolo (pasos 3.4.1 a 3.4.3). Puede ser necesario hacer clic en el candado (icono verde en la esquina superior derecha - panel vertical) para obtener el control de la interfaz. (B) Los controladores relevantes se arrastran y sueltan en la plataforma de lanzamiento como se explica en el protocolo (pasos 3.4.4 a 3.4.5). Aquí, los dos últimos controladores se denominan IN16DopplerSettings y Count. Abreviaturas: QENS = dispersión de neutrones cuasielástica, EFWS = escaneos elásticos de ventana fija. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S6: Configuración de una rampa de temperatura y E/IFWS en IN16B con NOMAD. (A) El controlador FurnaceCryostat se agrega en la plataforma de lanzamiento y se configura como se explica en el protocolo (paso 3.4.6). (B) El controlador de bucle For se agrega en la plataforma de lanzamiento y los controladores relevantes se insertan en él y se configuran como se explica en el protocolo (paso 3.4.7). Abreviatura: E/IFWS = escaneos elásticos e inelásticos de ventana fija. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S7: Las primeras cinco funciones esféricas de Bessel explican la mayor parte de la contribución rotacional del agua de hidratación. Las primeras ocho funciones esféricas de Bessel se trazan usando un valor d = 0.98 Å y valores de transferencia de momento q de 0 a 3 Å (líneas de color sólido). El rango de transferencia de momento de 0,3 Å < q < 1,8 Å está delimitado por las líneas punteadas azules. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S8: La lisozima forma partículas de forma reproducible. La lisozima se disolvió en el tampón de agregación (preparado como se describe en el protocolo, paso 1), y ThT se agregó a una concentración final de 2 μM para monitorear la formación de la estructura de β cruzada utilizando fluorescencia. La gráfica representa el promedio de tres mediciones independientes, y las barras de error son la desviación estándar. El recuadro muestra una fotografía de microscopía de fluorescencia de las partículas formadas después de 6 h de agregación. Barra de escala = 20 μm. Esta cifra es de 5. Abreviatura: ThT = tioflavina T. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S9: Rampa de temperatura rápida disponible en IN16B. En el modo rápido en IN16B, la temperatura se puede aumentar de 280 K a 363 K en aproximadamente 30 minutos. Esta cifra es de 5. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S10: Datos E/IFWS sobre lisozima durante la agregación en partículas. La lisozima se disolvió en el tampón de agregación (descrito en otra parte5), y E/IFWS se adquirió a lo largo de la agregación, que se activó al aumentar la temperatura a 90 °C. Los datos, después de la corrección de absorción con una celda vacía y la normalización utilizando la señal de vanadio, se representan contra la transferencia de momento q y el tiempo para la transferencia de energía diferente medida, 0 μeV (arriba a la izquierda), 0.6 μeV (arriba a la derecha), 1.5 μeV (abajo a la izquierda) y 3 μeV (abajo a la derecha). Para cada subgráfica, el eje vertical corresponde a la señal de dispersión S(q, ΔE), trazada contra el tiempo experimental en horas y la transferencia de momento q. Esta cifra es de 5. Abreviatura: E/IFWS = escaneos elásticos e inelásticos de ventana fija. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S11: Ajuste de los datos de agua de hidratación de tau. (A) Ajuste de los datos EFWS utilizando un gaussiano. El polvo hidratado deH2O de monómeros tau deuterados se selló en un soporte de muestra de aluminio plano, y se adquirieron EFWS durante una rampa de temperatura de 20 a 300 K. Los datos experimentales (señal elástica S(q, 0) en línea azul del eje vertical con barras de error) se representan para el rango de transferencia de momento q 0.2 < q < 0.6 Å-1 junto con el gaussiano ajustado utilizado para extraer el MSD. (B) Movimientos de traslación y rotación del agua de hidratación obtenida del ajuste QENS. Los polvos hidratados de H2O de fibras tau deuteradas (izquierda) y monómeros (derecha) se sellaron en un soporte de muestra de aluminio plano, y los datos de QENS se adquirieron a 280 K. Los datos experimentales (intensidad S(q,ω) en función de la transferencia de energía) para fibras (triángulos azules) y monómeros (puntos verdes) se representan junto con el modelo ajustado (línea continua negra) y sus componentes, fondo (azul), función de resolución (verde), rotaciones (rojo) y traslaciones (cian) para la transferencia de momento q = 0,783 Å-1. Esta cifra es de 31. Abreviaturas: QENS = dispersión de neutrones cuasielástica, EFWS = exploraciones elásticas de ventana fija; MSD = desplazamiento cuadrático medio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La espectroscopia de neutrones es el único método que permite sondear la dinámica ps-ns promediada por conjuntos de muestras de proteínas, independientemente del tamaño de la proteína o de la complejidad de la solución cuando se utiliza la deuteración6. Específicamente, al sondear la autodifusión de ensamblajes de proteínas en solución, el tamaño hidrodinámico de dichos ensamblajes puede determinarse inequívocamente. No obstante, el método está comúnmente limitado por el bajo flujo de neutrones, lo que implica largos tiempos de adquisición y el requisito de altas cantidades de muestra (típicamente 100 mg de proteína) para obtener una buena relación señal-ruido dentro del tiempo de haz asignado.

Preparación de la muestra (pasos del protocolo 1 y 2). Para muestras en estado líquido, la concentración mínima que se puede utilizar es ~ 50 mg / ml (se pueden usar concentraciones más bajas a costa de tiempos de adquisición prolongados). La alta concentración de proteínas se asocia con tasas de fibrilación más rápidas, lo que ayuda a ajustar la medición en el tiempo de haz asignado, pero también puede afectar la vía de agregación44. Por lo tanto, es necesaria una caracterización exhaustiva de la muestra con métodos complementarios, como la fuerza atómica o la microscopía electrónica.

El material del portamuestras también es un punto a tener en cuenta al preparar las muestras, ya que las aleaciones de aluminio están sujetas a corrosión45. Una aleación de aluminio típica que presenta buena resistencia a la corrosión y tiene baja absorbancia de neutrones es la Norma Europea (EN) AW-6060 [AlMgSi] hecha de 98% -98.75% Al, 0.1% Ti, 0.15% Zn, 0.05% Cr, 0.35% -0.6% Mg, 0.1% Mn, 0.1% Cu, 0.1% -0.3% Fe y 0.3% -0.6% Si. La corrosión se puede minimizar, por ejemplo, reduciendo el tiempo en el portamuestras o utilizando una capa protectora (que puede agregar a la señal de fondo) como níquel u oro.

Para muestras de polvo de proteínas hidrogenadas, se demostró que el procedimiento de liofilización se completa de manera eficiente con un paso en un desecador en presencia de polvo de P2O5 para eliminar la mayor cantidad posible de agua ligera residual35. Para muestras de polvo, también se recomienda caracterizar (utilizando microscopía de fuerza atómica y difracción de polvo de rayos X) el polvo en su estado final hidratado y evaluar el efecto de la deuteración, la liofilización y la difusión de vapor en los estados de monómero y fibra. En particular, la liofilización puede romper las fibras, lo que resulta en segmentos acortados, sin afectar la morfología. Además, se ha observado por difracción de potencia de rayos X que el enfriamiento lento, en lugar del enfriamiento repentino en nitrógeno líquido, podría inducir la presencia de estructuras similares a amiloides (resultado no publicado).

Recopilación de datos (paso 3 del protocolo). Se recomienda planificar la recopilación de datos con el contacto local antes del experimento (incluso si se ha discutido durante el proceso de redacción de la propuesta). El plan de recopilación de datos está sujeto a cambios después de los primeros escaneos, dependiendo de la relación señal-ruido obtenida. Para experimentos resueltos en el tiempo en particular, el uso de E/IFWS permite una rápida recopilación de datos: 30 s a 1 min para la línea elástica, 4-5 min para un punto de datos a 3 μeV5, pero el rango de transferencias de energía accesibles es inherentemente limitado. Alternativamente, se puede utilizar un promedio móvil de los datos QENS46. Con este fin, la nueva opción de retrodispersión y espectroscopia de tiempo de vuelo (BATS) en IN16B ofrece un flujo mayor que el IN16B clásico con un rango de energía de ±150 μeV (o superior dependiendo de la configuración utilizada) a costa de una menor resolución en energía11. Por lo tanto, la opción BATS se recomienda para estudios resueltos en el tiempo, especialmente para procesos como la agregación amiloide, que tiene lugar durante varias horas.

Análisis de datos (pasos de protocolo 4, 5 y 6). La función de dispersión S(q,ω) incluye todos los tipos de movimientos en la muestra, y los modelos descritos en el protocolo anterior son aproximaciones. En particular, para IDP en estado líquido, los movimientos a gran escala de la cadena desordenada pueden ocurrir en la misma longitud y escala de tiempo que la difusión del centro de masa de toda la proteína. Por lo tanto, el usuario debe tener en cuenta que la separación de la difusión del centro de masa y la dinámica interna de las proteínas no siempre es sencilla. El procedimiento de ajuste puede beneficiarse de la información sobre la difusión del centro de masa obtenida a través de métodos complementarios, de modo que este parámetro puede fijarse (teniendo en cuenta que otros métodos pueden proporcionar un coeficiente de difusión colectiva asociado a diferentes escalas de tiempo y longitud) para obtener un resultado más robusto para la dinámica interna.

Además de la dispersión de neutrones, la dinámica de un sistema molecular puede caracterizarse por resonancia magnética nuclear (RMN), que proporciona información local sobre proteínas marcadas con isótopos y en una amplia gama de escalas de tiempo47,48,49. El método se ha utilizado con éxito para estudiar sistemas amiloides 48,50,51,52,53, pero no permite a los usuarios simplemente estudiar el agua de hidratación o seguir el proceso de agregación amiloide en tiempo real debido a la limitación inherente en el tamaño de la proteína. Los desarrollos recientes en espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR) y el método derivado de EPR Overhauser dynamic nuclear polarization (ODNP) ofrecen una buena perspectiva cuando se combinan con la dispersión de neutrones. De hecho, a través del etiquetado de espín dirigido al sitio (SDSL), EPR y ODNP pueden sondear la proteína54 y la dinámica de hidratación55, respectivamente, en la escala de tiempo ps-ns alrededor de la etiqueta de espín introducida.

Estos métodos se utilizaron para estudiar la agregación de la proteína tau56,57 y ofrecerán una gran complementariedad con la dispersión de neutrones que puede obtener información similar, pero promediada sobre toda la muestra. Además, la espectroscopia infrarroja puede proporcionar información dinámica para movimientos de alta energía asociados con patrones estructurales específicos, pero la complejidad del entorno proteico (tampón utilizado) puede afectar la interpretación de los datos58,59. Las técnicas de retrodispersión de neutrones proporcionan una visión única y complementaria de la dinámica de las proteínas y el agua de hidratación en la escala de tiempo ps-ns junto con los resultados de los métodos antes mencionados. No requieren un etiquetado específico de la muestra, la calidad de la señal no es sensible al tamaño de la proteína y las mediciones se pueden realizar in vivo o en entornos deuterados altamente complejos, como el lisado bacteriano deuterado 3,6,7. Como este método proporciona un resultado promediado por conjuntos, se complementa bien con simulaciones de dinámica molecular para obtener información de detalle atómico sobre el sistema en estudio. Las simulaciones se pueden validar fácilmente mediante una comparación directa entre el conjunto de datos experimentales y los espectros QENS teóricos calculados a partir de la trayectoria de simulación utilizando software como mdanse60.

En cuanto a los sistemas amiloides, la retrodispersión de neutrones ha demostrado ser útil para caracterizar la proteína ps-ns y la dinámica del agua para diversos sistemas y condiciones 5,31,61,62,63,64. En particular, se utilizó la retrodispersión de neutrones para revelar la correlación entre la proporción de la secuencia de proteínas involucrada en la estructura de β cruzada y la amplitud de la ganancia de entropía del agua tras la fibrilación (resultados no publicados). Además, el desarrollo de entornos de muestreo permite la adquisición simultánea de espectros de neutrones y datos de relajación dieléctrica65 o datos de dispersión Raman66. Además, los detectores de difracción están presentes en IN16B para obtener datos estructurales junto con datos dinámicos. Además, se espera que el flujo de neutrones entrantes mejore para el modo BATS de IN16B en un futuro próximo, gracias al uso de la llamada guía de enfoque variable, cuya geometría se puede adaptar bajo demanda a la configuración instrumental utilizada. Impulsar aún más el desarrollo de entornos de muestras e instrumentación sofisticados permitiría experimentos aún más complejos en el futuro, posiblemente entregando más información dinámica y estructural al mismo tiempo.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Michaela Zamponi en el Centro Jülich para la Ciencia de Neutrones en el Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Alemania, por parte de los experimentos de dispersión de neutrones realizados en el instrumento SPHERES. Este trabajo se ha beneficiado de las actividades del consorcio Deuteration Laboratory (DLAB) financiado por la Unión Europea bajo los Contratos HPRI-2001-50065 y RII3-CT-2003-505925, y de la actividad financiada por el Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas del Reino Unido (EPSRC) dentro del Institut Laue Langevin EMBL DLAB bajo las subvenciones GR / R99393/01 y EP / C015452 / 1. Se reconoce el apoyo de la Comisión Europea en el marco del 7º Programa Marco a través de la Acción Clave: Fortalecimiento del Espacio Europeo de Investigación, Infraestructuras de Investigación [Contrato 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot y Christian Beck agradecen al Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF, número de subvención 05K19VTB) por la financiación de sus becas postdoctorales.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Espectroscopía de neutrones de alta resolución para estudiar la dinámica de picosegundos-nanosegundos de proteínas y agua de hidratación
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Pounot, K., Appel, M., Beck, C., Weik, M., Schirò, G., Fichou, Y., Seydel, T., Schreiber, F. High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water. J. Vis. Exp. (182), e63664, doi:10.3791/63664 (2022).

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