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Biochemistry

Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

La spettroscopia di retrodiffusione neutronica offre un accesso non distruttivo e privo di etichette alla dinamica ps-ns delle proteine e della loro acqua di idratazione. Il flusso di lavoro è presentato con due studi sulle proteine amiloidi: sulla dinamica tempo-risolta del lisozima durante l'aggregazione e sulla dinamica dell'acqua di idratazione della tau sulla formazione delle fibre.

Abstract

Lo scattering neutronico offre la possibilità di sondare la dinamica all'interno dei campioni per una vasta gamma di energie in modo non distruttivo e senza etichettatura diversa dal deuterio. In particolare, la spettroscopia di retrodiffusione neutronica registra i segnali di scattering a più angoli di scattering simultaneamente ed è adatta per studiare la dinamica dei sistemi biologici sulla scala temporale ps-ns. Impiegando D2O-e possibilmente componenti tampone deuterati, il metodo consente il monitoraggio sia della diffusione del centro di massa che dei movimenti della spina dorsale e della catena laterale (dinamica interna) delle proteine allo stato liquido.

Inoltre, la dinamica dell'acqua di idratazione può essere studiata impiegando polveri di proteine perdeuterate idratate con H2O. Questo documento presenta il flusso di lavoro impiegato sullo strumento IN16B presso l'Institut Laue-Langevin (ILL) per studiare la dinamica delle proteine e dell'idratazione dell'acqua. Viene spiegata la preparazione di campioni di soluzione e campioni di polvere proteica idrata utilizzando lo scambio di vapore. La procedura di analisi dei dati per la dinamica delle proteine e dell'acqua di idratazione è descritta per diversi tipi di set di dati (spettri quasielastici o scansioni a finestra fissa) che possono essere ottenuti su uno spettrometro di retrodiffusione di neutroni.

Il metodo è illustrato con due studi che coinvolgono proteine amiloidi. L'aggregazione del lisozima in aggregati sferici di dimensioni μm - particolato indicato - è dimostrato che avviene in un processo in un'unica fase sull'intervallo di spazio e tempo sondato su IN16B, mentre la dinamica interna rimane invariata. Inoltre, la dinamica dell'acqua di idratazione della tau è stata studiata su polveri idratate di proteine perdeuterate. È dimostrato che i movimenti traslazionali dell'acqua si attivano sulla formazione di fibre amiloidi. Infine, vengono discussi i passaggi critici del protocollo su come lo scattering neutronico è posizionato per quanto riguarda lo studio della dinamica rispetto ad altri metodi biofisici sperimentali.

Introduction

Il neutrone è una particella massiccia e priva di carica che è stata utilizzata con successo nel corso degli anni per sondare campioni in vari campi, dalla fisica fondamentale alla biologia1. Per le applicazioni biologiche, lo scattering neutronico a piccolo angolo, lo scattering neutronico anelastico, la cristallografia neutronica e la riflettometria sono ampiamente utilizzati 2,3,4. Lo scattering anelastico di neutroni fornisce una misura mediata dell'insieme della dinamica senza richiedere un'etichettatura specifica di per sé e una qualità del segnale che non dipende dalla dimensione o dalla proteina5. La misurazione può essere effettuata utilizzando un ambiente altamente complesso per la proteina in studio che imita il mezzo intracellulare, come un lisato batterico deuterato o anche in vivo 3,6,7. Diverse configurazioni sperimentali possono essere utilizzate per studiare le dinamiche, vale a dire i) l'accesso al tempo di volo alle dinamiche sub-ps-ps, ii) l'accesso alla dinamica ps-ns e iii) l'accesso alle dinamiche da ns a centinaia di ns. La retrodiffusione neutronica fa uso della legge di Bragg 2d sinθ = nλ, dove d è la distanza tra i piani in un cristallo, θ l'angolo di scattering, n l'ordine di scattering e λ la lunghezza d'onda. L'uso di cristalli per il backscattering verso i rivelatori consente di ottenere un'alta risoluzione in energia, tipicamente ~ 0,8 μeV. Per misurare lo scambio di energia, viene utilizzato un azionamento Doppler che trasporta un cristallo in retrodiffusione per definire e sintonizzare la lunghezza d'onda dei neutroni in arrivo 8,9,10 (Figura 1), oppure è possibile utilizzare una configurazione del tempo di volo al costo di una diminuzione della risoluzione energetica 11.

Figure 1
Figura 1: Schizzo di uno spettrometro di retrodiffusione di neutroni con un drive Doppler. Il fascio in entrata colpisce il chopper PST (Phase Space Transformation)42, che aumenta il flusso nella posizione del campione. Viene quindi retrodiffuso verso il campione dall'azionamento Doppler, che seleziona un'energia E1 (freccia ciano). I neutroni vengono poi dispersi dal campione (con energie diverse rappresentate dal colore delle frecce) e gli analizzatori, costituiti da cristalli di Si 111, disperderanno solo neutroni con una specifica energia E0 (qui frecce colorate di rosso). Quindi, il trasferimento di quantità di moto q è ottenuto dalla posizione rilevata del neutrone sull'array del rivelatore e il trasferimento di energia è ottenuto dalla differenza E1- E0. Il tempo di volo previsto per l'impulso neutronico prodotto dal PST viene utilizzato per scartare il segnale dai neutroni sparsi direttamente verso i tubi del rivelatore. Abbreviazione: PST = trasformazione dello spazio delle fasi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Per la spettroscopia di retrodiffusione, il principale contributo al segnale da campioni ricchi di protoni di idrogeno, come le proteine, proviene dallo scattering incoerente, per il quale l'intensità di scattering Sinc(q, ω) è mostrata da Eq (1)12

Equation 1 (1)

Dove σinc è la sezione trasversale incoerente dell'elemento considerato, k' è la norma del vettore d'onda diffuso, k la norma del vettore d'onda entrante, q (= k - k') il trasferimento di quantità di moto, r j(t) il vettore posizione dell'atomo j al tempo t e ω la frequenza corrispondente al trasferimento di energia tra il neutrone entrante e il sistema. Le parentesi angolari indicano la media dell'ensemble. Quindi, lo scattering incoerente sonda l'autocorrelazione delle singole particelle mediata dall'insieme delle posizioni degli atomi con il tempo e fornisce l'autodinamica mediata su tutti gli atomi nel sistema e le diverse origini temporali (media dell'insieme). La funzione di scattering è la trasformata di Fourier nel tempo della funzione di scattering intermedia I(q, t), che può essere vista come la trasformata di Fourier nello spazio della funzione di correlazione di van Hove mostrata da Eq (2):

Equation 2 (2)

Dove ρ(r,t) è la densità di probabilità di trovare un atomo in posizione r e tempo t 13.

Per un processo di diffusione di Fick, la funzione di autodiffusione risulta (vedi Eq (3)) dopo una doppia trasformata di Fourier in una funzione di scattering consistente in un lorentziano di larghezza di linea data da γ = Dq2.

Equation 10 (3)

Sono stati sviluppati e trovati utili modelli più sofisticati come il modello di diffusione a salto di Singwi e Sjölander per la dinamica interna delle proteine ps-ns14 o il modello di rotazione di Sears per l'acqua di idratazione15,16,17.

Sullo strumento di retrodiffusione neutronica (NBS) IN16B 8,9 presso l'ILL, Grenoble, Francia (Figura supplementare S1), una configurazione comunemente usata con le proteine è costituita da cristalli di Si 111 per gli analizzatori con un drive Doppler per la regolazione della lunghezza d'onda in entrata (Figura supplementare S2A), dando così accesso all'intervallo di trasferimento della quantità di moto ~0,2 Å-1 < q < ~2 Å-1 e intervallo di trasferimento di energia di -30 μeV < Equation 3 < 30 μeV, corrispondenti a scale temporali che vanno da pochi ps a pochi ns e distanze di pochi Å. Inoltre, IN16B offre la possibilità di eseguire scansioni elastiche e anelastiche a finestra fissa (E/IFWS)10, che includono l'acquisizione dei dati a un trasferimento di energia fisso. Poiché il flusso è limitato quando si lavora con neutroni, E/IFWS consente di massimizzare il flusso per un trasferimento di energia, riducendo così il tempo di acquisizione necessario per ottenere un soddisfacente rapporto segnale-rumore. Un'opzione più recente è il backscattering and time-of-flight spectrometer (BATS) mode11, che consente la misurazione di un'ampia gamma di trasferimenti di energia, (ad esempio, -150 μeV < < Equation 3 150 μeV), con un flusso più elevato rispetto al Doppler, ma al costo di una risoluzione energetica inferiore (Figura supplementare S2B).

Una proprietà importante dello scattering neutronico è che la sezione d'urto incoerente σinc ha un valore 40 volte superiore per l'idrogeno che per il deuterio ed è trascurabile per altri elementi che si trovano comunemente nei campioni biologici. Pertanto, la dinamica delle proteine in un ambiente liquido può essere studiata utilizzando un tampone deuterato e lo stato della polvere consente lo studio della dinamica interna delle proteine con polvere proteica idrogenata idratata conD 2 O, o lo studio dell'acqua di idratazione per proteine perdeuterate in polvere idratate con H2O. Allo stato liquido, la retrodiffusione neutronica consente tipicamente l'accesso simultaneo all'autodiffusione del centro di massa delle proteine (diffusione di tipo Fickiano) e alla loro dinamica interna. Questi ultimi sono movimenti della spina dorsale e della catena laterale solitamente descritti dal cosiddetto modello di diffusione del salto o altri 3,18. Nelle polveri proteiche idrogenate, la diffusione proteica è assente e deve essere modellata solo la dinamica interna. Per l'acqua di idratazione, i contributi dei moti traslazionali e rotazionali delle molecole d'acqua presentano una diversa dipendenza dal trasferimento di quantità di moto q, che consente la loro distinzione nel processo di analisi dei dati17.

Questo articolo illustra il metodo di retrodiffusione neutronica con lo studio di proteine che sono risultate in grado di dispiegarsi, aggregarsi in una forma canonica costituita da pile di β-filamenti - il cosiddetto modello di β incrociato19,20 - e formare fibre allungate. Si tratta della cosiddetta aggregazione amiloide, ampiamente studiata per il suo ruolo centrale nelle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer o il Parkinson21,22. Lo studio delle proteine amiloidi è anche motivato dal ruolo funzionale che possono svolgere 23,24 o dal loro elevato potenziale per lo sviluppo di nuovi biomateriali25. I determinanti fisico-chimici dell'aggregazione amiloide rimangono poco chiari e non è disponibile alcuna teoria generale dell'aggregazione amiloide, nonostante gli enormi progressi compiuti negli ultimi anni21,26.

L'aggregazione amiloide implica cambiamenti nella struttura e nella stabilità delle proteine nel tempo, il cui studio implica naturalmente dinamiche, legate alla stabilità della conformazione delle proteine, alla funzione proteica e al panorama energetico delle proteine27. La dinamica è direttamente collegata alla stabilità di uno stato specifico attraverso il contributo entropico per i moti più veloci28, e la funzione proteica può essere sostenuta da movimenti su varie scale temporali da sub-ps per proteine sensibili alla luce29 a ms per movimenti di dominio, che possono essere facilitati dalla dinamica picosecondo-nanosecondo30.

Saranno presentati due esempi di utilizzo della spettroscopia di retrodiffusione neutronica per studiare le proteine amiloidi, uno allo stato liquido per studiare la dinamica delle proteine e uno allo stato di polvere idratata per studiare la dinamica dell'acqua di idratazione. Il primo esempio riguarda l'aggregazione del lisozima in sfere di dimensioni μm (chiamate particolato) seguite in tempo reale5, e il secondo un confronto della dinamica dell'acqua negli stati nativi e aggregati della proteina umana tau31.

Il lisozima è un enzima coinvolto nella difesa immunitaria ed è composto da 129 residui di aminoacidi. Il lisozima può formare particolato in tampone deuterato a pD di 10,5 e ad una temperatura di 90 °C. Con lo scattering neutronico, abbiamo dimostrato che l'evoluzione temporale del coefficiente di diffusione del centro di massa del lisozima segue la singola cinetica esponenziale della fluorescenza T della tioflavina (una sonda fluorescente utilizzata per monitorare la formazione di modelli di β incrociato amiloide32), indicando che le sovrastrutture particolate di formazione e i modelli di cross-β si verificano in un unico passaggio con la stessa velocità. Inoltre, la dinamica interna è rimasta costante durante tutto il processo di aggregazione, che può essere spiegato sia da un rapido cambiamento conformazionale che non può essere osservato sugli strumenti NBS, sia dall'assenza di cambiamenti significativi nell'energia interna della proteina dopo l'aggregazione.

La proteina umana tau è una proteina intrinsecamente disordinata (IDP) costituita da 441 aminoacidi per la cosiddetta isoforma 2N4R, che è particolarmente coinvolta nella malattia di Alzheimer33. Utilizzando la retrodiffusione neutronica su polveri di proteina tau perdeuterata, abbiamo dimostrato che la dinamica dell'acqua di idratazione è aumentata allo stato di fibra, con una maggiore popolazione di molecole d'acqua sottoposte a movimenti traslazionali. Il risultato suggerisce che un aumento dell'entropia dell'acqua di idratazione potrebbe guidare la fibrillazione amiloide della tau.

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Protocol

1. Preparare il tampone deuterato per le proteine allo stato liquido

  1. Sciogliere tutti i componenti del tampone in puro D2O.
  2. Se l'elettrodo pH è stato calibrato in H2O, regolare il pD secondo la formula pD = pH + 0,4 usando NaOD o DCl34.
    NOTA: L'uso di D2 O invece di H2O potrebbe influire sulla solubilità delle proteine e potrebbe essere necessario adattare le condizioni tampone (ad esempio, con una leggera variazione della concentrazione salina).

2. Preparare le polveri H2O-idratate di proteine perdeuterate

  1. Preparare il portacampioni.
    1. Pulire accuratamente un portacampioni piatto in alluminio con la guarnizione del filo di indio e le viti con acqua ed etanolo e lasciarlo asciugare.
      NOTA: viene utilizzato un portacampioni piatto in modo tale che la polvere possa essere distribuita in modo omogeneo sulla superficie. La quantità di polvere deve essere sufficiente in modo tale da poter essere mantenuta tra le pareti e non cadere quando il portacampioni viene posizionato verticalmente.
    2. Pesare separatamente le diverse parti del portacampioni, il fondo, il coperchio e il filo di indio su una bilancia di precisione.
    3. Posizionare la guarnizione del filo di indio da 1 mm nella scanalatura della parte inferiore del portacampioni, lasciando una piccola sovrapposizione nel punto in cui le due estremità si uniscono (figura 2A).
    4. Posizionare una quantità appropriata di proteine liofilizzate (tipicamente ~ 100 mg di proteine) in modo tale da riempire la superficie interna della parte inferiore del portacampioni.
  2. Idratare la polvere proteica.
    1. Porre il portacampioni in un essiccatore con una capsula di Petri contenente polvere di P2O5 per 24 ore per asciugare completamente la polvere proteica35 (Figura 2B). Pesare la parte inferiore asciutta del portacampioni contenente il sigillo di indio e la polvere secca per ottenere masciutto.
      ATTENZIONE: la polvere P2O5 è molto corrosiva.
    2. Rimuovere il P 2 O5 dall'essiccatore e mettere una capsula di Petri con D2O all'interno. Controllare regolarmente la massa della polvere per controllare il livello di idratazione h = m hyd / m dry dove mhyd e mdry sono rispettivamente la massa della polvere idratata e della polvere secca.
      NOTA: Per proteine altamente idrofobiche come l'insulina, potrebbe essere necessario aumentare la temperatura all'interno dell'essiccatore per ottenere una pressione di vapore più elevata e raggiungere il livello di idratazione desiderato h.
    3. Ripetere i passaggi 2.2.1 e 2.2.2 almeno tre volte per convertire correttamente tutti gli idrogeni scambiabili in deuteroni.
      NOTA: In alternativa, cicli di liofilizzazione e dissoluzione in D2O puro potrebbero essere utilizzati per un migliore scambio H/D a condizione che la proteina non ne sia influenzata.
    4. Idratare la polvere leggermente al di sopra del livello desiderato, lasciare che la parte inferiore del supporto del campione con il filo di indio e la polvere idratata rimanga sulla bilancia di precisione e attendere che la massa diminuisca lentamente fino al valore desiderato per ottenere l'h target (tipicamente 0,2-0,4 se una proteina globulare di medie dimensioni deve essere coperta da uno strato di idratazione completo).
    5. Posizionare rapidamente il coperchio sulla parte inferiore e chiudere prima il portacampioni con quattro viti per interrompere lo scambio di vapore (Figura supplementare S3A).
    6. Posizionare e serrare tutte le viti rimanenti fino a quando non è visibile alcuno spazio tra la parte inferiore e il coperchio (Figura supplementare S3B).
    7. Pesare il portacampioni sigillato per verificare eventuali perdite di idratazione dovute a perdite dopo l'esperimento neutronico.

3. Eseguire l'esperimento di scattering neutronico incoerente

  1. Discutere e ricontrollare la configurazione dello strumento necessario per l'esperimento con il contatto locale alcune settimane prima del beamtime assegnato.
  2. Preparare il campione allo stato liquido.
    1. Sciogliere la proteina nel tampone deuterato.
    2. Determinare il volume appropriato di liquido da inserire nel portacampioni usando acqua (assicurarsi che non vi sia trabocco quando il portacampioni è chiuso; Figura 2C).
      NOTA: Le seguenti fasi (3.3 e 3.4) descrivono un esperimento condotto sullo spettrometro NBS IN16B all'ILL8,9, utilizzando una criofornace come ambiente campione. Il sistema di controllo dello strumento cambierà da uno strumento all'altro, ma i principi di funzionamento rimarranno gli stessi.
  3. Inserire l'esempio.
    1. Asciugare accuratamente lo stick del campione (Figura 2D) e rimuovere l'eventuale campione precedente dopo aver verificato che la dose di radiazioni ionizzanti sia inferiore a 100 μSv/h prima di maneggiare qualsiasi materiale (all'ILL).
    2. Posizionare il campione, verificare la corretta centratura rispetto al centro del fascio (Figura supplementare S4) e inserire il bastoncino del campione nella criofornace (Figura 2D). Accendere la pompa per vuoto per raggiungere meno di 10-3 bar e sciacquare l'aria all'interno della crioforno ripetendo le seguenti tre volte: riempire la criofornace con gas elio fino a raggiungere la pressione atmosferica e rimuovere nuovamente il gas utilizzando la pompa per vuoto.
      NOTA: Nel caso di un portacampioni piatto, il portacampioni deve essere orientato con un angolo di 45° rispetto al fascio in entrata. L'intervallo di trasferimento del momento utile potrebbe essere ridotto a causa dell'assorbimento e della dispersione da parte della cellula. Un potente assorbitore di neutroni come il cadmio può essere utilizzato per mascherare alcune parti del portacampioni (ad esempio, viti, parti spesse).
    3. Introdurre un po 'di gas elio nella criofornace in modo tale che la pressione sia ~ 0,05 bar.
  4. Acquisire dati (ad esempio, utilizzando NOMAD su IN16B all'ILL, si presume che l'utente preferisca una temperatura di 200 K prima di acquisire uno spettro di neutroni quasielastici (QENS), quindi E / IFWS durante una rampa di temperatura a 310 K a 0,5 K al minuto e infine un QENS a 310 K).
    1. Utilizzando NOMAD, nella scheda di esecuzione , trascinare e rilasciare un controller FurnaceCryostat nella piattaforma di lancio. Impostare la temperatura su 200 K. Utilizzare la modalità veloce e un timeout di 30 minuti in modo tale che la temperatura abbia il tempo di stabilizzarsi. Fare clic sull'icona delle frecce rotanti per eseguirlo in background in modo che i dati possano essere acquisiti durante la diminuzione della temperatura.
    2. Trascinare e rilasciare il controller IN16DopplerSettings , impostare il profilo di velocità su Velocità accurata impostata da Max ΔE, un valore di 0,00 μeV e 128 canali per ottenere una configurazione EFWS.
    3. Trascina e rilascia un controller Count , compila il campo Sottotitolo con un nome che consenta una facile identificazione dei dati e imposta 60 ripetizioni di scansioni di 30 s (Figura supplementare S5A).
    4. Trascinare e rilasciare un controller IN16DopplerSettings , impostare il profilo di velocità su Sine impostato da Speed con un valore di 4,5 m/s e 2.048 canali per ottenere una configurazione QENS.
    5. Trascina e rilascia un controller Count con 4 ripetizioni di scansioni di 30 minuti (Figura supplementare S5B).
    6. Per la rampa di temperatura, trascinare e rilasciare un controller FurnaceCryostat , impostare la temperatura su 310 K, impostare Ramp su SetPoint con Δ = 0,05 K e 6 s. Utilizzare un tempo di 220 minuti (figura supplementare S6A).
    7. Usa un ciclo for con 65 ripetizioni. All'interno, inserire un controller IN16DopplerSettings come nel passaggio 3.4.2, seguito da un singolo conteggio di 30 s. Successivamente, inserire IN16DopplerSettings, come descritto in precedenza, ma utilizzando un offset energetico di 1,5 μeV e 1.024 canali seguito da un singolo conteggio di 3 minuti (Figura supplementare S6B).
    8. Per acquisire l'ultimo QENS a 310 K, trascinare e rilasciare i controller IN16DopplerSettings e Count configurati come descritto rispettivamente nei passaggi 3.4.4 e 3.4.5.
    9. Premere il pulsante di avvio (triangolo rettangolo nella parte inferiore della finestra) per eseguire lo script.
      NOTA: Ogni esperimento richiederà l'acquisizione di dati di calibrazione; cioè la cella vuota per le correzioni di sottrazione o assorbimento, il buffer da solo alle diverse temperature utilizzate per modellare lo sfondo e una misura di vanadio (o equivalentemente, il campione a una temperatura di 10 K o inferiore) per ottenere la funzione di risoluzione dello strumento.

4. Analisi dei dati - QENS

  1. Importare il set di dati utilizzando il metodo 'IN16B_QENS.process()' nel software Python nPDyn v3.x36
    >>>> da nPDyn.dataParser importa IN16B_QENS

    >>> esempio = IN16B_QENS(
    ...
    ... [detGroup=... formato>]
    ... ). processo()

    >>> campione = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Eseguire correzioni dei dati (facoltativo) con i seguenti comandi (vedere la documentazione di nPDyn per ulteriori informazioni, Figura 3):
    #it si presume che i dati per celle vuote, vanadio e buffer
    # sono stati importati già nel set di dati chiamato 'empty_cell', 'vanadio',
    # e 'buffer', rispettivamente.

    # per la sottrazione di celle vuote con un fattore di scala
    # (gli errori vengono propagati automaticamente)
    >>> campione = campione - 0,95 * empty_cell

    # per la correzione utilizzando il coefficiente di Paalman-Ping
    # (mutuamente esclusivo con l'esempio sopra)
    >>> sample = sample.absorptionCorrection(empty_cell)

    # per la normalizzazione
    >>> campione = sample.normalize(vanadio)

    # per il binning lungo l'asse osservabile
    # osservabile è il tempo di aggregazione qui
    >>> campione = campione.bin(3; asse=0)
  3. Adatta i dati di calibrazione. I campioni del set di dati, la cella vuota, il buffer deuterato (se necessario) e il vanadio possono essere montati utilizzando modelli integrati o un modello definito dall'utente (vedere la documentazione nPDyn):
    >>> dall'importazione nPDyn.models.builtins (
    ... modelloPVoigt,
    ... modelloAcqua,
    ... modelloCalibratedD2O,
    ...     )

    # I modelli incorporati utilizzano un vettore colonna della quantità di moto
    # Trasferisci valori Q
    >>> q = vanadio.q[:, Nessuno]

    # il vanadio è montato utilizzando un profilo pseudo-Voigt
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. Utilizzare il modello integrato per l'acqua di idratazione chiamato "modelWater". Questo modello si legge come mostrato da Eq (4)17
    Equation 4 (4)
    Dove a0, ar e at sono scalari che rappresentano il contributo relativo del segnale elastico, dei moti rotazionali e dei moti traslazionali, rispettivamente; j1(qd) è la funzione di Bessel sferica di ordinel-esimo , dove q è il trasferimento di quantità di moto; d la distanza O-H nella molecola d'acqua; δ(ω) è il delta di Dirac, che qui viene moltiplicato per l'EISF; N è l'ordine più alto della funzione di Bessel sferica utilizzata (tipicamente ~5); Equation 5 e Equation 11 sono rispettivamente i moti rotazionali e traslazionali lorentziani; b(q) è un termine di fondo piatto. Le funzioni sferiche di Bessel danno il contributo relativo di ogni stato del momento angolare delle molecole d'acqua, e il numero N è determinato in base all'intervallo q di trasferimento della quantità di moto. Nel caso di un tipico spettrometro NBS, i termini fino a N = 4 spiegano quasi interamente il segnale (Figura supplementare S7).
    # Qui, l'equazione 2 è usata per l'acqua di idratazione
    # convoluzione con funzione di risoluzione e aggiunta di
    # Lo sfondo D2O viene eseguito automaticamente con il
    # argomenti forniti
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=vanadio,
    ... bkgd=buffer,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    NOTA: I contributi dei moti rotazionali e traslazionali dovrebbero essere contorti per essere perfettamente rigorosi. Il successo di un modello additivo è da attribuire alla presenza di popolazioni distinte di acqua sulla superficie proteica e alla limitata gamma di energia accessibile.
  5. Utilizzare quanto segue per tracciare i dati (Figura 4):
    >>> dal grafico di importazione nPDyn.plot
    >>> trama(esempio)

5. Analisi dei dati - rampa di temperatura, scansioni elastiche a finestra fissa (EFWS)

  1. Utilizzare una procedura simile alla sezione 4 per normalizzare i dati della rampa di temperatura dal segnale alla temperatura più bassa (in genere 10 K):
    >>> da nPDyn.dataParser importa IN16B_FWS

    >>> esempio = IN16B_FWS(
    ... ,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ). processo()

    # normalizzazione con i primi 5 punti sull'osservabile
    # asse, che corrispondono alla temperatura
    >>> esempio /= sample[:5].mean(0)

    # L'intervallo Q di trasferimento del momento utilizzato qui è più piccolo
    # poiché il modello utilizzato è valido solo per Q basso
    >>> campione = sample.get_q_range(0,2; 0,8)
  2. Utilizzare un semplice modello gaussiano per iniziare, la cui larghezza è data dal cosiddetto spostamento quadratico medio (MSD). Compilate e adattate il modello utilizzando i seguenti comandi:
    >>> importare numpy come np
    >>> da nPDyn.models import Parametri, Modello, Componente

    # a è un fattore di scala
    >>> params = Parameters(
    ... a={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)},
    ... msd={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> model = Model(params)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... «gaussiano»,
    ... lambda x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(model; x=sample.q[:; None])

    >>> trama(esempio)
    NOTA: L'approssimazione gaussiana vale sempre per q2MSD << 1, ma è possibile utilizzare un intervallo di trasferimento della quantità di moto più ampio per il confronto relativo tra campioni. Modelli più sofisticati, che vanno oltre l'approssimazione gaussiana, sono stati sviluppati37,38,39.

6. Analisi dei dati - scansioni elastiche e anelastiche a finestra fissa (E/IFWS)

  1. Analogamente al passaggio 4, importare il set di dati ma utilizzando la classe 'IN16B_FWS':
    >>> da nPDyn.dataParser importa IN16B_FWS

    >>> esempio = IN16B_FWS(
    ...
    ... [detGroup=]
    ... ). processo()

    >>> campione = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Adattare i dati di calibrazione e i dati campione.
    1. Analizzare i dati E/IFWS utilizzando un MSD40 generalizzato o considerandoli come spettri QENS grossolani (con solo pochi punti dati sull'asse dell'energia). Quando E/IFWS è visto come QENS grossolano, i modelli utilizzati per QENS vengono utilizzati per adattare l'intero set di dati E/IFWS contemporaneamente (adattamento globale dei trasferimenti di energia e trasferimenti di quantità di moto).
      NOTA: Quest'ultima soluzione - che utilizza modelli per QENS su dati E/IFWS - è usata qui dove viene imposta la dipendenza dal trasferimento di quantità di moto della diffusione del centro di massa e la dinamica interna delle proteine.
    2. Modellare la dinamica delle proteine nei liquidi usando il seguente Eq (5) ('modelProteinJumpDiff' in nPDyn):
      Equation 6 (5)
      Dove R(q,ω) è la funzione di risoluzione; β uno scalare indipendente per ogni trasferimento di quantità di moto q; a0 è il fattore di struttura elastico incoerente (EISF); Equation 7 un spiegazione lorentziano della diffusione del centro di massa con una larghezza data da Eq (6); Equation 12 è un lorentziano che include la diffusione del centro di massa e un contributo seguendo il modello di salto-diffusione14 che tiene conto della dinamica interna (Eq (7); Equation 8 essendo il segnale adattato da D2O riscalato dalla sua frazione di volume nel campione.
      γ = Dsq2 (6)
      Ds è il coefficiente di autodiffusione.
      Equation 9 (7)
      D i è il coefficiente di diffusione apparente per la dinamica interna e τ un tempo di rilassamento per i moti diffusivi.
      >>> dall'importazione nPDyn.models.builtins (
      ... modelloPVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... modelloCalibratedD2O,
      ... )

      # I modelli incorporati utilizzano un vettore colonna della quantità di moto
      # Trasferisci valori Q
      >>> q = vanadio.q[:, Nessuno]

      # il vanadio è montato utilizzando un profilo pseudo-Voigt
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # per puro D2O, un modello con larghezza di linea calibrata
      # per temperature diverse è incluso in nPDyn
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # qui, l'equazione 3 viene utilizzata per i campioni liquidi
      # convoluzione con funzione di risoluzione e aggiunta di
      # Lo sfondo D2O viene eseguito automaticamente con gli argomenti # forniti
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=vanadio,
      ... bkgd=buffer,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. Tracciare i dati adattati utilizzando:
    >>> dal grafico di importazione nPDyn.plot
    >>> trama(esempio)

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Representative Results

L'aggregazione del lisozima in particolato è stata effettuata a 90 °C con una concentrazione proteica di 50 mg/ml in un tampone deuterato (0,1 M NaCl a pD 10,5). La formazione di particolato è innescata dall'aumento della temperatura a 90 °C e avviene entro 6 ore (figura supplementare S8). L'acquisizione dei dati è stata eseguita su IN16B, come descritto nel protocollo sopra (i dati sono curati in modo permanente dall'ILL e accessibili a http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

È stato acquisito uno spettro QENS a 7 °C per caratterizzare completamente lo stato iniziale. Successivamente, la temperatura è stata aumentata a 90 °C (in genere richiede ~ 30 minuti su IN16B, figura supplementare S9) per innescare il processo di aggregazione. La cinetica può essere seguita utilizzando una media mobile degli spettri QENS, consentendo l'accesso all'intera gamma di trasferimenti di energia, ma con una risoluzione limitata nel tempo. La risoluzione temporale può essere migliorata a ~1 min utilizzando EFWS e a ~20 min utilizzando E/IFWS a quattro valori di trasferimento di energia5.

Nell'esempio presentato, abbiamo esplorato i trasferimenti di energia di 0, 0,6, 1,5 e 3 μeV. Le scansioni E/IFWS vengono acquisite continuamente durante il processo di aggregazione e uno spettro QENS è stato acquisito per lo stato finale a 90 °C. I dati E/IFWS sono stati corretti per l'assorbimento utilizzando l'E/IFWS della cella vuota e normalizzati utilizzando i dati sul vanadio.

Per il lisozima E/IFWS, osserviamo un aumento del segnale nel tempo a basso trasferimento di quantità di moto e basso trasferimento di energia, mentre il segnale ad alto trasferimento di energia e basso trasferimento di quantità di moto diminuisce (Figura supplementare 10). Questa osservazione qualitativa indica la formazione di oggetti più grandi, diffondendosi più lentamente e confermando che il processo di aggregazione ha avuto luogo. L'analisi, secondo Eq (4), risulta in un coefficiente iniziale di diffusione del centro di massa di 15 Å2/ns, in accordo con la presenza di piccoli cluster proteici (supportati da diffusione dinamica della luce e calcoli HYDROPRO 5,41), che poi diminuisce esponenzialmente nel tempo (Figura 5). Il coefficiente di diffusione apparente per le dinamiche interne rimane costante durante tutto il processo di aggregazione. Quindi, la formazione di particolato lisozima sembra avvenire in una singola fase di aggregazione. L'assenza di cambiamenti nella dinamica interna delle proteine suggerisce che la conversione in cross-β e il possibile cambiamento associato di energia sono troppo veloci o che altri effetti trainanti, come un aumento dell'entropia del solvente, potrebbero essere pienamente dominanti all'interno dell'intervallo di energia sondato.

Lo studio della dinamica dell'acqua di idratazione intorno a monomeri e fibre di tau è stato eseguito su SPHERES presso il Maier-Leibnitz Zentrum (MLZ) di Garching, in Germania, utilizzando il protocollo sopra descritto per campioni di polvere. Sono stati utilizzati circa 100 mg di polvere proteica tau deuterata, idratata a 0,4 g di H2O per g di proteine. Gli EFWS sono stati acquisiti durante una rampa di temperatura e spettri QENS a temperatura costante. Gli EFWS sono stati registrati a partire da 20 K e aumentando la temperatura a 300 K a una velocità di 0,2 K / min mentre acquisivano continuamente dati durante le scansioni di 5 minuti.

Gli spettri QENS sono stati registrati a 20 e a 280 K. I dati EFWS sono stati adattati utilizzando una semplice gaussiana sull'intervallo q di trasferimento di quantità di moto 0,2 Å-1 < q < 0,8 Å-1 per estrarre l'MSD (Figura supplementare S11A). I valori MSD sono superiori al limite di validità per il modello gaussiano . Quindi, si raccomanda in questo caso di esplorare altri modelli oltre l'approssimazione gaussiana37,38,39. A temperature superiori a 220 K, l'acqua di idratazione intorno alle fibre di tau è significativamente più mobile dell'acqua di idratazione intorno ai monomeri tau (Figura 6). L'adattamento dei dati QENS consente agli utenti di ottenere la larghezza di linea e il contributo relativo dei movimenti elastici, rotazionali e traslazionali dell'acqua di idratazione nel campione (Figura supplementare S11B). Sembra che la frazione di molecole d'acqua sottoposte a movimento traslazionale sia aumentata intorno alle fibre, e sia i coefficienti di diffusione traslazionale che di rotazione delle molecole d'acqua sono aumentati intorno alle fibre17,31. Al contrario, le dinamiche interne ps-ns della proteina tau, che riflettono i movimenti della spina dorsale e della catena laterale, non sono cambiate dopo la fibrillazione.

Figure 2
Figura 2: Base di un portacampioni piatto in alluminio. (A) Il portacampioni piatto in alluminio presenta una parte centrale esposta ai neutroni in cui la polvere proteica è mantenuta all'interno di un piccolo spazio - tipicamente ~ 0,3 mm - tra la base e il coperchio. Un filo di indio può essere utilizzato per la sigillatura in quanto resiste agli aumenti di temperatura fino a 90 ° C. In caso di temperature più elevate, è possibile utilizzare una guarnizione in teflon. (B) La polvere proteica è posta nella base del portacampioni con il filo di indio in posizione. Il portacampioni viene posto in un essiccatore in presenza di P 2 O5 per l'essiccazione o H 2 O/D2O per l'idratazione. Il grasso sottovuoto viene aggiunto per evitare perdite tra il fondo e il coperchio dell'essiccatore. Il vuoto può essere usato con cautela per accelerare il processo di essiccazione. Il riscaldamento del fondo dell'essiccatore può essere necessario per campioni altamente idrofobici. C) La soluzione proteica è posta tra il cilindro interno e quello esterno. Assicurarsi di non pipettare troppo liquido (non ci dovrebbe essere troppo pieno quando il portacampioni è chiuso). Il filo di indio è posto nella scanalatura circolare. (D) Lo stick del campione (sullo sfondo) fornisce il controllo sull'altezza e l'orientamento del campione e può includere diversi controller e rilevatori per ambienti campione (temperatura, pressione). Lo stick del campione viene inserito dalla parte superiore della criofornace (anteriore), che fornisce il controllo della temperatura durante l'esperimento. Durante l'esperimento, il fascio di neutroni di solito colpisce il fondo della crioforce, come indicato dal rettangolo bianco (la dimensione del fascio dipende dalla configurazione dello strumento). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Le correzioni e la normalizzazione dei dati possono migliorare l'adattamento. I dati sono stati importati utilizzando nPDyn, come descritto nel protocollo. A sinistra, il set di dati è stato normalizzato utilizzando solo i dati del monitor. A destra, il segnale della lattina vuota è stato utilizzato insieme ai coefficienti di Paalman-Ping43 per correggere l'assorbimento neutronico dal supporto del campione. Successivamente, il modello adattato per il segnale di vanadio è stato integrato indipendentemente per ogni trasferimento di quantità di moto q e il risultato è stato utilizzato per normalizzare il set di dati del campione. In entrambi i grafici, S(q,ω) denota il segnale di diffusione, q è il trasferimento di quantità di moto e Equation 3 è il trasferimento di energia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Finestra di plottaggio generata da nPDyn che mostra il risultato dell'adattamento. I dati QENS sono stati adattati utilizzando nPDyn, come descritto nel protocollo. La finestra di plottaggio consente agli utenti di tracciare i dati lungo diversi assi - osservabili (tempo, temperatura o pressione), trasferimento di quantità di moto q o trasferimento di energia - e sono disponibili selettori per navigare lungo gli altri assi. Sono disponibili diversi tipi di trama, con il semplice "Trama" presentato in (A) e "Analisi - q-wise" in (B). Il pulsante 'Plot' mostra i diversi dataset in sottoplot separati, il pulsante 'Confronta' mostra i dataset nello stesso grafico, il '3D plot' mostra i dataset in diversi sottoplot 3D simili a s, il pulsante 'Analysis - q-wise' mostra i parametri adattati come funzione del trasferimento di quantità di moto q e 'Analysis - observable-wise' mostra i parametri adattati come funzione di osservabile (tempo, temperatura o pressione). Abbreviazione: QENS = quasielastic neutron scattering. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: L'aggregazione del lisozima avviene in un processo in un'unica fase con dinamiche interne costanti. Il lisozima è stato disciolto nel tampone di aggregazione (descritto altrove5) e E/IFWS è stato acquisito durante l'aggregazione, che è stata innescata aumentando la temperatura a 90 °C. Dopo la correzione dell'assorbimento con una cella vuota e la normalizzazione utilizzando il segnale del vanadio, i dati sono stati analizzati utilizzando il modello di diffusione del salto come descritto nel protocollo. Il coefficiente di autodiffusione del centro di massa adattato è tracciato in funzione del tempo (triangoli blu) insieme al coefficiente di diffusione apparente per la dinamica interna (quadrati arancioni). Questa cifra è da 5. Abbreviazione: E/IFWS = scansioni elastiche e anelastiche a finestra fissa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: La dinamica dell'acqua di idratazione è aumentata intorno alle fibre tau. Le polveri H2O-idrato di fibre tau deuterate e monomeri sono state sigillate in un portacampioni di alluminio piatto e i dati EFWS sono stati acquisiti durante una rampa di temperatura da 20 a 300 K. Dopo la correzione dell'assorbimento con una cella vuota e la normalizzazione utilizzando il segnale del vanadio, i dati sono stati analizzati utilizzando il modello di diffusione del salto come descritto nel protocollo. Questa immagine è stata ridisegnata utilizzando un intervallo q più piccolo (0,2 < q < 0,8 Å-1) dai dati di 31. Abbreviazione: EFWS = scansioni elastiche a finestra fissa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare S1: Fotografie dello strumento IN16B presso l'ILL. (in alto) Lo strumento IN16B visto dalla zona a radiazione controllata dedicata allo strumento. Il fascio in entrata viaggia all'interno della guida neutronica verso la camera a vuoto, che contiene la maggior parte degli elementi dello strumento (chopper PST, analizzatori, campioni, rivelatori). (in basso) Interno della camera a vuoto. L'elicottero PST è visibile così come gli analizzatori che circondano la criofornace contenente il campione. I rilevatori si trovano dietro la criofornace. Per gentile concessione di Laurent Thion, eclittique. Abbreviazione: PST = trasformazione dello spazio delle fasi. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Schizzo di IN16B in modalità classica (con azionamento Doppler) e BATS. (A) Il fascio di neutroni è parzialmente monocromatizzato dal selettore di velocità. Successivamente, gli elicotteri di fondo e PST produrranno un impulso neutronico, dal quale verrà selezionato un profilo energetico dal monocromatore Doppler (modalità E/IFWS o QENS). I neutroni vengono quindi dispersi dal campione e una singola energia viene riflessa verso i rivelatori dagli analizzatori. Per gentile concessione dell'ILL. (B) Gli elicotteri BATS sono utilizzati per definire un singolo impulso neutronico con un intervallo di energia definito. Il fascio di neutroni è parzialmente monocromatizzato dal selettore di velocità. Successivamente, l'elicottero di fondo rimuoverà i neutroni indesiderati che non appartengono all'impulso selezionato. I neutroni vengono quindi dispersi dal campione e una singola energia viene riflessa verso i rivelatori dagli analizzatori. Per gentile concessione dell'ILL. Abbreviazioni: BATS = backscattering and time-of-flight spectrometer; PST = trasformazione dello spazio delle fasi; E/IFWS = scansioni elastiche e anelastiche a finestra fissa; QENS = scattering neutronico quasielastico; PG = grafite pirolitica. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S3: Il portacampioni viene chiuso rapidamente dopo che la polvere ha raggiunto l'idratazione desiderata e sigillata. (A) Il portacampioni piatto viene rapidamente chiuso utilizzando quattro viti. Un piccolo spazio rimarrà a causa del filo di indio. Le altre viti vengono quindi aggiunte e il supporto del campione viene sigillato lentamente stringendo delicatamente ciascuna vite più volte per consentire all'indio di rilassarsi. (B) Il portacampioni piatto è adeguatamente sigillato quando non è più visibile alcuno spazio tra la base del supporto e il coperchio. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S4: Il portacampioni è centrato rispetto al fascio di neutroni. Un portacampioni cilindrico è stato posizionato sul bastoncino del campione. La posizione del portacampioni viene controllata in modo tale che il raggio colpisca la parte inferiore del supporto. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S5: Acquisizione di EFWS seguita da QENS su IN16B con NOMAD. (A) I controllori pertinenti vengono trascinati e rilasciati nella rampa di lancio come spiegato nel protocollo (passaggi da 3.4.1 a 3.4.3). Potrebbe essere necessario fare clic sul lucchetto (icona verde nell'angolo in alto a destra - riquadro verticale) per ottenere il controllo sull'interfaccia. (B) I controllori pertinenti vengono trascinati e rilasciati nella rampa di lancio come spiegato nel protocollo (passaggi da 3.4.4 a 3.4.5). Qui, gli ultimi due controller sono denominati IN16DopplerSettings e Count. Abbreviazioni: QENS = scattering neutronico quasielastico, EFWS = scansioni elastiche a finestra fissa. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S6: Impostazione di una rampa di temperatura e E/IFWS su IN16B con NOMAD. (A) Il controller FurnaceCryostat viene aggiunto nella rampa di lancio e configurato come spiegato nel protocollo (passaggio 3.4.6). (B) Il controller For loop viene aggiunto nella rampa di lancio e i relativi controller vengono inseriti e configurati come spiegato nel protocollo (passo 3.4.7). Abbreviazione: E/IFWS = scansioni elastiche e anelastiche a finestra fissa. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S7: Le prime cinque funzioni sferiche di Bessel spiegano la maggior parte del contributo rotazionale dell'acqua di idratazione. Le prime otto funzioni sferiche di Bessel sono tracciate usando un valore d = 0,98 Å e valori di trasferimento di quantità di moto q da 0 a 3 Å (linee colorate continue). L'intervallo di trasferimento della quantità di moto di 0,3 Å < q < 1,8 Å è delimitato dalle linee tratteggiate blu. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S8: Il lisozima forma in modo riproducibile il particolato. Il lisozima è stato sciolto nel tampone di aggregazione (preparato come descritto nel protocollo, fase 1) e ThT è stato aggiunto a una concentrazione finale di 2 μM per monitorare la formazione della struttura cross-β mediante fluorescenza. Il grafico rappresenta la media di tre misurazioni indipendenti e le barre di errore sono la deviazione standard. L'inserto mostra una fotografia al microscopio a fluorescenza del particolato formatosi dopo 6 ore di aggregazione. Barra della scala = 20 μm. Questa cifra è da 5. Abbreviazione: ThT = tioflavina T. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S9: Rampa di temperatura rapida disponibile su IN16B. Nella modalità veloce su IN16B, la temperatura può essere aumentata da 280 K a 363 K in circa 30 minuti. Questa cifra è da 5. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S10: Dati E/IFWS sul lisozima durante l'aggregazione in particolato. Il lisozima è stato disciolto nel tampone di aggregazione (descritto altrove5) e E/IFWS è stato acquisito durante l'aggregazione, che è stata innescata aumentando la temperatura a 90 °C. I dati - dopo la correzione dell'assorbimento con una cella vuota e la normalizzazione utilizzando il segnale del vanadio - sono tracciati rispetto al trasferimento di quantità di moto q e tempo per il diverso trasferimento di energia misurato, 0 μeV (in alto a sinistra), 0,6 μeV (in alto a destra), 1,5 μeV (in basso a sinistra) e 3 μeV (in basso a destra). Per ogni sottotrama, l'asse verticale corrisponde al segnale di diffusione S(q, ΔE), tracciato rispetto al tempo sperimentale in ore e al trasferimento di quantità di moto q. Questa cifra è da 5. Abbreviazione: E/IFWS = scansioni elastiche e anelastiche a finestra fissa. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S11: Adattamento dei dati sull'acqua di idratazione della tau. (A) Adattamento dei dati EFWS utilizzando un gaussiano. La polvere H2O-idrata di monomeri tau deuterati è stata sigillata in un portacampioni di alluminio piatto e gli EFWS sono stati acquisiti durante una rampa di temperatura da 20 a 300 K. I dati sperimentali (segnale elastico S(q, 0) su linea verticale asse-blu con barre di errore) sono tracciati per l'intervallo di trasferimento della quantità di moto q 0,2 < q < 0,6 Å-1 insieme alla gaussiana adattata utilizzata per estrarre l'MSD. (B) Moti traslazionali e rotazionali dell'acqua di idratazione ottenuta dal raccordo QENS. Le polveri H2O-idrato di fibre tau deuterate (a sinistra) e monomeri (a destra) sono state sigillate in un portacampioni di alluminio piatto e i dati QENS sono stati acquisiti a 280 K. I dati sperimentali (intensità S(q,ω) in funzione del trasferimento di energia) per fibre (triangoli blu) e monomeri (punti verdi) sono tracciati insieme al modello adattato (linea continua nera) e ai suoi componenti, sfondo (blu), funzione di risoluzione (verde), rotazioni (rosso) e traslazioni (ciano) per il trasferimento di quantità di moto q = 0,783 Å-1. Questa cifra è di 31. Abbreviazioni: QENS = scattering neutronico quasielastico, EFWS = scansioni elastiche a finestra fissa; MSD = cilindrata quadratica media. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

La spettroscopia neutronica è l'unico metodo che consente di sondare la dinamica ps-ns mediata dall'insieme di campioni proteici indipendentemente dalle dimensioni della proteina o dalla complessità della soluzione quando viene utilizzata la deuterazione6. In particolare, sondando l'autodiffusione di gruppi proteici in soluzione, la dimensione idrodinamica di tali assemblaggi può essere determinata in modo inequivocabile. Tuttavia, il metodo è comunemente limitato dal basso flusso di neutroni, che implica lunghi tempi di acquisizione e la necessità di elevate quantità di campione (tipicamente 100 mg di proteine) per ottenere un buon rapporto segnale-rumore entro il tempo del fascio assegnato.

Preparazione del campione (fasi del protocollo 1 e 2). Per i campioni allo stato liquido, la concentrazione minima che può essere utilizzata è ~ 50 mg / ml (concentrazioni inferiori possono essere utilizzate al costo di tempi di acquisizione prolungati). Un'alta concentrazione proteica è associata a tassi di fibrillazione più rapidi, che aiutano ad adattare la misurazione nel tempo del fascio assegnato, ma possono influenzare anche il percorso di aggregazione44. Pertanto, è necessaria un'accurata caratterizzazione del campione con metodi complementari, come la forza atomica o la microscopia elettronica.

Il materiale del portacampioni è anche un punto da affrontare durante la preparazione dei campioni poiché le leghe di alluminio sono soggette a corrosione45. Una tipica lega di alluminio che presenta una buona resistenza alla corrosione e ha un basso assorbimento neutronico è la norma europea (EN) AW-6060 [AlMgSi] composta da 98% -98,75% Al, 0,1% Ti, 0,15% Zn, 0,05% Cr, 0,35% -0,6% Mg, 0,1% Mn, 0,1% Cu, 0,1% -0,3% Fe e 0,3% -0,6% Si. La corrosione può essere ridotta al minimo, ad esempio riducendo il tempo nel supporto del campione o utilizzando un rivestimento protettivo (che può aggiungere al segnale di fondo) come nichel o oro.

Per i campioni in polvere di proteine idrogenate, la procedura di liofilizzazione ha dimostrato di essere completata in modo efficiente con una fase in un essiccatore in presenza di polvere di P2O5 per rimuovere quanta più acqua leggera residua possibile35. Per i campioni di polvere, si consiglia inoltre di caratterizzare (utilizzando la microscopia a forza atomica e la diffrazione della polvere a raggi X) la polvere nel suo stato finale idratato e valutare l'effetto della deuterazione, della liofilizzazione e della diffusione del vapore sia sullo stato monomero che su quello delle fibre. In particolare, la liofilizzazione può rompere le fibre, con conseguente accorciamento dei segmenti, senza intaccare la morfologia. Inoltre, è stato osservato dalla diffrazione di potenza a raggi X che un raffreddamento lento, invece del raffreddamento flash in azoto liquido, potrebbe indurre la presenza di strutture amiloidi (risultato non pubblicato).

Raccolta dati (fase 3 del protocollo). Si consiglia di pianificare la raccolta dei dati con il contatto locale prima dell'esperimento (anche se è stato discusso durante il processo di scrittura della proposta). Il piano di raccolta dati è soggetto a modifiche dopo le prime scansioni, a seconda del rapporto segnale-rumore ottenuto. In particolare, per gli esperimenti risolti nel tempo, l'uso di E/IFWS consente una rapida raccolta dei dati - da 30 s a 1 min per la linea elastica, 4-5 minuti per un punto dati a 3 μeV5 - ma la gamma di trasferimenti di energia accessibili è intrinsecamente limitata. In alternativa, è possibile utilizzare una media mobile dei dati QENS46. A tal fine, la nuova opzione di retrodiffusione e spettroscopia del tempo di volo (BATS) su IN16B offre un flusso più elevato rispetto al classico IN16B con un intervallo di energia di ±150 μeV (o superiore a seconda della configurazione utilizzata) al costo di una risoluzione inferiore in energia11. Pertanto, l'opzione BATS è raccomandata per gli studi risolti nel tempo, in particolare per processi come l'aggregazione amiloide, che si svolge nell'arco di diverse ore.

Analisi dei dati (passaggi di protocollo 4, 5 e 6). La funzione di scattering S(q,ω) include tutti i tipi di movimenti nel campione e i modelli descritti nel protocollo di cui sopra sono approssimazioni. In particolare, per le IDP allo stato liquido, i movimenti su larga scala della catena disordinata possono verificarsi sulla stessa lunghezza e scala temporale della diffusione del centro di massa dell'intera proteina. Quindi, l'utente dovrebbe tenere presente che la separazione tra la diffusione del centro di massa e le dinamiche interne delle proteine non è sempre semplice. La procedura di fitting può beneficiare di informazioni sulla diffusione del centro di massa ottenute tramite metodi complementari, in modo tale che questo parametro possa essere fissato (tenendo presente che altri metodi possono fornire un coefficiente di diffusione collettivo associato a diverse scale di tempo e lunghezza) per ottenere un risultato più robusto per la dinamica interna.

Oltre allo scattering neutronico, la dinamica di un sistema molecolare può essere caratterizzata dalla risonanza magnetica nucleare (NMR), che fornisce informazioni locali sulle proteine marcate con isotopi e su una vasta gamma di scale temporali47,48,49. Il metodo è stato utilizzato con successo per studiare i sistemi amiloidi 48,50,51,52,53 ma non consente agli utenti di studiare semplicemente l'acqua di idratazione o seguire il processo di aggregazione amiloide in tempo reale a causa della limitazione intrinseca sulla dimensione della proteina. I recenti sviluppi nella spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) e il metodo derivato dall'EPR Overhauser polarizzazione nucleare dinamica (ODNP) offrono una buona prospettiva se combinati con lo scattering neutronico. Infatti, sebbene l'etichettatura dello spin diretto al sito (SDSL), EPR e ODNP possano sondare rispettivamente la proteina54 e la dinamica di idratazione55, sulla scala temporale ps-ns attorno all'etichetta di spin introdotta.

Questi metodi sono stati utilizzati per studiare l'aggregazione della proteina tau56,57 e offriranno una grande complementarietà con lo scattering neutronico che può ottenere informazioni simili, ma mediate sull'intero campione. Inoltre, la spettroscopia infrarossa può fornire informazioni dinamiche per movimenti ad alta energia associati a specifici modelli strutturali, ma la complessità dell'ambiente proteico (tampone utilizzato) può influenzare l'interpretazione dei dati58,59. Le tecniche di retrodiffusione neutronica forniscono una visione unica e complementare sulla dinamica delle proteine e dell'acqua di idratazione sulla scala temporale ps-ns insieme ai risultati dei metodi sopra menzionati. Non richiedono una marcatura specifica del campione, la qualità del segnale non è sensibile alla dimensione della proteina e le misurazioni possono essere effettuate in vivo o in ambienti altamente complessi e deuterati come il lisato batterico deuterato 3,6,7. Poiché questo metodo fornisce un risultato mediato dall'insieme, è ben integrato da simulazioni di dinamica molecolare per ottenere informazioni di dettaglio atomico sul sistema in studio. Le simulazioni possono essere facilmente convalidate da un confronto diretto tra il set di dati sperimentale e gli spettri teorici QENS calcolati dalla traiettoria di simulazione utilizzando software come mdanse60.

Per quanto riguarda i sistemi amiloidi, la retrodiffusione neutronica si è dimostrata utile per caratterizzare la dinamica della proteina ps-ns e dell'acqua per vari sistemi e condizioni 5,31,61,62,63,64. In particolare, la retrodiffusione neutronica è stata utilizzata per rivelare la correlazione tra la proporzione della sequenza proteica coinvolta nella struttura cross-β e l'ampiezza del guadagno di entropia dell'acqua dopo fibrillazione (risultati non pubblicati). Inoltre, lo sviluppo di ambienti campione consente l'acquisizione simultanea di spettri neutronici e dati di rilassamento dielettrico65 o dati di scattering Raman66. Inoltre, i rivelatori di diffrazione sono presenti su IN16B per ottenere dati strutturali insieme a dati dinamici. Inoltre, il flusso di neutroni in entrata dovrebbe essere migliorato per la modalità BATS di IN16B nel prossimo futuro, grazie all'uso della cosiddetta guida di messa a fuoco variabile, la cui geometria può essere adattata su richiesta alla configurazione strumentale utilizzata. Spingere ulteriormente lo sviluppo di ambienti e strumentazione di campionamento sofisticati consentirebbe esperimenti ancora più complessi in futuro, possibilmente fornendo ulteriori informazioni dinamiche e strutturali allo stesso tempo.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori sono grati a Michaela Zamponi del Jülich Centre for Neutron Science presso l'Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Germania, per parte degli esperimenti di scattering neutronico condotti sullo strumento SPHERES. Questo lavoro ha beneficiato delle attività del consorzio Deuteration Laboratory (DLAB) finanziato dall'Unione Europea nell'ambito dei contratti HPRI-2001-50065 e RII3-CT-2003-505925, e dell'attività finanziata dal UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) all'interno dell'Institut Laue Langevin EMBL DLAB nell'ambito delle sovvenzioni GR/R99393/01 e EP/C015452/1. Il sostegno della Commissione europea nell'ambito del 7° programma quadro attraverso l'azione chiave: rafforzare lo Spazio europeo della ricerca, le infrastrutture di ricerca è riconosciuto [contratto 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot e Christian Beck ringraziano il Ministero Federale dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF, numero di sovvenzione 05K19VTB) per il finanziamento delle loro borse di studio post-dottorato.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione
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Pounot, K., Appel, M., Beck, C., Weik, M., Schirò, G., Fichou, Y., Seydel, T., Schreiber, F. High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water. J. Vis. Exp. (182), e63664, doi:10.3791/63664 (2022).

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