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Bioengineering

परिपक्व मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट मोनोलेयर का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64364
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

Summary

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) प्रीक्लिनिकल कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग के लिए जानवरों का उपयोग करने का विकल्प प्रदान करते हैं। प्रीक्लिनिकल विषाक्तता स्क्रीनिंग में एचआईपीएससी-सीएम को व्यापक रूप से अपनाने की एक सीमा कोशिकाओं के अपरिपक्व, भ्रूण जैसे फेनोटाइप है। यहां प्रस्तुत एचआईपीएससी-सीएम की मजबूत और तेजी से परिपक्वता के लिए प्रोटोकॉल हैं।

Abstract

मानव प्रेरित स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) का उपयोग प्रीक्लिनिकल कार्डियोटॉक्सिसिटी परीक्षण के लिए जानवरों और पशु कोशिकाओं पर निर्भरता को बदलने और कम करने के लिए किया जाता है। दो-आयामी मोनोलेयर प्रारूपों में, HIPSC-CMs एक इष्टतम बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) पर सुसंस्कृत होने पर वयस्क मानव हृदय की मांसपेशियों की कोशिकाओं की संरचना और कार्य को पुन: परिभाषित करते हैं। एक मानव प्रसवकालीन स्टेम सेल-व्युत्पन्न ईसीएम (परिपक्वता-उत्प्रेरण बाह्य मैट्रिक्स-एमईसीएम) चढ़ाना के बाद 7 दिनों में एचआईपीएससी-सीएम संरचना, कार्य और चयापचय अवस्था को परिपक्व करता है।

परिपक्व HIPSC-CM मोनोलेयर भी चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक दवाओं की अपेक्षा के अनुसार प्रतिक्रिया करते हैं, जिसमें अतालता और कार्डियोटॉक्सिसिटी पैदा करने का ज्ञात जोखिम होता है। एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर की परिपक्वता अब तक नियामक विज्ञान और सुरक्षा स्क्रीनिंग के लिए इन मूल्यवान कोशिकाओं को व्यापक रूप से अपनाने में एक बाधा थी। यह लेख हाइपीएससी-सीएम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन के प्लेटिंग, परिपक्वता और उच्च-थ्रूपुट, कार्यात्मक फेनोटाइपिंग के लिए मान्य तरीके प्रस्तुत करता है। ये विधियां व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्ध कार्डियोमायोसाइट्स, साथ ही अत्यधिक कुशल, कक्ष-विशिष्ट भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग करके घर में उत्पन्न स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स पर लागू होती हैं।

उच्च-थ्रूपुट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल फ़ंक्शन को वोल्टेज-संवेदनशील रंजक (वीएसडी; उत्सर्जन: 488 एनएम), कैल्शियम-संवेदनशील फ्लोरोफोरेस (सीएसएफ), या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर (जीसीएएमपी 6) का उपयोग करके मापा जाता है। प्रत्येक कार्यात्मक पैरामीटर की ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट ऑप्टिकल मैपिंग डिवाइस का उपयोग किया जाता है, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा विश्लेषण के लिए कस्टम समर्पित सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है। एमईसीएम प्रोटोकॉल को सकारात्मक इनोट्रोप (आइसोप्रेनालाइन) और मानव ईथर-ए-गो-गो-संबंधित जीन (एचईआरजी) चैनल-विशिष्ट ब्लॉकर्स का उपयोग करके दवा स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जाता है। ये संसाधन अन्य जांचकर्ताओं को उच्च-थ्रूपुट, प्रीक्लिनिकल कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग, कार्डियक दवा प्रभावकारिता परीक्षण और कार्डियोवैस्कुलर अनुसंधान के लिए परिपक्व एचआईपीएससी-सीएम का सफलतापूर्वक उपयोग करने में सक्षम बनाएंगे।

Introduction

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) को अंतरराष्ट्रीय स्तर पर मान्य किया गया है, और इन विट्रो कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग1 के लिए उपलब्ध हैं। अत्यधिक शुद्ध HIPSC-CM को लगभग असीमित संख्या में उत्पन्न किया जा सकता है, क्रायोसंरक्षित और पिघलाया जा सकता है। पुनरावृत्ति करने पर, वे भी पुनर्जीवित होते हैं और मानव हृदय2,3 की याद दिलाने वाली लय के साथ अनुबंध करना शुरू कर देते हैं। उल्लेखनीय रूप से, व्यक्तिगत HIPSC-CM एक-दूसरे से जुड़ते हैं और कार्यात्मक सिंकिटिया बनाते हैं जो एकल ऊतक के रूप में धड़कते हैं। आजकल, एचआईपीएससी नियमित रूप से रोगी के रक्त के नमूनों से प्राप्त किए जाते हैं, इसलिए किसी भी व्यक्ति को इन विट्रो एचआईपीएससी-सीएम कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंगपरख 4,5 का उपयोग करके दर्शाया जा सकता है। यह विभिन्न आबादी से महत्वपूर्ण प्रतिनिधित्व के साथ "एक डिश में नैदानिक परीक्षण" करने का अवसर बनाताहै।

मौजूदा पशु और पशु सेल कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग दृष्टिकोणों पर एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि HIPSC-CMS पूर्ण मानव जीनोम का उपयोग करते हैं और मानव हृदय के लिए आनुवंशिक समानता के साथ एक इन विट्रो सिस्टम प्रदान करते हैं। यह फार्माकोजेनोमिक्स और व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए विशेष रूप से आकर्षक है - दवा और अन्य चिकित्सा विकास के लिए एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग अधिक सटीक, सटीक और सुरक्षित दवा नुस्खे प्रदान करने के लिए भविष्यवाणी की गई है। दरअसल, दो-आयामी (2 डी) एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर परख दवा कार्डियोटॉक्सिसिटी का पूर्वानुमान साबित हुआ है, चिकित्सकीय रूप से उपयोग की जाने वाली दवाओं के एक पैनल का उपयोग करके अतालता 1,7,8,9 पैदा करने का ज्ञात जोखिम है। एचआईपीएससी-सीएम की विशाल क्षमता और दवा विकास को सुव्यवस्थित और सस्ता बनाने के वादे के बावजूद, इन नए परीक्षणों का उपयोग करने में अनिच्छा रही है।

अब तक, एचआईपीएससी-सीएम स्क्रीनिंग परख को व्यापक रूप से अपनाने और स्वीकृति की एक बड़ी सीमा उनकी अपरिपक्व, भ्रूण जैसी उपस्थिति, साथ ही साथ उनका कार्य है। HIPSC-CM परिपक्वता के महत्वपूर्ण मुद्दे की समीक्षा की गई है और वैज्ञानिक साहित्य ad nauseum 13,14,15,16 में बहस की गई है। इसी तरह, एचआईपीएससी-सीएम परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए कई दृष्टिकोणों को नियोजित किया गया है, जिसमें 2 डी मोनोलेयर में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) जोड़तोड़ और 3 डी इंजीनियर हृदय ऊतकों (ईएचटी) 17,18 का विकास शामिल है। फिलहाल, एक व्यापक रूप से आयोजित धारणा है कि 3 डी ईएचटी का उपयोग 2 डी मोनोलेयर-आधारित दृष्टिकोणों के सापेक्ष बेहतर परिपक्वता प्रदान करेगा। हालांकि, 2 डी मोनोलेयर सेल उपयोग की उच्च दक्षता प्रदान करते हैं और 3 डी ईएचटी की तुलना में चढ़ाना में सफलता में वृद्धि करते हैं; 3 डी ईएचटी अधिक संख्या में कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, और अक्सर अन्य सेल प्रकारों को शामिल करने की आवश्यकता होती है जो परिणामों को भ्रमित कर सकते हैं। इसलिए, इस लेख में, विद्युत और यांत्रिक रूप से युग्मित कोशिकाओं के 2 डी मोनोलेयर के रूप में संवर्धित एचआईपीएससी-सीएम को परिपक्व करने के लिए एक सरल विधि का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित किया गया है।

उन्नत HIPSC-CM परिपक्वता एक ईसीएम का उपयोग करके 2 डी मोनोलेयर में प्राप्त की जा सकती है। HIPSC-CM के 2D मोनोलेयर को एक नरम, लचीले पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन कवरस्लिप का उपयोग करके परिपक्व किया जा सकता है, जो एक एंगेलब्रेथ-होल्म-स्वार्म माउस सारकोमा सेल (माउस ईसीएम) द्वारा स्रावित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ लेपित होता है। 2016 में, रिपोर्टों से पता चला कि इस नरम ईसीएम स्थिति पर संवर्धित HIPSC-CM कार्यात्मक रूप से परिपक्व हुए, वयस्क हृदय मूल्यों (~ 50 सेमी / s) 18 के पास कार्रवाई संभावित चालन वेग प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, इन परिपक्व HIPSC-CMs ने वयस्क हृदय की याद दिलाने वाली कई अन्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं को प्रदर्शित किया, जिसमें हाइपरपोलराइज्ड रेस्टिंग मेम्ब्रेन क्षमता औरKir2.1 की अभिव्यक्ति शामिल है। हाल ही में, रिपोर्टों ने एक मानव प्रसवकालीन स्टेम सेल-व्युत्पन्न ईसीएम कोटिंग की पहचान की जो 2 डी एचआईपीएससी-सीएम19 की संरचनात्मक परिपक्वता को बढ़ावा देती है। यहां, उच्च-थ्रूपुट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल स्क्रीन में उपयोग के लिए संरचनात्मक रूप से परिपक्व 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर के लिए उपयोग में आसान तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं। इसके अलावा, हम वोल्टेज-संवेदनशील रंजक (वीएसडी) और कैल्शियम-संवेदनशील जांच और प्रोटीन का उपयोग करके 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल फ़ंक्शन के स्वचालित अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए एक ऑप्टिकल मैपिंग उपकरण का सत्यापन प्रदान करते हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में HIPSC उपयोग मिशिगन विश्वविद्यालय HPSCRO समिति (मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल ओवरसाइट कमेटी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। सामग्री और उपकरणों की सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें। मीडिया और उनकी रचनाओं के लिए तालिका 1 देखें।

1. परिपक्वता-उत्प्रेरण बाह्य मैट्रिक्स (एमईसीएम) पर परिपक्वता के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्रायोप्रिजर्व्ड एचआईपीएस-सीएम को पिघलाना और चढ़ाना

  1. सभी अभिकर्मकों को कमरे के तापमान पर गर्म करें और हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) या कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ एमईसीएम प्लेटों को कार्डियोमायोसाइट्स प्लेटिंग से 1 घंटे पहले पुनर्जलीकृत करें (96-वेल प्लेट के प्रति कुएं में बफर का 200 μL)।
  2. कार्डियोमायोसाइट प्लेटिंग से पहले 1 घंटे के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त एचबीएसएस या पीबीएस के साथ एमईसीएम प्लेटों को धोएं (96-वेल प्लेट के कुएं पर बफर का 200 μL) और कुओं को हाइड्रेटेड रखें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान तैयार करें।
  4. तरल नाइट्रोजन टैंक से कार्डियोमायोसाइट्स ट्यूबों को हटा दें, ट्यूबों को सूखी बर्फ में स्थानांतरित करें, और दबाव छोड़ने के लिए ट्यूब कैप्स को थोड़ा खोलें।
    नोट: ट्यूबों में दबाव छोड़ना बेहद महत्वपूर्ण है! यदि ट्यूबों के अंदर बहुत अधिक दबाव बनता है, तो वे विस्फोट कर सकते हैं।
  5. ट्यूब कैप्स को फिर से सील करें और उन्हें 4 मिनट के लिए पिघलने के लिए पानी के स्नान में रखें।
    नोट: आंशिक पिघलने के कारण सेल क्षति से बचने के लिए, उन्हें पूरी तरह से पिघलने दें।
  6. कोशिकाओं के पिघलने के बाद, खोलने से पहले ट्यूबों को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। कोशिकाओं को 1 एमएल पिपेट के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें। धीरे-धीरे 8 एमएल प्लेटिंग माध्यम टपकाएं, हर बार 1 एमएल जोड़े जाने पर ट्यूब को उत्तेजित करें, ताकि कोशिकाओं को परासरण में परिवर्तन को समायोजित करने की अनुमति मिल सके।
    1. क्रायोवियल को 1 एमएल ग्लास पिपेट का उपयोग करके 1 एमएल प्लेटिंग माध्यम से धोएं। फिर, धीरे-धीरे धोने को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में टपकाएं।
  7. ट्यूबों को ~ 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और 1 एमएल प्लेटिंग माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें। एक एलिकोट निकालें और हेमोसाइटोमीटर के साथ लाइव सेल गिनती करें। 7.5 × 105 कोशिकाओं / एमएल प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त चढ़ाना माध्यम जोड़ें।
    नोट: 96 कुओं को तैयार करने के लिए लगभग 10 एमएल सेल निलंबन की आवश्यकता होती है।
  8. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके एमईसीएम-लेपित 96-वेल प्लेट के प्रति कुएं 100 μL सेल सस्पेंशन वितरित करें।
    नोट: सेल वर्षा से बचना सुनिश्चित करें और चढ़ाना करते समय सभी कुओं में समान सेल घनत्व प्राप्त करें।
  9. माध्यम से रखरखाव माध्यम (200 μL / वेल) को बदलने से पहले 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO 2 पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। पिघलने के बाद 5 वें दिन रखरखाव माध्यम बदलें। दिन 7 या बाद में ईपी परीक्षण करें, जैसा कि पहले 8,9 वर्णित है। सेल संस्कृति का विस्तार करने का विकल्प चुनते समय हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।

2. एचआईपीएससी कार्डियक-निर्देशित भेदभाव और एचआईपीएससी-सीएम शुद्धिकरण

  1. गर्म 1x व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) समाधान, कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना एचबीएसएस (एचबीएसएस--) और कमरे के तापमान पर एंगेलब्रेथ-होल्म-स्वार्म माउस सारकोमा सेल (माउस ईसीएम) द्वारा स्रावित घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ लेपित 6-वेल प्लेटें।
  2. विभेदित कालोनियों को चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी और एस्पिरेट/एब्लेट द्वारा चिह्नित करें। प्रत्येक को 1 एमएल एचबीएसएस के साथ अच्छी तरह से धोएं--. >10 विभेदन स्पॉट वाले कुओं में दो धोने का प्रदर्शन करें।
  3. एचबीएसएस को एस्पिरेट करें - और प्रत्येक कुएं में ईडीटीए समाधान का 1 एमएल जोड़ें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट तक इनक्यूबेट करें। 3 मिनट के बाद प्लेटों की जांच करें और पारभासी सफेद, दृश्यमान कॉलोनियों की तलाश करें।
  4. ईडीटीए समाधान को एस्पिरेट करें और एक कुएं में 1 एमएल जोड़ें। निलंबन को बार-बार ऊपर और नीचे करके, कुएं से सभी स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए 10 एमएल ग्लास पिपेट का उपयोग करके, और सेल निलंबन को एक संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करके 2 एमएल एचआईपीएस माध्यम के साथ कोशिकाओं को हटा दें। बाद के कुओं के साथ आकांक्षा और विघटन को दोहराएं।
    नोट: कांच के पिपेट की नोक के साथ कॉलोनियों को उठाने के लिए कठिन हटा दें।
  5. स्टेम कोशिकाओं की गणना करें और मात्रा को प्लेट 8.0 × 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से समायोजित करें। एचआईपीएस माध्यम (2 एमएल / वेल) पर कोशिकाओं को तब तक कल्चर करें जब तक कि स्टेम सेल 90% संगम तक नहीं पहुंच जाते (इस समय को अब से डी0 के रूप में संदर्भित किया जाता है)।
  6. 2 एमएल बेसल भेदभाव माध्यम तैयार करें जो 4 μM CHIR99021 के साथ पूरक है।
  7. डी0 पर, स्टेम कोशिकाओं की 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं को 1 एमएल एचबीएसएस प्रति अच्छी तरह से धोएं। एचबीएसएस को बेसल भेदभाव माध्यम के साथ बदलें जो सीएचआईआर 99021 के 4 एसएम के साथ पूरक है।
  8. डी1 पर, कुछ भी न करें।
  9. डी2 पर, आईडब्ल्यूपी 4 के 4 μM के साथ पूरक बेसल भेदभाव माध्यम तैयार करें।
  10. माध्यम को 2 एमएल आईडब्ल्यूपी 4-पूरक बेसल भेदभाव माध्यम प्रति अच्छी तरह से बदलें।
  11. डी3 पर, वेंट्रिकुलर-विशिष्ट भेदभाव के लिए कुछ भी न करें। एट्रियल-विशिष्ट विभेदन के लिए, माध्यम को एस्पिरेट करें और 2 एमएल बेसल माध्यम जोड़ें, जो आईडब्ल्यूपी 4 के 4 μM और 1 μM रेटिनोइक एसिड (RA) समाधान के साथ पूरक है।
  12. डी4 पर, माध्यम को एस्पिरेट करें और वेंट्रिकुलर भेदभाव के लिए प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल बेसल माध्यम जोड़ें। एक एट्रियल भेदभाव के लिए, माध्यम को एस्पिरेट करें और प्रति अच्छी तरह से 1 μM RA समाधान के साथ पूरक बेसल माध्यम के 2 एमएल जोड़ें।
  13. D5 पर, कुछ भी मत करो।
  14. डी6 पर, माध्यम को एस्पिरेट करें और प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल बेसल माध्यम जोड़ें (एट्रियल और वेंट्रिकुलर भेदभाव दोनों के लिए)।
  15. D7 पर, कुछ भी मत करो।
  16. डी8 पर, माध्यम को एस्पिरेट करें और कार्डियोमायोसाइट्स रखरखाव माध्यम के 2 एमएल जोड़ें। सेल पृथक्करण तक हर दूसरे दिन माध्यम बदलें, या पुरानी दवा जोखिम योजना का पालन करें।

3. एमएसीएस (चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग) के माध्यम से एचआईपीएससी-सीएम शुद्धिकरण

  1. सेल कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें और प्रत्येक को 1 एमएल एचबीएसएस के साथ अच्छी तरह से धोएं--. 0.25% ट्रिप्सिन /ईडीटीए के 1 एमएल को जोड़कर कोशिकाओं को अलग करें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। ट्रिप्सिन/ईडीटीए को निष्क्रिय करने के लिए 2 एमएल प्लेटिंग माध्यम के साथ प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं को पुन: निलंबित और विलक्षण करें।
  2. छह कुओं से कोशिकाओं को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एकत्र करें जिसमें 70 μm छन्नी हो। फिर, छन्नी को 3 एमएल चढ़ाना माध्यम से धो लें। कोशिकाओं की गणना करें।
  3. 5 मिनट के लिए ~ 300 × ग्राम पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 20 एमएल बर्फ-ठंडे एमएसीएस पृथक्करण बफर के साथ धोएं। फिर, सेंट्रीफ्यूज फिर से ~ 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए।
  4. पेलेट को 80 μL ठंडे एमएसीएस पृथक्करण बफर प्रति 5 × 10 6 कोशिकाओं में पुन: निलंबितकरें । 106 कोशिकाओं में प्रति 5 × 20 μL ठंडा गैर-कार्डियोमायोसाइट्स रिक्तीकरण कॉकटेल (मानव) जोड़ें। धीरे से सेल निलंबन मिलाएं और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  5. 106 कोशिकाओं में प्रति 5 × 4 एमएल ठंडा एमएसीएस पृथक्करण बफर जोड़कर नमूने को धोएं। नमूने को ~ 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
  6. पेलेट को 80 μL ठंडे एमएसीएस पृथक्करण बफर प्रति 5 × 10 6 कोशिकाओं में पुन: निलंबितकरें । प्रति 5 × 106 कोशिकाओं में 20 μL ठंडा एंटी-बायोटिन माइक्रोबीड्स जोड़ें। धीरे से सेल निलंबन मिलाएं और बर्फ पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. जब नमूने इनक्यूबेट हो रहे हों, तो एमएसीएस विभाजक पर सकारात्मक रिक्तीकरण कॉलम (30 μm पूर्व-पृथक्करण फिल्टर के साथ फिट) रखें, और कॉलम के नीचे लेबल किए गए 15 एमएल संग्रह ट्यूब रखें। प्रत्येक 5 × 106 कोशिकाओं के लिए एक कॉलम की आवश्यकता होती है।
  8. प्रत्येक कॉलम को 3 एमएल ठंडे एमएसीएस पृथक्करण बफर के साथ प्राइम करें। एंटीबॉडी-उपचारित सेल निलंबन को 106 कोशिकाओं × प्रति 5 एमएल एमएसीएस पृथक्करण बफर के साथ मिलाएं, और कॉलम में जोड़ें।
    नोट: सेंट्रीफ्यूज न करें! इस चरण में सेंट्रीफ्यूजेशन का कार्डियोमायोसाइट उपज पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है।
  9. प्रत्येक कॉलम में 2 एमएल एमएसीएस पृथक्करण बफर जोड़ें, और कार्डियोमायोसाइट निलंबन के माध्यम से 12 एमएल प्रवाह एकत्र होने तक प्रवाह एकत्र करें।
    नोट: कॉलम को कभी भी पूरी तरह से सूखने की अनुमति न दें।
  10. कार्डियोमायोसाइट्स को 5 मिनट के लिए ~ 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और कार्डियोमायोसाइट्स को 1 एमएल प्लेटिंग माध्यम में निलंबित करें।
  11. एकाग्रता निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं की गणना करें, मात्रा को वांछित सीडिंग घनत्व में समायोजित करें, और कोशिकाओं को प्लेट करें। एमईसीएम 96-वेल प्लेटों पर शुद्ध कार्डियोमायोसाइट्स को प्लेट करें, जैसा कि ऊपर चरण 1.9-1.11 (7.5 × 105 कोशिकाओं / कुएं) में वर्णित है।

4. वोल्टेज-संवेदनशील रंजक (वीएसडी) और कैल्शियम-संवेदनशील फ्लोरोफोरे (सीएसएफ) का उपयोग करके ऑप्टिकल मैपिंग

  1. कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ एचबीएसएस में वीएसडी की उचित मात्रा तैयार करें, एचबीएसएस के प्रति एमएल वीएसडी डाई के 1 μL और HBSS के प्रति एमएल लोडिंग सहायक के 10 μL को जोड़कर।
    नोट: आमतौर पर, एक 96-वेल प्लेट को 10 एमएल वीएसडी समाधान की आवश्यकता होती है।
  2. वैकल्पिक रूप से, कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ एचबीएसएस तैयार करें जो सीएसएफ के 5 μM के साथ पूरक है। कार्डियोमायोसाइट्स रखरखाव माध्यम को एस्पिरेट करें और 96-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 100 μL VSD या CSF के साथ प्रतिस्थापित करें। सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. रंगों को हटा दें और परख माध्यम या एचबीएसएस के साथ बदलें। एक उच्च-थ्रूपुट ऑप्टिकल मैपिंग डिवाइस के साथ बेसलाइन डेटा ऑप्टिकल मैपिंग के अधिग्रहण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर समतुल्य करें।
  4. तीव्र जोखिम परीक्षण के लिए दवाओं के साथ कोशिकाओं का इलाज करें, या उन कोशिकाओं को मैप करें जो लंबे समय से रुचि की दवाओं के संपर्क में थे।
  5. 96-वेल प्लेटों में कार्डियोटॉक्सिसिटी परीक्षण के लिए, प्रति खुराक कम से कम छह कुओं के साथ एक यौगिक की चार खुराक का उपयोग करें। नैदानिक प्रभावी चिकित्सीय प्लाज्मा एकाग्रता की खुराक सहित प्रभावी चिकित्सीय प्लाज्मा एकाग्रता के नीचे से ऊपर तक की खुराक का उपयोग करें।
  6. डाइमिथाइल सल्फोक्साइड में दवाओं को पतला करें, उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान के रूप में स्टोर करें, और फिर उन्हें वांछित सांद्रता में एचबीएसएस में पतला करें।
  7. दवा आवेदन से पहले बेसलाइन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माप करें, जैसा कि अनुभाग 5 में वर्णित है। एक बार दवाओं को लागू करने के बाद, पुरानी अध्ययनों के लिए कम से कम 30 मिनट बाद इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग करें। ऑप्टिकल मैपिंग डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण प्रक्रियाओं के लिए निम्न अनुभाग देखें।

5. आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) का उपयोग करऑप्टिकल मैपिंग

  1. प्लेट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है या एमएसीएस-शुद्ध एचआईपीएस-सीएम, जैसा कि ऊपर वर्णित है, परिपक्व HIPSC-CM बनाने के लिए MECM-लेपित 96-वेल प्लेटों का उपयोग करते हुए। कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर बनाने के लिए, प्लेट 7.5 × प्रत्येक 96-वेल प्लेट के प्रति कुएं 104 सीएम। चढ़ाना माध्यम का उपयोग करें।
  2. प्लेटिंग माध्यम में 48 घंटे के बाद, कार्डियोमायोसाइट्स रखरखाव माध्यम पर स्विच करें।
  3. पिघलने और रिप्लेटिंग के बाद 4 वें दिन, संक्रमण (एमओआई) = 5 की बहुलता पर कोशिकाओं में जीसीएएमपी 6 एम (एडीजीसीएएमपी 6 एम) व्यक्त करने के लिए पुनः संयोजक एडेनोवायरस जोड़ें। सीएम परख माध्यम का उपयोग करके वायरस जोड़ें।
    नोट: यहां, जीसीएएमपी 6 एम का उपयोग करने वाले प्रयोग एक वाणिज्यिक विक्रेता से आईसेल2 कार्डियोमायोसाइट्स में किए गए थे।
  4. दिन 5 पर, adGCaMP6m माध्यम को हटा दें और ताजा RPMI + B27 (कार्डियोमायोसाइट्स रखरखाव माध्यम) के साथ बदलें।
  5. दिन 7 पर, माइक्रोस्कोपी या ऑप्टिकल मैपिंग इमेजर का उपयोग करके सीएम का निरीक्षण करें, सहज संकुचन और संबंधित कैल्शियम क्षणिकता की कल्पना करने के लिए।
  6. दिन 7 या बाद में, दवा स्क्रीनिंग के लिए, बेसलाइन डेटा अधिग्रहण के लिए इनक्यूबेटर से ऑप्टिकल मैपिंग इमेजर में जीसीएएमपी 6 एम को व्यक्त करने वाले परिपक्व एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर की 96-वेल प्लेटों को सीधे स्थानांतरित करें।
  7. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा अधिग्रहण के बाद, बाद के समय बिंदु पर माप के लिए, सीएम की प्लेटों को टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें।
  8. बेसलाइन रिकॉर्डिंग के बाद, प्रत्येक दवा की कम से कम चार खुराक और प्रति खुराक कम से कम छह कुओं का उपयोग करके दवाओं को लागू करें। डेटा संग्रह से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए कोशिकाओं पर दवाओं को बराबर करें। डेटा के अधिग्रहण से पहले और दौरान कुएं के तापमान को ~ 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  9. एक पूरी प्लेट की बेसलाइन रिकॉर्डिंग के बाद, मजबूत दवा प्रतिक्रिया डेटा को सक्षम करने के लिए हर कुएं में आइसोप्रोटेरोल (500 एनएम) जोड़ें। मोनोलेयर बीट दर, संकुचन आयाम (कैल्शियम क्षणिक आयाम), और कैल्शियम क्षणिक अवधि (चित्रा 6 देखें) पर आइसोप्रोटेरेनॉल के प्रभावों को निर्धारित करें, जैसा कि खंड 5 में वर्णित है।

6. ऑप्टिकल मैपिंग डेटा और विश्लेषण का अधिग्रहण

  1. सुनिश्चित करें कि ऑप्टिकल मैपिंग डिवाइस कैमरा, ट्रांसिल्युमिनेटर और प्लेट हीटर चालू हैं।
  2. अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर खोलें और फ़ाइल सहेजने का स्थान निर्धारित करें।
  3. सामने की दराज खोलें और प्लेट को प्लेट हीटर पर रखें।
  4. डार्क फ्रेम बटन पर क्लिक करके एक डार्क फ्रेम प्राप्त करें।
  5. अवधि (10-30 सेकंड) और अधिग्रहण की फ्रेम दर (उदाहरण के लिए, 100 एफपीएस; उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के लिए 250 एफपीएस) का चयन करें, और अधिग्रहण प्रारंभ करें पर क्लिक करें।
  6. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें और आयात/फ़िल्टर टैब में, प्लेट के पुनर्निर्माण के लिए एकल फ़ाइल या टाइल एकाधिक के लिए ब्राउज़ करें का चयन करें.
  7. पैरामीटर मोड (APD या CaTD) का चयन करें, प्रति पिक्सेल दूरी दर्ज करें, और छवि में कुओं का स्थान निर्धारित करने के लिए वेल विज़ार्ड का उपयोग करें। अगले टैब पर जाने के लिए प्रक्रिया सहेजें क्लिक करें.
  8. ROIs (रुचि के क्षेत्र) टैब खोलें और ROIs को मैन्युअल रूप से, स्वचालित रूप से, या ROIs का उपयोग न करें, जो तब विश्लेषण के लिए पूरे पर विचार करेगा। ROIs का चयन होने के बाद, अगले चरण पर जाने के लिए प्रक्रिया/सहेजें बटन पर क्लिक करें। ROIs की कल्पना करने के लिए कुओं को छिपाएं और केवल फ़िल्टर किए गए बक्से दिखाएँ की जाँच करें।
  9. विश्लेषण टैब खोलें और, स्क्रीन के शीर्ष दाईं ओर, स्वचालित बीट डिटेक्शन की सटीकता की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक वेल या आरओआई का चयन करें। ऐड बीट/सेव बीट दबाकर या किसी व्यक्तिगत बीट का चयन करके और कीबोर्ड पर डिलीट दबाकर निशान से बीट्स जोड़ें या निकालें।
  10. वैकल्पिक रूप से, प्लेट के लिए चयनित मापदंडों के हीटमैप बनाने के लिए औसत हीट मैप्स सुविधा का उपयोग करें।
  11. प्रत्येक कुएं या आरओआई के लिए डेटा की कल्पना करने के लिए विश्लेषण टैब में टाइम-स्पेस प्लॉट बटन पर क्लिक करें। यह सुनिश्चित करने के बाद कि बीट डिटेक्शन सटीक है, निर्यात टैब पर आगे बढ़ें और फ़ाइल प्रारूप का चयन करें। निर्यात दबाएँ और निर्यात किए जाने वाले डेटा के लिए फ़ोल्डर बनाएँ. डेटा फ़ाइलों को खोलने और चुने हुए सांख्यिकीय विश्लेषण दिनचर्या को चलाने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: .xlxs फ़ाइलों को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि सभी पैरामीटर एक ही फ़ाइल में निर्यात किए जाते हैं; अन्य स्वरूप (.csv या .tsv) प्रति पैरामीटर एक फ़ाइल उत्पन्न करते हैं.

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Representative Results

HIPSC-CM परिपक्वता चरण कंट्रास्ट और इम्यूनोफ्लोरोसेंट कॉन्फोकल इमेजिंग की विशेषता है
एमईसीएम लेपित 96-वेल प्लेटों का उपयोग करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एचआईपीएससी-सीएम की ईसीएम-मध्यस्थता परिपक्वता के लिए समयरेखा चित्रा 1 ए में प्रस्तुत की गई है। ये डेटा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके एकत्र किए जाते हैं जो प्रयोगशाला में कोशिकाओं की क्रायोसंरक्षित शीशियों के रूप में आते हैं। प्रत्येक शीशी में >5 × 106 व्यवहार्य कार्डियोमायोसाइट्स होते हैं। कोशिकाओं को ~ 98% शुद्ध और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए कड़ाई से परीक्षण किया जाता है (प्रत्येक शीशी के साथ विश्लेषण का प्रमाण पत्र प्रदान किया जाता है)। सीएम की उच्च संख्या कोशिकाओं के एक ही बैच का उपयोग करके विभिन्न ईसीएम संयोजनों पर सीएम को पिघलाने और चढ़ाने में सक्षम बनाती है। चित्रा 1 में, HIPSC-CM को माउस ईसीएम- या MECM-लेपित प्लेटों पर चढ़ाया जाता है। एमईसीएम पर चढ़ाए गए एचआईपीएससी-सीएम परिपक्व होते हैं और माउस ईसीएम पर एचआईपीएससी-सीएम के एक ही बैच से संरचनात्मक रूप से अलग हो जाते हैं। अर्थात्, परिपक्व कोशिकाएं रॉड के आकार की हो जाती हैं, जबकि अपरिपक्व कोशिकाएं एक गोलाकार आकार बनाए रखती हैं। यह चरण कंट्रास्ट इमेजिंग में और कार्डियक मायोफिलामेंट्स (चित्रा 1 बी; ट्रोपोनिन आई [टीएनआई], लाल) को धुंधला करने पर देखा जा सकता है। HIPSC-CM की संरचनात्मक परिपक्वता का अधिक व्यापक सत्यापन चित्रा 2 में प्रस्तुत किया गया है। α-एक्टिनिन एंटीबॉडी से सना सीएम का एक बड़ा क्षेत्र (20x उद्देश्य) प्रत्येक ईसीएम स्थिति पर संवर्धित कोशिकाओं के विशिष्ट आकार को दर्शाता है। α-एक्टिनिन एक महत्वपूर्ण संरचनात्मक प्रोटीन है जो कार्डियक मायोफिलामेंट्स में नियमित अंतराल के साथ व्यवस्थित होता है। चित्रा 1 में टीएनआई धुंधला होने के अनुरूप, α-एक्टिनिन धुंधला होना आगे एमईसीएम पर संवर्धित एचआईपीएससी-सीएम की परिपक्वता को इंगित करता है। रॉड के आकार के परिपक्व फेनोटाइप को बढ़ावा देने के अलावा, एमईसीएम अधिक सार्कोमेरे संगठन (60x छवियां) को भी प्रेरित करता है। माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री और गतिविधि माउस ईसीएम और एमईसीएम (चित्रा 2 बी) पर संवर्धित कोशिकाओं के बीच भी अलग हैं। भ्रूण-अपरिपक्व HIPSC-CM माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री पेरिन्यूक्लियर स्पेस तक सीमित है, जिसमें साइटोसोल में थोड़ा माइटोकॉन्ड्रिया पाया जाता है। इसके विपरीत, परिपक्व HIPSC-CM माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री पूरे सेल में वितरित की जाती है। माइटोकॉन्ड्रियल मूल्यांकन एक स्थापित प्रोटोकॉल19 का उपयोग करता है।

HIPSC कार्डियक-निर्देशित भेदभाव और कार्डियक चैंबर विनिर्देश
यहां प्रदान किया गया है कि शुद्ध, चैंबर-विशिष्ट एचआईपीएससी-सीएम (चित्रा 3 ए) के इन-हाउस उत्पादन और परिपक्वता के लिए एक प्रोटोकॉल है। यह पहले प्रकाशित रिपोर्ट20 पर आधारित है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, चुंबक-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) किट का उपयोग करके एचआईपीएससी-सीएम शुद्धिकरण के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं प्रस्तुत की गई हैं। हमने हाल ही में एमएसीएस शुद्धिकरण के उपयोग को मान्य किया और चयापचय-आधारित एचआईपीएससी-सीएम शुद्धिकरण की तुलना में एमएसीएस का उपयोग करने के लाभ दिखाए; आमतौर पर, 95% से ऊपर एचआईपीएससी-सीएम शुद्धताका अनुमान 21 है। यह इंगित करना महत्वपूर्ण है कि यदि प्रारंभिक सीएम सामग्री <50% है, तो एमएसीएस शुद्धिकरण केवल ~ 85% तक पहुंच सकता है। इन मामलों में, गैर-सीएम की कमी के बाद सीएम संवर्धन आवश्यक हो सकता है। यदि विभेदन से प्रारंभिक सीएम सामग्री >50% है, तो एमएसीएस किट का उपयोग करके सेल आबादी से गैर-सीएम की कमी शुद्धता प्राप्त कर सकती है >95%; इस मामले में, मुख्यमंत्रियों का आगे संवर्धन या सकारात्मक चयन आवश्यक नहीं है। कक्ष-विशिष्ट HIPSC-CM को MECM-लेपित 96-वेल प्लेटों का उपयोग करके भी परिपक्व किया जा सकता है, जैसा कि ऊपर उल्लिखित है और चित्रा 1 और चित्रा 2 में दिखाया गया है। यह उम्मीद की जानी चाहिए कि एट्रियल-विशिष्ट कोशिकाओं (एचआईपीएससी-एसीएम) में वेंट्रिकुलर-विशिष्ट कोशिकाओं (एचआईपीएससी-वीसीएम) की तुलना में काफी तेज सहज बीट दर और कम कार्रवाई संभावित अवधि 80 (एपीडी 80) होती है। ये वीएसडी और ऑप्टिकल मैपिंग सिस्टम (चित्रा 3 बी-डी) का उपयोग करके दर्ज कार्रवाई क्षमता के लिए विशिष्ट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा हैं।

उच्च-थ्रूपुट कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल ऑप्टिकल मैपिंग
किसी भी परख के लिए वैज्ञानिक कठोरता नाटकीय रूप से बढ़ जाती है यदि इसे उच्च-थ्रूपुट तरीके से किया जा सकता है। कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग डेटा चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6 और चित्रा 7 में प्रस्तुत किया गया है, जो 96-वेल प्लेट में परिपक्व एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल स्क्रीनिंग दिखाता है। एपीडी 80 (चित्रा 4 ए) जैसे मापदंडों के लिए पूरे प्लेट हीटमैप एक प्लेट के भीतर किसी दिए गए पैरामीटर की प्रजनन क्षमता को अच्छी तरह से प्रकट करते हैं। इसके अलावा, होल-प्लेट हीटमैप डेटा सेट में किसी भी आउटलायर्स की त्वरित परीक्षा प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, चित्रा 4 ए में प्रस्तुत प्लेट के अच्छी तरह से ई 4 में, यह स्पष्ट है कि इस कुएं में बहुत अधिक एपीडी 80 मूल्य है, जो अच्छी तरह से दिखाई देने वाले पीले रंग से संकेत मिलता है, जबकि अन्य कुएं इंडिगो-नीले हैं। परिपक्व 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर (चित्रा 4 बी) की विशिष्ट कार्रवाई क्षमता संस्कृति में पृथक और परीक्षण किए गए वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स की कार्रवाई संभावित आकृति विज्ञान की याद दिलाती है। इसके अलावा, चित्रा 4 सी में एक विशिष्ट क्रिया संभावित सहज लय प्रदर्शित होती है। चित्रा 4 सी में डेटा पंक्ति ए, कॉलम 1-12 का एक समय-स्थान प्लॉट है। चित्रा 4 ए में प्लेट मानचित्र पर सफेद रेखा इसे दर्शाती है। प्रत्येक कुएं में समय के साथ प्रत्येक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट फ्लैश एक एकल सहज सक्रियण का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 5 और चित्रा 6 इंट्रासेल्युलर कैल्शियम क्षणिकों को मापने के लिए जीसीएएमपी 6 एम आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) का उपयोग करने की उपयोगिता दिखाते हैं; चित्रा 6 आइसोप्रोटेरेनॉल-शास्त्रीय कार्डियक पॉजिटिव इनोट्रोप के लिए अपेक्षित प्रतिक्रिया भी दिखाता है। आइसोप्रोटेरेनॉल के जवाब में, ए1-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स के सक्रियण से सकारात्मक क्रोनोट्रॉपी (चित्रा 6 ए), सकारात्मक इनोट्रोपी (चित्रा 6 बी), और सकारात्मक ल्यूसिट्रॉपी (चित्रा 6 सी) होती है। आइसोप्रोटेरोनॉल के लिए ये प्रतिक्रियाएं एचआईपीएससी-सीएम 1-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग कैस्केड की महत्वपूर्ण परिपक्वता का संकेत देती हैं।

चित्रा 7 में, मानव ईथर-ए-गो-गो-संबंधित जीन (एचईआरजी) चैनल ब्लॉकर्स के लिए एचआईपीएससी-सीएम प्रतिक्रिया दिखाई गई है, लय की निगरानी के लिए जीसीएएमपी 6 एम कैल्शियम फ्लोरेसेंस का उपयोग करके और अनुबंध के लिए सरोगेट मार्कर के रूप में काम करने के लिए। ई -4031 एक एचईआरजी-विशिष्ट चैनल अवरोधक है, जो सहज बीट दर को धीमा कर देता है और कैल्शियम क्षणिक अवधि (सीएटीडी 80) और त्रिकोणीय (सीएटी त्रिकोणीय) को बढ़ाता है। चित्रा 7 ए ई -4031 एचईआरजी चैनल नाकाबंदी के कारण शुरुआती आफ्टर-डिपोलराइजेशन का पता लगाता है। डोमपेरिडोन, वेंडेटानिब और सोटालोल सहित अन्य एचईआरजी चैनल ब्लॉकर्स का भी परीक्षण किया गया था, और परिणाम चित्रा 7 ई-जी में दिखाए गए हैं। इन यौगिकों और खुराक को हाल ही में एचआईपीएससी-सीएम सत्यापन अध्ययन 1,7,9 के आधार पर चुना गया था।

Figure 1
चित्र 1: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या अन्य-स्रोत क्रायोसंरक्षित HIPSC-CM की तेजी से परिपक्वता के लिए समयरेखा। (A) प्लेटिंग माध्यम में निलंबित पिघले हुए कार्डियोमायोसाइट्स को दिन 0 पर MECM पर लागू किया जाता है। दिन 2 पर, माध्यम को रखरखाव माध्यम के साथ बदल दिया जाता है, और खर्च किए गए माध्यम को दिन 5 पर बदल दिया जाता है। कोशिकाओं को अतिरिक्त 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है, और 7 वें दिन, HIPSC-CM के परिपक्व सिंसिटिया को डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए रिकॉर्डिंग समाधान के साथ लोड किया जा सकता है या लंबी अवधि के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है। (बी) माउस ईसीएम या एमईसीएम पर चढ़ाए गए कार्डियोमायोसाइट्स के सिंकिटिया के विपरीत चरण से पता चलता है कि माउस ईसीएम पर चढ़ाए गए कार्डियोमायोसाइट्स में एमईसीएम पर चढ़ाए गए कार्डियोमायोसाइट्स की तुलना में अधिक परिपत्रता होती है; इसके अलावा, टीएनआई के लिए इम्यूनोस्टेनिंग इंगित करता है कि माउस ईसीएम पर चढ़ाए गए कार्डियोमायोसाइट्स एमईसीएम पर चढ़ाए गए डोलिकोमॉर्फिक और अच्छी तरह से संरचित एचआईपीएससी-सीएम के विपरीत एक रेडियल समरूपता आकृति विज्ञान और अव्यवस्थित सरकोमेरेस को बनाए रखते हैं। स्केल सलाखों = 100 μm (B, ऊपरी); 50 μm (B, निचला)। संक्षेप: HIPSC-CMs = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स; ईसीएम = बाह्य मैट्रिक्स; एमईसीएम = परिपक्वता-उत्प्रेरण ईसीएम; 96wp = 96-वेल प्लेट; DAPI = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल; TnI = ट्रोपोनिन I. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(ए) α-एक्टिनिन के खिलाफ माउस ईसीएम-सुसंस्कृत एचआईपीएससी-सीएम इम्यूनोस्टेन्ड रेडियल आकृति विज्ञान का संकेत देते हैं, जिसमें मैट्रिक्स पर चढ़ाए गए एक ही बैच से हाईपीएससी-सीएम के विपरीत कार्डियोमायोसाइट के माध्यम से फैले सरकोमेरेस का कम घनत्व होता है और रॉड के आकार की आकृति विज्ञान (20x) प्रस्तुत करता है। (60x) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ HIPSC-CCM के अवलोकन से पता चलता है कि माउस ईसीएम पर संवर्धित HIPSC-CM में रेडियल समरूपता आकृति विज्ञान होता है, जिसमें SARcomeres का सघन पेरिमेट्रल वितरण होता है और उसी बैच के HIPSC-CM के विपरीत रेडियल सरकोमेरेस का कम घनत्व होता है जिसे MECM पर संवर्धित किया गया था। वे कोशिकाओं की लंबी धुरी के साथ संगठित सरकोमेरेस का एक सजातीय वितरण प्रस्तुत करते हैं। स्केल सलाखों = 100 μm (ऊपरी); 50 μm (निचला)। (बी) माउस ईसीएम या एमईसीएम पर एक माइटोकॉन्ड्रियल डाई के साथ सुसंस्कृत एचआईपीएससी-सीएम का धुंधलापन जो उच्च ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता वाले माइटोकॉन्ड्रिया पर दाग लगाता है, एमईसीएम की तुलना में माउस ईसीएम पर संवर्धित कार्डियोमायोसाइट्स में धुंधलापन की कम तीव्रता दिखाता है। इसके अलावा, एमईसीएम पर संवर्धित एचआईपीएससी-सीएम में कार्डियोमायोसाइट्स में समरूप रूप से वितरित माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं, माउस ईसीएम पर संवर्धित एचआईपीएससी-सीएम के विपरीत जो माइटोकॉन्ड्रिया के पेरिन्यूक्लियर संचय को प्रस्तुत करते हैं। स्केल सलाखों = 200 μm. संक्षेप: HIPSC-CMs = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स; ईसीएम = बाह्य मैट्रिक्स; एमईसीएम = परिपक्वता-उत्प्रेरण ईसीएम; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
(ए) कक्ष-विशिष्ट कार्डियोमायोसाइट्स के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल समान डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग हेरफेर साझा करते हैं, जिसमें दिन 0 से 2 तक जीएसके 3 के निषेध द्वारा डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग की टीएचआर उत्तेजना होती है, और दिन 2 और 4 के बीच इस मार्ग का निषेध होता है। चैंबर विनिर्देश को रेटिनोइक एसिड मार्ग के सक्रियण और दिन 3 और 6 के बीच डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग हेरफेर के साथ प्राप्त किया जाता है। (बी) कक्ष विनिर्देश के परिणामस्वरूप, एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स की तुलना में सहज विध्रुवण की तेज दर पेश करते हैं। (ग) वेंट्रिकुलर हिपीएससी-सीएम में एट्रियल हिपीएससी-सीएम की तुलना में धीमी बीट दर होती है; इसलिए, एचआईपीएस-वीसीएम की तुलना में एचआईपीएस-एसीएम में 80% पुनर्ध्रुवण पर कार्रवाई संभावित अवधि कम है। संक्षेप: HIPSC-CMs = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स; HIPSC-ACM = एट्रियल मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स; HIPSC-VCM = वेंट्रिकुलर मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ऑप्टिकल मैपिंग एक ऑप्टिकल मैपिंग डिवाइस के साथ अधिग्रहित और पल्स के साथ विश्लेषण किया गया। (ए) फिल्म निस्पंदन के बाद 96-वेल प्लेट में मूल्यांकन किए गए मापदंडों के समग्र अवलोकन के लिए हीटमैप का उदाहरण और ऑप्टिकल मैपिंग डिवाइस के साथ मैप किए गए 96-वेल प्लेटों में रुचि के क्षेत्रों का निर्धारण। इस उदाहरण में, एक एपीडी 80% हीटमैप जो एक आउटलायर वेल (ई 4) और कुओं को इंगित करता है जो डेटा का उत्पादन करने में विफल रहे (कुएं एच 3, 4, और 5)। (बी) इसके अलावा, उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफ़ेस चयनित कुओं से औसत कार्रवाई संभावित आकृति विज्ञान की आसान प्लॉटिंग की अनुमति देता है। (सी) अतिरिक्त डेटा विज़ुअलाइज़ेशन टूल उपलब्ध हैं; इस उदाहरण में, पंक्ति A (पैनल A) पर कुओं को पार करने वाली क्षैतिज रेखा से उत्पन्न एक समय-स्थान प्लॉट 10 सेकंड की अवधि में प्रत्येक कुएं (पंक्ति A में सफेद रेखा) के क्षैतिज खंड में सक्रियण दिखाता है। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक के साथ इंट्रासेल्युलर कैल्शियम क्षणिक परिवर्तनों के मानचित्रण के लिए समयरेखा। एमईसीएम-लेपित 96-वेल प्लेट में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कार्डियोमायोसाइट्स चढ़ाने के बाद दिन 4 पर, जैसा कि चित्रा 1 ए में दर्शाया गया है, कोशिकाओं को रात भर सीएम परख माध्यम में वायरस के 5 एमओआई के साथ ट्रांसड्यूस किया जाना चाहिए। माध्यम को दिन 6 तक सीडीआई रखरखाव माध्यम के साथ बदल दिया जाता है, और 7 और 11 दिनों के बीच फिनोल लाल के बिना सीडीआई रखरखाव माध्यम में बदल दिया जाता है ताकि नॉटिलस के साथ इंट्रासेल्युलर कैल्शियम क्षणिक परिवर्तनों की त्वरित या निरंतर निगरानी की अनुमति मिल सके। (ख) 7, 9 और 10 दिनों के पिघलने के बाद ऑप्टिकल मैपिंग के साथ मूल्यांकन किए गए एडीजीसीएएमपी6एफ के साथ एचआईपीएससी-सीएम स्थिर, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम-मध्यस्थता प्रतिदीप्ति परिवर्तनों की उपस्थिति को इंगित करते हैं, जो कैल्शियम-संवेदनशील रंगों के पुन: आवेदन की आवश्यकता के बिना विस्तारित अवधि में एक ही प्लेट के दैनिक ऑप्टिकल मानचित्रण की अनुमति देते हैं। संक्षेप: जीईसीआई = आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक; सीएम = कार्डियोमायोसाइट; एमओआई = संक्रमण की बहुलता; 96wp = 96-वेल प्लेट; बीएसए = गोजातीय सीरम एल्बुमिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: नॉटिलस के साथ HIPSC-CM के परिपक्व कार्यात्मक सिंकिटिया से प्राप्त डेटा की दृश्य तुलना के लिए हीटमैप का त्वरित और आसान उपयोग और पल्स के साथ विश्लेषण किया गया। (A) आइसोप्रोटेरनॉल के साथ इलाज किए गए HIPSC-CM बीट दर में वृद्धि दिखाते हैं, जैसा कि हीटमैप के निरीक्षण द्वारा देखा गया है और युग्मित टी-टेस्ट के साथ पुष्टि की गई है। (बी) इसी तरह, आइसोप्रोटेरोल उपचार से पहले और बाद में कोशिकाओं का मानचित्रण हीटमैप्स की दृश्य तुलना और युग्मित टी-परीक्षण के साथ β-एड्रीनर्जिक उत्तेजना के इनोट्रोपिक प्रभाव को दर्शाता है। (सी) अंत में, डेटा की दृश्य तुलना के लिए हीटमैप का उपयोग लुसिट्रॉपी दिखाता है, जो β-एड्रीनर्जिक उत्तेजना का एक और कैननिकल प्रभाव है, जिसकी पुष्टि युग्मित टी-टेस्ट (पी < 0.0001) के साथ की गई है। वृत्त की अनुपस्थिति उस विशिष्ट कुएं के लिए डेटा अधिग्रहण/विश्लेषण में विफलता को इंगित करती है। संक्षेप: HIPSC-CMs = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स; आईएसओ = आइसोप्रोटेरेनॉल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: एचईआरजी चैनल ब्लॉकर्स का उपयोग करके जीईसीआई कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग परख का सत्यापन। (ए) एचबीएसएस में बेसलाइन कुओं से और 500 एनएम ई -4031 की उपस्थिति में प्रतिनिधि सहज कैल्शियम फ्लक्स के निशान। (बी-डी) बीट दर, कैल्शियम क्षणिक अवधि 80 (सीएटीडी 80), और कैल्शियम क्षणिक त्रिकोणीय (कैट त्रिकोणीय) पर बेसलाइन और + ई -4031 प्रभावों का परिमाणीकरण। *,** महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है; अप्रकाशित टी-टेस्ट; पी < 0.01; प्रत्येक समूह में n = 8 (ङ) एक अन्य एचईआरजी अवरोधक, डोमपेरीडोन का जीईसीआई पता लगाना। (च) वंदेतानीब द्वारा प्रेरित एचईआरजी ब्लॉक का जीईसीआई पता लगाना। (छ) जीईसीआई द्वारा सोटालोल की उच्च खुराक द्वारा एचईआरजी ब्लॉक का पता लगाना। संक्षेप: जीईसीआई = आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक; एचईआरजी = मानव ईथर-ए-गो-गो-संबंधित जीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: मीडिया और उनकी रचनाएँ कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग करके इन विट्रो कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग के लिए कई अलग-अलग दृष्टिकोण हैं। एचआईपीएससी-सीएम के उपयोग पर हाल ही में "सर्वोत्तम अभ्यास" पेपर ने विभिन्न इन विट्रो परखों, उनके प्राथमिक रीडआउट और महत्वपूर्ण रूप से, मानव कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल फ़ंक्शन20 को मापने के लिए प्रत्येक परख की ग्रैन्यूलैरिटी को प्रस्तुत किया। झिल्ली-भेदी इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के अलावा, मानव कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल फ़ंक्शन का सबसे प्रत्यक्ष माप वीएसडी द्वारा प्रदान किया जाता है। वीएसडी परख रीडआउट कार्रवाई संभावित अवधि, कार्रवाई संभावित प्रसार वेग, कार्रवाई संभावित अपस्ट्रोक, एक्शन पोटेंशियल ट्रायंगुलेशन, बीट रेट, बीट नियमितता और एक्शन पोटेंशियल ड्यूरेशन हेटरोजेनेसिस सहित महत्वपूर्ण इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापदंडों के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण को सक्षम करता है। इसी तरह, कैल्शियम-संवेदनशील जांच एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर लय, दर और घटना की अवधि पर जानकारी प्रदान करती है। फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके किए गए एचआईपीएससी-सीएम कैल्शियम क्षणिक माप भी प्रत्येक संकुचन की सिकुड़न और सिकुड़ा हुआ शक्ति पर जानकारी प्रदान करते हैं। यह पेपर उच्च-थ्रूपुट वीएसडी और कैल्शियम क्षणिक माप परख में परिपक्व HIPSC-CM (96-वेल प्लेट्स) के उपयोग के लिए तरीके प्रदान करता है। ऑप्टिकल मैपिंग के तरीकों के अलावा, उच्च-थ्रूपुट ईपी डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर प्रस्तुत किया गया है।

यहां उल्लिखित विधियां कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग और नियामक विज्ञान क्षेत्रों के लिए एक महत्वपूर्ण प्रगति हैं। यहां, हमने उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्लेटों (96-वेल प्लेटों) में 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर की तेजी से परिपक्वता और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए तरीके प्रस्तुत किए हैं। यहां दिखाए गए एमईसीएम (7 दिन) का उपयोग करके तेजी से परिपक्वता पिछले दृष्टिकोणों की तुलना में एक बड़ी प्रगति है, जिसमें परिपक्वता को 30-100 दिनों22,23 से अधिक होने की आवश्यकता होती है। अन्य ईसीएम की तुलना में, जिन्हें प्रत्येक प्रयोग के लिए मैन्युअल आवेदन की आवश्यकता होती है, एमईसीएम प्लेटों को ईसीएम के साथ प्रीकोट किया जाता है और उपयोग करने के लिए तैयार प्रयोगशाला में पहुंचते हैं। एमईसीएम का यह पहलू अन्य ईसीएम कोटिंग्स का उपयोग करने की तुलना में उपयोग करना आसान, कम परिवर्तनशील और अधिक कुशल बनाता है। महत्वपूर्ण रूप से, इस दृष्टिकोण का उपयोग क्रायोप्रिजर्व्ड, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध HIPSC-CM और "होममेड" HIPSC-CM दोनों के लिए किया जा सकता है, जो कक्ष-विशिष्ट हो सकते हैं। परिपक्व HIPSC-CMs (चित्रा 1 और चित्रा 2) की विशिष्ट, रॉड के आकार की संरचना के कारण, यह इंगित करना महत्वपूर्ण है कि अन्य ईसीएम का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल की तुलना में यहां कंफ्लुएंट मोनोलेयर गठन के लिए अधिक संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, माउस ईसीएम का उपयोग करते समय (कोशिकाओं में लगातार फैलने वाला पैनकेक फेनोटाइप होता है), हम प्रति अच्छी तरह से 50,000 एचआईपीएससी-सीएम प्लेट करते हैं, लेकिन एमईसीएम का उपयोग करते समय, हम प्रति अच्छी तरह से 75,000 एचआईपीएस-सीएम प्लेट करते हैं। प्रति कुएं सीएम की संख्या को भी कम किया जा सकता है यदि कोशिकाओं का उपयोग एकल-सेल विश्लेषण के लिए किया जाना है, जैसे कि पैच क्लैंप या एकल कोशिकाओं की आवश्यकता वाली कोई अन्य इमेजिंग तकनीक।

खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) के नेतृत्व वाले अंतरराष्ट्रीय प्रयासों द्वारा इन कोशिकाओं के व्यापक लक्षण वर्णन के कारण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध HIPSC-सीएम नियामक विज्ञान के लिए लाभ प्रदान करते हैं। हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोशिकाएं नोडल, एट्रियल और वेंट्रिकुलर हिपीएससी-सीएम का मिश्रण हैं, जो अत्यधिक प्रासंगिक विषाक्तता जानकारी प्रदान करते हैं लेकिन कक्ष-विशिष्ट विशेषताओं की कमी होती है जो मानव हृदय की नकल करते हैं। चैंबर-विशिष्ट HIPSC-CMs एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स के बीच प्रसिद्ध इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अंतर को फिर से बनाते हैं, और कक्ष-विशिष्ट एंटी-अरिदमिक उपचार (चित्रा 3 बी-डी) के विकास के लिए एक इन विट्रो परख प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, एट्रियल फाइब्रिलेशन-विशिष्ट दवाओं को अब मजबूत और कठोर डेटा संग्रह के लिए 96-वेल प्लेटों में चढ़ाए गए एचआईपीएससी-एसीएम मोनोलेयर का उपयोग करके परीक्षण और विकसित किया जा सकता है। इसी तरह, जब यह निर्धारित करने के लिए स्क्रीनिंग की जाती है कि क्या कोई यौगिक टॉर्सडेस डी पॉइंट्स (टीडीपी), एक उच्च जोखिम वाले वेंट्रिकुलर अतालता का कारण बनता है- तो एट्रियल और नोडल कोशिकाओं को वेंट्रिकुलर कार्डियक मोनोलेयर को "दूषित" नहीं करना इष्टतम है। इसलिए, हालांकि एफडीए के नेतृत्व वाले एचआईपीएससी-सीएम सत्यापन प्रयासों ने आज तक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीएम का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित किया है, यह संभावना है कि भविष्य की नियामक विज्ञान सिफारिशें विषाक्तता स्क्रीनिंग को मानव हृदय की स्थिति के और भी अधिक पूर्वानुमानित बनाने के लिए कक्ष-विशिष्ट कोशिकाओं के उपयोग की ओर रुख करेंगी। यहां उल्लिखित विधियां पिछली रिपोर्टों पर आधारित हैं, और प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं21 से प्राप्त कक्ष-विशिष्ट कार्डियोमायोसाइट्स की पीढ़ी के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करती हैं।

इन प्रोटोकॉल और आमतौर पर क्षेत्र में उपयोग किए जाने वाले लोगों के बीच एक बड़ा अंतर उपयोग किया जाने वाला शुद्धिकरण दृष्टिकोण है। अधिकांश प्रयोगशालाएं जो अपनी प्रयोगशालाओं में HIPSC-CMS उत्पन्न करती हैं, कार्डियोमायोसाइट्स22 के चयापचय-मध्यस्थता चयन पर भरोसा करती हैं। यहां, हम एक चिकित्सकीय रूप से अनुमोदित सेल प्रोसेसिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके एचआईपीएससी-सीएम को शुद्ध करने के लिए एमएसीएस का उपयोग करने पर भरोसा करते हैं जो स्वस्थ फेनोटाइप23 के साथ सीएम का उत्पादन करता है। चयापचय चुनौती दृष्टिकोण प्रभावी है, लेकिन एक मीडिया सूत्रीकरण का उपयोग करता है जो मायोकार्डियल इस्किमिया24 का अनुकरण करता है। एचआईपीएससी-सीएम के एमएसीएस शुद्धिकरण का उपयोग करते समय, गैर-सीएम रिक्तीकरण कॉकटेल का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, जो सेल आबादी से चुंबकीय कमी के लिए गैर-सीएम को लक्षित करता है। गैर-सीएम रिक्तीकरण दृष्टिकोण का उपयोग कतरनी तनाव को कम करता है जो सीएम चुंबकीय स्तंभ में अनुभव करते हैं, और सीएम आबादी के प्रत्यक्ष चुंबकीय लेबलिंग पर पसंद किया जाता है। चैंबर-विशिष्ट कोशिकाओं के एमएसीएस शुद्धिकरण का उपयोग अन्य प्रयोगशालाओं को अनुसंधान और विषाक्तता परीक्षण के लिए स्वस्थ सीएम उत्पन्न करने में सक्षम करेगा।

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Disclosures

टीबी स्टेमबायोसिस, इंक का एक कर्मचारी है। एएमआर और जेसी स्टेमबायोसिस, इंक के पूर्व सलाहकार हैं। टीजेएच, टीबी, एएमआर और जेसी स्टेमबायोसिस, इंक के पूर्व सलाहकार हैं।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान एचएल 148068-04 और आर 44ईएस027703-02 (टीजेएच) द्वारा समर्थित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin EDTA Gibco 25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) Millipore Sigma A3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) Millipore Sigma H4034
AdGCaMP6m Vector biolabs 1909
Albumin human Sigma A9731-1G
alpha actinin antibody ThermoFisher MA1-22863
B27 Gibco 17504-044
Blebbistatin Sigma B0560
CalBryte 520AM AAT Bioquest 20650
CELLvo MatrixPlus 96wp StemBiosys N/A https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021 LC Laboratories c-6556
Clear Assay medium (fluorobrite) ThermoFisher A1896701 For adenovirus transduction
DAPI ThermoFisher 62248
DMEM:F12 Gibco 11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135-500ML
FluoVolt ThermoFisher F10488
HBSS Gibco 14025-092
iCell CM maintenance media FUJIFILM/Cellular Dynamics M1003
iCell2 CMs FUJIFILM 1434
Incucyte Zoom  Sartorius
iPS DF19-9-11T.H WiCell
Isoproterenol MilliporeSigma CAS-51-30-9
IWP4 Tocris 5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma A8960-5g
L-glutamine Gibco A2916801
LS columns Miltenyii Biotec 130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) Miltenyii Biotec 130-091-221
Matrigel Corning 354234
MitoTracker Red ThermoFisher M7512
Nautilus HTS Optical Mapping  CuriBio https://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal Microscope Nikon
nonessential amino acids Gibco 11140-050
pre-separation filter Miltenyii Biotec 130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human Miltenyii Biotec 130-110-188
Pulse CuriBio https://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet) Miltenyii Biotec 130-091-051
Retinoic acid Sigma R2625
RPMI 1640  Gibco 11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) Gibco 22400-089
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyii Biotec 130-107-086
TnI antibody (pan TnI) Millipore Sigma MAB1691 
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) Gibco 15040-066
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
β-mercaptoethanol Gibco 21985023

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References

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परिपक्व मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट मोनोलेयर का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग
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Monteiro da Rocha, A., Allan, A., Block, T., Creech, J., Herron, T. J. High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers. J. Vis. Exp. (193), e64364, doi:10.3791/64364 (2023).

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