Summary
Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) oferecem uma alternativa ao uso de animais para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade. Uma limitação à adoção generalizada de hiPSC-CMs na triagem pré-clínica de toxicidade é o fenótipo imaturo e semelhante ao fetal das células. São apresentados protocolos para maturação robusta e rápida de hiPSC-CMs.
Abstract
Os cardiomiócitos derivados de células-tronco induzidas humanas (hiPSC-CMs) são usados para substituir e reduzir a dependência de animais e células animais para testes pré-clínicos de cardiotoxicidade. Em formatos bidimensionais de monocamada, os hiPSC-CMs recapitulam a estrutura e a função das células musculares cardíacas humanas adultas quando cultivadas em uma matriz extracelular (MEC) ótima. Uma MEC derivada de células-tronco perinatais humanas (matriz extracelular indutora de maturação-MECM) amadurece a estrutura, a função e o estado metabólico do hiPSC-CM em 7 dias após o plaqueamento.
As monocamadas maduras de hiPSC-CM também respondem, como esperado, a medicamentos clinicamente relevantes, com risco conhecido de causar arritmias e cardiotoxicidade. A maturação das monocamadas hiPSC-CM foi um obstáculo à adoção generalizada dessas células valiosas para a ciência regulatória e triagem de segurança, até agora. Este artigo apresenta métodos validados para o plaqueamento, maturação e fenotipagem funcional de alto rendimento da função eletrofisiológica e contrátil hiPSC-CM. Esses métodos aplicam-se aos cardiomiócitos purificados comercialmente disponíveis, bem como aos cardiomiócitos derivados de células-tronco gerados internamente usando protocolos de diferenciação altamente eficientes e específicos da câmara.
A função eletrofisiológica de alto rendimento é medida usando corantes sensíveis à voltagem (VSDs; emissão: 488 nm), fluoróforos sensíveis ao cálcio (CSFs) ou sensores de cálcio codificados geneticamente (GCaMP6). Um dispositivo de mapeamento óptico de alto rendimento é usado para gravações ópticas de cada parâmetro funcional, e um software dedicado personalizado é usado para análise de dados eletrofisiológicos. Os protocolos MECM são aplicados para triagem de medicamentos usando um inotrópico positivo (isoprenaline) e bloqueadores de canal específicos do gene humano relacionado ao Ether-a-go-go (hERG). Esses recursos permitirão que outros pesquisadores utilizem com sucesso hiPSC-CMs maduros para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade de alto rendimento, testes de eficácia de medicamentos cardíacos e pesquisa cardiovascular.
Introduction
Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (MC-hiPSC) foram validados em escala internacional e estão disponíveis para triagem de cardiotoxicidade in vitro 1. HiPSC-CMs altamente puros podem ser gerados em números virtualmente ilimitados, criopreservados e descongelados. Ao serem replaqueados, eles também reanimam e começam a se contrair com um ritmo que lembra o coração humano 2,3. Notavelmente, os hiPSC-CMs individuais se acoplam uns aos outros e formam sincícios funcionais que batem como um único tecido. Atualmente, as hiPSCs são rotineiramente derivadas de amostras de sangue de pacientes, de modo que qualquer pessoa pode ser representada usando ensaios in vitro de triagem de cardiotoxicidade com hiPSC-CM 4,5. Isso cria a oportunidade de realizar "Ensaios Clínicos em um Prato", com representação significativa de diversas populações6.
Uma vantagem crítica sobre as abordagens existentes de triagem de cardiotoxicidade animal e de células animais é que os hiPSC-CMs utilizam o genoma humano completo e oferecem um sistema in vitro com semelhanças genéticas com o coração humano. Isso é especialmente atraente para farmacogenômica e medicina personalizada - o uso de hiPSC-CMs para o desenvolvimento de medicamentos e outras terapias é previsto para fornecer prescrições de medicamentos mais precisas, precisas e seguras. De fato, ensaios bidimensionais (2D) de monocamada de hiPSC-CM provaram ser preditivos de cardiotoxicidade medicamentosa, utilizando um painel de medicamentos de uso clínico com risco conhecido de causar arritmias 1,7,8,9. Apesar do grande potencial dos MC-hiPSC e da promessa de agilizar e baratear o desenvolvimento de fármacos, tem havido uma relutância em utilizar esses novos ensaios10,11,12.
Até agora, uma grande limitação da ampla adoção e aceitação dos ensaios de rastreamento hiPSC-CM é sua aparência imatura e fetal, bem como sua função. A questão crítica da maturação da hiPSC-CM tem sido revista e debatida na literatura científica ad nauseum13,14,15,16. Da mesma forma, muitas abordagens têm sido empregadas para promover a maturação da hiPSC-CM, incluindo manipulações da matriz extracelular (MEC) em monocamadas 2D e o desenvolvimento de tecidos cardíacos (EHTs) projetados em 3D17,18. No momento, há uma crença amplamente difundida de que o uso de EHTs 3D proporcionará maturação superior em relação às abordagens baseadas em monocamadas 2D. No entanto, as monocamadas 2D proporcionam uma maior eficiência de utilização celular e maior sucesso no revestimento em comparação com os EHTs 3D; Os EHTs 3D utilizam um número maior de células e, muitas vezes, requerem a inclusão de outros tipos de células que podem confundir os resultados. Portanto, neste artigo, o foco está no uso de um método simples para amadurecer hiPSC-CMs cultivadas como monocamadas 2D de células acopladas elétrica e mecanicamente.
A maturação avançada do hiPSC-CM pode ser obtida em monocamadas 2D usando um ECM. As monocamadas 2D de hiPSC-CMs podem ser amadurecidas usando uma lamínula macia e flexível de polidimetilsiloxano, revestida com matriz de membrana basal secretada por uma célula de sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de camundongo). Em 2016, relatos mostraram que os MC-hiPSC cultivados nessa condição de MEC mole amadureceram funcionalmente, exibindo velocidades de condução do potencial de ação próximas aos valores do coração adulto (~50 cm/s)18. Além disso, esses hiPSC-CMs maduros exibiram muitas outras características eletrofisiológicas que lembram o coração adulto, incluindo potencial de membrana de repouso hiperpolarizado e expressão de Kir2.1. Mais recentemente, relatos identificaram um revestimento de MEC derivado de células-tronco perinatais humanas que promove a maturação estrutural de HIPSC-CMs 2D19. Aqui, métodos fáceis de usar são apresentados para monocamadas hiPSC-CM 2D estruturalmente maduras para uso em telas eletrofisiológicas de alto rendimento. Além disso, fornecemos a validação de um instrumento de mapeamento óptico para a aquisição e análise automatizada da função eletrofisiológica da monocamada hiPSC-CM 2D, usando corantes sensíveis à voltagem (VSDs) e sondas e proteínas sensíveis ao cálcio.
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Protocol
O uso do hiPSC neste protocolo foi aprovado pelo Comitê HPSCRO da Universidade de Michigan (Comitê de Supervisão de Células-Tronco Pluripotentes Humanas). Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de materiais e equipamentos. Veja a Tabela 1 para mídias e suas composições.
1. Descongelamento e plaqueamento de hiPSC-CMs criopreservados comercialmente disponíveis para maturação em matriz extracelular indutora de maturação (MECM)
- Aquecer todos os reagentes à temperatura ambiente e reidratar as placas MECM com solução salina balanceada de Hank (HBSS) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo cálcio e magnésio, por 1 h antes do plaqueamento dos cardiomiócitos (200 μL de tampão por poço de uma placa de 96 poços).
- Lavar as placas MECM 2x com HBSS ou PBS contendo cálcio e magnésio por 1 h antes do plaqueamento dos cardiomiócitos (200 μL de tampão por poço de uma placa de 96 poços) e manter os poços hidratados.
- Prepare um banho-maria a 37 °C.
- Remova os tubos de cardiomiócitos do tanque de nitrogênio líquido, transfira os tubos para gelo seco e abra ligeiramente as tampas dos tubos para liberar pressão.
OBS: Liberar pressão nos tubos é extremamente importante! Se muita pressão se acumular dentro dos tubos, eles podem explodir. - Volte a selar as tampas dos tubos e coloque-as em banho-maria para descongelar durante 4 minutos.
NOTA: Deixe-os descongelar completamente, para evitar danos celulares devido ao descongelamento parcial. - Após o descongelamento das células, borrife os tubos com etanol 70% antes de abrir. Transfira as células para tubos cônicos de 15 mL com pipeta de 1 mL. Gotejar lentamente 8 mL de meio de plaqueamento, agitando o tubo cada vez que 1 mL for adicionado, para permitir que as células se ajustem às mudanças na osmolaridade.
- Lavar o criovial com 1 mL de meio de chapeamento usando uma pipeta de vidro de 1 mL. Em seguida, goteje lentamente a lavagem no tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugar os tubos a ~300 × g por 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de meio de plaqueamento. Remova uma alíquota e realize a contagem de células vivas com um hemocitômetro. Adicionar meio de plaqueamento adicional para obter 7,5 × 105 células/mL.
NOTA: Aproximadamente 10 mL de suspensão celular são necessários para preparar 96 poços. - Dispense 100 μL de suspensão celular por poço de uma placa de 96 poços revestida com MECM usando uma pipeta multicanal.
NOTA: Certifique-se de evitar a precipitação celular e obter densidade celular uniforme em todos os poços durante o revestimento. - Incubar as células a 37 °C, 5% CO 2 durante2 dias antes de mudar o meio para o meio de manutenção (200 μL/poço). Troque o meio de manutenção no dia 5 após o descongelamento. Realizar ensaios de EP no 7º dia ou mais tarde, conforme descrito anteriormente 8,9. Troque o meio a cada dois dias ao optar por estender a cultura celular.
2. diferenciação cardíaca hiPSC dirigida e purificação hiPSC-CM
- Solução quente de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) comercialmente disponível, HBSS sem cálcio e magnésio (HBSS--) e placas de 6 poços revestidas com matriz de membrana basal solubilizada secretada por uma célula de sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de camundongo) à temperatura ambiente.
- Marcar as colônias diferenciadas por microscopia de contraste de fase e aspirado/ablato. Lave bem cada poço com 1 mL de HBSS--. Realizar duas lavagens em poços contendo >10 pontos de diferenciação.
- Aspirar o HBSS -- e adicionar 1 mL de solução de EDTA a cada poço. Incubar as placas até 5 min a 37 °C. Verifique as placas após 3 min e procure colônias brancas translúcidas visíveis.
- Aspirar a solução de EDTA e adicionar 1 ml a um único poço. Deslocar as células com 2 mL de meio hiPSC pipetando a suspensão para cima e para baixo repetidamente, usando uma pipeta de vidro de 10 mL para separar todas as células-tronco do poço e transferir a suspensão celular para um tubo de coleta. Repita a aspiração e o deslocamento com poços subsequentes.
OBS: Desalojar colônias difíceis de levantar com a ponta da pipeta de vidro. - Conte as células-tronco e ajuste o volume para placa 8,0 × 105 células/poço. Cultivar as células em meio hiPSC (2 mL/poço) até que as células-tronco atinjam 90% de confluência (desta vez é referida doravante como D0).
- Preparar 2 mL de meio de diferenciação basal suplementado com 4 μM de CHIR99021.
- Em D0, lavar cada poço de uma placa de células-tronco de 6 poços com 1 mL de HBSS por poço. Substitua o HBSS por meio de diferenciação basal suplementado com 4 μM de CHIR99021.
- Em D1, não faça nada.
- Em D2, preparar meio de diferenciação basal suplementado com 4 μM de IWP4.
- Substitua o meio por 2 mL de meio de diferenciação basal suplementado com IWP4 por poço.
- Em D3, não faça nada para uma diferenciação ventricular-específica. Para uma diferenciação atrial-específica, aspirar o meio e adicionar 2 mL de meio basal suplementado com 4 μM de IWP4 e 1 μM de solução de ácido retinóico (AR) por poço.
- No D4, aspirar o meio e acrescentar 2 mL de meio basal por poço para diferenciação ventricular. Para uma diferenciação atrial, aspirar o meio e adicionar 2 mL de meio basal suplementado com 1 μM de solução de RA por poço.
- No D5, não faça nada.
- No D6, aspirar o meio e adicionar 2 mL de meio basal por poço (para diferenciação atrial e ventricular).
- No D7, não faça nada.
- No D8, aspirar o meio e adicionar 2 mL de meio de manutenção de cardiomiócitos. Mude o meio a cada dois dias até a separação celular, ou siga um plano de exposição crônica a drogas.
3. purificação hiPSC-CM via MACS (magnetic-activated cell sorting)
- Aspirar o meio de cultura celular e lavar bem cada um com 1 mL de HBSS--. Dissociar as células adicionando 1 mL de tripsina/EDTA a 0,25% e incubando a 37 °C, 5% CO2 por 10 min. Ressuspender e singularizar as células em cada poço com 2 mL de meio plaqueante para inativar a tripsina/EDTA.
- Coletar as células dos seis poços em um tubo cônico de 50 mL com filtro de 70 μm. Em seguida, lave o filtro com 3 mL de meio de chapeamento. Conte as células.
- Centrifugar a suspensão a ~300 × g por 5 min. Aspirar o sobrenadante e lavar as células com 20 mL de tampão de separação MACS gelado. Em seguida, centrifugar novamente a ~300 × g por 5 min.
- Ressuspender o pellet em 80 μL de tampão de separação MACS frio por 5 × 106 células. Adicionar 20 μL de cocktail frio de depleção de cardiomiócitos não cardiomiócitos (humano) por 5 × 106 células. Misture suavemente a suspensão celular e incube no gelo por 10 min.
- Lavar a amostra adicionando 4 ml de tampão de separação MACS frio por 5 × 106 células. Centrifugar a amostra a ~300 × g durante 5 min e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet em 80 μL de tampão de separação MACS frio por 5 × 106 células. Adicionar 20 μL de microesferas frias anti-biotina por 5 × 106 células. Misture suavemente a suspensão celular e incube por 10 min no gelo.
- Enquanto as amostras estiverem incubando, coloque as colunas de depleção positiva (equipadas com os filtros de pré-separação de 30 μm) no separador MACS e coloque os tubos de coleta marcados de 15 mL abaixo das colunas. Uma coluna é necessária para cada 5 × 106 células.
- Primer cada coluna com 3 mL de tampão de separação MACS frio. Misturar a suspensão celular tratada com anticorpos com 2 ml de tampão de separação MACS por 5 × 106 células e adicionar à coluna.
NOTA: Não centrifugar! A centrifugação nessa etapa tem efeitos prejudiciais sobre o rendimento dos cardiomiócitos. - Adicionar 2 mL de tampão de separação MACS a cada coluna e coletar o fluxo até que 12 mL de suspensão de cardiomiócitos de fluxo sejam coletados.
NOTA: Nunca deixe as colunas secarem totalmente. - Centrifugar os cardiomiócitos a ~300 × g por 5 min, descartar o sobrenadante e suspender os cardiomiócitos em 1 mL de plaqueamento.
- Conte as células para determinar a concentração, ajuste o volume para a densidade de semeadura desejada e plaqueie as células. Plaquear os cardiomiócitos purificados nas placas MECM de 96 poços, conforme descrito acima nas etapas 1,9-1,11 (7,5 × 105 células/poço).
4. Mapeamento óptico utilizando corantes sensíveis à voltagem (VSDs) e fluoróforos sensíveis ao cálcio (CSFs)
- Preparar a quantidade adequada de CIV em HBSS com cálcio e magnésio, adicionando 1 μL de corante VSD por mL de HBSS e 10 μL de adjuvante de carga por mL de HBSS.
NOTA: Normalmente, uma placa de 96 poços requer 10 mL de solução VSD. - Alternativamente, preparar HBSS com cálcio e magnésio suplementado com 5 μM de LCR. Aspirar o meio de manutenção do cardiomiócito e substituir por 100 μL de CIV ou LCR por poço de uma placa de 96 poços. Incubar as células por 30 min na incubadora de cultura celular.
- Retire os corantes e substitua por meio de ensaio ou HBSS. Equilibre a 37 °C para a aquisição de mapeamento óptico de dados de linha de base com um dispositivo de mapeamento óptico de alto rendimento.
- Tratar as células com drogas para testes de exposição aguda, ou mapear as células que foram cronicamente expostas a drogas de interesse.
- Para testes de cardiotoxicidade em placas de 96 poços, use quatro doses de um composto com pelo menos seis poços por dose. Use doses que variam de abaixo a acima da concentração plasmática terapêutica efetiva, incluindo uma dose da concentração plasmática terapêutica clinicamente eficaz.
- Diluir os fármacos em dimetil sulfóxido, armazená-los como soluções-estoque a -20 °C e, em seguida, diluí-los em HBSS para as concentrações desejadas.
- Faça medições eletrofisiológicas basais antes da aplicação do medicamento, conforme descrito na seção 5. Uma vez que as drogas tenham sido aplicadas, faça registros eletrofisiológicos pelo menos 30 minutos depois para estudos crônicos. Consulte as seções a seguir para obter procedimentos de aquisição e análise de dados de mapeamento óptico.
5. Mapeamento óptico utilizando indicador de cálcio codificado geneticamente (GECI)
- Placas hiPSC-CMs comercialmente disponíveis ou purificadas por MACS, como descrito acima, usando placas de 96 poços revestidas com MECM para fazer hiPSC-CMs maduros. Para formar monocamadas confluentes, placa de 7,5 × 104 CMs por poço de cada placa de 96 poços. Use meio de chapeamento.
- Após 48 h em meio de plaqueamento, mude para meio de manutenção de cardiomiócitos.
- No dia 4 após o descongelamento e replaqueamento, adicionar adenovírus recombinante para expressar GCaMP6m (AdGCaMP6m) às células em uma multiplicidade de infecção (MOI) = 5. Adicione o vírus usando o meio de ensaio CM.
NOTA: Aqui, experimentos usando GCaMP6m foram realizados em cardiomiócitos iCell2 de um fornecedor comercial. - No dia 5, remova o meio adGCaMP6m e substitua por RPMI+B27 fresco (meio de manutenção de cardiomiócitos).
- No 7º dia, observar os MCs por meio de microscopia ou do imageador de mapeamento óptico, para visualizar as contrações espontâneas e os transientes de cálcio correspondentes.
- No dia 7 ou mais tarde, para triagem medicamentosa, transfira diretamente placas de 96 poços de monocamadas hiPSC-CM maduras expressando GCaMP6m para o imageador de mapeamento óptico da incubadora para aquisição dos dados basais.
- Após a aquisição dos dados eletrofisiológicos, retornar as placas dos MCs à incubadora de cultura de tecidos, para medidas em um ponto de tempo subsequente.
- Após os registros basais, aplicar os medicamentos, utilizando pelo menos quatro doses de cada medicamento e pelo menos seis poços por dose. Equilibre os medicamentos nas células por pelo menos 30 minutos antes da coleta de dados. Aqueça a temperatura do poço a ~37 °C antes e durante a aquisição de dados.
- Após os registros basais de uma placa inteira, adicione isoproterenol (500 nM) a cada poço para permitir dados robustos de resposta a medicamentos. Quantificar os efeitos do isoproterenol na taxa de batimento da monocamada, na amplitude da contração (amplitude transitória do cálcio) e na duração do transiente do cálcio (ver Figura 6), conforme descrito na secção 5.
6. Aquisição de dados e análises de mapeamento óptico
- Verifique se a câmera, o transiluminador e o aquecedor de placas do dispositivo de mapeamento óptico estão ligados.
- Abra o software de aquisição e determine o local de salvamento do arquivo.
- Abra a gaveta frontal e posicione a placa no aquecedor de placas.
- Adquira uma moldura escura clicando no botão Moldura escura .
- Selecione Duração (10-30 s) e Taxa de quadros de aquisição (por exemplo, 100 fps; 250 fps para maior resolução temporal) e clique em Iniciar aquisição.
- Abra o software de análise e, na guia Importar/Filtrar , selecione Procurar um único arquivo ou Múltiplo de bloco para reconstruir uma placa.
- Selecione Modo de parâmetro (APD ou CaTD), insira Distância por pixel e use o Assistente de poço para determinar a localização dos poços na imagem. Clique em Processar Salvar para ir para a próxima guia.
- Abra a guia ROIs (regiões de interesse) e escolha desenhar as ROIs manualmente, automaticamente ou não usar ROIs, o que consideraria todo o poço para análise. Depois que as ROIs tiverem sido selecionadas, clique no botão Processar/Salvar para passar para a próxima etapa. Marque as caixas Ocultar poços e Mostrar somente filtrado para visualizar as ROIs.
- Abra a guia Análise e, no canto superior direito da tela, selecione cada Poço ou ROI para confirmar a Precisão da Detecção Automática de Batidas. Adicione ou remova batidas dos rastreamentos pressionando Add Beat/ Save Beats, ou selecionando uma batida individual e pressionando Delete no teclado.
- Opcionalmente, use o recurso Mapas de calor médio para criar mapas de calor dos parâmetros selecionados para a placa.
- Clique no botão Gráfico de Espaço-Tempo na guia Análise para visualizar os dados de cada poço ou o ROI. Depois de certificar-se de que a detecção de batida é precisa, vá para a guia Exportar e selecione Formato de arquivo. Pressione Exportar e crie uma pasta para a qual os dados serão exportados. Prossiga para abrir arquivos de dados e execute a rotina de análise estatística escolhida.
Observação : arquivos .xlxs são preferidos como todos os parâmetros são exportados em um único arquivo; Outros formatos (.csv ou .tsv) geram um arquivo por parâmetro.
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Representative Results
Maturação hiPSC-CM caracterizada por contraste de fase e imagem confocal imunofluorescente
A linha do tempo para a maturação mediada por MEC de hiPSC-CMs comercialmente disponíveis usando placas de 96 poços revestidas com MECM é apresentada na Figura 1A. Esses dados são coletados usando cardiomiócitos disponíveis comercialmente que chegam ao laboratório como frascos criopreservados de células. Cada frasco para injetáveis contém >5 × 106 cardiomiócitos viáveis. As células são ~98% puras e rigorosamente testadas para controle de qualidade (certificado de análise é fornecido com cada frasco). O alto número de MCs permite descongelar e plaquear os MCs em diferentes combinações de MEC usando o mesmo lote de células. Na Figura 1, os hiPSC-CMs são plaqueados em placas revestidas com ECM ou MECM de camundongos. Os hiPSC-CMs plaqueados no MECM amadurecem e tornam-se estruturalmente distintos do mesmo lote de hiPSC-CMs replaqueados no ECM de camundongo. Ou seja, as células maduras tornam-se em forma de bastonete, enquanto as células imaturas mantêm uma forma circular. Isso pode ser visto na imagem com contraste de fase e na coloração dos miofilamentos cardíacos (Figura 1B; troponina I [TnI], vermelho). Uma validação mais extensa da maturação estrutural dos MC-hiPSC é apresentada na Figura 2. Um amplo campo de visão (objetivo de 20x) dos MCs corados com anticorpo α-actinina mostra a forma típica das células cultivadas em cada condição de MEC. α-actinina é uma proteína estrutural crítica arranjada com espaçamento regular nos miofilamentos cardíacos. Consistente com a coloração de TnI na Figura 1, a coloração de α-actinina indica ainda mais a maturação das hiPSC-CMs cultivadas no MECM. Além de promover um fenótipo maduro em forma de bastonete, a MECM também induz maior organização dos sarcômeros (imagens de 60x). O conteúdo e a atividade mitocondrial também são distintos entre as células cultivadas na MEC de camundongos e na MECM (Figura 2B). O conteúdo mitocondrial imaturo da hiPSC-CM fetal é limitado ao espaço perinuclear, com pouca mitocôndria sendo encontrada no citosol. Em contraste, o conteúdo mitocondrial hiPSC-CMs maduro é distribuído por toda a célula. A avaliação mitocondrial utiliza um protocolo estabelecido19.
diferenciação cardíaca dirigida hiPSC e especificação da câmara cardíaca
Fornecido aqui é um protocolo para a produção interna e maturação de hiPSC-CMs purificados e específicos da câmara (Figura 3A). Isso se baseia em um relatório publicado anteriormente20. São apresentados procedimentos detalhados para purificação de hiPSC-CM usando um kit de classificação de células ativadas por ímã (MACS) disponível comercialmente. Recentemente, validamos o uso da purificação MACS e mostramos os benefícios do uso da MACS em comparação com a purificação hiPSC-CM baseada em metabólicos; tipicamente, a pureza do hiPSC-CM acima de 95% é esperada21. É importante ressaltar que se o teor inicial de CM for de <50%, a purificação do MACS pode atingir apenas ~85%. Nesses casos, o enriquecimento de MC pode ser necessário após o esgotamento de não-MCs. Se o conteúdo inicial de MC da diferenciação for de >50%, a depleção de não-CMs da população celular usando o kit MACS pode atingir pureza >95%; neste caso, não é necessário o enriquecimento adicional ou a seleção positiva dos MC. Os hiPSC-CMs específicos da câmara também podem ser maturados usando placas de 96 poços revestidas com MECM, conforme descrito acima e mostrado na Figura 1 e na Figura 2. Deve-se esperar que as células atriais específicas (hiPSC-ACM) tenham uma taxa de batimento espontâneo significativamente mais rápida e menor duração do potencial de ação 80 (APD80) do que as células específicas do ventrículo (hiPSC-VCM). Estes são dados eletrofisiológicos típicos para potenciais de ação registrados usando VSDs e o sistema de mapeamento óptico (Figura 3B-D).
Mapeamento óptico eletrofisiológico cardíaco de alto rendimento
O rigor científico é drasticamente aumentado para qualquer ensaio se puder ser realizado de forma de alto rendimento. Os dados de triagem de cardiotoxicidade são apresentados na Figura 4, Figura 5, Figura 6 e Figura 7, mostrando triagem eletrofisiológica de alto rendimento usando monocamadas hiPSC-CM maduras em uma placa de 96 poços. Mapas de calor de placas inteiras para parâmetros como APD80 (Figura 4A) revelam a reprodutibilidade de um determinado parâmetro dentro de uma placa de poço para poço. Além disso, os mapas de calor de placas inteiras fornecem um exame rápido de quaisquer outliers no conjunto de dados. Por exemplo, no poço E4 da placa apresentada na Figura 4A, fica claro que este poço tem um valor de APD80 muito maior, indicado pelo poço que aparece amarelo, enquanto os outros poços são índigo-azul. Os potenciais de ação típicos das monocamadas 2D hiPSC-CM maduras (Figura 4B) lembram a morfologia do potencial de ação de cardiomiócitos adultos isolados e testados em cultura. Além disso, um ritmo espontâneo típico do potencial de ação é mostrado na Figura 4C. Os dados na Figura 4C são um gráfico de espaço temporal da linha A, colunas 1-12. A linha branca ao longo do mapa da placa na Figura 4A mostra isso. Cada flash fluorescente brilhante ao longo do tempo em cada poço representa uma única ativação espontânea. A Figura 5 e a Figura 6 mostram a utilidade do uso do indicador de cálcio codificado geneticamente GCaMP6m (GECI) para medir os transientes de cálcio intracelulares; A Figura 6 também mostra a resposta esperada ao isoproterenol, o clássico inotrópico cardíaco positivo. Em resposta ao isoproterenol, a ativação dos receptores β1-adrenérgicos causa cronotropia positiva (Figura 6A), inotropia positiva (Figura 6B) e lusitropia positiva (Figura 6C). Essas respostas ao isoproterenol indicam a maturação significativa dos receptores β1-adrenérgicos hiPSC-CM e cascatas de sinalização intracelular.
Na Figura 7, a resposta do hiPSC-CM aos bloqueadores de canais humanos relacionados ao gene Ether-a-go-go (hERG) é mostrada, usando fluorescência de cálcio GCaMP6m para monitorar o ritmo e servir como marcador substituto para contratilidade. O E-4031 é um bloqueador de canal específico para hERG, que diminui a taxa de batimento espontâneo e aumenta a duração transitória do cálcio (CaTD80) e a triangulação (triangulação do CaT). A Figura 7A mostra a detecção de pós-despolarizações precoces causadas pelo bloqueio do canal HERG E-4031. Outros bloqueadores dos canais hERG, incluindo domperidona, vandetanibe e sotalol, também foram testados, e os resultados são mostrados na Figura 7E-G. Esses compostos e doses foram selecionados com base no recente estudo de validação do hiPSC-CM 1,7,9.
Figura 1: Linha do tempo para a rápida maturação de hiPSC-CMs criopreservados comercialmente disponíveis ou de outra fonte . (A) Cardiomiócitos descongelados suspensos em meio de plaqueamento são aplicados ao MECM no dia 0. No dia 2, o meio é substituído por meio de manutenção, e o meio gasto é trocado no dia 5. As células são cultivadas por mais 2 dias e, no dia 7, os sincícios maduros de hiPSC-CMs podem ser carregados com solução de gravação para aplicações a jusante ou cultivados por períodos mais longos. (B) A fase contrastada de sincícios de cardiomiócitos plaqueados na MEC de camundongos ou na MECM mostra que os cardiomiócitos plaqueados na MEC de camundongos apresentam maior circularidade em comparação aos cardiomiócitos plaqueados na MECM; além disso, a imunomarcação para TnI indica que os cardiomiócitos plaqueados na MEC de camundongos mantêm uma morfologia de simetria radial e sarcômeros desorganizados, em contraste com os hiPSC-CMs dolicomorfos e bem estruturados plaqueados na MECM. Barras de escala = 100 μm (B, superior); 50 μm (B, inferior). Abreviações: hiPSC-CMs = cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos; MEC = matriz extracelular; MECM = MEC indutora da maturação; 96wp = placa de 96 poços; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TnI = troponina I. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação da organização dos sarcômeros de hiPSC-CMs plaqueados em ECM de camundongo ou MECM. (A) Camundongos imunomarcados por cultura de ECM contra α-actinina indicam morfologia radial, com menor densidade de sarcômeros dispersos pelo cardiomiócito em contraste com hiPSC-CMs do mesmo lote plaqueados na matriz e apresentando morfologia em bastonete (20x). (60x) A observação de MC-hiPSC com microscopia confocal mostra que os MC-hiPSC cultivados em uma MEC de camundongo têm morfologia de simetria radial, com uma distribuição perimetral mais densa de sarcômeros e uma baixa densidade de sarcômeros radiais em contraste com os hiPSC-CMs do mesmo lote que foram cultivados no MECM. Apresentam uma distribuição homogênea de sarcômeros organizados ao longo do maior eixo das células. Barras de escala = 100 μm (superior); 50 μm (inferior). (B) A coloração de hiPSC-CMs cultivadas na MEC de camundongos ou MECM com um corante mitocondrial que cora mitocôndrias com alto potencial transmembrana mostra uma menor intensidade de coloração em cardiomiócitos cultivados na MEC de camundongos em comparação com a MECM. Além disso, os hiPSC-CMs cultivados na MECM têm mitocôndrias homogeneamente distribuídas nos cardiomiócitos, em contraste com as hiPSC-CMs cultivadas na MEC de camundongos que apresentam um acúmulo perinuclear de mitocôndrias. Barras de escala = 200 μm. Abreviações: hiPSC-CMs = cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos; MEC = matriz extracelular; MECM = MEC indutora da maturação; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Produção de cardiomiócitos específicos da câmara. (A) Protocolos para produção de cardiomiócitos câmara-específica compartilham manipulação idêntica da via de sinalização Wnt, com estimulação da sinalização Wnt por inibição da GSK3 do dia 0 ao 2, e a inibição dessa via entre os dias 2 e 4. A especificação da câmara é obtida com ativação da via do ácido retinóico e manipulação da sinalização Wnt entre os dias 3 e 6. (B) Como resultado da especificação da câmara, os cardiomiócitos atriais apresentam uma taxa de despolarização espontânea mais rápida em comparação aos cardiomiócitos ventriculares. (C) As MC-hiPSC ventriculares têm taxas de batimento mais lentas em comparação com as MC-hiPSC atriais; portanto, a duração do potencial de ação a 80% da repolarização é menor em hiPSC-ACMs em comparação com hiPSC-VCMs. Abreviações: hiPSC-CMs = cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos; hiPSC-ACM = cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos atriais; hiPSC-VCM = cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos ventriculares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Mapeamento óptico adquirido com um dispositivo de mapeamento óptico e analisado com Pulse. (A) Exemplo de um mapa de calor para a observação holística de parâmetros avaliados em uma placa de 96 poços após filtração de filme e determinação de regiões de interesse em placas de 96 poços, mapeados com o dispositivo de mapeamento óptico. Neste exemplo, um mapa de calor APD80% que indica um poço atípico (E4) e poços que não conseguiram produzir dados (poços H3, 4 e 5). (B) Além disso, a interface amigável permite a plotagem fácil da morfologia média do potencial de ação dos poços selecionados. (C) Ferramentas adicionais de visualização de dados estão disponíveis; neste exemplo, um gráfico de espaço-tempo gerado a partir da linha horizontal que cruza os poços na linha A (painel A) mostra a ativação em uma seção horizontal de cada poço (linha branca na linha A) durante um período de 10 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Linha do tempo para mapeamento das alterações transitórias do cálcio intracelular com um indicador de cálcio codificado geneticamente. No dia 4, após o plaqueamento dos cardiomiócitos comercialmente disponíveis em uma placa de 96 poços revestida com MECM, conforme indicado na Figura 1A, as células devem ser transduzidas com 5 MOI de vírus em meio de ensaio CM durante a noite. O meio é substituído por meio de manutenção CDI até o dia 6 e alterado para meio de manutenção CDI sem vermelho fenol entre os dias 7 e 11 para permitir o monitoramento imediato ou contínuo das mudanças transitórias de cálcio intracelular com Nautilus. (B) hiPSC-CMstransduzidos com AdGCaMP6f avaliados com mapeamento óptico nos dias 7, 9 e 10 pós-descongelamento indicam a presença de alterações de fluorescência estáveis, intracelulares mediadas por cálcio, que permitem o mapeamento óptico diário da mesma placa por longos períodos de tempo sem a necessidade de reaplicação de corantes sensíveis ao cálcio. Abreviaturas: GECI = indicador de cálcio codificado geneticamente; MC = cardiomiócitos; MOI = multiplicidade de infecção; 96wp = placa de 96 poços; BSA = albumina de soro bovino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Utilização rápida e fácil de heatmaps para comparação visual de dados adquiridos de sincícios funcionais maduros de hiPSC-CMs com Nautilus e analisados com Pulse. (A) hiPSC-CMs tratados com isoproterenol mostram um aumento na taxa de batimentos, como observado pela inspeção de mapas de calor e confirmado com o teste t pareado. (B) Da mesma forma, o mapeamento das células antes e após o tratamento com isoproterenol mostra o efeito inotrópico da estimulação β-adrenérgica por comparação visual de mapas de calor e com teste t pareado. (C) Por fim, a utilização de heatmaps para comparação visual dos dados mostra lusitropia, outro efeito canônico da estimulação β-adrenérgica, confirmado com o teste t pareado (p < 0,0001). A ausência de um círculo indica falha na aquisição/análise de dados para aquele poço específico. Abreviações: hiPSC-CMs = cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos; ISO = isoproterenol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Validação do ensaio de triagem de cardiotoxicidade do GECI usando bloqueadores do canal hERG. (A) Traços representativos do fluxo espontâneo de cálcio dos poços basais na HBSS e na presença de 500 nM E-4031. (B-D) Quantificação dos efeitos basais e +E-4031 na taxa de batimento, duração transitória de cálcio 80 (CaTD80) e triangulação de transientes de cálcio (triangulação de CaT), respectivamente. *,** denota diferença significativa; teste t não pareado; p < 0,01; n = 8 em cada grupo. (E) Detecção de ICGE de outro bloqueador do hERG, a domperidona. (F) Detecção de bloqueio hERG por GECI induzida por vandetanib. (G) Detecção de bloqueio hERG por altas doses de sotalol. Abreviaturas: GECI = indicador de cálcio codificado geneticamente; hERG = gene humano relacionado ao éter-a-go-go. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Mídias e suas composições Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Existem várias abordagens diferentes para a triagem de cardiotoxicidade in vitro usando hiPSC-CMs. Um recente artigo de "Melhores Práticas" sobre o uso de hiPSC-CMs apresentou os vários ensaios in vitro , suas leituras primárias e, principalmente, a granularidade de cada ensaio para quantificar a função eletrofisiológica cardíaca humana20. Além de usar eletrodos perfurantes de membrana, a medida mais direta da função eletrofisiológica cardíaca humana é fornecida pelas CIVs. As leituras de ensaios de VSD permitem a visualização direta e quantificação de parâmetros eletrofisiológicos críticos, incluindo duração do potencial de ação, velocidade de propagação do potencial de ação, upstroke do potencial de ação, triangulação do potencial de ação, taxa de batimento, regularidade de batimento e heterogeneidades de duração do potencial de ação. Da mesma forma, sondas sensíveis ao cálcio oferecem informações sobre o ritmo, a taxa e a duração dos eventos da monocamada hiPSC-CM. As medidas transitórias de cálcio hiPSC-CM feitas com sondas fluorescentes também fornecem informações sobre a contratilidade e a força contrátil de cada contração. Este trabalho fornece métodos para o uso de MC-hiPSC maduros (placas de 96 poços) em ensaios de medição de VSD de alto rendimento e transiente de cálcio. Além de métodos para mapeamento óptico, softwares para análise de dados EP de alto rendimento são apresentados.
Os métodos aqui delineados são um avanço significativo para os campos da triagem de cardiotoxicidade e da ciência regulatória. Aqui, apresentamos métodos para a maturação rápida e registro eletrofisiológico de monocamadas hiPSC-CM 2D em placas de triagem de alto rendimento (placas de 96 poços). A maturação rápida com MECM (7 dias) é mostrada aqui como um grande avanço em relação às abordagens anteriores, exigindo que a maturação ocorra ao longo de 30-100 dias22,23. Em comparação com outras ECMs, que requerem aplicação manual para cada experimento, as placas MECM são pré-revestidas com ECM e chegam ao laboratório prontas para uso. Esse aspecto do MECM o torna mais fácil de usar, menos variável e mais eficiente do que o uso de outros revestimentos ECM. É importante ressaltar que essa abordagem pode ser usada tanto para hiPSC-CMs criopreservados disponíveis comercialmente quanto para hiPSC-CMs "caseiros", que podem ser específicos da câmara. Devido à estrutura distinta em forma de bastonete dos hiPSC-CMs maduros (Figura 1 e Figura 2), é importante ressaltar que um número maior de células é necessário para a formação de monocamadas confluentes aqui, em comparação com protocolos que utilizam outras ECMs. Notavelmente, ao usar ECM de camundongo (as células têm um fenótipo de panqueca continuamente espalhado), nós plaqueamos 50.000 hiPSC-CMs por poço, mas ao usar MECM, nós plaqueamos 75.000 hiPSC-CMs por poço. O número de MCs por poço também pode ser reduzido se as células forem usadas para análise de célula única, como patch clamp ou qualquer outra técnica de imagem que exija células únicas.
As hiPSC-CMs disponíveis comercialmente oferecem vantagens para a ciência regulatória devido à extensa caracterização dessas células pelos esforços internacionais liderados pela Food and Drug Administration (FDA). No entanto, as células comercialmente disponíveis são uma mistura de MC-hiPSC nodal, atriais e ventriculares, que fornecem informações de toxicidade altamente relevantes, mas carecem de características específicas da câmara que mimetizam o coração humano. As hiPSC-CMs específicas da câmara recriam as diferenças eletrofisiológicas bem conhecidas entre cardiomiócitos atriais e ventriculares e fornecem um ensaio in vitro para o desenvolvimento de terapias antiarrítmicas específicas da câmara (Figura 3B-D). Por exemplo, medicamentos específicos para fibrilação atrial agora podem ser testados e desenvolvidos usando monocamadas hiPSC-ACM plaqueadas em placas de 96 poços para coleta de dados robusta e rigorosa. Da mesma forma, ao rastrear se um composto causa Torsades de Pointes (TdP), uma arritmia ventricular de alto risco, o ideal é não ter células atriais e nodais "contaminando" as monocamadas cardíacas ventriculares. Portanto, embora os esforços de validação hiPSC-CM liderados pela FDA até o momento tenham se concentrado no uso de MCs comercialmente disponíveis, é provável que futuras recomendações científicas regulatórias se voltem para o uso de células específicas da câmara para tornar a triagem de toxicidade ainda mais preditiva da condição cardíaca humana. Os métodos aqui descritos são baseados em relatos prévios e fornecem uma abordagem robusta para a geração de cardiomiócitos de câmara específica derivados de células-troncopluripotentes21.
Uma grande diferença entre esses protocolos e aqueles normalmente usados no campo é a abordagem de purificação usada. A maioria dos laboratórios que geram hiPSC-CMs em seus próprios laboratórios depende da seleção de cardiomiócitos mediada por metabólicos22. Aqui, contamos com o uso de MACS para purificar hiPSC-CMs, usando uma abordagem de processamento celular clinicamente aprovada que produz MCs com fenótipos mais saudáveis23. A abordagem do desafio metabólico é eficaz, mas utiliza uma formulação média que simula isquemia miocárdica24. Ao utilizar a purificação MACS de hiPSC-CMs, é importante utilizar o coquetel de depleção não-CM, que tem como alvo não-CMs para depleção magnética da população celular. O uso da abordagem de depleção não-CM minimiza a tensão de cisalhamento que os MCs experimentam na coluna magnética, e é preferido em relação à marcação magnética direta da população de CM. O uso da purificação MACS de células específicas da câmara permitirá que outros laboratórios gerem CMs saudáveis para pesquisa e testes de toxicidade.
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Disclosures
TJH é consultor e conselheiro científico da StemBioSys, Inc.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH HL148068-04 e R44ES027703-02 (TJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
- Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
- Strauss, D. G., Blinova, K.
- Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
- Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
- da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
- Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
- Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).
