Summary
Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) bieden een alternatief voor het gebruik van dieren voor preklinische cardiotoxiciteitsscreening. Een beperking voor de wijdverbreide toepassing van hiPSC-CMs in preklinische toxiciteitsscreening is het onrijpe, foetale fenotype van de cellen. Hier worden protocollen gepresenteerd voor robuuste en snelle rijping van hiPSC-CMs.
Abstract
Door de mens geïnduceerde van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) worden gebruikt om de afhankelijkheid van dieren en dierlijke cellen te vervangen en te verminderen voor preklinische cardiotoxiciteitstests. In tweedimensionale monolaagformaten recapituleren hiPSC-CMs de structuur en functie van de volwassen menselijke hartspiercellen wanneer ze worden gekweekt op een optimale extracellulaire matrix (ECM). Een van menselijke perinatale stamcellen afgeleide ECM (rijpingsinducerende extracellulaire matrix-MECM) rijpt de hiPSC-CM-structuur, functie en metabole toestand in 7 dagen na plating.
Volwassen hiPSC-CM monolayers reageren ook zoals verwacht op klinisch relevante medicijnen, met een bekend risico op het veroorzaken van aritmieën en cardiotoxiciteit. De rijping van hiPSC-CM monolagen was tot nu toe een obstakel voor de wijdverspreide acceptatie van deze waardevolle cellen voor regelgevende wetenschap en veiligheidsscreening. Dit artikel presenteert gevalideerde methoden voor de plating, rijping en high-throughput, functionele fenotypering van hiPSC-CM elektrofysiologische en contractiele functie. Deze methoden zijn van toepassing op in de handel verkrijgbare gezuiverde cardiomyocyten, evenals van stamcellen afgeleide cardiomyocyten die intern worden gegenereerd met behulp van zeer efficiënte, kamerspecifieke differentiatieprotocollen.
De elektrofysiologische functie met hoge doorvoer wordt gemeten met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD's; emissie: 488 nm), calciumgevoelige fluoroforen (CSF's) of genetisch gecodeerde calciumsensoren (GCaMP6). Een high-throughput optisch mappingapparaat wordt gebruikt voor optische opnames van elke functionele parameter en aangepaste speciale software wordt gebruikt voor elektrofysiologische gegevensanalyse. MECM-protocollen worden toegepast voor medicatiescreening met behulp van een positieve inotroop (isoprenaline) en humane Ether-a-go-go-related gene (hERG) kanaalspecifieke blokkers. Deze middelen zullen andere onderzoekers in staat stellen om met succes volwassen hiPSC-CMs te gebruiken voor high-throughput, preklinische cardiotoxiciteitsscreening, hartmedicatie-werkzaamheidstests en cardiovasculair onderzoek.
Introduction
Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn op internationale schaal gevalideerd en zijn beschikbaar voor in vitro cardiotoxiciteitsscreening1. Zeer zuivere hiPSC-CM's kunnen in vrijwel onbeperkte aantallen worden gegenereerd, gecryopreserveerd en ontdooid. Bij het replateren reanimeren ze ook en beginnen ze samen te trekken met een ritme dat doet denken aan het menselijk hart 2,3. Opmerkelijk is dat individuele hiPSC-CM's aan elkaar koppelen en functionele syncytia vormen die als een enkel weefsel kloppen. Tegenwoordig worden hiPSC's routinematig afgeleid van bloedmonsters van patiënten, zodat elke persoon kan worden weergegeven met behulp van in vitro hiPSC-CM cardiotoxiciteitsscreeningstests 4,5. Dit creëert de mogelijkheid om "Clinical Trials in a Dish" uit te voeren, met een significante vertegenwoordiging uit diverse populaties6.
Een cruciaal voordeel ten opzichte van bestaande benaderingen voor cardiotoxiciteit bij dieren en dierlijke cellen is dat hiPSC-CMs het volledige menselijke genoom gebruiken en een in vitro systeem bieden met genetische overeenkomsten met het menselijk hart. Dit is vooral aantrekkelijk voor farmacogenomica en gepersonaliseerde geneeskunde - het gebruik van hiPSC-CMs voor medicatie en andere therapieontwikkeling zal naar verwachting nauwkeurigere, nauwkeurigere en veiligere medicatievoorschriften opleveren. Inderdaad, tweedimensionale (2D) hiPSC-CM monolayer assays hebben bewezen voorspellend te zijn voor medicatie cardiotoxiciteit, met behulp van een panel van klinisch gebruikte medicijnen met een bekend risico op het veroorzaken van aritmieën 1,7,8,9. Ondanks het enorme potentieel van hiPSC-CMs en de belofte om de ontwikkeling van geneesmiddelen te stroomlijnen en goedkoper te maken, is er een terughoudendheid geweest om deze nieuwe assays10,11,12 te gebruiken.
Tot nu toe is een belangrijke beperking van wijdverspreide acceptatie en acceptatie van hiPSC-CM-screeningstests hun onvolwassen, foetale uiterlijk, evenals hun functie. De kritieke kwestie van hiPSC-CM rijping is besproken en besproken in de wetenschappelijke literatuur ad nauseum13,14,15,16. Evenzo zijn veel benaderingen gebruikt om hiPSC-CM-rijping te bevorderen, waaronder extracellulaire matrix (ECM) manipulaties in 2D-monolagen en de ontwikkeling van 3D-gemanipuleerde hartweefsels (EHT's)17,18. Op dit moment is er een wijdverbreide overtuiging dat het gebruik van 3D EHT's een superieure rijping zal bieden ten opzichte van 2D monolayer-gebaseerde benaderingen. 2D-monolagen bieden echter een hogere efficiëntie van celgebruik en meer succes bij het plateren in vergelijking met 3D-EHT's; 3D EHT's gebruiken grotere aantallen cellen en vereisen vaak de opname van andere celtypen die de resultaten kunnen verstoren. Daarom ligt de focus in dit artikel op het gebruik van een eenvoudige methode om hiPSC-CMs te rijpen die zijn gekweekt als 2D-monolagen van elektrisch en mechanisch gekoppelde cellen.
Geavanceerde hiPSC-CM rijping kan worden bereikt in 2D monolagen met behulp van een ECM. De 2D-monolagen van hiPSC-CMs kunnen worden gerijpt met behulp van een zachte, flexibele polydimethylsiloxaan coverslip, bedekt met keldermembraanmatrix afgescheiden door een Engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoomcel (muis-ECM). In 2016 toonden rapporten aan dat hiPSC-CMs gekweekt op deze zachte ECM-conditie functioneel volwassen werden, met actiepotentiaalgeleidingssnelheden in de buurt van volwassen hartwaarden (~ 50 cm / s)18. Verder vertoonden deze volwassen hiPSC-CM's vele andere elektrofysiologische kenmerken die doen denken aan het volwassen hart, waaronder hyperpolariseerde rustmembraanpotentiaal en expressie van Kir2.1. Meer recent identificeerden rapporten een van menselijke perinatale stamcellen afgeleide ECM-coating die de structurele rijping van 2D hiPSC-CMsbevordert 19. Hier worden eenvoudig te gebruiken methoden gepresenteerd om structureel volwassen 2D hiPSC-CM monolagen te ontwikkelen voor gebruik in elektrofysiologische schermen met hoge doorvoer. Verder bieden we validatie van een optisch mapping-instrument voor de geautomatiseerde acquisitie en analyse van 2D hiPSC-CM monolayer elektrofysiologische functie, met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD's) en calciumgevoelige sondes en eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hiPSC-gebruik in dit protocol is goedgekeurd door de HPSCRO-commissie van de Universiteit van Michigan (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Zie de Tabel met materialen voor een lijst met materialen en apparatuur. Zie tabel 1 voor de media en hun samenstellingen.
1. Ontdooien en plateren van in de handel verkrijgbare gecryopreserveerde hiPSC-CMs voor rijping op een rijpingsinducerende extracellulaire matrix (MECM)
- Verwarm alle reagentia tot kamertemperatuur en rehydrateer de MECM-platen met Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die calcium en magnesium bevat, gedurende 1 uur voorafgaand aan cardiomyocytenplating (200 μL buffer per put van een plaat met 96 putten).
- Was de MECM-platen 2x met HBSS of PBS met calcium en magnesium gedurende 1 uur voorafgaand aan cardiomyocytenplating (200 μL buffer per put van een 96-putplaat) en houd de putjes gehydrateerd.
- Bereid een waterbad van 37 °C voor.
- Verwijder de cardiomyocytenbuizen uit de tank met vloeibare stikstof, breng de buizen over naar droogijs en open de buisdoppen enigszins om de druk te verminderen.
OPMERKING: Het loslaten van druk in de buizen is uiterst belangrijk! Als er te veel druk in de buizen ontstaat, kunnen ze exploderen. - Sluit de buisdoppen opnieuw en plaats ze in het waterbad om 4 minuten te ontdooien.
OPMERKING: Laat ze volledig ontdooien, om celbeschadiging als gevolg van gedeeltelijke ontdooiing te voorkomen. - Nadat de cellen zijn ontdooid, spuit u de buizen met 70% ethanol voordat u ze opent. Breng de cellen over in conische buisjes van 15 ml met een pipet van 1 ml. Druppel langzaam 8 ml platingmedium, waarbij de buis wordt geroerd telkens wanneer 1 ml wordt toegevoegd, zodat de cellen zich kunnen aanpassen aan veranderingen in osmolariteit.
- Was de cryovial met 1 ml beplatingsmedium met behulp van een glazen pipet van 1 ml. Druppel vervolgens de was langzaam in de conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer de buizen op ~300 × g gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 1 ml platingmedium. Verwijder een aliquot en voer live celtelling uit met een hemocytometer. Voeg extra beplatingsmedium toe om 7,5 × 105 cellen/ml te verkrijgen.
OPMERKING: Ongeveer 10 ml celsuspensie is vereist om 96 putten te bereiden. - Doseer 100 μL celsuspensie per put van een MECM-gecoate 96-well plaat met behulp van een meerkanaals pipet.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u celprecipitatie vermijdt en een uniforme celdichtheid in alle putten verkrijgt tijdens het plateren. - Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO 2 gedurende2 dagen voordat het medium wordt omgezet in onderhoudsmedium (200 μL/put). Vervang het onderhoudsmedium op dag 5 na het ontdooien. Voer EP-assays uit op dag 7 of later, zoals eerder beschreven 8,9. Verander het medium om de dag wanneer u kiest voor verlenging van de celkweek.
2. hiPSC cardiale differentiatie en hiPSC-CM zuivering
- Warme 1x in de handel verkrijgbare ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) oplossing, HBSS zonder calcium en magnesium (HBSS--), en 6-well platen bedekt met opgeloste keldermembraanmatrix uitgescheiden door een Engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoomcel (muis-ECM) tot kamertemperatuur.
- Markeer de gedifferentieerde kolonies door fasecontrastmicroscopie en aspiraat/ablaat. Was elk goed met 1 ml HBSS--. Voer twee wasbeurten uit in putten met >10 differentiatieplekken.
- Zuig de HBSS aan - en voeg 1 ml EDTA-oplossing toe aan elke put. Incubeer de platen gedurende maximaal 5 minuten bij 37 °C. Controleer de platen na 3 minuten en zoek naar doorschijnende witte, zichtbare kolonies.
- Zuig de EDTA-oplossing aan en voeg 1 ml toe aan een enkele put. Maak de cellen los met 2 ml hiPSC-medium door de suspensie herhaaldelijk op en neer te pipetteren, met behulp van een glazen pipet van 10 ml om alle stamcellen uit de put los te maken en de celsuspensie over te brengen naar een verzamelbuis. Herhaal de aspiratie en ontwrichting met volgende putten.
OPMERKING: Maak moeilijk op te tillen kolonies los met de punt van de glazen pipet. - Tel de stamcellen en stel het volume in op plaat 8,0 × 105 cellen/put. Kweek de cellen op hiPSC-medium (2 ml / put) totdat de stamcellen 90% samenvloeiing bereiken (deze keer wordt dit vanaf nu D0 genoemd).
- Bereid 2 ml basaal differentiatiemedium aangevuld met 4 μM CHIR99021.
- Was op D0 elke put van een 6-putplaat met stamcellen met 1 ml HBSS per put. Vervang de HBSS door basaal differentiatiemedium aangevuld met 4 μM CHIR99021.
- Op D1, niets doen.
- Bereid op D2 basaal differentiatiemedium aangevuld met 4 μM IWP4.
- Vervang het medium door 2 ml IWP4-aangevuld basaal differentiatiemedium per put.
- Doe op D3 niets voor een ventriculaire-specifieke differentiatie. Voor een atriale specifieke differentiatie, zuig het medium en voeg 2 ml basaal medium aangevuld met 4 μM IWP4 en 1 μM retinoïnezuur (RA) oplossing per putje toe.
- Op D4, zuig het medium op en voeg 2 ml basaal medium per put toe voor ventriculaire differentiatie. Voor een atriale differentiatie, zuig het medium en voeg 2 ml basaal medium aangevuld met 1 μM RA-oplossing per put toe.
- Op D5 niets doen.
- Zuig op D6 het medium aan en voeg 2 ml basaal medium per put toe (voor zowel atriale als ventriculaire differentiatie).
- Op D7, niets doen.
- Zuig op D8 het medium aan en voeg 2 ml cardiomyocytenonderhoudsmedium toe. Verander het medium om de dag tot de celscheiding of volg een plan voor blootstelling aan chronische geneesmiddelen.
3. hiPSC-CM zuivering via MACS (magnetisch-geactiveerde celsortering)
- Zuig het celkweekmedium aan en was elk goed met 1 ml HBSS--. Dissocieer de cellen door 1 ml 0,25% trypsine/EDTA toe te voegen en te incuberen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 10 minuten. Resuspendeer en singulariseer de cellen in elke put met 2 ml platingmedium om de trypsine / EDTA te inactiveren.
- Verzamel de cellen uit de zes putjes in een conische buis van 50 ml met een zeef van 70 μm. Was vervolgens de zeef met 3 ml platingmedium. Tel de cellen.
- Centrifugeer de suspensie op ~300 × g gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant op en was de cellen met 20 ml ijskoude MACS-scheidingsbuffer. Centrifugeer vervolgens opnieuw op ~ 300 × g gedurende 5 minuten.
- Resuspendeerde de pellet in 80 μL koude MACS-scheidingsbuffer per 5 × 106 cellen. Voeg 20 μL koude niet-cardiomyocytendepletiecocktail (menselijk) toe per 5 × 106 cellen. Meng de celsuspensie voorzichtig en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
- Was het monster door 4 ml koude MACS-scheidingsbuffer per 5 × 106 cellen toe te voegen. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten op ~300 × g en zuig het supernatant op.
- Resuspendeerde de pellet in 80 μL koude MACS-scheidingsbuffer per 5 × 106 cellen. Voeg 20 μL koude anti-biotine microbeads per 5 × 106 cellen toe. Meng de celsuspensie voorzichtig en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
- Terwijl de monsters aan het broeden zijn, plaatst u de positieve depletiekolommen (uitgerust met de 30 μm voorscheidingsfilters) op de MACS-separator en plaatst u de gelabelde 15 ml opvangbuizen onder de kolommen. Voor elke 5 × 106 cellen is één kolom nodig.
- Primeer elke kolom met 3 ml koude MACS-scheidingsbuffer. Meng de met antilichamen behandelde celsuspensie met 2 ml MACS-scheidingsbuffer per 5 × 106 cellen en voeg toe aan de kolom.
LET OP: Niet centrifugeren! Centrifugatie bij deze stap heeft nadelige effecten op de cardiomyocytenopbrengst. - Voeg 2 ml MACS-scheidingsbuffer toe aan elke kolom en verzamel de doorstroming totdat 12 ml doorstroomde cardiomyocytensuspensie is verzameld.
OPMERKING: Laat de kolommen nooit volledig drogen. - Centrifugeer de cardiomyocyten op ~ 300 × g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en suspensie de cardiomyocyten in 1 ml platingmedium.
- Tel de cellen om de concentratie te bepalen, pas het volume aan de gewenste zaaidichtheid aan en plaats de cellen. Plaats de gezuiverde cardiomyocyten op de MECM 96-putplaten, zoals hierboven beschreven in stappen 1.9-1.11 (7.5 × 105 cellen/put).
4. Optische mapping met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD's) en calciumgevoelige fluoroforen (CSF's)
- Bereid de juiste hoeveelheid VSD in HBSS met calcium en magnesium, door 1 μL VSD-kleurstof per ml HBSS en 10 μL laadadjuvans per ml HBSS toe te voegen.
OPMERKING: Doorgaans vereist een plaat met 96 putten 10 ml VSD-oplossing. - Als alternatief, bereid HBSS met calcium en magnesium aangevuld met 5 μM van CSF. Zuig het onderhoudsmedium voor cardiomyocyten aan en vervang het door 100 μL VSD of CSF per putje van een plaat met 96 putten. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten in de celkweekincubator.
- Verwijder de kleurstoffen en vervang deze door assay medium of HBSS. Evenwicht bij 37 °C voor de verwerving van optische mapping van basisgegevens met een optische mappingapparaat met hoge doorvoer.
- Behandel de cellen met medicijnen voor acute blootstellingstests, of breng de cellen in kaart die chronisch werden blootgesteld aan geneesmiddelen van belang.
- Gebruik voor cardiotoxiciteitstests in 96-putplaten vier doses van een verbinding met ten minste zes putjes per dosis. Gebruik doses variërend van onder tot boven de effectieve therapeutische plasmaconcentratie, inclusief een dosis van de klinisch effectieve therapeutische plasmaconcentratie.
- Verdun de geneesmiddelen in dimethylsulfoxide, bewaar ze als stamoplossingen bij -20 °C en verdun ze vervolgens in HBSS tot de gewenste concentraties.
- Voer basislijnelektrofysiologische metingen uit voorafgaand aan de toediening van het geneesmiddel, zoals beschreven in rubriek 5. Zodra de medicijnen zijn toegepast, maakt u ten minste 30 minuten later elektrofysiologische opnames voor chronische onderzoeken. Zie de volgende secties voor procedures voor het verzamelen en analyseren van optische mappinggegevens.
5. Optische mapping met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI)
- Plaat in de handel verkrijgbaar of MACS-gezuiverde hiPSC-CMs, zoals hierboven beschreven, met behulp van MECM-gecoate 96-well platen om volwassen hiPSC-CMs te maken. Om confluente monolagen te vormen, plaat 7,5 × 104 CMs per put van elke 96-well plaat. Gebruik plating medium.
- Schakel na 48 uur in platingmedium over op onderhoudsmedium voor cardiomyocyten.
- Voeg op dag 4 na het ontdooien en opnieuw plateren recombinant adenovirus voor het tot expressie brengen van GCaMP6m (AdGCaMP6m) toe aan cellen met een multipliciteit van infectie (MOI) = 5. Voeg het virus toe met behulp van CM-testmedium.
OPMERKING: Hier werden experimenten met GCaMP6m uitgevoerd in iCell2 cardiomyocyten van een commerciële leverancier. - Verwijder op dag 5 het adGCaMP6m-medium en vervang het door vers RPMI+B27 (onderhoudsmedium voor cardiomyocyten).
- Observeer op dag 7 de CMs met behulp van microscopie of de optische mapping imager, om spontane contracties en bijbehorende calciumtransiënten te visualiseren.
- Op dag 7 of later, voor medicatiescreening, brengt u 96-putplaten van volwassen hiPSC-CM-monolagen die GCaMP6m tot expressie brengen rechtstreeks over naar de optische mapping-imager van de incubator voor baselinegegevensverzameling.
- Na het verzamelen van elektrofysiologische gegevens, retourneert u de platen van de CM's naar de weefselkweekincubator voor metingen op een volgend tijdstip.
- Na basislijnopnamen, breng de medicijnen aan, met behulp van ten minste vier doses van elk medicijn en ten minste zes putten per dosis. Breng de medicijnen op de cellen in evenwicht gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Verwarm de puttemperatuur tot ~37 °C voor en tijdens het verzamelen van gegevens.
- Voeg na basislijnopnamen van een hele plaat isoproterenol (500 nM) toe aan elke put om robuuste medicijnresponsgegevens mogelijk te maken. Kwantificeer de effecten van isoproterenol op de monolayer beat rate, contractie amplitude (calcium transient amplitude) en calcium transient duration (zie figuur 6), zoals beschreven in rubriek 5.
6. Verwerving van optische kaartgegevens en analyse
- Zorg ervoor dat de camera van het optische mappingapparaat, de transilluminator en de plaatverwarming zijn ingeschakeld.
- Open de acquisitiesoftware en bepaal de locatie voor het opslaan van bestanden.
- Open de voorste lade en plaats de plaat op de plaatverwarming.
- Verkrijg een donker frame door op de knop Dark Frame te klikken.
- Selecteer Duur (10-30 s) en Framesnelheid van acquisitie (bijvoorbeeld 100 fps; 250 fps voor hogere tijdelijke resolutie) en klik op Acquisitie starten.
- Open de analysesoftware en selecteer op het tabblad Importeren/filteren de optie Bladeren naar één bestand of Meerdere naast elkaar plaatsen om een plaat te reconstrueren.
- Selecteer Parametermodus (APD of CaTD), voer Afstand per pixel in en gebruik de wizard Put om de locatie van de putten in de afbeelding te bepalen. Klik op Opslaan verwerken om naar het volgende tabblad te gaan.
- Open het tabblad ROI's (interessegebieden) en kies ervoor om de ROI's handmatig, automatisch of helemaal niet te gebruiken, waardoor de hele put voor analyse wordt overwogen. Nadat de ROI's zijn geselecteerd, klikt u op de knop Verwerken/Opslaan om naar de volgende stap te gaan. Vink de vakjes Putten verbergen en Alleen gefilterd weergeven aan om de ROI's te visualiseren.
- Open het tabblad Analyse en selecteer in de rechterbovenhoek van het scherm elke put of ROI om de nauwkeurigheid van automatische beatdetectie te bevestigen. Beats toevoegen aan of verwijderen uit de traceringen door op Add Beat/Save Beats te drukken of door een Individual Beat te selecteren en op Delete op het toetsenbord te drukken.
- Gebruik desgewenst de functie Gemiddelde heatmaps om heatmaps te maken van geselecteerde parameters voor de plaat.
- Klik op de knop Time-Space Plot op het tabblad Analyse om gegevens voor elke put of de ROI te visualiseren. Nadat u hebt gecontroleerd of de beatdetectie nauwkeurig is, gaat u naar het tabblad Exporteren en selecteert u Bestandsindeling. Druk op Exporteren en maak een map voor de gegevens waarnaar de gegevens moeten worden geëxporteerd. Ga verder met het openen van gegevensbestanden en voer de gekozen statistische analyseroutine uit.
OPMERKING: .xlxs-bestanden hebben de voorkeur omdat alle parameters in één bestand worden geëxporteerd; Andere indelingen (.csv of .tsv) genereren één bestand per parameter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
hiPSC-CM rijping gekenmerkt door fasecontrast en immunofluorescente confocale beeldvorming
De tijdlijn voor ECM-gemedieerde rijping van in de handel verkrijgbare hiPSC-CM's met behulp van MECM-gecoate 96-putplaten is weergegeven in figuur 1A. Deze gegevens worden verzameld met behulp van in de handel verkrijgbare cardiomyocyten die in het laboratorium aankomen als gecryopreserveerde injectieflacons met cellen. Elke injectieflacon bevat >5 × 106 levensvatbare cardiomyocyten. De cellen zijn ~ 98% zuiver en grondig getest voor kwaliteitscontrole (analysecertificaat wordt bij elke injectieflacon geleverd). Het grote aantal CM's maakt het mogelijk om de CM's te ontdooien en te plateren op verschillende ECM-combinaties met behulp van dezelfde batch cellen. In figuur 1 zijn hiPSC-CMs geplateerd op muis-ECM- of MECM-gecoate platen. De hiPSC-CM's die op de MECM zijn geplateerd, rijpen en worden structureel verschillend van dezelfde partij hiPSC-CM's die opnieuw op de muis-ECU zijn geplaatst. Rijpe cellen worden namelijk staafvormig, terwijl onrijpe cellen een cirkelvorm behouden. Dit is te zien in fasecontrastbeeldvorming en bij kleuring van de cardiale myofilamenten (figuur 1B; troponine I [TnI], rood). Een uitgebreidere validatie van de structurele rijping van hiPSC-CMs is weergegeven in figuur 2. Een groot gezichtsveld (20x objectief) van CMs gekleurd met α-actinine antilichaam toont de typische vorm van de cellen gekweekt op elke ECM-conditie. α-actinine is een kritisch structureel eiwit gerangschikt met regelmatige afstand in de cardiale myofilamenten. In overeenstemming met de TnI-kleuring in figuur 1 duidt de α-actininekleuring verder op de rijping van hiPSC-CM's gekweekt op de MECM. Naast het bevorderen van een staafvormig volwassen fenotype, induceert de MECM ook een grotere sarcomeerorganisatie (60x afbeeldingen). Mitochondriale inhoud en activiteit zijn ook verschillend tussen cellen gekweekt op de muis-ECU en de MECM (figuur 2B). Foetaal-onrijpe hiPSC-CM mitochondriale inhoud is beperkt tot de perinucleaire ruimte, met weinig mitochondriën die in het cytosol worden gevonden. Daarentegen is volwassen hiPSC-CMs mitochondriale inhoud verdeeld over de cel. Mitochondriale beoordeling maakt gebruik van een vastgesteld protocol19.
hiPSC cardiale differentiatie en hartkamerspecificatie
Hier is een protocol voor de interne productie en rijping van gezuiverde, kamerspecifieke hiPSC-CMs (figuur 3A). Dit is gebaseerd op een eerder gepubliceerd rapport20. Gepresenteerd zijn gedetailleerde procedures voor hiPSC-CM zuivering met behulp van een in de handel verkrijgbare, magneet-geactiveerde celsortering (MACS) kit. We hebben onlangs het gebruik van MACS-zuivering gevalideerd en de voordelen van het gebruik van MACS aangetoond in vergelijking met metabole hiPSC-CM-zuivering; typisch, hiPSC-CM zuiverheid boven 95% wordt verwacht21. Het is belangrijk om erop te wijzen dat als het initiële CM-gehalte <50% is, MACS-zuivering slechts ~ 85% kan bereiken. In deze gevallen kan CM-verrijking nodig zijn na de uitputting van niet-CM's. Als het initiële CM-gehalte van differentiatie >50% is, kan uitputting van niet-CM's uit de celpopulatie met behulp van de MACS-kit een zuiverheid >95% bereiken; in dit geval is verdere verrijking of positieve selectie van CM's niet nodig. De kamerspecifieke hiPSC-CM's kunnen ook worden gerijpt met behulp van MECM-gecoate 96-putplaten, zoals hierboven beschreven en weergegeven in figuur 1 en figuur 2. Verwacht mag worden dat de atriale-specifieke cellen (hiPSC-ACM) een significant snellere spontane slagsnelheid en kortere actiepotentiaalduur 80 (APD80) hebben dan de ventriculaire-specifieke cellen (hiPSC-VCM). Dit zijn typische elektrofysiologische gegevens voor actiepotentialen die zijn geregistreerd met behulp van VSD's en het optische mappingsysteem (figuur 3B-D).
High-throughput cardiale elektrofysiologische optische mapping
Wetenschappelijke nauwkeurigheid wordt drastisch verhoogd voor elke test als deze op een high-throughput manier kan worden uitgevoerd. Cardiotoxiciteitsscreeningsgegevens worden weergegeven in figuur 4, figuur 5, figuur 6 en figuur 7, met elektrofysiologische screening met hoge doorvoer met behulp van volwassen hiPSC-CM-monolagen in een 96-putplaat. Heatmaps voor hele platen voor parameters zoals APD80 (figuur 4A) onthullen de reproduceerbaarheid van een bepaalde parameter binnen een plaat van put tot put. Verder bieden heatmaps voor de hele plaat een snel onderzoek van eventuele uitschieters in de dataset. In put E4 van de plaat in figuur 4A is het bijvoorbeeld duidelijk dat deze put een veel grotere APD80-waarde heeft, aangegeven door het goed dat geel lijkt, terwijl de andere putten indigoblauw zijn. Typische actiepotentialen van volwassen 2D hiPSC-CM monolagen (figuur 4B) doen denken aan de actiepotentiaalmorfologie van volwassen cardiomyocyten geïsoleerd en getest in cultuur. Bovendien wordt een typisch actiepotentiaal spontaan ritme weergegeven in figuur 4C. De gegevens in figuur 4C zijn een tijd-ruimteplot van rij A, kolommen 1-12. De witte lijn over de plaatkaart in figuur 4A geeft dit weer. Elke heldere fluorescerende flits in de loop van de tijd in elke put vertegenwoordigt een enkele spontane activering. Figuur 5 en figuur 6 tonen het nut van het gebruik van GCaMP6m genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) om intracellulaire calciumtransiënten te meten; Figuur 6 toont ook de verwachte respons op isoproterenol-de klassieke cardiale positieve inotroop. Als reactie op isoproterenol veroorzaakt activering van de β1-adrenerge receptoren positieve chronotropie (figuur 6A), positieve inotropie (figuur 6B) en positieve lusitropie (figuur 6C). Deze reacties op isoproterenol wijzen op de significante rijping van hiPSC-CM β1-adrenerge receptoren en intracellulaire signaalcascades.
In figuur 7 wordt hiPSC-CM-respons op humane Ether-a-go-go-related gene (hERG) kanaalblokkers getoond, waarbij GCaMP6m calciumfluorescentie wordt gebruikt om het ritme te controleren en te dienen als een surrogaatmarker voor contractiliteit. E-4031 is een hERG-specifieke kanaalblokker, die de spontane slagsnelheid vertraagt en de calciumtransiënte duur (CaTD80) en triangulatie (CaT-triangulatie) verhoogt. Figuur 7A toont de detectie van vroege na-depolarisaties veroorzaakt door de E-4031 hERG kanaalblokkade. Andere hERG-kanaalblokkers, waaronder domperidon, vandetanib en sotalol, werden ook getest en de resultaten worden weergegeven in figuur 7E-G. Deze verbindingen en doses werden geselecteerd op basis van de recente hiPSC-CM validatiestudie 1,7,9.
Figuur 1: Tijdlijn voor snelle rijping van in de handel verkrijgbare of andere bron gecryopreserveerde hiPSC-CM's . (A) Ontdooide cardiomyocyten gesuspendeerd in platingmedium worden op dag 0 op de MECM aangebracht. Op dag 2 wordt het medium vervangen door onderhoudsmedium en op dag 5 wordt het gebruikte medium vervangen. Cellen worden nog eens 2 dagen gekweekt en op dag 7 kan de rijpe syncytia van hiPSC-CMs worden geladen met opnameoplossing voor downstream-toepassingen of gedurende langere perioden worden gekweekt. (B) De contrastfase van syncytie van cardiomyocyten die op de muis-ECM of de MECM zijn geplateerd, toont aan dat cardiomyocyten die op de muis-ECM zijn geplateerd, een grotere circulariteit hebben in vergelijking met cardiomyocyten die op de MECM zijn geplateerd; bovendien geeft immunostaining voor TnI aan dat cardiomyocyten die op de muis-ECM zijn geplateerd een radiale symmetriemorfologie en ongeorganiseerde sarcomeren behouden in tegenstelling tot dolichomorfe en goed gestructureerde hiPSC-CMs die op de MECM zijn geplateerd. Schaalbalken = 100 μm (B, boven); 50 μm (B, lager). Afkortingen: hiPSC-CMs = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten; ECM = extracellulaire matrix; MECM = rijpings-inducerende ECM; 96wp = 96-well plaat; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; TnI = troponine I. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van sarcomeerorganisatie van hiPSC-CMs geplateerd op een muis-ECM of een MECM. (A) Muis ECM-gekweekte hiPSC-CMs immunogekleurd tegen α-actinine duiden op radiale morfologie, met een lagere dichtheid van sarcomeren verspreid door de cardiomyocyt in tegenstelling tot hiPSC-CMs uit dezelfde batch die op de matrix zijn geplateerd en staafvormige morfologie vertonen (20x). (60x) Observatie van hiPSC-CM's met confocale microscopie toont aan dat hiPSC-CM's gekweekt op een muis-ECM radiale symmetriemorfologie hebben, met een dichtere perimetrale verdeling van sarcomeren en een lage dichtheid van radiale sarcomeren in tegenstelling tot hiPSC-CM's uit dezelfde batch die op het MECM werden gekweekt. Ze presenteren een homogene verdeling van sarcomeren georganiseerd langs de langere as van de cellen. Schaalbalken = 100 μm (boven); 50 μm (lager). (B) Kleuring van hiPSC-CMs gekweekt op de muis-ECM of de MECM met een mitochondriale kleurstof die mitochondriën kleurt met een hoog transmembraanpotentiaal vertoont een lagere intensiteit van kleuring in cardiomyocyten gekweekt op de muis-ECM in vergelijking met de MECM. Bovendien hebben hiPSC-CM's gekweekt op de MECM mitochondriën homogeen verdeeld in de cardiomyocyten, in tegenstelling tot hiPSC-CMs gekweekt op de muis-ECM die een perinucleaire accumulatie van mitochondriën vertonen. Schaalstaven = 200 μm. Afkortingen: hiPSC-CMs = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten; ECM = extracellulaire matrix; MECM = rijpings-inducerende ECM; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Productie van kamerspecifieke cardiomyocyten. (A) Protocollen voor de productie van kamerspecifieke cardiomyocyten delen identieke Wnt-signaleringsroutemanipulatie, met thr-stimulatie van Wnt-signalering door remming van GSK3 van dag 0 tot 2, en de remming van deze route tussen dag 2 en 4. Kamerspecificatie wordt bereikt met activering van de retinoïnezuurroute en Wnt-signaleringsmanipulatie tussen dag 3 en 6. (B) Als gevolg van kamerspecificatie vertonen atriale cardiomyocyten een snellere snelheid van spontane depolarisatie in vergelijking met ventriculaire cardiomyocyten. (C) Ventriculaire hiPSC-CMs hebben langzamere slagsnelheden in vergelijking met atriale hiPSC-CMs; daarom is de actiepotentiaalduur bij 80% van de repolarisatie korter in hiPSC-ACM's in vergelijking met hiPSC-VCM's. Afkortingen: hiPSC-CMs = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten; hiPSC-ACM = atriale door de mens geïnduceerde pluripotente cardiomyocyten die van stamcellen zijn afgeleid; hiPSC-VCM = ventriculaire door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Optische mapping verkregen met een optisch mapping apparaat en geanalyseerd met Pulse. (A) Voorbeeld van een heatmap voor de holistische observatie van parameters beoordeeld in een 96-well plaat na filmfiltratie en bepaling van gebieden van belang in 96-well platen, in kaart gebracht met het optische mapping apparaat. In dit voorbeeld een APD80% heatmap die een uitschieter (E4) aangeeft en putten die geen gegevens hebben geproduceerd (putten H3, 4 en 5). (B) Bovendien maakt de gebruiksvriendelijke interface het eenvoudig om de gemiddelde actiepotentiaalmorfologie van de geselecteerde putten te plotten. (C) Er zijn aanvullende hulpmiddelen voor gegevensvisualisatie beschikbaar; in dit voorbeeld toont een tijd-ruimteplot die wordt gegenereerd uit de horizontale lijn die de putten op rij A (paneel A) kruist, activering over een horizontale sectie van elke put (witte lijn over rij A) over een periode van 10 s. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Tijdlijn voor het in kaart brengen van intracellulaire calcium voorbijgaande veranderingen met een genetisch gecodeerde calciumindicator. Op dag 4 na het plateren van in de handel verkrijgbare cardiomyocyten in een MECM-gecoate 96-well plaat, zoals aangegeven in figuur 1A, moeten de cellen 's nachts worden getransduceerd met 5 MOI virus in CM-testmedium. Het medium wordt tot dag 6 vervangen door CDI-onderhoudsmedium en tussen dag 7 en 11 vervangen door CDI-onderhoudsmedium zonder fenolrood om snelle of continue monitoring van intracellulaire calciumtransiënte veranderingen met Nautilus mogelijk te maken. (B) hiPSC-CM's getransduceerd met AdGCaMP6f beoordeeld met optische mapping op dag 7, 9 en 10 na het ontdooien wijzen op de aanwezigheid van stabiele, intracellulaire calciumgemedieerde fluorescentieveranderingen, die dagelijkse optische kartering van dezelfde plaat gedurende langere perioden mogelijk maken zonder de noodzaak van hertoepassing van calciumgevoelige kleurstoffen. Afkortingen: GECI = genetisch gecodeerde calciumindicator; CM = cardiomyocyt; MOI = veelvoud van infectie; 96wp = 96-well plaat; BSA = runderserumalbumine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Snel en eenvoudig gebruik van heatmaps voor visuele vergelijking van gegevens verkregen uit volwassen functionele syncytia van hiPSC-CMs met Nautilus en geanalyseerd met Pulse. (A) hiPSC-CMs behandeld met isoproterenol vertonen een toename van de beat rate, zoals waargenomen door de inspectie van heatmaps en bevestigd met gepaarde t-test. (B) Evenzo toont het in kaart brengen van cellen voor en na behandeling met isoproterenol het inotrope effect van β-adrenerge stimulatie door visuele vergelijking van heatmaps en met gepaarde t-test. (C) Ten slotte toont het gebruik van heatmaps voor visuele vergelijking van gegevens lusitropie, een ander canoniek effect van β-adrenerge stimulatie, bevestigd met gepaarde t-test (p < 0,0001). Het ontbreken van een cirkel duidt op een storing in de data-acquisitie/-analyse voor die specifieke put. Afkortingen: hiPSC-CMs = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten; ISO = isoproterenol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Validatie van geci cardiotoxiciteit screening assay met behulp van hERG kanaalblokkers. (A) Representatieve spontane calciumfluxsporen van baselineputten in HBSS en in aanwezigheid van 500 nM E-4031. (B-D) Kwantificering van baseline en +E-4031 effecten op beat rate, calcium transient duration 80 (CaTD80) en calcium transient triangulation (CaT triangulatie) respectievelijk. *,** duidt op significant verschil; ongepaarde t-test; p < 0,01; n = 8 in elke groep. (E) GECI-detectie van een andere hERG-blokker, domperidon. (F) GECI-detectie van hERG-blok geïnduceerd door vandetanib. (G) GECI-detectie van hERG-blok door hoge dosis sotalol. Afkortingen: GECI = genetisch gecodeerde calciumindicator; hERG = humaan Ether-a-go-go-gerelateerd gen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Media en hun samenstelling Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende benaderingen voor in vitro cardiotoxiciteitsscreening met behulp van hiPSC-CMs. Een recent artikel over "Best Practices" over het gebruik van hiPSC-CM's presenteerde de verschillende in vitro assays, hun primaire uitlezingen en, belangrijker nog, de granulariteit van elke assay om de menselijke cardiale elektrofysiologische functie te kwantificeren20. Naast het gebruik van membraandoorborende elektroden, wordt de meest directe meting van de menselijke cardiale elektrofysiologische functie geleverd door VSD's. VSD-testuitlezingen maken directe visualisatie en kwantificering van kritische elektrofysiologische parameters mogelijk, waaronder actiepotentiaalduur, actiepotentiaalvoortplantingssnelheid, actiepotentiaal upstroke, actiepotentiaaltriangulatie, slagsnelheid, slagregelmaat en heterogeniteiten van actiepotentiaalduur. Evenzo bieden calciumgevoelige sondes informatie over hiPSC-CM monolaagritme, snelheid en gebeurtenisduur. hiPSC-CM calciumtransiënte metingen met fluorescerende sondes geven ook informatie over de contractiliteit en contractiele sterkte van elke contractie. Dit artikel biedt methoden voor het gebruik van volwassen hiPSC-CMs (96-well platen) in high-throughput VSD en calcium transiënte meettesten. Naast methoden voor optische mapping wordt ook software voor high-throughput EP-data-analyse gepresenteerd.
De hier beschreven methoden zijn een belangrijke vooruitgang voor de cardiotoxiciteitsscreening en regelgevende wetenschapsvelden. Hier hebben we methoden gepresenteerd voor de snelle rijping en elektrofysiologische registratie van 2D hiPSC-CM monolagen in high-throughput zeefplaten (96-well platen). Snelle rijping met behulp van een MECM (7 dagen) hier getoond is een grote vooruitgang ten opzichte van eerdere benaderingen waarbij rijping gedurende 30-100 dagen22,23 moet plaatsvinden. In vergelijking met andere ECM's, die handmatig moeten worden aangebracht voor elk experiment, zijn MECM-platen voorgecoat met ECM en komen ze klaar voor gebruik in het laboratorium aan. Dit aspect van de MECM maakt het gemakkelijker te gebruiken, minder variabel en efficiënter dan het gebruik van andere ECM-coatings. Belangrijk is dat deze aanpak kan worden gebruikt voor zowel gecryopreserveerde, in de handel verkrijgbare hiPSC-CMs als "zelfgemaakte" hiPSC-CMs, die kamerspecifiek kunnen zijn. Vanwege de duidelijke, staafvormige structuur van volwassen hiPSC-CMs (figuur 1 en figuur 2), is het belangrijk om erop te wijzen dat hier een groter aantal cellen nodig is voor confluente monolaagvorming, in vergelijking met protocollen die andere ECM's gebruiken. Met name bij het gebruik van muis-ECM (cellen hebben een continu verspreidend pannenkoekfenotype), platen we 50.000 hiPSC-CMs per put, maar bij gebruik van MECM platen we 75.000 hiPSC-CMs per put. Het aantal CM's per put kan ook worden verminderd als de cellen worden gebruikt voor eencellige analyse, zoals patchklem of een andere beeldvormingstechniek waarvoor afzonderlijke cellen nodig zijn.
Commercieel verkrijgbare hiPSC-CMs bieden voordelen voor de regelgevende wetenschap vanwege de uitgebreide karakterisering van deze cellen door de door de Food and Drug Administration (FDA) geleide internationale inspanningen. De in de handel verkrijgbare cellen zijn echter een mengsel van nodale, atriale en ventriculaire hiPSC-CMs, die zeer relevante toxiciteitsinformatie bieden, maar de kamerspecifieke kenmerken missen die het menselijk hart nabootsen. Kamerspecifieke hiPSC-CM's recreëren de bekende elektrofysiologische verschillen tussen atriale en ventriculaire cardiomyocyten en bieden een in vitro test voor de ontwikkeling van kamerspecifieke anti-aritmische therapieën (figuur 3B-D). Atriale fibrillatie-specifieke medicijnen kunnen nu bijvoorbeeld worden getest en ontwikkeld met behulp van hiPSC-ACM monolagen verguld in 96-well platen voor robuuste en rigoureuze gegevensverzameling. Evenzo, bij screening om te bepalen of een verbinding Torsades de Pointes (TdP) veroorzaakt, een hoogrisico ventriculaire aritmie, is het optimaal om geen atriale en nodale cellen te hebben die ventriculaire cardiale monolagen "besmetten". Daarom, hoewel de door de FDA geleide hiPSC-CM-validatie-inspanningen tot nu toe gericht zijn op het gebruik van commercieel beschikbare CM's, is het waarschijnlijk dat toekomstige aanbevelingen van de regelgevende wetenschap zich zullen richten op het gebruik van kamerspecifieke cellen om de toxiciteitsscreening nog meer voorspellend te maken voor de menselijke hartaandoening. De hier beschreven methoden zijn gebaseerd op eerdere rapporten en bieden een robuuste aanpak voor het genereren van kamerspecifieke cardiomyocyten afgeleid van pluripotente stamcellen21.
Een groot verschil tussen deze protocollen en de protocollen die meestal in het veld worden gebruikt, is de zuiveringsbenadering die wordt gebruikt. De meeste laboratoria die hiPSC-CM's genereren in hun eigen laboratoria vertrouwen op metabole gemedieerde selectie van cardiomyocyten22. Hier vertrouwen we op het gebruik van MACS om hiPSC-CMs te zuiveren, met behulp van een klinisch goedgekeurde celverwerkingsbenadering die CMs produceert met gezondere fenotypes23. De metabole uitdagingsbenadering is effectief, maar maakt gebruik van een mediaformulering die myocardiale ischemie simuleert24. Bij het gebruik van MACS-zuivering van hiPSC-CMs is het belangrijk om de niet-CM-depletiecocktail te gebruiken, die zich richt op niet-CM's voor magnetische uitputting van de celpopulatie. Het gebruik van de niet-CM-depletiebenadering minimaliseert de schuifspanning die de CM's ervaren in de magnetische kolom en heeft de voorkeur boven directe magnetische etikettering van de CM-populatie. Het gebruik van MACS-zuivering van kamerspecifieke cellen zal andere laboratoria in staat stellen om gezonde CM's te genereren voor onderzoek en toxiciteitstests.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TJH is een consultant en wetenschappelijk adviseur van StemBioSys, Inc. TB is een werknemer van StemBioSys, Inc. AMR en JC zijn voormalige consultants van StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR en JC zijn aandeelhouders van StemBioSys, Inc.
Acknowledgments
Dit werk is ondersteund door NIH-subsidies HL148068-04 en R44ES027703-02 (TJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
References
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
- Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
- Strauss, D. G., Blinova, K.
- Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
- Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
- da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
- da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
- Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
- Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).
