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Bioengineering

Criblage de cardiotoxicité à haut débit utilisant des monocouches de cardiomyocytes de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme mature

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64364
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

Summary

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) offrent une alternative à l’utilisation d’animaux pour le dépistage cardiotoxique préclinique. Une limite à l’adoption généralisée des CSPhi-CM dans le dépistage de la toxicité préclinique est le phénotype immature, semblable au fœtus des cellules. Les protocoles pour une maturation robuste et rapide des CM-HIPSC sont présentés ici.

Abstract

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches induites humaines (hiPSC-CM) sont utilisés pour remplacer et réduire la dépendance à l’égard des animaux et des cellules animales pour les tests de cardiotoxicité précliniques. Dans des formats monocouches bidimensionnels, les hiPSC-CM récapitulent la structure et la fonction des cellules du muscle cardiaque humain adulte lorsqu’elles sont cultivées sur une matrice extracellulaire optimale (ECM). Une ECM (matrice extracellulaire induisant la maturation-MECM) dérivée de cellules souches périnatales humaines fait mûrir la structure, la fonction et l’état métabolique de l’hiPSC-CM en 7 jours après le placage.

Les monocouches matures d’hiPSC-CM répondent également comme prévu aux médicaments cliniquement pertinents, avec un risque connu de provoquer des arythmies et une cardiotoxicité. La maturation des monocouches hiPSC-CM était un obstacle à l’adoption généralisée de ces cellules précieuses pour la science réglementaire et le dépistage de la sécurité, jusqu’à présent. Cet article présente des méthodes validées pour le placage, la maturation et le phénotypage fonctionnel à haut débit de la fonction électrophysiologique et contractile de l’hiPSC-CM. Ces méthodes s’appliquent aux cardiomyocytes purifiés disponibles dans le commerce, ainsi qu’aux cardiomyocytes dérivés de cellules souches générés en interne à l’aide de protocoles de différenciation hautement efficaces et spécifiques à la chambre.

La fonction électrophysiologique à haut débit est mesurée à l’aide de colorants sensibles à la tension (VSD; émission: 488 nm), de fluorophores sensibles au calcium (LCR) ou de capteurs de calcium génétiquement codés (GCaMP6). Un dispositif de cartographie optique à haut débit est utilisé pour les enregistrements optiques de chaque paramètre fonctionnel, et un logiciel dédié personnalisé est utilisé pour l’analyse des données électrophysiologiques. Les protocoles MECM sont appliqués pour le dépistage des médicaments à l’aide d’un inotrope positif (isoprénaline) et d’un gène humain lié à l’éther (hERG) bloqueur spécifique du canal. Ces ressources permettront à d’autres chercheurs d’utiliser avec succès les CM-HIPSC matures pour le dépistage cardiotoxique préclinique à haut débit, les tests d’efficacité des médicaments cardiaques et la recherche cardiovasculaire.

Introduction

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) ont été validés à l’échelle internationale et sont disponibles pour le dépistage de la cardiotoxicité in vitro 1. Les hiPSC-CM très purs peuvent être générés en nombre pratiquement illimité, cryoconservés et décongelés. Lors du replating, ils se réaniment également et commencent à se contracter avec un rythme rappelant le cœur humain 2,3. Remarquablement, les hiPSC-CM individuels se couplent les uns aux autres et forment une syncytie fonctionnelle qui bat comme un seul tissu. De nos jours, les CSPhi sont systématiquement dérivées d’échantillons de sang de patients, de sorte que toute personne peut être représentée à l’aide de tests de cardiotoxicité hiPSC-CM in vitro 4,5. Cela crée l’opportunité d’effectuer des « essais cliniques dans un plat », avec une représentation significative de diverses populations6.

Un avantage essentiel par rapport aux approches existantes de dépistage de la cardiotoxicité animale et cellulaire animale est que les hiPSC-CM utilisent le génome humain complet et offrent un système in vitro présentant des similitudes génétiques avec le cœur humain. Ceci est particulièrement intéressant pour la pharmacogénomique et la médecine personnalisée - l’utilisation de hiPSC-CM pour le développement de médicaments et d’autres thérapies devrait fournir des prescriptions de médicaments plus précises, précises et sûres. En effet, les tests bidimensionnels (2D) hiPSC-CM monocouche se sont avérés prédictifs de la cardiotoxicité des médicaments, en utilisant un panel de médicaments utilisés cliniquement avec un risque connu de provoquer des arythmies 1,7,8,9. Malgré le vaste potentiel des hiPSC-CM et la promesse de rationaliser et de rendre le développement de médicaments moins cher, il y a eu une réticence à utiliser ces nouveaux tests10,11,12.

Jusqu’à présent, l’une des principales limites de l’adoption et de l’acceptation généralisées des tests de dépistage HiPSC-CM est leur apparence immature, semblable à celle du fœtus, ainsi que leur fonction. La question critique de la maturation hiPSC-CM a été examinée et débattue dans la littérature scientifique ad nauseum13,14,15,16. De même, de nombreuses approches ont été utilisées pour promouvoir la maturation hiPSC-CM, y compris les manipulations de la matrice extracellulaire (ECM) dans les monocouches 2D et le développement de tissus cardiaques modifiés en 3D (EHTs)17,18. À l’heure actuelle, il existe une croyance largement répandue selon laquelle l’utilisation de EHT 3D fournira une maturation supérieure par rapport aux approches monocouches 2D. Cependant, les monocouches 2D offrent une plus grande efficacité d’utilisation des cellules et un succès accru dans le placage par rapport aux EHT 3D; Les EHT 3D utilisent un plus grand nombre de cellules et nécessitent souvent l’inclusion d’autres types de cellules qui peuvent confondre les résultats. Par conséquent, dans cet article, l’accent est mis sur l’utilisation d’une méthode simple pour faire mûrir les hiPSC-CM cultivés en tant que monocouches 2D de cellules couplées électriquement et mécaniquement.

La maturation hiPSC-CM avancée peut être réalisée en monocouches 2D à l’aide d’un ECM. Les monocouches 2D des hiPSC-CM peuvent être affinées à l’aide d’une couche de couverture souple et flexible en polydiméthylsiloxane, recouverte d’une matrice membranaire basale sécrétée par une cellule de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de souris). En 2016, des rapports ont montré que les CM-HIPSC cultivés sur cette condition ECM molle ont mûri fonctionnellement, affichant des vitesses de conduction potentielles d’action proches des valeurs cardiaques adultes (~50 cm/s)18. De plus, ces hiPSC-CM matures présentaient de nombreuses autres caractéristiques électrophysiologiques rappelant le cœur adulte, notamment un potentiel membranaire au repos hyperpolarisé et l’expression de Kir2.1. Plus récemment, des rapports ont identifié un revêtement ECM dérivé de cellules souches périnatales humaines qui favorise la maturation structurelle des hiPSC-CMs2D 19. Ici, des méthodes faciles à utiliser sont présentées aux monocouches 2D hiPSC-CM structurellement matures pour une utilisation dans des criblages électrophysiologiques à haut débit. En outre, nous fournissons la validation d’un instrument de cartographie optique pour l’acquisition et l’analyse automatisées de la fonction électrophysiologique monocouche 2D hiPSC-CM, à l’aide de colorants sensibles à la tension (VSD) et de sondes et protéines sensibles au calcium.

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Protocol

L’utilisation de la CSPhi dans ce protocole a été approuvée par le comité HPSCRO de l’Université du Michigan (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Voir le tableau des matériaux pour une liste des matériaux et de l’équipement. Voir le tableau 1 pour les supports et leurs compositions.

1. Décongélation et placage de hiPSC-CM cryoconservés disponibles dans le commerce pour maturation sur une matrice extracellulaire induisant la maturation (MECM)

  1. Réchauffer tous les réactifs à température ambiante et réhydrater les plaques MECM avec la solution saline équilibrée (HBSS) ou la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de Hank contenant du calcium et du magnésium, pendant 1 h avant le placage cardiomyocytaire (200 μL de tampon par puits d’une plaque de 96 puits).
  2. Laver les plaques MECM 2x avec HBSS ou PBS contenant du calcium et du magnésium pendant 1 h avant le placage cardiomyocytaire (200 μL de tampon par puits d’une plaque de 96 puits) et garder les puits hydratés.
  3. Préparez un bain-marie à 37 °C.
  4. Retirez les tubes cardiomyocytaires du réservoir d’azote liquide, transférez les tubes dans de la glace sèche et ouvrez légèrement les bouchons des tubes pour relâcher la pression.
    REMARQUE: Relâcher la pression dans les tubes est extrêmement important! Si trop de pression s’accumule à l’intérieur des tubes, ils pourraient exploser.
  5. Refermez les bouchons du tube et placez-les au bain-marie pour les décongeler pendant 4 min.
    REMARQUE: Laissez-les décongeler complètement, pour éviter les dommages cellulaires dus à la décongélation partielle.
  6. Après la décongélation des cellules, pulvériser les tubes avec de l’éthanol à 70% avant de les ouvrir. Transférer les cellules dans des tubes coniques de 15 mL à l’aide d’une pipette de 1 mL. Égoutter lentement 8 mL de milieu de placage, en agitant le tube chaque fois que 1 mL est ajouté, pour permettre aux cellules de s’adapter aux changements d’osmolarité.
    1. Laver le cryoflain avec 1 mL de produit de placage à l’aide d’une pipette en verre de 1 mL. Ensuite, versez lentement le lavage dans le tube conique de 15 mL.
  7. Centrifuger les tubes à ~300 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu de placage. Retirer une partie aliquote et effectuer le comptage des cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre. Ajouter un milieu de placage supplémentaire pour obtenir 7,5 × 105 cellules/mL.
    REMARQUE : Environ 10 mL de suspension cellulaire sont nécessaires pour préparer 96 puits.
  8. Distribuer 100 μL de suspension cellulaire par puits d’une plaque de 96 puits revêtue de MECM à l’aide d’une pipette multicanal.
    REMARQUE: Assurez-vous d’éviter la précipitation cellulaire et d’obtenir une densité cellulaire uniforme dans tous les puits pendant le placage.
  9. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO 2 pendant2 jours avant de changer le milieu en milieu d’entretien (200 μL/puits). Changez le milieu d’entretien le jour 5 après la décongélation. Effectuer des tests EP le jour 7 ou plus tard, comme décrit précédemment 8,9. Changez le milieu tous les deux jours lorsque vous optez pour l’extension de la culture cellulaire.

2. Différenciation dirigée vers le cœur de la hiPSC et purification de l’hiPSC-CM

  1. Solution chaude 1x d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) disponible dans le commerce, HBSS sans calcium ni magnésium (HBSS--), et plaques à 6 puits recouvertes d’une matrice membranaire basale solubilisée sécrétée par une cellule de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de souris) à température ambiante.
  2. Marquez les colonies différenciées par microscopie à contraste de phase et aspirez/ablate. Bien laver chaque lavage avec 1 mL de HBSS--. Effectuer deux lavages dans des puits contenant >10 points de différenciation.
  3. Aspirer le HBSS et ajouter 1 mL de solution d’EDTA à chaque puits. Incuber les plaques jusqu’à 5 min à 37 °C. Vérifiez les plaques après 3 minutes et recherchez des colonies blanches translucides et visibles.
  4. Aspirer la solution d’EDTA et ajouter 1 mL dans un seul puits. Déloger les cellules avec 2 mL de milieu hiPSC en pipetant la suspension de haut en bas à plusieurs reprises, à l’aide d’une pipette en verre de 10 ml pour détacher toutes les cellules souches du puits, et transférer la suspension cellulaire dans un tube de collecte. Répétez l’aspiration et délogez avec les puits suivants.
    REMARQUE: Délogez les colonies difficiles à soulever avec la pointe de la pipette en verre.
  5. Compter les cellules souches et ajuster le volume à la plaque 8,0 × 105 cellules/puits. Culture des cellules sur milieu hiPSC (2 mL/puits) jusqu’à ce que les cellules souches atteignent 90% de confluence (cette fois est désormais appelée D0).
  6. Préparer 2 mL de milieu de différenciation basal additionné de 4 μM de CHIR99021.
  7. À J0, laver chaque puits d’une plaque de cellules souches à 6 puits avec 1 mL d’HBSS par puits. Remplacer le HBSS par un milieu de différenciation basal complété par 4 μM de CHIR99021.
  8. Sur J1, ne rien faire.
  9. SurJ2, préparer un milieu de différenciation basal complété par 4 μM d’IWP4.
  10. Remplacer le milieu par 2 mL de milieu de différenciation basal supplémenté en IWP4 par puits.
  11. Sur D3, ne rien faire pour une différenciation ventrale spécifique. Pour une différenciation spécifique à l’auriculaire, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de milieu basal complété par 4 μM d’IWP4 et 1 μM de solution d’acide rétinoïque (RA) par puits.
  12. SurJ4, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de milieu basal par puits pour la différenciation ventriculaire. Pour une différenciation auriculaire, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de milieu basal complété par 1 μM de solution de PR par puits.
  13. Sur J5, ne rien faire.
  14. SurJ6, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de milieu basal par puits (pour la différenciation auriculaire et ventriculaire).
  15. Sur la J7, ne rien faire.
  16. ÀJ8, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de milieu d’entretien cardiomyocytes. Changez le milieu tous les deux jours jusqu’à la séparation des cellules, ou suivez un plan d’exposition chronique au médicament.

3. purification hiPSC-CM via MACS (tri cellulaire activé magnétiquement)

  1. Aspirer le milieu de culture cellulaire et bien laver chaque avec 1 mL de HBSS--. Dissocier les cellules en ajoutant 1 mL de trypsine/EDTA à 0,25 % et en incubant à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 10 min. Remettez en suspension et singularisez les cellules de chaque puits avec 2 mL de milieu de placage pour inactiver la trypsine/EDTA.
  2. Recueillir les cellules des six puits dans un tube conique de 50 ml avec une crépine de 70 μm. Ensuite, lavez la passoire avec 3 ml de produit de placage. Comptez les cellules.
  3. Centrifuger la suspension à ~300 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et laver les cellules avec 20 ml de tampon de séparation MACS glacé. Ensuite, centrifuger à nouveau à ~300 × g pendant 5 min.
  4. Remettez la pastille en suspension dans 80 μL de tampon de séparation MACS froid par 5 × 106 cellules. Ajouter 20 μL de cocktail froid de déplétion non cardiomyocytaire (humain) par 5 × 106 cellules. Mélanger délicatement la suspension cellulaire et incuber sur de la glace pendant 10 min.
  5. Lavez l’échantillon en ajoutant 4 mL de tampon de séparation MACS froid par 5 × 10à 6 cellules. Centrifuger l’échantillon à ~300 × g pendant 5 min et aspirer le surnageant.
  6. Remettez la pastille en suspension dans 80 μL de tampon de séparation MACS froid par 5 × 106 cellules. Ajouter 20 μL de microbilles froides anti-biotine par 5 × 106 cellules. Mélanger délicatement la suspension cellulaire et incuber pendant 10 min sur de la glace.
  7. Pendant l’incubation des échantillons, placer les colonnes de déplétion positive (équipées des filtres de préséparation de 30 μm) sur le séparateur MACS et placer les tubes de prélèvement de 15 mL étiquetés sous les colonnes. Une colonne est nécessaire pour 5 × 106 cellules.
  8. Amorcez chaque colonne avec 3 mL de tampon de séparation MACS froid. Mélanger la suspension cellulaire traitée par anticorps avec 2 mL de tampon de séparation MACS par 5 × 106 cellules, et ajouter à la colonne.
    REMARQUE: Ne pas centrifuger! La centrifugation à cette étape a des effets néfastes sur le rendement en cardiomyocytes .
  9. Ajouter 2 mL de tampon de séparation MACS à chaque colonne et recueillir le flux jusqu’à ce que 12 mL de suspension de cardiomyocytes à écoulement continu soient recueillis.
    REMARQUE : Ne laissez jamais les colonnes sécher complètement.
  10. Centrifuger les cardiomyocytes à ~300 × g pendant 5 min, jeter le surnageant et suspendre les cardiomyocytes dans 1 mL de milieu de placage.
  11. Compter les cellules pour déterminer la concentration, ajuster le volume à la densité d’ensemencement souhaitée et plaquer les cellules. Plaquez les cardiomyocytes purifiés sur les plaques MECM 96 puits, comme décrit ci-dessus aux étapes 1.9-1.11 (7,5 × 105 cellules/puits).

4. Cartographie optique à l’aide de colorants sensibles à la tension (VSD) et de fluorophores sensibles au calcium (LCR)

  1. Préparer la quantité appropriée de VSD dans HBSS avec du calcium et du magnésium, en ajoutant 1 μL de colorant VSD par mL de HBSS et 10 μL d’adjuvant de charge par mL de HBSS.
    REMARQUE : En règle générale, une plaque de 96 puits nécessite 10 mL de solution VSD.
  2. Vous pouvez également préparer HBSS avec du calcium et du magnésium complétés par 5 μM de LCR. Aspirer le milieu d’entretien des cardiomyocytes et remplacer par 100 μL de VSD ou de LCR par puits d’une plaque de 96 puits. Incuber les cellules pendant 30 min dans l’incubateur de culture cellulaire.
  3. Retirez les colorants et remplacez-les par un milieu de dosage ou HBSS. Équilibrer à 37 °C pour l’acquisition de la cartographie optique des données de base avec un dispositif de cartographie optique à haut débit.
  4. Traiter les cellules avec des médicaments pour les tests d’exposition aiguë, ou cartographier les cellules qui ont été exposées de façon chronique à des médicaments d’intérêt.
  5. Pour les essais de cardiotoxicité dans des plaques à 96 puits, utiliser quatre doses d’un composé avec au moins six puits par dose. Utiliser des doses allant de dessous à au-dessus de la concentration plasmatique thérapeutique efficace, y compris une dose de la concentration plasmatique thérapeutique cliniquement efficace.
  6. Diluer les médicaments dans du diméthylsulfoxyde, les conserver sous forme de solutions mères à -20 °C, puis les diluer dans HBSS aux concentrations souhaitées.
  7. Effectuer des mesures électrophysiologiques de base avant l’application du médicament, comme décrit à la section 5. Une fois les médicaments appliqués, faites des enregistrements électrophysiologiques au moins 30 minutes plus tard pour les études chroniques. Voir les sections suivantes pour les procédures d’acquisition et d’analyse des données de cartographie optique.

5. Cartographie optique à l’aide d’un indicateur de calcium codé génétiquement (GECI)

  1. Plaques hiPSC-CM disponibles dans le commerce ou purifiées MACS, comme décrit ci-dessus, utilisant des plaques 96 puits revêtues de MECM pour fabriquer des hiPSC-CM matures. Pour former des monocouches confluentes, plaquer 7,5 × 104 cm par puits de chaque plaque de 96 puits. Utilisez un support de placage.
  2. Après 48 h en milieu de placage, passer au milieu d’entretien des cardiomyocytes .
  3. Le jour 4 après la décongélation et le replatage, ajouter l’adénovirus recombinant pour exprimer GCaMP6m (AdGCaMP6m) aux cellules à une multiplicité d’infection (MOI) = 5. Ajouter le virus à l’aide du milieu de dosage CM.
    REMARQUE: Ici, des expériences utilisant GCaMP6m ont été effectuées sur des cardiomyocytes iCell2 d’un fournisseur commercial.
  4. Le jour 5, retirez le milieu adGCaMP6m et remplacez-le par un nouveau RPMI+B27 (milieu d’entretien cardiomyocytes).
  5. Le jour 7, observez les CM à l’aide de la microscopie ou de l’imageur de cartographie optique, pour visualiser les contractions spontanées et les transitoires calciques correspondants.
  6. Au jour 7 ou plus tard, pour le dépistage des médicaments, transférer directement les plaques à 96 puits des monocouches hiPSC-CM matures exprimant GCaMP6m à l’imageur de cartographie optique de l’incubateur pour l’acquisition des données de référence.
  7. Après l’acquisition des données électrophysiologiques, retourner les plaques des CM dans l’incubateur de culture tissulaire, pour des mesures à un point temporel ultérieur.
  8. Après les enregistrements de référence, appliquer les médicaments, en utilisant au moins quatre doses de chaque médicament et au moins six puits par dose. Équilibrer les médicaments sur les cellules pendant au moins 30 minutes avant la collecte des données. Réchauffer la température du puits à ~37 °C avant et pendant l’acquisition des données.
  9. Après les enregistrements de base d’une plaque entière, ajouter de l’isoprotérénol (500 nM) à chaque puits pour obtenir des données robustes sur la réponse aux médicaments. Quantifier les effets de l’isoprotérénol sur la vitesse de battement monocouche, l’amplitude de contraction (amplitude transitoire du calcium) et la durée transitoire du calcium (voir Figure 6), comme décrit à la rubrique 5.

6. Acquisition de données cartographiques optiques et analyse

  1. Assurez-vous que la caméra du périphérique de cartographie optique, le transilluminateur et le réchauffeur de plaque sont allumés.
  2. Ouvrez le logiciel d’acquisition et déterminez l’emplacement d’enregistrement du fichier.
  3. Ouvrez le tiroir avant et positionnez la plaque sur la plaque chauffante.
  4. Acquérir un cadre sombre en cliquant sur le bouton Cadre sombre .
  5. Sélectionnez Durée (10-30 s) et Frame Rate of Acquisition (par exemple, 100 ips ; 250 ips pour une résolution temporelle supérieure), puis cliquez sur Démarrer l’acquisition.
  6. Ouvrez le logiciel d’analyse et, dans l’onglet Importer/Filtrer, sélectionnez Rechercher un seul fichier ou Mosaïque multiple pour reconstruire une plaque.
  7. Sélectionnez Mode paramètre (APD ou CaTD), entrez Distance par pixel et utilisez l’Assistant Puits pour déterminer l’emplacement des puits dans l’image. Cliquez sur Enregistrer le processus pour passer à l’onglet suivant.
  8. Ouvrez l’onglet ROIs (régions d’intérêt) et choisissez de dessiner les ROIs manuellement, Automatically ou Ne pas utiliser les ROI du tout, ce qui considérerait alors l’ensemble du puits pour analyse. Une fois les ROI sélectionnés, cliquez sur le bouton Traiter/Enregistrer pour passer à l’étape suivante. Cochez les cases Masquer les puits et Afficher uniquement les filtres pour visualiser le retour sur investissement.
  9. Ouvrez l’onglet Analyse et, en haut à droite de l’écran, sélectionnez chaque puits ou retour sur investissement pour confirmer la précision de la détection automatique des battements. Ajoutez ou supprimez des battements des traces en appuyant sur Ajouter un battement/Enregistrer les battements, ou en sélectionnant un rythme individuel et en appuyant sur Suppr sur le clavier.
  10. Vous pouvez également utiliser la fonction Cartes thermiques moyennes pour créer des cartes thermiques des paramètres sélectionnés pour la plaque.
  11. Cliquez sur le bouton Time-Space Plot dans l’onglet Analyse pour visualiser les données de chaque puits ou le retour sur investissement. Après vous être assuré que la détection de battement est précise, passez à l’onglet Exporter et sélectionnez Format de fichier. Appuyez sur Exporter et créez un dossier vers lequel les données à exporter. Procédez à l’ouverture des fichiers de données et exécutez la routine d’analyse statistique choisie.
    Remarque : .xlxs fichiers sont préférés car tous les paramètres sont exportés dans un seul fichier ; D’autres formats (.csv ou .tsv) génèrent un fichier par paramètre.

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Representative Results

maturation hiPSC-CM caractérisée par contraste de phase et imagerie confocale immunofluorescente
La chronologie de la maturation médiée par ECM des CM-hiPSC disponibles dans le commerce à l’aide de plaques à 96 puits revêtues de MECM est présentée à la figure 1A. Ces données sont recueillies à l’aide de cardiomyocytes disponibles dans le commerce qui arrivent en laboratoire sous forme de flacons cryoconservés de cellules. Chaque flacon contient >5 × 106 cardiomyocytes viables. Les cellules sont pures à ~98% et rigoureusement testées pour le contrôle de la qualité (un certificat d’analyse est fourni avec chaque flacon). Le nombre élevé de CM permet de décongeler et de placer les CM sur différentes combinaisons ECM en utilisant le même lot de cellules. Dans la figure 1, les hiPSC-CM sont plaqués sur des plaques revêtues d’ECM ou de MECM sur souris. Les hiPSC-CM plaqués sur le MECM arrivent à maturité et deviennent structurellement distincts du même lot de hiPSC-CM replaqués sur l’ECM de la souris. À savoir, les cellules matures deviennent en forme de bâtonnet, tandis que les cellules immatures conservent une forme circulaire. Cela peut être vu dans l’imagerie de contraste de phase et lors de la coloration des myofilaments cardiaques (Figure 1B; troponine I [TnI], rouge). Une validation plus poussée de la maturation structurale des CM-CSPh est présentée à la figure 2. Un large champ de vision (objectif 20x) de CM colorées avec des anticorps α-actinine montre la forme typique des cellules cultivées sur chaque condition ECM. α-actinine est une protéine structurelle critique arrangée avec un espacement régulier dans les myofilaments cardiaques. Conformément à la coloration TnI de la figure 1, la coloration à la α-actinine indique en outre la maturation des CM-HiPSC cultivés sur le MECM. En plus de favoriser un phénotype mature en forme de bâtonnet, le MECM induit également une plus grande organisation du sarcomère (images 60x). Le contenu et l’activité mitochondriaux sont également distincts entre les cellules cultivées sur l’ECM de souris et le MECM (Figure 2B). Le contenu mitochondrial de hiPSC-CM fœtal-immature est limité à l’espace périnucléaire, avec peu de mitochondries trouvées dans le cytosol. En revanche, le contenu mitochondrial des hiPSC-CMs matures est distribué dans toute la cellule. L’évaluation mitochondriale utilise un protocole établi19.

Différenciation dirigée par le cœur hiPSC et spécification de la chambre cardiaque
Voici un protocole pour la production et la maturation en interne de hiPSC-CM purifiés et spécifiques à la chambre (Figure 3A). Ceci est basé sur un rapport publié précédemment20. Les procédures détaillées pour la purification hiPSC-CM à l’aide d’un kit de tri cellulaire activé par aimant (MACS) disponible dans le commerce sont présentés. Nous avons récemment validé l’utilisation de la purification MACS et montré les avantages de l’utilisation de MACS par rapport à la purification métabolique hiPSC-CM ; typiquement, une pureté hiPSC-CM supérieure à 95% est prévue21. Il est important de souligner que si la teneur initiale en CM est de <50%, la purification MACS peut atteindre seulement ~85%. Dans ces cas, l’enrichissement en MC peut être nécessaire à la suite de l’épuisement des non-MC. Si la teneur initiale en CM provenant de la différenciation est de >50%, l’épuisement des non-CM de la population cellulaire à l’aide du kit MACS peut atteindre une pureté de >95%; dans ce cas, l’enrichissement supplémentaire ou la sélection positive des MC n’est pas nécessaire. Les hiPSC-CM spécifiques à la chambre peuvent également être matures à l’aide de plaques à 96 puits revêtues de MECM, comme indiqué ci-dessus et illustré à la figure 1 et à la figure 2. Il faut s’attendre à ce que les cellules auriculaires spécifiques (hiPSC-ACM) aient un taux de battement spontané significativement plus rapide et une durée de potentiel d’action plus courte de 80 (APD80) que les cellules ventrales spécifiques (hiPSC-VCM). Il s’agit de données électrophysiologiques typiques pour les potentiels d’action enregistrés à l’aide de VSD et du système de cartographie optique (Figure 3B-D).

Cartographie optique électrophysiologique cardiaque à haut débit
La rigueur scientifique est considérablement augmentée pour tout essai s’il peut être effectué de manière à haut débit. Les données de dépistage de la cardiotoxicité sont présentées à la figure 4, à la figure 5, à la figure 6 et à la figure 7, montrant le criblage électrophysiologique à haut débit utilisant des monocouches hiPSC-CM matures dans une plaque de 96 puits. Les cartes thermiques de plaques entières pour des paramètres tels que APD80 (Figure 4A) révèlent la reproductibilité d’un paramètre donné dans une plaque de puits à puits. De plus, les cartes thermiques à plaques entières fournissent un examen rapide des valeurs aberrantes dans l’ensemble de données. Par exemple, dans le puits E4 de la plaque présentée à la figure 4A, il est clair que ce puits a une valeur APD80 beaucoup plus élevée, indiquée par le puits apparaissant jaune, tandis que les autres puits sont bleu indigo. Les potentiels d’action typiques des monocouches 2D hiPSC-CM matures (Figure 4B) rappellent la morphologie du potentiel d’action des cardiomyocytes adultes isolés et testés en culture. De plus, un rythme spontané typique du potentiel d’action est représenté à la figure 4C. Les données de la figure 4C sont un diagramme spatio-temporel de la ligne A, colonnes 1 à 12. La ligne blanche sur la carte de la plaque de la figure 4A illustre cela. Chaque flash fluorescent lumineux au fil du temps dans chaque puits représente une seule activation spontanée. La figure 5 et la figure 6 montrent l’utilité de l’utilisation de l’indicateur de calcium génétiquement codé (GECI) GCaMP6m pour mesurer les transitoires de calcium intracellulaires; La figure 6 montre également la réponse attendue à l’isoprotérénol, l’inotrope cardiaque positif classique. En réponse à l’isoprotérénol, l’activation des récepteurs β1-adrénergiques provoque une chronotropie positive (Figure 6A), une inotropie positive (Figure 6B) et une lusitropie positive (Figure 6C). Ces réponses à l’isoprotérénol indiquent la maturation significative des récepteurs β1-adrénergiques hiPSC-CM et des cascades de signalisation intracellulaires.

La figure 7 montre la réponse hiPSC-CM aux inhibiteurs humains du gène lié à l’Ether-a-go-go-go (hERG), en utilisant la fluorescence calcique GCaMP6m pour surveiller le rythme et servir de marqueur de substitution de la contractilité. E-4031 est un bloqueur de canal spécifique à l’hERG, qui ralentit le rythme de battement spontané et augmente la durée transitoire du calcium (CaTD80) et la triangulation (triangulation CaT). La figure 7A montre la détection des post-dépolarisations précoces causées par le blocage du canal hERG E-4031. D’autres inhibiteurs des canaux hERG, notamment la dompéridone, le vandétanib et le sotalol, ont également été testés, et les résultats sont présentés à la figure 7E-G. Ces composés et doses ont été sélectionnés sur la base de la récente étude de validation hiPSC-CM 1,7,9.

Figure 1
Figure 1 : Chronologie de maturation rapide des CM-HiPSC cryoconservés disponibles dans le commerce ou provenant d’autres sources. (A) Des cardiomyocytes décongelés en suspension dans un milieu de placage sont appliqués sur la MECM au jour 0. Le jour 2, le milieu est remplacé par un milieu d’entretien et le milieu usé est changé le jour 5. Les cellules sont cultivées pendant 2 jours supplémentaires et, le jour 7, la synchronisation mature des hiPSC-CM peut être chargée avec une solution d’enregistrement pour les applications en aval ou cultivée pendant de plus longues périodes. (B) La phase de contraste de la syncytie des cardiomyocytes plaqués sur l’ECM de souris ou le MECM montre que les cardiomyocytes plaqués sur l’ECM de souris ont une circularité plus grande par rapport aux cardiomyocytes plaqués sur le MECM; de plus, l’immunomarquage pour TnI indique que les cardiomyocytes plaqués sur l’ECM de souris conservent une morphologie de symétrie radiale et des sarcomères désorganisés contrairement aux hiPSC-CM dolichomorphes et bien structurés plaqués sur le MECM. Barres d’échelle = 100 μm (B, supérieur); 50 μm (B, inférieur). Abréviations : hiPSC-CMs = cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme; ECM = matrice extracellulaire; MECM = ECM induisant la maturation; 96wp = plaque de 96 puits; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; TnI = troponine I. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Comparaison de l’organisation sarcomère des hiPSC-CM plaqués sur une ECM souris ou un MECM. (A) Les hiPSC-CM cultivés ECM chez souris immunocolorés contre la α-actinine indiquent une morphologie radiale, avec une densité plus faible de sarcomères dispersés à travers le cardiomyocyte contrairement aux hiPSC-CM du même lot plaqués sur la matrice et présentant une morphologie en forme de bâtonnet (20x). (60x) L’observation des CM-hiPSC par microscopie confocale montre que les CM-hiPSC cultivés sur une MCE de souris ont une morphologie de symétrie radiale, avec une distribution périmétrique plus dense des sarcomères et une faible densité de sarcomères radiaux, contrairement aux CM-HIPSC du même lot qui ont été cultivés sur le MECM. Ils présentent une distribution homogène des sarcomères organisés le long de l’axe le long des cellules. Barres d’échelle = 100 μm (supérieur); 50 μm (inférieur). (B) La coloration des hiPSC-CM cultivés sur l’ECM de souris ou le MECM avec un colorant mitochondrial qui colore les mitochondries à fort potentiel transmembranaire montre une intensité de coloration plus faible dans les cardiomyocytes cultivés sur l’ECM de souris par rapport au MECM. De plus, les hiPSC-CM cultivés sur le MECM ont des mitochondries réparties de manière homogène dans les cardiomyocytes, contrairement aux hiPSC-CM cultivés sur l’ECM de souris qui présentent une accumulation périnucléaire de mitochondries. Barres d’échelle = 200 μm. Abréviations : hiPSC-CMs = cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme; ECM = matrice extracellulaire; MECM = ECM induisant la maturation; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Production de cardiomyocytes spécifiques à la chambre. (A) Les protocoles de production de cardiomyocytes spécifiques à la chambre partagent une manipulation identique de la voie de signalisation Wnt, avec la stimulation de la signalisation Wnt par inhibition de GSK3 du jour 0 au jour 2, et l’inhibition de cette voie entre les jours 2 et 4. La spécification de la chambre est obtenue avec l’activation de la voie de l’acide rétinoïque et la manipulation de la signalisation Wnt entre les jours 3 et 6. (B) En raison de la spécification de la chambre, les cardiomyocytes auriculaires présentent un taux de dépolarisation spontanée plus rapide par rapport aux cardiomyocytes ventriculaires. (C) Les hiPSC-CM ventriculaires ont des taux de battement plus lents que les HIPSC-CM auriculaires; par conséquent, la durée du potentiel d’action à 80% de la repolarisation est plus courte dans les hiPSC-ACM par rapport aux hiPSC-VCM. Abréviations : hiPSC-CMs = cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme; hiPSC-ACM = cardiomyocytes pluripotents induits par l’homme auriculaire dérivés de cellules souches; hiPSC-VCM = cardiomyocytes veintriculaires induits par l’homme pluripotents dérivés de cellules souches. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Cartographie optique acquise avec un dispositif de cartographie optique et analysée avec Pulse. (A) Exemple de carte thermique pour l’observation holistique des paramètres évalués dans une plaque de 96 puits après filtration du film et détermination des régions d’intérêt dans les plaques de 96 puits, cartographiées à l’aide du dispositif de cartographie optique. Dans cet exemple, une carte thermique APD80% qui indique un puits aberrant (E4) et des puits qui n’ont pas produit de données (puits H3, 4 et 5). (B) En outre, l’interface conviviale permet de tracer facilement la morphologie du potentiel d’action moyen à partir des puits sélectionnés. C) D’autres outils de visualisation des données sont disponibles; dans cet exemple, un diagramme spatio-temporel généré à partir de la ligne horizontale traversant les puits de la rangée A (panneau A) montre l’activation sur une section horizontale de chaque puits (ligne blanche sur la rangée A) sur une période de 10 s. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Chronologie de la cartographie des changements transitoires intracellulaires du calcium à l’aide d’un indicateur de calcium codé génétiquement. Le jour 4 après le placage des cardiomyocytes disponibles dans le commerce dans une plaque à 96 puits recouverte de MECM, comme indiqué à la figure 1A, les cellules doivent être transduites avec 5 MOI de virus dans le milieu de dosage CM pendant la nuit. Le milieu est remplacé par un milieu d’entretien CDI jusqu’au jour 6, et remplacé par un milieu d’entretien CDI sans rouge de phénol entre les jours 7 et 11 pour permettre une surveillance rapide ou continue des changements transitoires intracellulaires du calcium avec Nautilus. (B) hiPSC-CMs transduits avec AdGCaMP6f évalués par cartographie optique aux jours 7, 9 et 10 après le dégel indiquent la présence de changements de fluorescence intracellulaires stables médiés par le calcium, qui permettent une cartographie optique quotidienne de la même plaque sur une longue période de temps sans qu’il soit nécessaire de réappliquer des colorants sensibles au calcium. Abréviations : GECI = indicateur de calcium génétiquement codé; CM = cardiomyocyte; MOI = multiplicité de l’infection; 96wp = plaque de 96 puits; BSA = albumine sérique bovine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Utilisation rapide et facile des cartes thermiques pour la comparaison visuelle des données acquises à partir de syncytia fonctionnelle mature de hiPSC-CMs avec Nautilus et analysées avec Pulse. (A) Les hiPSC-CM traités à l’isoprotérénol présentent une augmentation du taux de battement, observée par l’inspection des cartes thermiques et confirmée par le test t apparié. (B) De même, la cartographie des cellules avant et après le traitement à l’isoprotérénol montre l’effet inotrope de la stimulation β-adrénergique par comparaison visuelle des cartes thermiques et avec le test t apparié. (C) Enfin, l’utilisation de cartes thermiques pour la comparaison visuelle des données montre la lusitropie, un autre effet canonique de la stimulation β-adrénergique, confirmé par le test t apparié (p < 0,0001). L’absence d’un cercle indique une défaillance dans l’acquisition ou l’analyse des données pour ce puits spécifique. Abréviations : hiPSC-CMs = cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme; ISO = isoprotérénol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Validation de l’essai de dépistage de la cardiotoxicité GECI à l’aide d’inhibiteurs de canaux hERG. (A) Traces représentatives de flux spontané de calcium provenant de puits de référence dans HBSS et en présence de 500 nM E-4031. (B-D) Quantification des effets de base et +E-4031 sur la vitesse de battement, la durée transitoire du calcium 80 (CaTD80) et la triangulation transitoire du calcium (triangulation CaT) respectivement. *,** indique une différence significative; test t non apparié; p < 0,01; n = 8 dans chaque groupe. (E) Détection GECI d’un autre inhibiteur de l’hERG, la dompéridone. (F) Détection GECI du bloc hERG induit par le vandétanib. (G) Détection GECI du bloc hERG par une forte dose de sotalol. Abréviations : GECI = indicateur de calcium génétiquement codé; hERG = gène humain lié à l’éther à go-go-go. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Les médias et leurs compositions Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Il existe plusieurs approches différentes pour le dépistage de la cardiotoxicité in vitro à l’aide de hiPSC-CM. Un récent article sur les « meilleures pratiques » sur l’utilisation des CM-HIPSC a présenté les différents tests in vitro , leurs lectures primaires et, surtout, la granularité de chaque essai pour quantifier la fonction électrophysiologique cardiaque humaine20. En plus d’utiliser des électrodes de perçage de membrane, la mesure la plus directe de la fonction électrophysiologique cardiaque humaine est fournie par les VSD. Les lectures du test VSD permettent de visualiser et de quantifier directement les paramètres électrophysiologiques critiques, y compris la durée du potentiel d’action, la vitesse de propagation du potentiel d’action, la course ascendante du potentiel d’action, la triangulation du potentiel d’action, la vitesse de battement, la régularité des battements et les hétérogénéités de durée du potentiel d’action. De même, les sondes sensibles au calcium offrent des informations sur le rythme, la vitesse et la durée des événements de la monocouche hiPSC-CM. Les mesures transitoires du calcium hiPSC-CM effectuées à l’aide de sondes fluorescentes fournissent également des informations sur la contractilité et la force contractile de chaque contraction. Cet article fournit des méthodes pour l’utilisation de hiPSC-CM matures (plaques à 96 puits) dans les essais de mesure transitoire VSD et calcium à haut débit. En plus des méthodes de cartographie optique, un logiciel d’analyse de données EP à haut débit est présenté.

Les méthodes décrites ici constituent une avancée significative dans les domaines du dépistage de la cardiotoxicité et de la science réglementaire. Ici, nous avons présenté des méthodes pour la maturation rapide et l’enregistrement électrophysiologique des monocouches 2D hiPSC-CM dans des plaques de criblage à haut débit (plaques à 96 puits). La maturation rapide à l’aide d’un MECM (7 jours) illustrée ici est une avancée majeure par rapport aux approches précédentes nécessitant une maturation sur 30-100 jours22,23. Par rapport à d’autres ECM, qui nécessitent une application manuelle pour chaque expérience, les plaques MECM sont prérecouvertes d’ECM et arrivent en laboratoire prêtes à l’emploi. Cet aspect du MECM le rend plus facile à utiliser, moins variable et plus efficace que l’utilisation d’autres revêtements ECM. Il est important de noter que cette approche peut être utilisée à la fois pour les hiPSC-CM cryoconservés et disponibles dans le commerce et pour les hiPSC-CM « faits maison », qui peuvent être spécifiques à la chambre. En raison de la structure distincte en forme de bâtonnet des CM-hiPSC matures (Figure 1 et Figure 2), il est important de souligner qu’un plus grand nombre de cellules est nécessaire pour la formation de monocouches confluentes ici, par rapport aux protocoles qui utilisent d’autres ECM. Notamment, lors de l’utilisation de l’ECM de souris (les cellules ont un phénotype de crêpe à propagation continue), nous plaquons 50 000 hiPSC-CM par puits, mais lorsque nous utilisons MECM, nous plaquons 75 000 hiPSC-CM par puits. Le nombre de CM par puits peut également être réduit si les cellules doivent être utilisées pour l’analyse de cellules uniques, telles que la pince patch ou toute autre technique d’imagerie nécessitant des cellules uniques.

Les hiPSC-CM disponibles dans le commerce offrent des avantages pour la science réglementaire en raison de la caractérisation approfondie de ces cellules par les efforts internationaux dirigés par la Food and Drug Administration (FDA). Cependant, les cellules disponibles dans le commerce sont un mélange de hiPSC-CM nodaux, auriculaires et ventriculaires, qui fournissent des informations de toxicité très pertinentes, mais n’ont pas les caractéristiques spécifiques à la chambre qui imitent le cœur humain. Les hiPSC-CM spécifiques à la chambre recréent les différences électrophysiologiques bien connues entre les cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires et fournissent un test in vitro pour le développement de thérapies antiarythmiques spécifiques à la chambre (Figure 3B-D). Par exemple, les médicaments spécifiques à la fibrillation auriculaire peuvent maintenant être testés et développés à l’aide de monocouches hiPSC-ACM plaquées dans des plaques à 96 puits pour une collecte de données robuste et rigoureuse. De même, lors du dépistage visant à déterminer si un composé provoque des torsades de pointes (TdP), une arythmie ventriculaire à haut risque, il est optimal de ne pas avoir de cellules auriculaires et nodales « contaminant » les monocouches cardiaques ventriculaires. Par conséquent, bien que les efforts de validation hiPSC-CM dirigés par la FDA se soient jusqu’à présent concentrés sur l’utilisation de MC disponibles dans le commerce, il est probable que les futures recommandations scientifiques réglementaires se tourneront vers l’utilisation de cellules spécifiques à la chambre pour rendre le dépistage de la toxicité encore plus prédictif de l’état cardiaque humain. Les méthodes décrites ici sont basées sur des rapports antérieurs et fournissent une approche robuste pour la génération de cardiomyocytes spécifiques à la chambre dérivés de cellules souches pluripotentes21.

Une différence majeure entre ces protocoles et ceux généralement utilisés sur le terrain est l’approche de purification utilisée. La majorité des laboratoires qui génèrent des hiPSC-CM dans leurs propres laboratoires s’appuient sur la sélection métabolique des cardiomyocytes22. Ici, nous comptons sur l’utilisation de MACS pour purifier les hiPSC-CM, en utilisant une approche de traitement cellulaire cliniquement approuvée qui produit des CM avec des phénotypesplus sains 23. L’approche de provocation métabolique est efficace, mais utilise une formulation de milieu qui simule l’ischémie myocardique24. Lors de l’utilisation de la purification MACS des hiPSC-CM, il est important d’utiliser le cocktail de déplétion non-CM, qui cible les non-CM pour l’épuisement magnétique de la population cellulaire. L’utilisation de l’approche de déplétion non CM minimise la contrainte de cisaillement que les CM subissent dans la colonne magnétique et est préférée au marquage magnétique direct de la population CM. L’utilisation de la purification MACS de cellules spécifiques à la chambre permettra à d’autres laboratoires de générer des CM sains pour la recherche et les tests de toxicité.

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Disclosures

TJH est consultant et conseiller scientifique de StemBioSys, Inc. TB est un employé de StemBioSys, Inc. AMR et JC sont d’anciens consultants de StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR et JC sont actionnaires de StemBioSys, Inc.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions HL148068-04 et R44ES027703-02 (TJH) des NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin EDTA Gibco 25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) Millipore Sigma A3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) Millipore Sigma H4034
AdGCaMP6m Vector biolabs 1909
Albumin human Sigma A9731-1G
alpha actinin antibody ThermoFisher MA1-22863
B27 Gibco 17504-044
Blebbistatin Sigma B0560
CalBryte 520AM AAT Bioquest 20650
CELLvo MatrixPlus 96wp StemBiosys N/A https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021 LC Laboratories c-6556
Clear Assay medium (fluorobrite) ThermoFisher A1896701 For adenovirus transduction
DAPI ThermoFisher 62248
DMEM:F12 Gibco 11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135-500ML
FluoVolt ThermoFisher F10488
HBSS Gibco 14025-092
iCell CM maintenance media FUJIFILM/Cellular Dynamics M1003
iCell2 CMs FUJIFILM 1434
Incucyte Zoom  Sartorius
iPS DF19-9-11T.H WiCell
Isoproterenol MilliporeSigma CAS-51-30-9
IWP4 Tocris 5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma A8960-5g
L-glutamine Gibco A2916801
LS columns Miltenyii Biotec 130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) Miltenyii Biotec 130-091-221
Matrigel Corning 354234
MitoTracker Red ThermoFisher M7512
Nautilus HTS Optical Mapping  CuriBio https://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal Microscope Nikon
nonessential amino acids Gibco 11140-050
pre-separation filter Miltenyii Biotec 130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human Miltenyii Biotec 130-110-188
Pulse CuriBio https://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet) Miltenyii Biotec 130-091-051
Retinoic acid Sigma R2625
RPMI 1640  Gibco 11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) Gibco 22400-089
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyii Biotec 130-107-086
TnI antibody (pan TnI) Millipore Sigma MAB1691 
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution) Gibco 15040-066
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
β-mercaptoethanol Gibco 21985023

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References

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Criblage de cardiotoxicité à haut débit utilisant des monocouches de cardiomyocytes de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme mature
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Monteiro da Rocha, A., Allan, A., Block, T., Creech, J., Herron, T. J. High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers. J. Vis. Exp. (193), e64364, doi:10.3791/64364 (2023).

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