Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro Udvælgelse af konstruerede transkriptionelle repressorer til målrettet epigenetisk hæmning

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64403
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 2, 1,4
1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget), IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences, IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

Summary

Her præsenterer vi en protokol til in vitro-udvælgelse af konstruerede transkriptionelle repressorer (ETR'er) med høj, langsigtet, stabil, on-target hæmningseffektivitet og lav genom-wide, off-target aktivitet. Denne arbejdsgang gør det muligt at reducere et indledende, komplekst repertoire af kandidat-ETR'er til en kort liste, der er egnet til yderligere evaluering i terapeutisk relevante indstillinger.

Abstract

Geninaktivering er medvirkende til at studere genfunktion og repræsenterer en lovende strategi til behandling af en bred vifte af sygdomme. Blandt traditionelle teknologier lider RNA-interferens af delvis målophævelse og kravet om livslange behandlinger. I modsætning hertil kan kunstige nukleaser pålægge stabil geninaktivering gennem induktion af et DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB), men nylige undersøgelser stiller spørgsmålstegn ved sikkerheden ved denne tilgang. Målrettet epigenetisk redigering via konstruerede transkriptionelle repressorer (ETR'er) kan repræsentere en løsning, da en enkelt administration af specifikke ETR-kombinationer kan føre til holdbar hæmning uden at fremkalde DNA-brud.

ETR'er er proteiner, der indeholder et programmerbart DNA-bindende domæne (DBD) og effektorer fra naturligt forekommende transkriptionelle repressorer. Specifikt viste en kombination af tre ETR'er udstyret med KREB-domænet for human ZNF10, det katalytiske domæne for human DNMT3A og human DNMT3L, sig at inducere arvelige undertrykkende epigenetiske tilstande på ETR-målgenet. Denne platforms hit-and-run-karakter, den manglende indvirkning på målets DNA-sekvens og muligheden for at vende tilbage til den undertrykkende tilstand ved DNA-demethylering efter behov gør epigenetisk hæmning til et spilændrende værktøj. Et kritisk trin er identifikationen af de korrekte ETR'ers position på målgenet for at maksimere on-target og minimere off-target hæmning. Det kan være besværligt at udføre dette trin i den endelige prækliniske ex vivo- eller in vivo-indstilling .

Ved at tage CRISPR / katalytisk døde Cas9-system som en paradigmatisk DBD for ETR'er beskriver dette papir en protokol bestående af in vitro-skærmen af guide-RNA'er (gRNA'er) koblet til triple-ETR-kombinationen for effektiv hæmning på målet efterfulgt af evaluering af genom-wide specificitetsprofilen for tophits. Dette giver mulighed for at reducere det oprindelige repertoire af kandidat-gRNA'er til en kort liste over lovende, hvis kompleksitet er egnet til deres endelige evaluering i den terapeutisk relevante interesseindstilling.

Introduction

Geninaktivering har traditionelt spillet en central rolle for at studere genfunktion i både cellulære og dyremodeller. Desuden er det i de sidste to årtier, med stigningen i genterapi, blevet foreslået som en potentielt spilændrende tilgang til behandling af sygdomme forårsaget af gain-of-function-mutationer1, infektionssygdomme2 eller patologier, hvor hæmning af et gen kan kompensere for en arvelig defekt i et andet3. Endelig er genetisk inaktivering af nøgleregulatorer af celleegnethed og funktionel kontrol blevet foreslået for at øge effektiviteten af celleprodukter til kræftimmunterapi4 og regenerativ medicin5.

Blandt de forskellige teknologier til at opnå geninaktivering er en af de mest lovende målrettet epigenetisk hæmning 6,7. Kernen i denne teknologi er de såkaldte konstruerede transkriptionelle repressorer (ETR'er), kimære proteiner bestående af et programmerbart DNA-bindende domæne (DBD) og et effektordomæne (ED) med epigenetisk repressiv funktion. Zinkfingerproteiner (ZFP'er)8, transkriptionsaktivatorlignende effektorer (TALEs)9 eller CRISPR/dCas910-baserede DBD'er kan designes til selektivt at binde ED til promotor/forstærkersekvensen af målgenet, der skal bringes til tavshed. Når den er der, udfører ED af ETR sin hæmningsaktivitet ved at pålægge heterochromatininducerende undertrykkende epigenetiske mærker såsom histonmodifikationer (H3K9 11,12 eller H3K27 13 methylering, H3 eller H4 deacetylation 14) og CpG DNA-methylering 15 i henhold til det anvendte undertrykkende domæne.

Især inspireret af de molekylære processer med permanent transkriptionel undertrykkelse af endogene retrovira, der forekommer i præimplantationsembryoet16, er der genereret en kombination af tre ETR'er for at udnytte følgende hormonforstyrrende stoffer: i) det Krüppel-associerede boksdomæne (KRAB) for human ZNF10; ii) det katalytiske domæne af humant de novo-DNA-methyltransferase 3A (DNMT3A) og iii) humant DNA-methyltransferase 3-lignende (DNMT3L) i fuld længde. KRAB er et konserveret undertrykkende domæne, der deles af flere ZEP'er hos højere hvirveldyr17,18, hvis hæmningsaktivitet hovedsageligt er baseret på dets evne til at rekruttere KAP1 19-et stilladsprotein, der derefter interagerer med flere andre heterochromatininduktorer20-omfattende nukleosomremodellerings- og deacetylationskomplekset (NuRD) 21, H3K9-histonmethyltransferase SETDB1 22 og H3K9-methyleringslæseren HP1 23, 24, blandt andre.

DNMT3A overfører aktivt methylgrupper på DNA'et ved CpG-sekvenser25. Den katalytiske aktivitet af DNMT3A forstærkes af dens fysiske tilknytning til DNMT3L, en embryo- og kimcellebegrænset paralog af DNMT3A, der mangler det katalytiske domæne, der er ansvarlig for methylgruppeoverførsel26,27. DNA-methylering i CpG-rige regioner - kaldet CpG-øer (CGI'er) - indlejret i promotor- / forstærkerelementerne i pattedyrgener er normalt forbundet med transkriptionshæmning28. Det er vigtigt, at når CpG-methylering er deponeret, kan den stabilt nedarves gennem mitose af et UHRF1-DNMT1-baseret molekylært kompleks29.

Stabil overekspression af ETR'erne i målcellen kan være problematisk, sandsynligvis på grund af den stigende risiko for aktivitet uden for målet og kvælning af endogene interaktorer fra deres fysiologiske målsteder over tid. Imidlertid kan forbigående ekspression af enkelt-ETR-dele ikke fremkalde langvarig hæmning med høj effektivitet30, hvilket hæmmer deres terapeutiske anvendelse. Derfor var et skelsættende gennembrud i feltet beviset for, at kombinationen af de tre KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-baserede ETR'er kan synergisere og, selv når de kun leveres forbigående, pålægge promotorsekvensen af målgenet H3K9 og CpG-methylering. Disse læses og formeres derefter af cellen gennem mitose, hvilket fører til arvelig hæmning i flere humane og murincellelinjer samt ex vivo-dyrkede primære celler30.

Det skal bemærkes, at den epigenetiske hæmning, der pålægges af ETR'erne, kan vendes tilbage efter behov ved målrettet (f.eks. rekruttering af den CRISPR/dCas9-baserede TET1-DNA-demethylase på det tavse locus) eller farmakologisk (administration af DNA-methyltransferasehæmmeren 5-Aza) DNA-demethylering30, en potentiel modgift i tilfælde af ETR-relaterede bivirkninger. Alt-i-en ETR'er, der bærer de tre KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-baserede ED'er, blev også beskrevet, hvilket viser signifikant hæmningseffektivitet i cellelinjer31,32 mod det store flertal af proteinkodende gener. Desuden rapporterede flere undersøgelser, der anvendte ETR'erne, en høj sikkerhedsprofil uden større aktivitet uden for målet med hensyn til de novo CpG-methylering eller ændring af kromatintilgængelighed30,31,32. Det anbefales dog at foretage en særlig analyse af specificitetsprofilen for ETR'er, der er udstyret med en nydesignet DBD, før kliniske anvendelser.

Fra et klinisk perspektiv kan målrettet epigenetisk hæmning give kritiske fordele for både RNA-interferens (RNAi)-baseret knockdown33 og kunstig nukleasebaseret genforstyrrelse8. I modsætning til RNAi kan målrettet epigenetisk hæmning inducere fuld ophævelse af dets mål pr. celle og kræver ikke periodisk behandling for at sikre langvarig hæmning; i modsætning til genforstyrrelse efterlader den DNA-sekvensen uændret og undgår generering af DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB'er). DSB'er kan derefter inducere apoptose og cellecyklusstop, hvilket potentielt kan føre til en selektion mod celler med en funktionel p53-vej 34,35 og, især i multiplex-genredigeringsindstillinger, kromosomale omlejringer35. Ved at videreformidle det irreversible mosaikresultat af ikke-homologt end-joining-medieret DNA DSB-reparation36 kan genforstyrrelse desuden ikke undgå reparation af målet inden for rammen til funktionelle kodningssekvenser som et af de endelige resultater og kan i modsætning til epigenetisk hæmning ikke slettes efter behov.

Endelig har epigenetisk hæmning potentialet til at udvide rækken af målbare genetiske elementer til klasser, der er helt eller i det mindste delvist ildfaste over for RNAi og genforstyrrelser, såsom ikke-transskriberede regulatoriske elementer og ikke-kodende RNA'er30,32. Det første kritiske skridt for enhver målrettet epigenetisk hæmningsapplikation er at designe et panel af ETR'er, der dækker de forskellige regulatoriske sekvenser af målgenet og identificere de bedst ydende. Antallet af ETR'er, der skal testes, kan være afgørende i betragtning af den stigende andel af genomet, der kan målrettes af de programmerbare DNA-bindingsteknologier, der konstant er under udvikling37. Udførelse af skærmen af ETR'erne direkte på celletypen, hvor målgenet terapeutisk bringes til tavshed, ville være den mest relevante mulighed. Imidlertid kan skærme med høj kapacitet være teknisk besværlige i primære celler på grund af deres begrænsede overlevelse i kultur og deres ofte suboptimale tekniske kapacitet. Store skærme kan være endnu mere umulige in vivo.

Et mere praktisk alternativ består i først at udføre en indledende screening af et stort panel af ETR'er i let konstruerbare cellelinjer og derefter kun validere de mest lovende i den terapeutisk relevante celletype. Et parallelt spørgsmål er valget af en passende aflæsning til måling af dæmpningseffektiviteten af de europæiske fremskyndede køretøjer. Direkte vurdering af transkriptions- eller proteinniveauerne af målgenet ved RT-qPCR, western blot, eller ELISA kan være dyrt og tidskrævende og kan mangle tilstrækkelig følsomhed, hvilket begrænser deres anvendelse ved high-throughput skalaer. Genereringen af ad hoc-konstruerede reportercellelinjer, hvor en fluorofor placeres under transkriptionel kontrol af målgenets regulatoriske sekvenser, muliggør udnyttelse af den flowcytometribaserede tilgang til læsning af epigenetisk hæmning på enkeltcelleniveau og i højt gennemstrømningstempo.

Efter disse generelle overvejelser beskriver dette papir en protokol bestående af in vitro-arrayed screen af ETR'er for hæmningseffektivitet på målet efterfulgt af evaluering af den genom-dækkende off-target-aktivitet af de øverste hits. Denne arbejdsgang giver mulighed for at reducere det indledende repertoire af kandidat-ETR'er til en kort liste over lovende, hvis kompleksitet er egnet til deres endelige evaluering i den terapeutisk relevante celletype af interesse.

Blandt de forskellige programmerbare DBD'er, der kan udnyttes til at generere ETR'er, vil denne protokol fokusere på den CRISPR/dCas9-baserede teknologi på grund af den lette konstruktion af gRNA'er, der spænder over målgenpromotoren i en høj gennemstrømningsskala. Den samme konceptuelle arbejdsgang, der er beskrevet nedenfor, kan imidlertid anvendes til at evaluere effektiviteten og specificiteten af ETR'er udstyret med andre DBD'er.

Protocol

1. Konstruktion af en fluorescensbaseret reportercellelinje til overvågning af målgenets transkriptionelle aktivitet ved flowcytometri

  1. Identificer cellelinjer, der udtrykker målgenet, der skal bringes til tavshed. Gennemse målgenet, der skal bringes til tavshed i Human Protein Atlas38, og naviger gennem dets "Cellelinje" -sektion for at identificere de linjer, der er repræsentative for det somatiske væv af interesse (f.eks. En levercellelinje, hvis de endelige mål er leverhepatocytter). Alternativt kan du forhøre dig i en offentligt tilgængelig RNA-sekventeringsdatabase (RNA-Seq) (f.eks. NCBI GEO).
  2. Blandt kandidaterne skal du prioritere cellelinjer, for hvilke effektive forbigående genleveringsprotokoller - instrumentelle til ETR-levering - er tilgængelige.
    BEMÆRK: Blandt de forskellige modaliteter repræsenterer nukleofektion en af de bedste muligheder, da den sikrer høj transfektionseffektivitet. Her er humane erythroleukæmi K-562-celler blevet valgt til at generere en cellelinje, der rapporterer transkriptionel aktivitet af beta-2-mikroglobulin (B2M) genet (i det følgende benævnt B2MTdTomato K-562-cellerne).
  3. Yderligere prioritere kandidaterne for at undgå cellelinjer, hvor målgenet er afgørende for cellelevedygtighed, da dette forringer vedligeholdelsen af celler med stabil hæmning af målgenet i kultur. Hvis det ikke tidligere er rapporteret, for at få en fornemmelse af målgenets væsentlighed i den valgte celletype, skal du generere en genetisk forstyrrelseskontrol ved at transfektere cellerne med Cas9-nuklease og et gRNA rettet mod en af de første kodende exoner af genet.
    BEMÆRK: Genetisk forstyrrelse er pr. definition en stabil begivenhed; Modvalg af forstyrrede celler over tid indikerer, at målgenet er afgørende for den valgte celles fysiologi.
    1. Identificer målsplejsningsisoformen, der fortrinsvis anvendes i den valgte cellelinje (isoformen NM_004048.4 af B2M-genet er målrettet i denne protokol).
    2. Identificer et gRNA, der kan skære effektivt og specifikt i den første kodende exon af målisoformen (f.eks. Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/)39, som er et gyldigt og brugervenligt online gRNA-selektionsværktøj).
    3. For K-562-celler transfekteres 1 μg spCas9-kodende plasmid (hCas9; se materialetabel) og 250 ng gRNA-kodende plasmid (phU6-gRNA; se materialetabel) pr. 5 × 10 5 celler gennem nukleofektion (ifølge producentens anvisninger).
    4. Dyrk cellerne (K-562-celler ved 37 °C under 5% CO2 i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum [FBS], L-glutamin og penicillin / streptomycin [100 U / ml]) og overvåg niveauerne af genforstyrrelser over tid ved at udnytte et mutationsdetekteringssæt (følg producentens instruktioner).
  4. Klon en donorskabelon til homolog rekombinationsmedieret integration af en fluorescerende reporter under transkriptionel kontrol af målgenet af interesse (figur 1).
    1. Identificer regionen af målgenet for at integrere fluoroforekspressionskassetten.
      BEMÆRK: Undgå at målrette transkriptionelt relevante elementer, såsom CpG-øer og regioner beriget til H3K27-acetylering (markør for aktive promotorer og forstærkere). Ændring af disse regulatoriske elementer (potentielt vigtigt at blive målrettet af ETR'erne for at instruere epigenetisk hæmning) gør reportercellelinjen mindre forudsigelig for den fysiologiske regulering af målgenet.
      1. Hvis målgenet ikke koder for et udskilt protein, skal du smelte reporteren til målgenets sidste codon gennem et 2A selvspaltende peptid for at opretholde målgenets funktionalitet.
      2. Hvis målgenet koder for et udskilt protein, skal du placere reporteren i en intronisk region af målgenet for at undgå potentiel sekretion af reporteren. Tvungen integration af reporteren i det splejsede transkript gennem et splejsningsacceptorsted (SA) og efterfølgende oversættelse gennem en intern ribosomindgangssekvens (IRES) forringer målgenets funktionalitet.
    2. Brug Chopchop til at vælge gRNA-skæring i målområdet (her vælges et gRNA til at målrette sekvensen 5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′ af den første intron af B2M-genet ).
    3. Design en donorskabelon til gRNA-snitstedet bestående af: i) en venstre homologiarm (n basepar [bp], der matcher regionen lige opstrøms for gRNA-snitstedet); ii) en promotorfri transgenekspressionskassette (i det her viste tilfælde en SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH poly(A), der favoriserer splejsning med den første intron af B2M-genet ); og iii) en højre homologiarm (n bp, der matcher regionen nedstrøms for gRNA-snitstedet).
      BEMÆRK: Længden af homologiarmene, der er nødvendige for effektivt at inducere homolog rekombination, kan variere mellem forskellige celletyper (100-500 bp er et korrekt interval for K-562-celler).
  5. Lever CRISPR / Cas9-nukleasesystemet og donorskabelonen inde i målcellelinjen. For K-562-celler transfekteres 1 μg spCas9-kodende plasmid (hCas9; se materialetabel), 250 ng gRNA-kodende plasmid (phU6-gRNA; se materialetabel) og 1 μg donorskabelonkodende plasmid pr. 5 × 105 celler gennem nukleofektion (ifølge producentens anvisninger).
  6. Dyrk cellerne i mindst 14 dage (for K-562-celler) og overvåg ekspressionsniveauerne for den fluorescerende reporter over tid ved hjælp af et flowcytometer (aktiver phycoerythrin (PE) kanalen for at måle fluorescensintensiteten af tdTomato-reporteren og følg producentens instruktioner for at udføre flowcytometri).
    BEMÆRK: Donorskabelonen - især hvis plasmidbaseret - kan indeholde kryptiske promotorsekvenser, hvilket fører til ekspression af den fluorescerende reporter fra ikke-integrerede donorkopier. Dyrkning af cellerne muliggør fortynding af disse ikke-integrerede kopier ved celledeling og endelig opretholder kun ekspressionen af reporteren fra donorkopierne integreret i målgenomet.
  7. Klon reporter-positive celler gennem fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) på enkeltcelleniveau. For denne protokol skal du aktivere PE-kanalen for at måle fluorescensintensiteten af tdTomato-reporteren og følge producentens instruktioner for at sortere enkelte tdTomato-positive K-562-celler pr. Brønd på en 96-brøndplade.
  8. Ved celleudvidelse i kultur (typisk 20-30 dage for K-562-celler) screenes reporter-positive kloner ved PCR for at vælge en, der bærer en bi-allelisk integration af reporterkassetten inde i målstedet.
    BEMÆRK: Dette maksimerer reporterekspression og letter yderligere opløsning mellem reporter-ekspressive og reporter-tavse celler ved flowcytometri ved ETR-behandling.
    1. Uddrag genomisk DNA fra 1 × 105 celler pr. Reporter-positiv klon ved hjælp af et DNA-ekstraktionssæt (efter producentens anvisninger).
    2. Forstærk B2M-målområdet med fremadgående (5'-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3') og omvendte (5'-AATGGTTGAGTTGGAC-3') primere ved at følge instruktionerne i PCR-forstærkningssættet. Udglødningstemperaturen for dette par primere er 47,7 °C med Taq-baserede DNA-polymeraser og 0,5 μM primerkoncentrationer.
    3. Analyser PCR-produktet ved hjælp af 1% agarosegelelektroforese (efter producentens anvisninger). Skærm for kloner, der viser båndet relateret til integration af tdTomato i B2M-målstedet (3.413 bp) uden båndet relateret til vildtypemålstedet (1.027 bp).

2. Design af gRNA'er til CRISPR/dCas 9-baseret epigenetisk hæmning af målgenet

  1. Gennemse målgenet i UCSC-genombrowseren40 og ekstraher nukleotidsekvensen af regioner, der potentielt regulerer dets transkriptionelle aktivitet, såsom CpG-øer og steder beriget til H3K27-acetylering (markør for aktive promotorer og forstærkere).
    BEMÆRK: Ifølge en nylig undersøgelse er den bedste målretningsregion et vindue på 1 kilobase (kb) centreret om transkriptionsstartstedet for målgenet32.
  2. Indsæt de valgte sekvenser i Chopchop online-værktøjet, og vælg undertrykkelse som formålet med de gRNA'er, der skal hentes. Vent på, at Chopchop leverer en liste over gRNA'er, der er kortlagt på den genetiske sekvens af interesse og opført efter en score under hensyntagen til både antallet af off-target matches og den forudsagte effektivitet på målet (figur 2).
  3. Vælg mindst 10 gRNA'er pr. målsekvens. Hvis det er muligt, prøv at vælge gRNA'er, der spænder over hele regionen, der skal forhøres, uden fulde matches med andre intragene sekvenser i hele genomet.

3. Arrayed transient levering af CRISPR/dCas 9-baserede ETR'er i reportercellelinjen

  1. Blandt de transgenleveringssystemer, der tidligere er rapporteret for målcellelinjen, skal du vælge dem, der kun tillader forbigående transgenekspression, maksimerer leveringseffektiviteten og minimerer cellemanipulationsrelateret toksicitet. I tilfælde af K-562-celler anbefales både plasmid- og mRNA-nukleofektion stærkt, hvor plasmidproduktion repræsenterer et teknisk lettere og billigere alternativ.
  2. Klon både de gRNA'er, der er valgt i afsnit 2, og CRISPR/dCas9-baserede ETR'er i det valgte transgenleveringssystem. Se følgende trin for en protokol til kloning af ETR'erne i plasmid-DNA'er.
    BEMÆRK: Plasmider, der separat koder for dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A og dCas9:DNMT3L30, er ikke tilgængelige på Addgene. De blev klonet ved at erstatte VP160-transaktivatoren fra plasmidet pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41 (se materialetabel) med enten KRAB-, DNMT3A- eller DNMT3L-domænekodningssekvens30. En plasmidkodning for en alt-i-en ETR, kaldet CRISPRoff-v2.132, er tilgængelig (se materialetabel).
    1. Transformér plasmider, der koder for ETR'erne i kemisk kompetente E. coli-celler (efter producentens anvisninger). Screene kolonierne for tilstedeværelsen af det ETR-bærende plasmid ved restriktionsenzymfordøjelse og Sanger-sekventering, og vælg til sidst en af de positive kolonier til plasmid-DNA Midiprep-produktion (efter producentens anvisninger).
    2. Klon gRNA'erne inde i phU6-gRNA-rygraden (figur 3).
      1. Ved hjælp af molekylærbiologisk designsoftware tilføjes en 5'-CACCG-3' sekvens opstrøms for protospaceren (den første variabel 20 nukleotider [nt] af det valgte gRNA) for at generere en 25 nt-lang oligo i silico, kaldet SGfw.
      2. På samme måde tilføjes en 5'-AAAC-3'-sekvens opstrøms for det omvendte komplement af protospaceren af det valgte gRNA og en 5'-C-3' nedstrøms for at generere en 25 nt-lang oligo kaldet SGrv.
      3. Bestil både SGfw- og SGrv-sekvenserne som saltfrie enkeltstrengede DNA-oligoer, resuspenderet i vand ved 100 μM.
      4. Der tilsættes 1 μL af hver oligo til 2 μL udglødningsbuffer (10 mM Tris [pH 7,5-8,0], 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) og 16 μL vand.
      5. Udfør oligoglødning ved at anbringe opløsningen i en termocyklisk maskine, der er programmeret til at starte ved 95 °C i 10 minutter. Derefter afkøles gradvist til 25 °C over 45 min.
      6. Fortynd 1 μL af de udglødede oligoer med 99 μL nukleasefrit vand, og ligér derefter 1 μL af denne fortynding med 50 ng phU6-gRNA-plasmid, der tidligere er fordøjet med BsaI-restriktionsenzymet (følg instruktionerne fra BsaI og ligasekitleverandører til fordøjelses- og ligeringsproceduren).
      7. 20 μL kemisk kompetente E. coli-celler omdannes med 2 μL ligeringsprodukt (følg producentens anvisninger for transformationsproceduren).
      8. Vælg flere kolonier til plasmid-DNA Miniprep-produktion (følg leverandørens instruktioner), og kontroller den vellykkede kloning af protospaceren ved Sanger-sekventering med følgende primer, der matcher U6-promotoren 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'.
      9. Vælg en af de positive kolonier til plasmid DNA Midiprep-produktion (efter producentens anvisninger).
  3. Lever de valgte gRNA'er og CRISPR/dCas9-baserede ETR'er i reportercellelinjen i array (et specifikt gRNA pr. tilstand) (figur 3).
    BEMÆRK: Som et repræsentativt tilfælde vises arbejdsgangen for nukleofektion af plasmider, der koder for dCas9: KRAB, dCas9: DNMT3A, dCas9: DNMT3L og gRNA'er, der er målrettet mod B2M CpG-øen i B2M TdTomato K-562-celler, i de følgende trin.
    1. Forbered separate rør indeholdende 500 ng af hver af dCas9: KRAB-, dCas9: DNMT3A- og dCas9: DNMT3L-kodende plasmider, men forskellige for det gRNA, der skal testes (125 ng af et gRNA-kodende plasmid pr. Rør). Inkluder en gRNA- og ETR-fri nukleofektionstilstand som mock-behandlet prøve. Udfør skærmen med mindst tre tekniske replikater pr. prøve.
    2. Pellet 5 × 105 B2MTdTomato K-562 celler pr. Rør og nukleofekt dem med plasmidblandingen (efter producentens anvisninger).
    3. Resuspender cellerne i 200 μL tidligere opvarmede RPMI-1640 pattedyrcellekulturmedier og læg dem tilbage i inkubatoren.

4. Analyse af målgenets transkriptionelle aktivitet over tid

  1. Brug flowcytometri til at måle procentdelen af tavse celler på forskellige tidspunkter efter levering af ETR'erne (figur 4). Brug vildtypeceller (WT) - der ikke bærer fluoroforkodningssekvensen - til at indstille tærsklen for reporternegative celler. Brug den mock-behandlede prøve til at indstille porten til reporter-positive celler.
    BEMÆRK: Som foreslået i trin 1.3 skal du inkludere en genetisk forstyrrelseskontrol i eksperimentet. Dette kan være nyttigt for både at overvåge CRISPR-leveringseffektiviteten og egnetheden af celler, der er berøvet målgenet; Tabet af både transkriptionel hæmning og genetisk forstyrrelse over tid kan tilskrives essensen af målgenet i den valgte celletype. Medtag både kort- (dag 3, dag 7, dag 10) og langsigtede (dag 21, dag 35) tidspunkter for at få en indikation af både akut og langsigtet effektivitet af hæmning.
  2. Identificer de tre bedste gRNA'er med hensyn til langsigtet hæmningseffektivitet. Brug FACS til at vælge den rapporterer-negative subpopulation, der opretholdes stabilt i disse stikprøver. Udfør også FACS af de falske prøveemner for at holde dem under samme behandling som testprøverne for at muliggøre korrekt sammenligning i de efterfølgende analyser.

5. Evaluering af ETR-behandlingens specificitet ved RNA-seq og methyleret DNA-immunudfældning (MeDIP)-seq

  1. Brug RNA-seq til at evaluere enhver eventuel genom-dækkende transkriptionel deregulering ved ETR-levering.
    1. For både den reporter-tavse subpopulation af prøverne behandlet med de tre toppræsterende gRNA'er og mock-behandlede celler, ekstraheres RNA ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits. Vurder kvaliteten og koncentrationen af RNA'et ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits.
    2. Udfør RNA-fragmentering, retrotranskription og biblioteksforberedelse ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits til fremstilling af RNA-seq-biblioteker (efter producentens anvisninger).
    3. Udfør bibliotekskvantificering og kvalitetskontrol ved hjælp af kvalitetskontrolinstrumenter, der er kompatible med næste generations sekventering og digital elektroforese.
    4. Sekvensbiblioteker på en næste generations sequencer efter producentens anvisninger med en 100 bp parret protokol og sigter mod et gennemsnit på 45 M læsning/prøve.
    5. Juster læsetags til det relevante referencegenom, og kvantificer transkriptionsudtryk. Udfør justering på tdTomato-sekvensen, og kvantificer den separat.
      BEMÆRK: Her bruges STAR aligner (v 2.3.0)43, med standardparametre, koblet til Rsubread-pakke44.
    6. Udfør analyse af RNA-seq-data i henhold til offentliggjort bedste praksis45.
      BEMÆRK: R/Bioconductor-pakken edgeR46 anvendes her ved at anvende et filter på mindst et antal pr. million (cpm) i mindst tre prøver til at kassere gener med lavt udtrykt indhold. Alternativt kan filterByExpr-funktionen i edgeR bruges.
    7. Evaluer differentiel genekspression ved hjælp af en negativ binomial generaliseret log-lineær model implementeret edgeR (funktion glmFit)47. Indstil en tærskel på 0,01 på justerede p-værdier (Benjamini-Hochberg [BH] korrektion) for at bevare differentielt regulerede gener.
  2. Evaluer enhver eventuel off-target CpG-methyleringsaktivitet af ETR'erne af MeDIP-seq.
    1. For både den reportertavse subpopulation af prøverne behandlet med de tre øverste gRNA'er og mock-behandlede celler, ekstraheres genomisk DNA ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits (efter producentens instruktioner).
    2. Sonikere 500 ng genomisk DNA ved hjælp af en ultralydator og følgende parametre: Told: 20%; PIP: 175; cyklusser pr. burst: 200; Tid: 40 sek.
    3. Forbered sekventeringsbiblioteker med de kommercielt tilgængelige kits til MeDIP-seq (følg producentens anvisninger).
    4. Efter adapterligeringstrinnet kvantificeres biblioteker ved fluorometrisk assay og kontrolleres ligeringseffektiviteten ved qPCR ved hjælp af kommercielt tilgængelige bibliotekskvantificeringssæt (efter producentens anvisninger).
    5. Få bibliotekspuljer ved at blande tilfældigt udvalgte biblioteker for at reducere tekniske skævheder. Brug et lige stort biblioteksbeløb (ng) for hvert bibliotek til at afbalancere puljerne. Til hver pulje tilsættes det methylerede og umethylerede spike-in-kontrol-DNA, der leveres i sættet. Til kontrolformål skal du holde et volumen på 10% af biblioteket, mærket som "input" og ikke immunudfældet. Udfør immunudfældning på de resterende 90% af biblioteket ved hjælp af det monoklonale antistof rettet mod 5-methylcytosin, der leveres i MeDIP-seq-sættet.
    6. Rens berigede biblioteker og inputbiblioteker ved hjælp af sættene til rensning af 5-methylcytosinimmunudfældningsproduktet efter producentens anvisninger.
    7. Evaluer berigelseseffektiviteten ved at udføre kvantitativ PCR i realtid på den interne spids i kontroller ved hjælp af primere, der følger med sættet. For hver immunudfældning (IP), beregningsberigelsesspecificitet fra genvinding af methyleret og umethyleret DNA ved hjælp af cyklustærskelværdierne (Ct) for MeDIP og inputfraktioner opnået fra qPCR-reaktionen (se ligning 1 og 2):
      Equation 1 (1)
      Equation 2 (2)
      BEMÆRK: Betragt IP-biblioteker som vellykkede, hvis specificitetsværdierne er ≥0,95.
    8. Forstærk bibliotekerne ved hjælp af MeDIP-seq-biblioteksforberedelsessæt, følg producentens anvisninger, og udfør kvantificering og analyse af biblioteksstørrelsesfordeling af produktet.
    9. Udfør bibliotekssekvensering på næste generations sequencere. Brug parret sekvensering med en læselængde på 100 bp, der sigter mod et gennemsnit på 30 M læsninger/prøver.
    10. Juster sekventeringslæsekoderne til det relevante referencegenom (f.eks. hg38) ved hjælp af bwa (v 0.7.5 eller højere)48, og identificer derefter toppe ved hjælp af MACS (v 2.0.10 eller højere)49, hvilket gør det muligt at identificere brede toppe (-slocal = 0,-llocal = 500000).
    11. Opret et fælles sæt regioner fra forskellige prøver ved hjælp af BEDTools' multiskæringsværktøj50, hvilket muliggør klyngeindstillingen.
    12. Beregn dækningen pr. prøve over den endelige regionsliste ved hjælp af BEDTools' multicov, og kassér duplikerede læsninger.
    13. Udfør analyse af matrixtællingen ved hjælp af edgeR. Anvend et filter med mindst ét antal pr. million (cpm) i mindst tre prøver for at kassere områder med lav berigelse.
      BEMÆRK: Alternativt kan filterByExpr-funktionen i edgeR bruges.
    14. Identificer differentiel methylering ved at vedtage den generaliserede log-lineære model implementeret i edgeR (funktion glmFit) og normalisere ved hjælp af betinget kvantil normalisering51 for at korrigere for regionsmæssigt GC-indhold. Vælg differentielt methylerede regioner ved at anvende en tærskel på 0,01 på BH-justerede p-værdier . Udfør analysen af gentagne sekvenser som følger.
      BEMÆRK: Se brugervejledningen til edgeR for at få en komplet liste over indstillinger og parametre (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html).
      1. Filtrer MeDIP-seq-resultater for en nominel p-værdi <0,01, og opret to sæt regioner: Vælg regioner med logFC >1 i det første sæt og regioner med logFC <-1 i det andet sæt.
      2. Hent RepeatMasker-annotationen for det valgte genom som en sengefil, og tæl antallet af elementer i hvert sæt. Konverter antallet som et forhold over antallet af områder for hvert datasæt.
      3. Forholdet mellem methylom, der overlapper hver klasse af gentagelser, ekstraheres, ekstraheres, og der udføres en Chi-kvadreret test for at påvise signifikant berigelse.
  3. Evaluer, om differentielt transkriberede eller differentielt methylerede områder mellem ETR- og mock-behandlede prøver kortlægges til in silico-forudsagt off-target gRNA-binding.
    1. Brug CRISPR design suite52 som off-target gRNA binding prediction tool.
    2. For hver formodet off-target-region skal du se på det nærmeste transkriptionsstartsted (TSS) og det nærmeste methylerede område. Betragt som en ægte off-target-effekt en region, der enten er forbundet med et gen reguleret med FDR <0,01 og en afstand til TSS mindre end 10 Kb eller en methyleret region reguleret med FDR <0,01 og en afstand lavere end 1 Kb.
    3. Identificer antallet og funktionerne i regionerne transkriptionelt ændret eller overmethyleret i prøver behandlet med hver af de tre mest effektive gRNA'er sammenlignet med mock-behandlede prøver (figur 5) for at identificere de mest specifikke blandt gRNA'erne. Rangordne den potentielle indvirkning af et sted uden for målet på målcellernes fysiologi i følgende rækkefølge (fra den mest påvirkende til den mindre påvirkende):
      i) Intragent, regulatorisk region-fysiologisk udtrykt gen
      ii) Intragent, exonic region-fysiologisk udtrykt gen
      iii) Intragent, intronisk region-fysiologisk udtrykt gen
      iv) Intragent, regulatorisk region-ikke udtrykt gen
      v) Intragent, exonisk region-ikke udtrykt gen
      vi) Intragent, intronisk region-ikke udtrykt gen
      vii) Intergen region

Representative Results

Ved levering af en donorskabelon til homolog rekombinationsmedieret integration af den fluorescerende reporter i målstedet kombineret med CRISPR / Cas9-systemet (f.eks. Ved plasmidnukleofektion i tilfælde af K-562-celler) vises reporter-positive celler i den behandlede prøve (figur 1, nederst). Hvis dette ikke sker, skal du kontrollere nøjagtigheden af design og kloning af både donorskabelonen og CRISPR/Cas9-reagenser. Hvis det bekræftes, skal du prøve at optimere doserne af reagenser og selve leveringsprotokollen.

Når reportercellelinjen er opnået, skal du vælge promotor / forstærkersekvenser af målgenet og designe et panel af matchende gRNA'er. Brug in silico-forudsigelsesværktøjer som Chopchop til både at identificere gRNA-sekvenserne og rangordne dem med hensyn til forudsagt effektivitet og specificitet (figur 2). Hvis der ikke hentes gRNA'er, skal du kontrollere tilstedeværelsen af det kanoniske Cas9-protospacer-tilstødende motiv (PAM) (5'-NGG-3') i målsekvensen. Hvis der ikke er nogen PAM-sekvenser til stede, kan du overveje enten at skifte til ETR'er baseret på alternative PAM-uafhængige Cas9-varianter (ingen ETR'er offentliggjort med disse varianter endnu) eller skifte til alternative DNA-bindende domæneplatforme, såsom ZEP'er53 eller TALEs30. Men hvis kun gRNA'er med lav forudsagt effekt / specificitet hentes, skal du overveje enten 1) at teste disse gRNA'er af lav kvalitet eller 2) udvide mål-DNA-sekvensen i søgen efter bedre gRNA'er. Ved forbigående levering af den tredobbelte ETR-kombination (eller CRISPRoff; v2.1) sammen med gRNA'er udføres longitudinelle flowcytometrianalyser for ekspressionen af den fluorescerende reporter, idet der ofte observeres et højdepunkt i reporterundertrykkelse ved akutte analyser, som derefter i det mindste delvist reabsorberes på grund af mitotisk fortynding af de ETR-kodende plasmider over tid (figur 4C). Hvis ETR'erne / gRNA-kombinationen effektivt deponerer CpG-methylering på målstedet, vil permanent undertrykkelse af indberetteren forekomme i en betydelig brøkdel af behandlede celler (figur 4C). Forskellige gRNA'er kan vise variabel langsigtet hæmningseffektivitet (figur 4B, C).

Til genomdækkende specificitetsvurderinger skal du bruge MeDIP-seq til at identificere de differentielt methylerede regioner mellem celler, hvor målet har været langtidstavse og ubehandlede celler. Ideelt set vil et meget specifikt gRNA kun inducere en top af de novo CpG-methylering på målstedet (figur 5). Hvis ikke, kan man overveje at karakterisere off-target-aktiviteten af gRNA'erne rangeret i en lavere position på effektivitetslisten på målet.

Figure 1
Figur 1: Integration af en tdTomato-reporter under de regulatoriske elementer i det humane B2M-gen ved homologi-rettet reparation. Øverst: Skemaer over strategien for at integrere en tdTomato fluorescerende reporter i den første intron af det humane B2M-gen ved CRISPR/Cas9-induceret homologi-rettet reparation. Nederst: repræsentative prikplots af K-562-celler før og efter integration af tdTomato-reporteren i den første intron af B2M-genet . Forkortelser: HA = homologiarm; HDR = homologi-rettet reparation; IRES = internt ribosomindgangssted; pa = BGH poly (A); SA = splejsningsacceptorsted; WT = vildtype; 3XSTOP = tre tandemstopkodoner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: In silico-identifikation af gRNA'er rettet mod CpG-øen i B2M-genet , rangeret efter forventet effektivitet og specificitet. Chopchops outputgrænseflade, der viser gRNA'er rettet mod CpG-øen indlejret i promotorsekvensen af B2M-genet , rangeret efter både antallet af off-target-sekvenser med 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) eller 3 (MM3) mismatch og den forudsagte effektivitet på målet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kloning og arrayed nucleofection af gRNA'er til dCas9 ETR-medieret epigenetisk hæmning. Øverst: oligo-medieret protospacerkloning i et humant U6-gRNA, der udtrykker plasmid. Nederst: arrayed skærm af B2M-målrettede gRNA'er til CRISPR / dCas9-baseret epigenetisk hæmning ved plasmidnukleofektion i K-562B2M / tdTomatceller . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Screening for gRNA'er, der effektivt inducerer langsigtet hæmning af B2M-genet. (A) Top: skemaer over B2MtdTomato-genet afbildet i det udvidede område, den relative rækkefølge og orientering af binding af dCas9-baserede ETR'er kompleksbundet med gRNA'er. Nederst: repræsentative prikplots af B2MtdTomato K-562-celler enten før (venstre) eller efter (højre) ETR-lyddæmpning. Analyser 30 dage efter transfektion med plasmider, der koder for gRNA'erne og den tredobbelte dCas9:KRAB+ dCas9:D3A + dCas9:D3L-kombination. (B) Hæmningsaktivitet af de angivne gRNA'er (enten i puljer eller som individuelle gRNA'er) rettet mod CpG-øen B2M (røde pile i det øverste skema angiver orientering af gRNA'erne) i K-562 B2M tdTomatoceller på dag 30 efter transfektion. Data viser procentdelen af tdTomato-negative celler (gennemsnit ± SEM; n = fire uafhængige transfektioner for hver behandlingstilstand). (C) Tidsforløbsanalyse af B2MtdTomato K-562-celler ved transfektion med plasmider, der udtrykker den tredobbelte ETR-kombination og de angivne B2M CpG-ø-målrettede gRNA'er eller mock (gRNA- og ETR-fri transfektion). Data viser procentdelen af tdTomato-negative celler (gennemsnit ± SEM; n = tre uafhængige transfektioner for hver behandlingstilstand). Ikke-offentliggjorte data. Panelerne A og B tilpasset fra Amabile et al.30. Forkortelser: CGI = CpG ø; IRES = internt ribosomindgangssted; pa = BGH poly (A); SA = splejsningsacceptorsted; SD = splejsningsdonorsted; TSS = transskription startsted; UT = utransfekteret; 3XSTOP = 3 stopkodoner i tandem. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Genom-dækkende analyse af ETR-specificiteten ved RNA-seq og MeDIP-seq. Til venstre: sammenligning af ekspressionsniveauer i mock-behandlede B2MtdTomato K-562 celler og celler behandlet med den tredobbelte dCas9: KRAB, dCas9: DNMT3A, dCas9: DNMT3L ETR kombination og med et gRNA rettet mod CpG øen af B2M genet. Værdier udtrykkes i log2 af aflæsninger pr. kilobase pr. million (RPKM) kortlagte aflæsninger. Sorte prikker repræsenterer gener udtrykt på sammenlignelige niveauer under alle forhold; gule cirkler repræsenterer gener, der er differentielt reguleret under en FDR <0,01; rød cirkel repræsenterer B2M-IRES-tdTomato-transkriptet. Øverst til højre: cirkoplot, der viser MeDIP-seq-profiler af helgenom-MeDIP-seq-profiler af mock-behandlede B2MtdTomato K-562-celler (blå) eller celler behandlet med den tredobbelte dCas9: KRAB, dCas9: DNMT3A, dCas9: DNMT3L ETR-kombination og med et gRNA rettet mod CpG-øen (CGI) af B2M-genet (grøn). Nederst til højre: methyleringsstatus for B2MtdTomat locus i de angivne prøver vises. Tre replikater er repræsenteret i hver bunke; Bunken af justerede læsninger blev udjævnet ved hjælp af et gaussisk vindue. Denne figur blev tilpasset fra Amabile et al.30. Forkortelse: TSS = transskription start site. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Målrettet epigenetisk hæmning kan udgøre en lovende løsning til behandling af lidelser, der kan drage fordel af permanent geninaktivering, herunder sygdomme forårsaget af gain-of-function-mutationer1, infektionssygdomme2 og patologier, hvor hæmning af et gen enten kan kompensere for en arvelig defekt i et andet3 eller frigøre det fulde potentiale af adoptivcelleterapier4. 5. Ved at virke på kromatinniveau og blive autoformeret af cellen 7,30,32 kan epigenetisk hæmning undgå toksiske ændringer (f.eks. kromosomale omlejringer) af DNA-sekvensen af målgenet og delvis, forbigående hæmning af målet, som er begrænsninger for henholdsvis kunstig nukleasebaseret genforstyrrelse8,34,35 og RNAi-baseret knockdown 33.

Et af de vigtigste indledende trin i enhver epigenetisk hæmningsprotokol er at identificere den korrekte position på målgenet for at dirigere ETR'erne, der vil deponere de undertrykkende epigenetiske mærker, der er nødvendige for at slukke for målets transkriptionelle aktivitet. Forskellige transkriptionelle startsted-proksimale og -distale regulatoriske elementer kan være enige om at understøtte transkriptionel produktion af et givet humant gen54. Desuden kan der nu identificeres forskellige målsteder pr. specifikt reguleringselement takket være det stigende antal programmerbare DNA-bindingsteknologier6. Derfor kan protokoller, som den, der er beskrevet her i konstruerede cellelinjer, bruges til at nominere individuelle målsteder og / eller genomiske regioner, der er modtagelige for ETR-medieret epigenetisk hæmning, inden man går i gang med besværlig og tidskrævende evalueringsindsats af de bedste kandidater i den endelige terapeutiske indstilling. Nogle kritiske aspekter af protokollen beskrives yderligere nedenfor.

Konstruktion af en reportercellelinje, der forudsiger det endelige terapeutiske mål
På trods af den konstante optimering af celletekniske protokoller - der kræves her for at indsætte kassettekodningen for den fluorescerende reporter i målgenet og for at levere ETR'erne - kan det ikke tages for givet, at de måske allerede er tilgængelige for den cellelinje, der mest ligner det endelige terapeutiske mål mest. I dette tilfælde kan forskellige afbødningsstrategier anvendes: a) drage fordel af optimeringssæt leveret af leverandører til internt at optimere transfektionsprotokollen for målcellelinjen; b) skift til andre cellelinjer, der stadig udtrykker dette målgen, men tilhører andre væv end det endelige terapeutiske mål, for hvilke der er udviklet omfattende tekniske protokoller. Hvis disse muligheder ikke er tilgængelige, kan man overveje at skifte til primære celletyper eller organoider, der repræsenterer det endelige mål. Som en generel overvejelse for både prækliniske undersøgelser og terapeutiske anvendelser af ETR-baseret epigenetisk hæmning bør scenarier, hvor målgenet er afgørende for målcelletypen, kasseres. Den fuldstændige, langsigtede hæmning af et essentielt gen, der pålægges af ETR'erne, vil føre til modudvælgelse af målcellerne over tid (og potentielt toksicitet af behandlingen). Alternative teknologier, der giver delvis målabrogation, såsom RNAi33, foretrækkes i disse tilfælde.

Evaluering af ETR'ernes dæmpningsaktivitet på målet
ETR'er baseret på kombinationen af KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-effektordomæner har vist sig at være effektive mod det store flertal af proteinkodende gener med et bredt omkring 1 kilobase lang-tilladende målretningsvindue centreret på transkriptionsstartstedet32. For at få en fornemmelse af, hvordan et veludført epigenetisk hæmningseksperiment ser ud, gives de tekniske detaljer og resultater af hæmning af B2M-genet i K-562-celler her. Dette kan betragtes som en vigtig positiv kontrol, der ikke kun skal inkluderes af forskere, der arbejder med K-562-celler, men også af dem, der nærmer sig den ETR-baserede teknologi for første gang. Som anført i protokollen anbefales kunstig nuklease (f.eks. CRISPR/Cas9)-baseret genforstyrrelse som en yderligere kontrol af både effektiviteten af genlevering i den pågældende celletype og fænotypen af celler, der er berøvet målgenet. Efter den indledende screening af gRNA'er, der skal kobles med de CRISPR/dCas9-baserede ETR'er, hvis ingen af de testede gRNA'er er i stand til permanent at tavse målgenet, bør man overveje i følgende rækkefølge: 1) at øge mængden af leverede gRNA'er og ETR'er; 2) test af puljer af de bedste gRNA'er på udkig efter synergistiske effekter mellem dem. Hvis langsigtet hæmning stadig ikke opnås, bør man overveje: 3) at teste yderligere gRNA'er, som kan målrette mod steder, der er mere relevante for at instruere epigenetisk hæmning; 4) skift til ZFP8- eller TALE9-baserede DBD-platforme, som kan have en forbedret bindingskapacitet til målkromatinet; 5) skift fra forbigående til stabil - for eksempel integrering af viral vektorbaseret ekspression af ETR'erne (enten gRNA- eller dCas9-fusionskonstruktionerne eller begge dele, når CRISPR / dCas9-teknologien vedtages). Da vores gruppe udviklede og har solid erfaring med fælles levering af de tre separate ETR'er30, er protokollen og resultaterne vist her baseret på denne tilgang. Imidlertid kan en lignende konceptuel arbejdsgang sandsynligvis anvendes til et alt-i-et CRISPR-baseret system32.

Evaluering af ETR'ernes ikke-målrelaterede aktivitet
Flere undersøgelser har vist foreløbige in vitro-indikationer af specificiteten af ETR'er baseret på kombinationen af KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-effektordomæner30,31,32. Men hvis ingen af de testede gRNA'er viser en tilfredsstillende specificitetsprofil med hensyn til transkriptionsregulering og/eller de novo DNA-methylering, kan man forfølge to strategier, der ikke udelukker hinanden: a) at reducere opholdstiden for ETR'erne inde i cellen (og dermed deres potentielle off-target-aktivitet) ved enten at reducere doserne af ETR'er eller teste alternative leveringssystemer. For eksempel forventes både mRNA og proteinlevering sammenlignet med plasmider at reducere celleeksponeringstiden for ETR'erne og følgelig sandsynligheden for aktivitet uden for målet55; b) skifte til nyere Cas9-varianter, optimeret til at reducere off-target-bindingen af platform56 eller til alternative ZFP8- eller TALE9-baserede DNA-bindingsteknologier. Det er vigtigt at tage i betragtning, at sammenlignet med mock-behandlede prøver påvirkes genhæmningens on-target og off-target aktivitet ikke kun af DBD's binding til deres målsekvens, men også af den potentielle kapacitet af de epigenetiske effektordomæner, der kan rekrutteres til andre loci ved deres naturlige, endogene cofaktorer. En reduktion af opholdstiden for ETR'erne i målcellen kan derfor mindske ikke blot sandsynligheden for binding af DBD til steder uden for målområdet, men også sandsynligheden for, at ETR'erne interagerer med endogene cofaktorer med potentielle fordele i form af specificitet og ulemper med hensyn til aktivitet på målet. Endelig, sammenlignet med mock-behandlede prøver, kan nogle af de transkriptionelle og mindre sandsynlige CpG-methyleringsændringer målt i tavse celler simpelthen udledes ved berøvelse af målgenet. Disse betragtes ikke som ikke-mål for lyddæmpningsteknologien. For at identificere dem bør man også inkludere genforstyrrelse ved kunstig nuklease i forsøgspanelet 8,9,10. Biologiske ændringer som følge af det funktionelle tab af målgenet vil blive delt mellem epigenetisk hæmning og denne alternative teknologi.

Disclosures

AL er medstifter, kvoteindehaver og konsulent for Chroma Medicine, Inc.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica og Deborah Cipria for den fælles indsats for at udvikle den epigenetiske hæmningsteknologi gennem årene; Dejan Lazarevic og Francesca Giannese for kritisk gennemgang af RNA-seq og MeDIP-seq analyserne beskrevet i protokollen. Dette arbejde blev støttet af tilskud til A.L. fra Telethon Foundation (TIGET-bevilling nr. F1) og EU's Horizon 2020-program (UPGRADE). Der er skabt illustrationer med BioRender.com.

FORFATTERNES BIDRAG
A.M., M.A.C., F.G. og A.C. bidrog til udformningen af protokollen og til at skrive manuskriptet; S.V., I.M. og D.C. designede protokollens bioinformatikafsnit og reviderede manuskriptet; A.M. og A.L. designede protokollen, udtænkte og skrev manuskriptet med input fra alle forfatterne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4200 TapeStation System Agilent G2991BA DNA quantification
4D-Nucleofector X Unit Lonza Bioscience  AAF-1003X Nucleofection
B2M silencing gRNA #1   Lombardo's lab  GCAATCAGGACAAGGCCCGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #2  Lombardo's lab  GGGGTAGGAGAGACTCACGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #3  Lombardo's lab  GAGTCCAGGGCTGGATCTCG Gene silencing
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer BD Biosciences https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion Fluorescence Activated Cell Sorting
bedtools Bedtools http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Processing of genomic intervals
bwa Ih3 https://github.com/lh3/bwa Alignment of MeDIP-seq reads
Chopchop  Valen's lab http://chopchop.cbu.uib.no/ gRNA selection software
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine Corning 10-040-CV Cell culture
cqn Bioconductor http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html Region-wise normalization by GC-content
CRISPR design suite Zhang's lab https://zlab.bio/resources-2 off-target gRNA binding prediction 
CRISPRoff-v2.1 plasmid Addgene  167981 Gene silencing
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer  Beckman Coulter C01161 Flow cytometry
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab 

ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt
actgtgggcataaattaatttttcagttaagttttgg
aagcttaaataactctccaaaagtcataaagcc
agtaactggttgagcccaaattcaaacccagc
ctgtctgatacttgtcctcttcttagaaaagattac
agtgatgctctcacaaaatcttgccgccttccct
caaacagagagttccaggcaggatgaatctgt
gctctgatccctgaggcatttaatatgttcttatta
ttagaagctcagatgcaaagagctctcttagct
tttaatgttatgaaaaaaatcaggtcttcattaga
ttccccaatccacctcttactagtctgacctcttct
cttcctcccacagggataactagatgactcgag
ggatccgaattcctgcaggcctcgacgagggc
cggcgcgccgcggccgctacgtaaattccgc
cccccccccccctctccctcccccccccctaac
gttactggccgaagccgcttggaataaggccg
gtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgc
cgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacct
ggccctgtcttcttgacgagcattcctagggg
tctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtc
tgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctg
gaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagc
gaccctttgcaggcagcggaaccccccacctg
gcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacg
tgtataagatacacctgcaaaggcggcacaac
cccagtgccacgttgtgagttggatagttgtgga
aagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaac
aaggggctgaaggatgcccagaaggtacccc
attgtatgggatctgatctggggcctcggtgcaca
tgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacg
tctaggccccccgaaccacggggacgtggtttt
cctttgaaaaacacgatgataatatggccacaa
ccatggtgagcaagggcgaggaggtcatcaa
agagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcgaggg
cgagggcgagggccgcccctacgagggcac
ccagaccgccaagctgaaggtgaccaaggg
cggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtc
cccccagttcatgtacggctccaaggcgtacg
tgaagcaccccgccgacatccccgattacaag
aagctgtccttccccgagggcttcaagtgggag
cgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtg
accgtgacccaggactcctccctgcaggacgg
cacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggca
ccaacttcccccccgacggccccgtaatgcag
aagaagaccatgggctgggaggcctccaccg
agcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaa
gggcgagatccaccaggccctgaagctgaa
ggacggcggccactacctggtggagttcaag
accatctacatggccaagaagcccgtgcaac
tgcccggctactactacgtggacaccaagctg
gacatcacctcccacaacgaggactacacca
tcgtggaacagtacgagcgctccgagggccg
ccaccacctgttcctggggcatggcaccggca
gcaccggcagcggcagctccggcaccgcctc
ctccgaggacaacaacatggccgtcatcaaa
gagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcga
gggcgagggcgagggccgcccctacgag
ggcacccagaccgccaagctgaaggtgac
caagggcggccccctgcccttcgcctgggac
atcctgtccccccagttcatgtacggctccaa
ggcgtacgtgaagcaccccgccgacatcccc
gattacaagaagctgtccttccccgagggcttc
aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggac
ggcggtctggtgaccgtgacccaggactcct
ccctgcaggacggcacgctgatctacaaggt
gaagatgcgcggcaccaacttcccccccga
cggccccgtaatgcagaagaagaccatggg
ctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccc
cgcgacggcgtgctgaagggcgagatccac
caggccctgaagctgaaggacggcggcca
ctacctggtggagttcaagaccatctacatggc
caagaagcccgtgcaactgcccggctactact
acgtggacaccaagctggacatcacctccca
caacgaggactacaccatcgtggaacagtac
gagcgctccgagggccgccaccacctgttcct
gtacggcatggacgagctgtacaagtaagcgg
ccgcgtcgacctgtgccttctagttgccagccatc
tgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccct
ggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataa
aatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtagg
tgtcattctattctggggggtggggtggggcag
gacagcaagggggaggattgggaagacaat
agcaggcatgctggggatgcggtgggctctat
ggcttaagtgatggggctagtagcctttccttaa
tgatagggtgtttctagagagatatatctggtca
aggtggcctggtactcctccttctccccacagc
ctcccagacaaggaggagtagctgccttttag
tgatcatgtaccctgaatataagtgtatttaaaag
aattttatacacatatatttagtgtcaatctgtatat
ttagtagcactaacacttctcttcattttcaatga
aaaatatagagtttataatattttcttcccacttc
cccatggatggtctagtcatgcctctcattttgg
aaagtactgtttctgaaacattaggcaatatatt
cccaacctggctagtttacagcaactgca

 Genetic engineering
E220 Focused-ultrasonicator Covaris 500239 DNA sonication
edgeR Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html Differential abundance testing
EnGen Mutation Detection Kit NEB E3321 Gene disruption quantification
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 Cell culture
Flowjo BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo Flow cytometry data analysis software
Gel Loading Dye, Purple (6x) NEB B7024S DNA gel loading
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase Promega M7401 PCR amplification
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AGGCTACTAGCCCCATCAAG Genetic engineering
hCas9 plasmid Addgene  41815 Genetic engineering
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent 5067-5585 DNA quantification
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 DNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 RNA quantification
IPure kit Diagenode C03010011  Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product
K-562 cells ATCC CCL-243 Cell engineering
KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824 MeDIP-Seq libraries preparation
MACS2 Taoliu https://github.com/macs3-project/MACS Identification of methyl-enriched regions
MagMeDIP kit Diagenode C02010020  5-methylcytosine immunoprecipitation
NextFlex Methylseq kit 1  Bioo Scientific 5118-01 MeDIP-Seq libraries preparation
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 Illumina SY-415-1002 / 20012850 Next Generation Sequencing
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA Macherey-nagel 740410.50 Midiprep plasmid preparation
One Shot TOP10 Chemically Competent  cells  ThermoFisher C404010 Plasmid transformation
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid Addgene  48240 Gene activation
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Cell culture
phU6.sgRNA plasmid Addgene  53188 Genetic engineering
PowerPac Basic Power Supply Biorad 1645050 Agarose gel electrophoresis
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  GTATTTGCTGGTTATGTTAG Genetic engineering
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AATGGTTGAGTTGGAC Genetic engineering
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen 51304 DNA extraction
Qubit Thermo Fisher Q33238 DNA quantification
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32852 RNA quantification
Restriction enzymes NEB DNA digestion
RNeasy Mini kit  Qiagen 74106 RNA extraction
Rsubread Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html Quantification of gene expression
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza Bioscience  V4XC-2032 Nucleofection
SnapGene Dotmatics https://www.snapgene.com/ Molecular biology design software
STAR Alexander Dobin https://github.com/alexdobin/STAR Alignment of RNA-seq reads
T100 Thermal Cycler Biorad 1861096 PCR amplification
T4 DNA Ligase Promega M1801 DNA ligation
TAE Buffer Fisher scientific BP1332500 Agarose gel electrophoresis
TruSeq Stranded Total RNA kit  Illumina 20020597 RNA-Seq library preparation
UltraPure Agarose ThermoFisher 16500500 Agarose gel 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cummings, C. J., Zoghbi, H. Y. Fourteen and counting: unraveling trinucleotide repeat diseases. Human Molecular Genetics. 9 (6), 909-916 (2000).
  2. Tebas, P., et al. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. The New England Journal of Medicine. 370 (10), 901-910 (2014).
  3. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. Murty, T., Gene Mackall, C. L. Gene editing to enhance the efficacy of cancer cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3153-3162 (2021).
  5. Lanza, R., Russell, D. W., Nagy, A. Engineering universal cells that evade immune detection. Nature Reviews Immunology. 19 (12), 723-733 (2019).
  6. Matharu, N., Ahituv, N. Modulating gene regulation to treat genetic disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (11), 757-775 (2020).
  7. Sgro, A., Blancafort, P. Epigenome engineering: New technologies for precision medicine. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12453-12482 (2020).
  8. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  9. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: A widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  11. Gilbert, L. A., et al. XCRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442 (2013).
  12. Snowden, A. W., Gregory, P. D., Case, C. C., Pabo, C. O. Gene-specific targeting of H3K9 methylation is sufficient for initiating repression in vivo. Current Biology. 12 (24), 2159-2166 (2002).
  13. Chen, X., et al. Construction and validation of the CRISPR/dCas9-EZH2 system for targeted H3K27Me3 modification. Biochemical and Biophysical Research Communications. 511 (2), 246-252 (2019).
  14. Kwon, D. Y., Zhao, Y. T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nature Communications. 8, 15215 (2017).
  15. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  16. Ecco, G., Imbeault, M., Trono, D. KRAB zinc finger proteins. Development. 144 (15), 2719-2729 (2017).
  17. Witzgall, R., O'leary, E., Leaf, A., Onaldi, D., Bonventre, J. The Kruppel-associated box-A (KRAB-A) domain of zinc finger proteins mediates transcriptional repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (10), 4514-4518 (1994).
  18. Mannini, R., et al. Structure/function of KRAB repression domains: Structural properties of KRAB modules inferred from hydrodynamic, circular dichroism, and FTIR spectroscopic analyses. Proteins: Structure, Function and Genetics. 62 (3), 604-616 (2006).
  19. Friedman, J. R., et al. KAP-1, a novel corepressor for the highly conserved KRAB repression domain. Genes and Development. 10 (16), 2067-2078 (1996).
  20. Iyengar, S., Farnham, P. J. KAP1 protein: An enigmatic master regulator of the genome. The Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26267-26276 (2011).
  21. Schultz, D. C., Friedman, J. R., Rauscher, F. J. Targeting histone deacetylase complexes via KRAB-zinc finger proteins: The PHD and bromodomains of KAP-1 form a cooperative unit that recruits a novel isoform of the Mi-2α subunit of NuRD. Genes and Development. 15 (4), 428-443 (2001).
  22. Schultz, D. C., Ayyanathan, K., Negorev, D., Maul, G. G., Rauscher, F. J. SETDB1: A novel KAP-1-associated histone H3, lysine 9-specific methyltransferase that contributes to HP1-mediated silencing of euchromatic genes by KRAB zinc-finger proteins. Genes and Development. 16 (8), 919-932 (2002).
  23. Nielsen, A. L., et al. Interaction with members of the heterochromatin protein 1 (HP1) family and histone deacetylation are differentially involved in transcriptional silencing by members of the TIF1 family. The EMBO Journal. 18 (22), 6385-6395 (1999).
  24. Sripathy, S. P., Stevens, J., Schultz, D. C. The KAP1 corepressor functions to coordinate the assembly of de novo HP1-demarcated microenvironments of heterochromatin required for KRAB zinc finger protein-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 26 (22), 8623-8638 (2006).
  25. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. ChemBioChem. 12 (2), 206-222 (2011).
  26. Jia, D., Jurkowska, R. Z., Zhang, X., Jeltsch, A., Cheng, X. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature. 449 (7159), 248-251 (2007).
  27. Tajima, S., Suetake, I., Takeshita, K., Nakagawa, A., Kimura, H. Domain structure of the Dnmt1, Dnmt3a, and Dnmt3b DNA methyltransferases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 945, 63-86 (2016).
  28. Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  29. Ishiyama, S., et al. Structure of the Dnmt1 reader module complexed with a unique two-mono-ubiquitin mark on histone H3 reveals the basis for DNA methylation maintenance. Molecular Cell. 68 (2), 350.e7-360.e7 (2017).
  30. Amabile, A., et al. Inheritable silencing of endogenous genes by hit-and-run targeted epigenetic editing. Cell. 167 (1), 219.e14-232.e14 (2016).
  31. Mlambo, T., et al. Designer epigenome modifiers enable robust and sustained gene silencing in clinically relevant human cells. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4456-4468 (2018).
  32. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503.e17-2519.e17 (2021).
  33. Davidson, B. L., McCray, P. B. Current prospects for RNA interference-based therapies. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 329-340 (2011).
  34. Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B., Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nature Medicine. 24 (7), 927-930 (2018).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  37. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  38. Uhlén, M., et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), (2015).
  39. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  40. Kent, W. J., et al. The Human Genome Browser at UCSC. Genome Research. 12 (6), 996-1006 (2002).
  41. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  42. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
  43. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  44. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. The Subread aligner: fast, accurate and scalable read mapping by seed-and-vote. Nucleic Acids Research. 41 (10), e108-e108 (2013).
  45. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. GenomeBiology. 17, 13 (2016).
  46. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  47. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  48. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  49. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), R137 (2008).
  50. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 47, (2014).
  51. Hansen, K. D., Irizarry, R. A., Wu, Z. Removing technical variability in RNA-seq data using conditional quantile normalization. Biostatistics. 13 (2), 204-216 (2012).
  52. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  53. Zeitler, B., et al. Allele-selective transcriptional repression of mutant HTT for the treatment of Huntington's disease. Nature Medicine. 25 (7), 1131-1142 (2019).
  54. Andersson, R., Sandelin, A. Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements. Nature Reviews Genetics. 21 (2), 71-87 (2020).
  55. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  56. Han, H. A., Pang, J. K. S., Soh, B. -S. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. Journal of Molecular Medicine. 98 (5), 615-632 (2020).

Tags

Bioengineering udgave 195 målrettet epigenetisk hæmning geninaktivering RNA-interferens kunstige nukleaser DNA-dobbeltstrengsbrud epigenetisk redigering programmerbart DNA-bindende domæne KREB-domæne DNMT3A DNMT3L arvelige undertrykkende epigenetiske tilstande hit-and-run-natur DNA-demethylering
<em>In vitro</em> Udvælgelse af konstruerede transkriptionelle repressorer til målrettet epigenetisk hæmning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Migliara, A., Cappelluti, M. A.,… More

Migliara, A., Cappelluti, M. A., Giannese, F., Valsoni, S., Coglot, A., Merelli, I., Cittaro, D., Lombardo, A. In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing. J. Vis. Exp. (195), e64403, doi:10.3791/64403 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter