Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In Vitro Выбор инженерных транскрипционных репрессоров для таргетного эпигенетического подавления

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64403
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 2, 1,4
1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget), IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences, IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

Summary

В данной работе мы представляем протокол отбора in vitro инженерных транскрипционных репрессоров (ETR) с высокой, долгосрочной, стабильной, целевой эффективностью подавления и низкой общегеномной внецелевой активностью. Этот рабочий процесс позволяет свести первоначальный сложный репертуар кандидатов ETR к короткому списку, пригодному для дальнейшей оценки в терапевтически значимых условиях.

Abstract

Инактивация генов играет важную роль в изучении функции генов и представляет собой перспективную стратегию лечения широкого спектра заболеваний. Среди традиционных технологий РНК-интерференция страдает от частичной отмены мишени и требует пожизненного лечения. В отличие от них, искусственные нуклеазы могут обеспечить стабильную инактивацию генов через индукцию двухцепочечного разрыва ДНК (DSB), но недавние исследования ставят под сомнение безопасность этого подхода. Целенаправленное эпигенетическое редактирование с помощью инженерных транскрипционных репрессоров (ETR) может представлять собой решение, поскольку однократное введение определенных комбинаций ETR может привести к длительному подавлению без индуцирования разрывов ДНК.

ETR — это белки, содержащие программируемый ДНК-связывающий домен (DBD) и эффекторы из встречающихся в природе транскрипционных репрессоров. В частности, было показано, что комбинация из трех ETR, оснащенных доменом KRAB человеческого ZNF10, каталитическим доменом DNMT3A человека и DNMT3L человека, индуцирует наследуемые репрессивные эпигенетические состояния на гене-мишени ETR. Характер этой платформы, отсутствие влияния на последовательность ДНК мишени и возможность возврата к репрессивному состоянию путем деметилирования ДНК по требованию делают эпигенетическое молчание инструментом, меняющим правила игры. Критическим этапом является определение правильного положения ETR на гене-мишени для максимизации целевого и минимизации нецелевого молчания. Выполнение этого этапа в доклинических условиях ex vivo или in vivo может быть обременительным.

Взяв CRISPR/каталитически мертвую систему Cas9 в качестве парадигматического DBD для ETR, в этой статье описывается протокол, состоящий из скрининга in vitro направляющих РНК (гРНК) в сочетании с комбинацией triple-ETR для эффективного подавления на мишени с последующей оценкой полногеномного профиля специфичности топ-хитов. Это позволяет свести первоначальный репертуар гРНК-кандидатов к короткому списку перспективных, сложность которых подходит для их окончательной оценки в интересующих терапевтически значимых условиях.

Introduction

Инактивация генов традиционно играла ключевую роль в изучении функции генов как в клеточных, так и в животных моделях. Кроме того, в последние два десятилетия, с развитием генной терапии, она была предложена в качестве потенциально революционного подхода к лечению заболеваний, вызванных мутациями усиления функции1, инфекционными заболеваниями2 или патологиями, при которых подавление одного гена может компенсировать наследственный дефект вдругом. Наконец, была предложена генетическая инактивация ключевых регуляторов клеточной приспособленности и функционального контроля для повышения эффективности клеточных продуктов для иммунотерапии рака4 и регенеративной медицины5.

Среди различных технологий инактивации генов одной из наиболее перспективных является таргетная эпигенетическая подавление 6,7. В основе этой технологии лежат так называемые инженерные транскрипционные репрессоры (ETR), химерные белки, состоящие из программируемого ДНК-связывающего домена (DBD) и эффекторного домена (ED) с эпигенетической репрессивной функцией. Белки цинковых пальцев (ZFPs)8, эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALEs)9 или DBD на основе CRISPR/dCas910 могут быть разработаны для селективного связывания ЭД с последовательностью промотора/энхансера гена-мишени, который необходимо замолчать. Оказавшись там, ЭД ETR выполняет свою активность по подавлению, накладывая гетерохроматин-индуцирующие репрессивные эпигенетические метки, такие как модификации гистонов (метилирование H3K9 11,12 или H3K27 13, деацетилированиеH3 или H414) и метилирование ДНКCpG 15, в зависимости от используемого репрессивного домена.

В частности, под влиянием молекулярных процессов перманентной транскрипционной репрессии эндогенных ретровирусов, происходящих в преимплантационном эмбрионе16, была создана комбинация из трех ETR для использования следующих ЭД: i) Krüppel-ассоциированный бокс-домен (KRAB) человеческого ZNF10; ii) каталитический домен человеческой de novo ДНК-метилтрансферазы 3A (DNMT3A); и iii) полноразмерная ДНК-метилтрансфераза 3-типа человека (DNMT3L). KRAB представляет собой консервативный репрессивный домен, общий для нескольких ZFP у высших позвоночных17,18, чья активность сайленсинга в основном основана на его способности рекрутировать KAP1 19-белок-каркас, который затем взаимодействует с несколькими другими индукторами гетерохроматина 20, включающими комплекс ремоделирования и деацетилирования нуклеосом (NuRD) 21, H3K9-гистон-метилтрансферазу SETDB122 и считыватель метилирования H3K9 HP1 23, 24, среди прочих.

DNMT3A активно переносит метильные группы на ДНК в последовательностях CpG25. Каталитическая активность DNMT3A усиливается его физической ассоциацией с DNMT3L, ограниченным эмбрионами и половыми клетками паралогом DNMT3A, в котором отсутствует каталитический домен, ответственный за перенос метильной группы26,27. Метилирование ДНК в богатых CpG областях, называемых островками CpG (CGI), встроенных в промоторные/энхансерные элементы генов млекопитающих, обычно связано с подавлением транскрипции28. Важно отметить, что после депонирования метилирование CpG может стабильно наследоваться на протяжении всего митоза молекулярным комплексом на основе UHRF1-DNMT129.

Стабильная гиперэкспрессия ETR в клетке-мишени может быть проблематичной, вероятно, из-за растущего риска нецелевой активности и подавления эндогенных интеракторов из их физиологических целевых участков с течением времени. Тем не менее, транзиторная экспрессия одиночных фрагментов ETR может не вызывать длительного подавления с высокойэффективностью 30, что затрудняет их терапевтическое применение. Таким образом, основополагающим прорывом в этой области стало доказательство того, что комбинация трех ETR на основе KRAB, DNMT3A и DNMT3L может синергизировать и, даже при временной совместной доставке, накладывать на промоторную последовательность гена-мишени H3K9 и метилирование CpG. Затем они считываются и размножаются клеткой на протяжении всего митоза, что приводит к наследуемому молчанию в нескольких клеточных линиях человека и мышей, а также в первичныхклетках ex vivo.

Следует отметить, что эпигенетическое подавление, налагаемое ETR, может быть обращено вспять по требованию путем целенаправленного (например, рекрутирование ДНК-деметилазы TET1 на основе CRISPR/dCas9 на заглушенный локус) или фармакологического (введение ингибитора ДНК-метилтрансферазы 5-Aza) деметилированияДНК 30, потенциального антидота в случае нежелательных явлений, связанных с ETR. Также были описаны универсальные ETR, содержащие три ЭД на основе KRAB, DNMT3A и DNMT3L, демонстрирующие значительную эффективность подавления в клеточных линиях31,32 против подавляющего большинства генов, кодирующих белки. Кроме того, в нескольких исследованиях с использованием ETR сообщалось о высоком профиле безопасности, без значительной нецелевой активности с точки зрения de novo метилирования CpG или изменения доступности хроматина30,31,32. Тем не менее, перед клиническим применением рекомендуется провести специальный анализ профиля специфичности ETR, оснащенных недавно разработанным DBD.

С клинической точки зрения, таргетное эпигенетическое подавление может обеспечить критические преимущества как для нокдауна33 на основе РНК-интерференции (РНК-интерференции), так и для искусственного разрушения генов на основе нуклеазы8. В отличие от РНК-интерференции, таргетное эпигенетическое молчание может индуцировать полную отмену своей мишени для каждой клетки и не требует периодического лечения для обеспечения долгосрочного молчания; В отличие от разрушения генов, он оставляет последовательность ДНК неизменной, избегая образования двухцепочечных разрывов ДНК (DSB). Затем DSB могут индуцировать апоптоз и остановку клеточного цикла, потенциально приводя к отбору против клеток с функциональным путем p5334,35 и, особенно в условиях мультиплексного редактирования генов, хромосомными перестройками 35. Кроме того, ретранслируя необратимый мозаичный результат не гомологичной репарации DSB ДНК36, опосредованной концевым соединением, разрушение гена не может избежать внутрикадровой репарации мишени в функциональные кодирующие последовательности в качестве одного из конечных результатов и, в отличие от эпигенетического молчания, не может быть стерто по требованию.

Наконец, эпигенетическое молчание обладает потенциалом для расширения диапазона целевых генетических элементов до классов, полностью или, по крайней мере, частично рефрактерных к РНК-интерференции и разрушению генов, таких как нетранскрибируемые регуляторные элементы и некодирующие РНК30,32. Первым критическим шагом для любого целевого приложения эпигенетического подавления является разработка панели ETR, охватывающей различные регуляторные последовательности гена-мишени, и определение наиболее эффективных из них. Количество ETR, подлежащих тестированию, может иметь решающее значение, учитывая растущую часть генома, которая может быть нацелена программируемыми технологиями связывания ДНК, которыепостоянно разрабатываются. Выполнение скрининга ETR непосредственно на типе клеток, в котором терапевтическое подавление гена-мишени является наиболее подходящим вариантом. Тем не менее, высокопроизводительные экраны могут быть технически громоздкими в первичных клетках из-за их ограниченной выживаемости в культуре и их часто неоптимальной инженерной способности. Крупномасштабные экраны могут быть еще более неосуществимыми in vivo.

Более практичная альтернатива состоит в том, чтобы сначала провести первоначальный скрининг большой панели ETR в легко конструируемых клеточных линиях, а затем валидировать только наиболее перспективные из них в терапевтически значимом типе клеток. Параллельной проблемой является выбор соответствующего показания для измерения эффективности глушения ETR. Непосредственная оценка уровня транскрипта или белка гена-мишени с помощью ОТ-кПЦР, вестерн-блоттинга или ИФА может быть дорогостоящей и трудоемкой, а также может не иметь достаточной чувствительности, что ограничивает их применение в высокопроизводительных масштабах. Генерация специально спроектированных репортерных клеточных линий, в которых флуорофор находится под транскрипционным контролем регуляторных последовательностей гена-мишени, позволяет использовать подход, основанный на проточной цитометрии, для считывания эпигенетического сайленсинга на уровне одной клетки и с высокой пропускной способностью.

Следуя этим общим соображениям, в данной статье описывается протокол, состоящий из массивного скрининга ETR in vitro для повышения эффективности подавления на мишени с последующей оценкой полногеномной внецелевой активности топ-хитов. Этот рабочий процесс позволяет сократить первоначальный репертуар ETR-кандидатов до короткого списка перспективных, сложность которых подходит для их окончательной оценки в интересующем терапевтически значимом типе клеток.

Среди различных программируемых DBD, которые могут быть использованы для генерации ETR, этот протокол будет сосредоточен на технологии на основе CRISPR/dCas9 из-за простоты разработки гРНК, охватывающих промотор гена-мишени в масштабе высокой пропускной способности. Тем не менее, тот же концептуальный рабочий процесс, описанный ниже, может быть использован для оценки эффективности и специфичности ETR, оснащенных другими DBD.

Protocol

1. Разработка флуоресцентной репортерной клеточной линии для мониторинга транскрипционной активности гена-мишени методом проточной цитометрии

  1. Идентификация клеточных линий, экспрессирующих ген-мишень, который необходимо заставить замолчать. Просмотрите ген-мишень, который нужно заглушить, в Атласе белков человека38 и перейдите по разделу «Клеточная линия», чтобы определить те линии, которые представляют интересующую соматическую ткань (например, линию клеток печени, если конечными мишенями являются гепатоциты печени). В качестве альтернативы можно обратиться к общедоступной базе данных секвенирования РНК (RNA-Seq) (например, NCBI GEO).
  2. Среди кандидатов следует отдавать предпочтение клеточным линиям, для которых доступны эффективные протоколы доставки транзиторных генов, инструментальные для доставки ETR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среди различных методов нуклеофекция представляет собой один из лучших вариантов, поскольку она обеспечивает высокую эффективность трансфекции. Здесь клетки эритролейкоза человека K-562 были выбраны для создания клеточной линии, сообщающей о транскрипционной активности гена бета-2-микроглобулина (B2M) (далее именуемого клетками B2MTdTomato K-562).
  3. Кроме того, следует отдавать приоритет кандидатам, избегая клеточных линий, в которых ген-мишень необходим для жизнеспособности клеток, так как это ухудшает поддержание клеток со стабильным подавлением целевого гена в культуре. Если об этом не сообщалось ранее, чтобы иметь представление о важности гена-мишени в выбранном типе клетки, необходимо обеспечить контроль генетического нарушения путем трансфекции клеток нуклеазой Cas9 и гРНК, нацеленной на один из первых кодирующих экзонов гена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Генетический сбой является стабильным событием по определению; Контротбор разрушенных клеток с течением времени указывает на то, что ген-мишень имеет важное значение для физиологии выбранной клетки.
    1. Определите целевую изоформу сплайсинга, предпочтительно используемую в выбранной клеточной линии (изоформа NM_004048.4 гена B2M является мишенью в этом протоколе).
    2. Определите гРНК, которая может эффективно и специфически разрезаться в первом кодирующем экзоне целевой изоформы (например, Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/)39, который является валидным и удобным онлайн-инструментом выбора гРНК).
    3. Для клеток К-562 трансфицируют 1 мкг плазмиды, кодирующей sp Cas9 (hCas9; см. таблицу материалов) и 250 нг плазмиды, кодирующей гРНК (phU6-гРНК; см. таблицу материалов) на 5 × 105 клеток путем нуклеофекции (в соответствии с инструкцией производителя).
    4. Культивирование клеток (клетки К-562 при 37 °C при 5%СО2 в RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки [FBS], L-глутамина и пенициллина/стрептомицина [100 Ед/мл]) и контролируйте уровни разрушения генов с течением времени, используя набор для обнаружения мутаций (следуйте инструкциям производителя).
  4. Клонировать донорский шаблон для гомологичной рекомбинационно-опосредованной интеграции флуоресцентного репортера под транскрипционным контролем интересующего гена-мишени (рис. 1).
    1. Определите область гена-мишени для интеграции кассеты экспрессии флуорофора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте нацеливания на транскрипционно значимые элементы, такие как островки CpG и области, обогащенные для ацетилирования H3K27 (маркер активных промоторов и энхансеров). Изменение этих регуляторных элементов (потенциально важных для ETR для инструктажа эпигенетического молчания) делает репортерную клеточную линию менее прогностической физиологической регуляцией гена-мишени.
      1. Если ген-мишень не кодирует секретируемый белок, соедините репортера с последним кодоном гена-мишени с помощью саморасщепляющегося пептида 2А, чтобы сохранить функциональность гена-мишени.
      2. Если ген-мишень кодирует секретируемый белок, чтобы избежать потенциальной секреции репортера, поместите репортера в интронную область гена-мишени. Принудительная интеграция репортера в сплайсированный транскрипт через акцепторный сайт сплайсинга (SA) и последующая трансляция через внутреннюю входную последовательность рибосом (IRES) ухудшает функциональность гена-мишени.
    2. Используйте Chopchop для выбора разрезания гРНК в целевой области (здесь гРНК выбирается для нацеливания на последовательность 5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′ первого интрона гена B2M ).
    3. Разработайте донорский шаблон для сайта разреза гРНК, состоящий из: i) левого плеча гомологии (n пар оснований [.н.], соответствующих области, расположенной непосредственно перед сайтом разреза гРНК); ii) кассета экспрессии трансгена без промоторов (в показанном здесь случае SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH poly(A), благоприятствующая сплайсингу с первым интроном гена B2M ); и iii) правая гомологическая рука (n.о., совпадающая с областью, расположенной ниже по течению от сайта разреза гРНК).
      Примечание: Длина плеч гомологии, необходимая для эффективного индуцирования гомологичной рекомбинации, может варьироваться в зависимости от типа клеток (100-500.н. является подходящим диапазоном для клеток K-562).
  5. Доставить нуклеазную систему CRISPR/Cas9 и донорский шаблон внутрь целевой клеточной линии. Для клеток К-562 трансфицируют 1 мкг плазмиды, кодирующей spCas9 (hCas9; см. таблицу материалов), 250 нг плазмиды, кодирующей гРНК (phU6-gRNA; см. таблицу материалов), и 1 мкг донорской плазмиды, кодирующей матрицу, на 5 × 105 клеток путем нуклеофекции (согласно инструкции производителя).
  6. Культивируйте клетки в течение не менее 14 дней (для клеток K-562) и контролируйте уровни экспрессии флуоресцентного репортера с течением времени с помощью проточного цитометра (активируйте канал фикоэритрина (ПЭ) для измерения интенсивности флуоресценции репортера tdTomato и следуйте инструкциям производителя для выполнения проточной цитометрии).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Донорский шаблон, особенно если он основан на плазмиде, может содержать криптографические промоторные последовательности, приводящие к экспрессии флуоресцентного репортера из неинтегрированных донорских копий. Культивирование клеток позволяет разбавлять эти неинтегрированные копии путем клеточного деления и, в конечном итоге, поддерживать экспрессию репортера только из донорских копий, интегрированных в геном-мишень.
  7. Клонирование репортер-положительных клеток с помощью флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) на уровне одной клетки. Для этого протокола активируйте PE-канал для измерения интенсивности флуоресценции репортера tdTomato и следуйте инструкциям производителя по сортировке отдельных tdTomato-положительных клеток K-562 на лунку 96-луночного планшета.
  8. После размножения клеток в культуре (обычно 20-30 дней для клеток K-562) проводят скрининг репортер-положительных клонов методом ПЦР, чтобы выбрать тот, который несет биаллельную интеграцию репортерной кассеты внутри целевого локуса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это максимизирует репортерную экспрессию и способствует дальнейшему разрешению между репортерными и репортерными клетками с помощью проточной цитометрии после обработки ETR.
    1. Извлекают геномную ДНК из 1 × 105 клеток на репортер-положительный клон с помощью набора для экстракции ДНК (следуя инструкциям производителя).
    2. Амплифицируйте целевую область B2M с помощью прямых (5'-GTATTTGCTGGTTATTAG-3') и обратных (5'-AATGGTTGAGTTGGAC-3') праймеров в соответствии с инструкциями набора для амплификации ПЦР. Температура отжига для этой пары праймеров составляет 47,7 °C с ДНК-полимеразами на основе Taq и концентрацией праймера 0,5 мкМ.
    3. Анализируйте продукт ПЦР с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (следуя инструкции производителя). Скрининг клонов, показывающий полосу, относящуюся к интеграции tdTomato в целевой локус B2M (3,413.н.), без полосы, относящейся к целевому локусу дикого типа (1,027.н.).

2. Разработка гРНК для эпигенетического сайленсинга гена-мишени на основе CRISPR/dCas 9

  1. Просмотрите целевой ген в браузере генома UCSC40 и извлеките нуклеотидную последовательность областей, потенциально регулирующих его транскрипционную активность, таких как островки CpG и сайты, обогащенные для ацетилирования H3K27 (маркер активных промоторов и энхансеров).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно недавнему исследованию, наилучшей областью мишени является окно размером 1 килобаза (кб), центрированное на сайте начала транскрипции целевого гена32.
  2. Вставьте выбранные последовательности в онлайн-инструмент Chopchop и выберите репрессию в качестве цели извлечения гРНК. Подождите, пока Chopchop предоставит список гРНК, картированных на интересующую генетическую последовательность и перечисленных в соответствии с оценкой, учитывающей как количество нецелевых совпадений, так и прогнозируемую целевую эффективность (рис. 2).
  3. Выберите не менее 10 гРНК на последовательность-мишень. Если возможно, попытайтесь отобрать гРНК, охватывающие всю область для исследования, без полных совпадений с другими внутригенными последовательностями по всему геному.

3. Массивная переходная доставка ETR на основе CRISPR/dCas 9 в репортерной клеточной линии

  1. Среди систем доставки трансгенов, о которых сообщалось ранее для целевой клеточной линии, выбирайте те, которые допускают только транзиторную экспрессию трансгенов, максимизируют эффективность доставки и минимизируют токсичность, связанную с клеточными манипуляциями. В случае клеток K-562 настоятельно рекомендуется как плазмида, так и мРНК нуклеофекция, при этом производство плазмид представляет собой технически более простую и дешевую альтернативу.
  2. Клонируйте как гРНК, выбранные в разделе 2, так и ETR на основе CRISPR/dCas9 в выбранной системе доставки трансгенов. Протокол клонирования ETR в плазмидных ДНК см. в следующих шагах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмиды, кодирующие отдельно для dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A и dCas9:DNMT3L30, недоступны в Addgene. Они были клонированы путем замены трансактиватора VP160 из плазмиды pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41 (см. таблицу материалов) на последовательность30, кодирующую домен KRAB, DNMT3A или DNMT3L. Плазмидное кодирование для универсального ETR, называемое CRISPRoff-v2.132, доступно (см. Таблицу материалов).
    1. Трансформируют плазмиды, кодирующие ETR, в химически компетентные клетки E. coli (следуя инструкциям производителя). Скрининг колоний на наличие ETR-содержащей плазмиды путем расщепления ферментом рестрикции и секвенирования по Сэнгеру и, наконец, выбор одной из положительных колоний для получения плазмидной ДНК Мидипреп (следуя инструкциям производителя).
    2. Клонируйте гРНК внутри каркаса phU6-гРНК (рис. 3).
      1. Используя программное обеспечение для проектирования молекулярной биологии, добавьте последовательность 5'-CACCG-3' перед протоспейсером (первая переменная 20 нуклеотидов [nt] выбранной гРНК), чтобы сгенерировать олиго длиной 25 нт in silico, называемое SGfw.
      2. Аналогичным образом, добавьте последовательность 5'-AAAC-3' до обратного комплемента протоспейсера выбранной гРНК и 5'-C-3' ниже по течению, чтобы получить олиго длиной 25 нт, называемое SGrv.
      3. Последовательности SGfw и SGrv упорядочиваются как бессолевые одноцепочечные ДНК-олиго, ресуспендированные в воде при 100 мкМ.
      4. Добавьте 1 мкл каждого олиго к 2 мкл буфера для отжига (10 мМ Tris [pH 7,5-8,0], 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА) и 16 мкл воды.
      5. Выполните олигоотжиг, поместив раствор в амплификатор, запрограммированный на запуск при температуре 95 °C в течение 10 минут. Затем постепенно охладите до 25 °C в течение 45 минут.
      6. Разбавьте 1 мкл отожженных олигов 99 мкл воды, не содержащей нуклеаз, а затем лигируйте 1 мкл этого разведения 50 нг плазмиды phU6-гРНК, предварительно расщепленной ферментом рестрикции BsaI (следуйте инструкциям поставщиков наборов BsaI и лигаз для процедуры расщепления и лигирования).
      7. Трансформируют 20 мкл химически компетентных клеток E. coli с 2 мкл продукта лигирования (следуйте инструкции производителя по процедуре трансформации).
      8. Выберите несколько колоний для производства плазмидной ДНК Miniprep (следуйте инструкциям поставщика) и проконтролируйте успешное клонирование протоспейсера с помощью секвенирования по Сэнгеру со следующим праймером, соответствующим промотору U6 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'.
      9. Выберите одну из положительных колоний для получения плазмидной ДНК Мидипреп (следуя инструкции производителя).
  3. Доставьте выбранные гРНК и ETR на основе CRISPR/dCas9 в репортерную клеточную линию в массиве (по одной конкретной гРНК для каждого состояния) (рис. 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве репрезентативного случая рабочий процесс нуклеофекции плазмид, кодирующих dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L и гРНК, нацеленных на островок B2M CpG в клеткахB2M TdTomato K-562, показан на следующих шагах.
    1. Подготовьте отдельные пробирки, содержащие по 500 нг каждой из плазмид, кодирующих dCas9:KRAB-, dCas9:DNMT3A- и dCas9:DNMT3L, но отличающиеся для тестируемой гРНК (125 нг плазмиды, кодирующей гРНК, на пробирку). Включите состояние нуклеофекции без гРНК и ETR в качестве образца, обработанного имитационной обработкой. Выполните скрининг не менее чем с тремя техническими репликами для каждого образца.
    2. Гранулы 5 × 105 клеток B2MTdTomato K-562 в пробирке и нуклеофект их с плазмидной смесью (в соответствии с инструкциями производителя).
    3. Ресуспендируйте клетки в 200 мкл предварительно нагретой среды для культивирования клеток RPMI-1640 и поместите их обратно в инкубатор.

4. Анализ транскрипционной активности гена-мишени с течением времени

  1. Используйте проточную цитометрию для измерения процента молчащих клеток в разные моменты времени после доставки ETR (рис. 4). Используйте клетки дикого типа (WT), не несущие последовательность, кодирующую флуорофор, чтобы установить порог репортер-отрицательных клеток. Используйте пробку, прошедшую имитационную обработку, чтобы установить затвор для репортерно-положительных ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как было предложено в шаге 1.3, включите в эксперимент контроль генетических нарушений. Это может быть полезно как для мониторинга эффективности доставки CRISPR, так и для мониторинга приспособленности клеток, лишенных гена-мишени; Потеря как транскрипционного молчания, так и генетические нарушения с течением времени могут быть приписаны существенности гена-мишени в выбранном типе клетки. Включите как краткосрочные (день 3, день 7, день 10), так и долгосрочные (день 21, день 35) временные точки, чтобы получить представление как об острой, так и о долгосрочной эффективности подавления шума.
  2. Определите тройку лучших гРНК с точки зрения эффективности долгосрочного подавления шума. Используйте FACS для выбора репортерно-отрицательной субпопуляции, стабильно поддерживаемой в этих выборках. Кроме того, выполняйте FACS объемных проб, обработанных имитационной обработкой, чтобы они подвергались той же обработке, что и испытуемые образцы, чтобы обеспечить надлежащее сравнение в последующих анализах.

5. Оценка специфичности лечения ETR с помощью РНК-секвенирования и иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDIP)-seq

  1. Используйте РНК-секвенирование для оценки любой возможной полногеномной транскрипционной дерегуляции при доставке ETR.
    1. Как для субпопуляции образцов, обработанных тремя высокоэффективными гРНК, так и для клеток, обработанных имитационной обработкой, экстрагируют РНК с помощью коммерчески доступных наборов. Оценивают качество и концентрацию РНК с помощью имеющихся в продаже наборов.
    2. Выполняйте фрагментацию РНК, ретротранскрипцию и подготовку библиотек с использованием имеющихся в продаже наборов для подготовки библиотек РНК-секвенирования (в соответствии с инструкциями производителя).
    3. Выполняйте библиотечную количественную оценку и контроль качества с помощью инструментов контроля качества, совместимых с секвенированием нового поколения и цифровым электрофорезом.
    4. Библиотеки последовательностей на секвенсоре нового поколения в соответствии с инструкциями производителя, с протоколом 100 бит на парном конце и стремлением в среднем к 45 млн чтений на выборку.
    5. Выровняйте теги чтения с соответствующим референсным геномом и количественно определите экспрессию транскрипции. Выполните выравнивание последовательности tdTomato и определите ее отдельно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется STAR aligner (v 2.3.0)43 с параметрами по умолчанию, в сочетании с пакетом Rsubread44.
    6. Проведение анализа данных РНК-секвенирования в соответствии с опубликованными передовыми методами45.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется корпус R/Bioconductor edgeR46, применяющий фильтр не менее одного количества на миллион (cpm) по крайней мере в трех образцах для отбрасывания генов с низкой экспрессией. В качестве альтернативы можно использовать функцию filterByExpr в edgeR.
    7. Оценка дифференциальной экспрессии генов с использованием отрицательной биномиальной обобщенной лог-линейной модели, реализованной edgeR (функция glmFit)47. Установите пороговое значение 0,01 для скорректированных значений p (поправка Беньямини-Хохберга [BH]) для сохранения дифференциально регулируемых генов.
  2. Оценка любой возможной нецелевой активности метилирования CpG ETR с помощью MeDIP-seq.
    1. Как для субпопуляции образцов, обработанных тремя лучшими гРНК, так и для клеток, обработанных имитационной обработкой, извлекают геномную ДНК с помощью коммерчески доступных наборов (в соответствии с инструкциями производителей).
    2. Ультразвуковая обработка 500 нг геномной ДНК с помощью ультразвукового аппарата и следующих параметров: Пошлина: 20 %; ПИП: 175; Циклов за очередь: 200; Время: 40 с.
    3. Подготовьте библиотеки секвенирования с помощью коммерчески доступных наборов для MeDIP-seq (следуя инструкциям производителя).
    4. После этапа лигирования адаптера количественно оценить библиотеки с помощью флуорометрического анализа и проверить эффективность лигирования с помощью кПЦР с помощью коммерчески доступных наборов для количественного определения библиотек (в соответствии с инструкциями производителя).
    5. Создавайте библиотечные пулы, смешивая случайно выбранные библиотеки, чтобы уменьшить технические ошибки. Используйте равное количество библиотек (ng) для каждой библиотеки, чтобы сбалансировать пулы. В каждый пул добавьте метилированную и неметилированную контрольную ДНК спайк-ин, поставляемую в наборе. В целях контроля сохраняйте 10% объем библиотеки, помеченный как «входной» и не осаждаемый иммунопреципитацией. Проводят иммунопреципитацию на оставшихся 90% библиотеки с использованием моноклонального антитела, направленного против 5-метилцитозина, входящего в состав набора MeDIP-seq.
    6. Очистите обогащенные и входные библиотеки с помощью наборов для очистки продукта иммунопреципитации 5-метилцитозина, следуя инструкциям производителей.
    7. Оцените эффективность обогащения, выполнив количественную ПЦР в режиме реального времени на внутреннем пике в контрольной группе с использованием праймеров, поставляемых в комплекте. Для каждой иммунопреципитации (ВП) рассчитайте специфичность обогащения при восстановлении метилированной и неметилированной ДНК, используя значения порога цикла (Ct) MeDIP и входных фракций, полученных в результате реакции кПЦР (см. уравнения 1 и 2):
      Equation 1 (1)
      Equation 2 (2)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Считайте, что IP-библиотеки успешны, если значения специфичности равны ≥0,95.
    8. Увеличьте библиотеки с помощью наборов для подготовки библиотек MeDIP-seq, следуя инструкциям производителя, и выполните количественный анализ и анализ распределения размеров библиотек продукта.
    9. Выполняйте библиотечные последовательности на секвенсорах нового поколения. Используйте секвенирование на парных концах с длиной считывания 100.н., стремясь в среднем к 30 млн операций чтения на выборку.
    10. Выровняйте теги чтения секвенирования с соответствующим референсным геномом (например, hg38) с помощью bwa (v 0.7.5 или выше)48, а затем определите пики с помощью MACS (v 2.0.10 или выше)49, что позволит идентифицировать широкие пики (-slocal = 0,-llocal = 500000).
    11. Создайте общий набор областей из разных выборок с помощью инструмента мультипересечения50 BEDTools, включив опцию кластеризации.
    12. Вычислите покрытие для каждой выборки по окончательному списку регионов с помощью multicov BEDTools, отбрасывая дублированные чтения.
    13. Выполните анализ количества матриц с помощью edgeR. Примените фильтр не менее одного количества на миллион (cpm) по крайней мере в трех образцах, чтобы отбросить низкообогащенные области.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать функцию filterByExpr в edgeR.
    14. Идентификация дифференциального метилирования путем принятия обобщенной лог-линейной модели, реализованной в edgeR (функция glmFit), и нормализации с использованием условной квантильной нормализации51 для коррекции регионального GC-содержимого. Выберите дифференциально метилированные области, применив пороговое значение 0,01 к значениям p с поправкой на ЧД. Выполните анализ повторяющихся последовательностей следующим образом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полный список опций и параметров (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html) см. в руководстве пользователя edgeR.
      1. Отфильтруйте результаты MeDIP-seq по номинальному значению p <0,01 и создайте два набора регионов: выберите регионы с logFC >1 в первом наборе и регионы с logFC <-1 во втором наборе.
      2. Извлеките аннотацию RepeatMasker для выбранного генома в виде файла кровати и подсчитайте количество элементов в каждом наборе. Преобразуйте количество в отношение к числу регионов для каждого набора данных.
      3. Извлеките соотношение метиломов, которое перекрывается каждым классом повторов, и выполните критерий хи-квадрат, чтобы обнаружить любое значительное обогащение.
  3. Оцените, соответствуют ли дифференциально транскрибируемые или дифференциально метилированные участки между образцами, обработанными ETR и имитационной обработкой, предсказанному in silico нецелевому связыванию с гРНК.
    1. Используйте CRISPR design suite52 в качестве инструмента прогнозирования нецелевого связывания с гРНК.
    2. Для каждой предполагаемой нецелевой области обратите внимание на ближайший сайт начала транскрипции (TSS) и ближайшую метилированную область. В качестве истинного нецелевого эффекта рассматривают область, ассоциированную либо с геном, регулируемым FDR <0,01 и расстоянием до TSS менее 10 Kb, либо метилированную область, регулируемую FDR <0,01 и расстоянием менее 1 Kb.
    3. Определите количество и особенности транскрипционно измененных или переметилированных областей в образцах, обработанных каждой из трех наиболее эффективных гРНК, по сравнению с образцами, обработанными имитацией (рис. 5), чтобы определить наиболее специфичные среди гРНК. Проранжируйте потенциальное влияние нецелевого участка на физиологию клеток-мишеней в следующем порядке (от наиболее воздействующего к наименее воздействующему):
      i) Интрагенный, регуляторный регионально-физиологически экспрессируемый ген
      ii) Интрагенный, экзонически экспрессируемый ген
      iii) Интрагенный, интронный регионально-физиологически экспрессируемый ген
      iv) Интрагенный, регуляторный регион – неэкспрессируемый ген
      v) Интрагенный, экзонный участок – неэкспрессируемый ген
      vi) Интрагенный, интронный участок – неэкспрессируемый ген
      vii) Межгенный регион

Representative Results

После доставки донорского шаблона для гомологичной рекомбинационно-опосредованной интеграции флуоресцентного репортера в целевой локусе в сочетании с системой CRISPR/Cas9 (например, путем плазмидной нуклеофекции в случае клеток K-562) в обработанном образце появляются репортер-положительные клетки (рис. 1, внизу). Если этого не произошло, перепроверьте точность проектирования и клонирования как донорского шаблона, так и реагентов CRISPR/Cas9. В случае подтверждения постарайтесь оптимизировать дозы реагентов и сам протокол доставки.

После того, как репортерная клеточная линия получена, выберите последовательности промотора/энхансера гена-мишени и спроектируйте панель совпадающих гРНК. Использование инструментов прогнозирования in silico , таких как Chopchop, для идентификации последовательностей гРНК и ранжирования их с точки зрения прогнозируемой эффективности и специфичности (рис. 2). Если гРНК не извлекаются, контролируют наличие канонического мотива протоспейсера Cas9 (PAM) (5'-NGG-3') в последовательности-мишени. Если последовательности PAM отсутствуют, рассмотрите возможность перехода на ETR, основанные на альтернативных PAM-независимых вариантах Cas9 (ETR с этими вариантами еще не опубликованы), или перехода на альтернативные платформы доменов, связывающих ДНК, такие как ZFPs53 или TALEs30. Однако, если извлекаются только гРНК с низкой прогнозируемой эффективностью/специфичностью, рассмотрите возможность либо 1) тестирования этих низкокачественных гРНК, либо 2) расширения целевой последовательности ДНК в поисках лучших гРНК. При переходной доставке тройной комбинации ETR (или CRISPRoff; v2.1) вместе с гРНК проводят продольный анализ проточной цитометрии на экспрессию флуоресцентного репортера, часто наблюдая пик репортерной репрессии при острых анализах, который затем, по крайней мере, частично реабсорбируется из-за митотического разведения плазмид, кодирующих ETR, с течением времени (рис. 4C). Если комбинация ETRs/гРНК эффективно осаждает метилирование CpG на локусе-мишени, то в значительной части обработанных клеток будет происходить постоянное подавление репортера (рис. 4C). Различные гРНК могут демонстрировать различную долговременную эффективность подавления (рис. 4B, C).

Для оценки специфичности на уровне генома используйте MeDIP-seq для выявления дифференциально метилированных областей между клетками, в которых мишенью были длительно молчаливые и необработанные клетки. В идеале высокоспецифичная гРНК должна индуцировать пик de novo метилирования CpG только в сайте-мишени (рис. 5). Если нет, то можно рассмотреть вопрос о характеристике нецелевой активности гРНК, занимающих более низкую позицию в списке целевой эффективности.

Figure 1
Рисунок 1: Интеграция репортера tdTomato под регуляторные элементы гена B2M человека путем репарации, направленной на гомологию. Вверху: Схема стратегии интеграции флуоресцентного репортера tdTomato в первый интрон гена B2M человека с помощью CRISPR/Cas9-индуцированной гомологической направленной репарации. Внизу: репрезентативные точечные графики клеток K-562 до и после интеграции репортера tdTomato в первом интроне гена B2M . Сокращения: HA = гомология плеча; HDR = гомология-направленная репарация; IRES = внутренний сайт входа в рибосому; pa = BGH poly(A); SA = сайт акцептора сращивания; WT = дикий тип; 3XSTOP = три тандемных стоп-кодона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Идентификация in silico гРНК, нацеленных на островок CpG гена B2M , ранжированная по прогнозируемой эффективности и специфичности. Выходной интерфейс Chopchop, показывающий гРНК, нацеленные на островок CpG, встроенный в промоторную последовательность гена B2M , ранжирован как по количеству нецелевых последовательностей с 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) или 3 (MM3), так и по прогнозируемой целевой эффективности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Клонирование и массивная нуклеофекция гРНК для dCas9 ETR-опосредованного эпигенетического сайленсинга. Вверху: олиго-опосредованное клонирование протоспейсера в плазмиде, экспрессирующей U6-гРНК человека. Внизу: массивный скрининг B2M-таргетных гРНК для эпигенетического сайленсинга на основе CRISPR/dCas9 путем нуклеофекции плазмид в клетках K-562B2M/tdTomato. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Скрининг гРНК, эффективно индуцирующих долговременное подавление гена B2M. (A) Вверху: схемы генаB2M tdTomato, изображенные на увеличенной области, относительный порядок и ориентация связывания ETR на основе dCas9 в комплексе с гРНК. Внизу: репрезентативные точечные диаграммы клеток B2MtdTomato K-562 до (слева) или после (справа) подавления ETR. Анализы через 30 дней после трансфекции с плазмидами, кодирующими гРНК, и тройной комбинацией dCas9:KRAB+ dCas9:D3A + dCas9:D3L. (B) Активность сайленсинга указанных гРНК (либо в пулах, либо в виде отдельных гРНК), нацеленных на островок CpG B2M (красные стрелки на верхней схеме обозначают ориентацию гРНК) в клетках K-562 B2M tdTomato на 30-й день после трансфекции. Данные показывают процент tdTomato-отрицательных клеток (среднее ± SEM; n = четыре независимые трансфекции для каждого состояния лечения). (C) Анализ с течением времени клеток B2MtdTomato K-562 при трансфекции плазмидами, экспрессирующими тройную комбинацию ETR и указанные B2M CpG, нацеленные на островные РНК или макеты (трансфекция без гРНК и ETR). Данные показывают процент tdTomato-отрицательных клеток (среднее ± SEM; n = три независимые трансфекции для каждого состояния лечения). Неопубликованные данные. Панели A и B адаптированы из Amabile et al.30. Аббревиатуры: CGI = CpG island; IRES = внутренний сайт входа в рибосому; pa = BGH poly(A); SA = сайт акцептора сращивания; SD = донорный участок сплайсинга; TSS = место начала транскрипции; UT = нетрансфицированный; 3XSTOP = 3 тандемных стоп-кодона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Полногеномный анализ специфичности ETR с помощью РНК-секвенирования и MeDIP-секвенирования. Слева: сравнение уровней экспрессии в клетках B2MtdTomato K-562, обработанных имитацией, и клетках, обработанных тройной комбинацией dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR и с гРНК, нацеленной на островок CpG гена B2M. Значения выражаются в log2 операций чтения на миллион (RPKM) сопоставленных чтений. Черные точки представляют гены, экспрессируемые на сопоставимых уровнях во всех условиях; желтые круги обозначают гены, дифференциально регулируемые в соответствии с FDR <0,01; красный кружок представляет транскрипцию B2M-IRES-tdTomato. Вверху справа: график circos, показывающий полногеномные профили MeDIP-seq обработанных клеток B2MtdTomato K-562 (синий) или клеток, обработанных тройной комбинацией dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR и гРНК, нацеленной на островок CpG (CGI) гена B2M (зеленый). Справа внизу: показан статус метилирования локусаB2M tdTomato в указанных образцах. В каждом pileup представлены три репликата; Нагромождение выровненных чтений было сглажено с помощью гауссова окна. Эта цифра была адаптирована из Amabile et al.30. Аббревиатура: TSS = место начала транскрипции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Целенаправленное эпигенетическое подавление может представлять собой многообещающее решение для лечения заболеваний, которые могут выиграть от постоянной инактивации генов, включая заболевания, вызванные мутациями усиления функции1, инфекционные заболевания2 и патологии, при которых подавление одного гена может либо компенсировать наследственный дефект в другом гене3, либо раскрыть весь потенциал адоптивной клеточной терапии4. 5. См. Действуя на уровне хроматина и автоматически размножаясь клеткой 7,30,32, эпигенетическое подавление может избежать токсических изменений (например, хромосомных перестроек) последовательности ДНК гена-мишени и частичного, преходящего молчания мишени, которые являются ограничениями искусственного разрушения генов на основе нуклеаз 8,34,35 и нокдауна 33 на основе РНК-интерференции соответственно.

Одним из ключевых предварительных шагов в любом протоколе эпигенетического молчания является определение правильного положения на гене-мишени для направления ETR, которые будут депонировать репрессивные эпигенетические метки, необходимые для выключения транскрипционной активности мишени. Различные проксимальные и дистальные регуляторные элементы стартового сайта транскрипции могут совпадать для поддержки транскрипционного выхода данного человеческого гена54. Кроме того, благодаря растущему числу программируемых технологий связывания ДНК теперь можно идентифицировать различные целевые сайты для каждого конкретного регуляторного элемента6. Таким образом, протоколы, подобные описанному здесь в разделе «Сконструированные клеточные линии», могут быть использованы для номинирования отдельных целевых участков и/или областей генома, поддающихся эпигенетическому подавлению, опосредованному ETR, прежде чем приступать к громоздким и трудоемким усилиям по оценке лучших кандидатов в окончательной терапевтической обстановке. Ниже описаны некоторые критические аспекты протокола.

Инженерия репортерной клеточной линии, предикторующая конечную терапевтическую мишень
Несмотря на постоянную оптимизацию протоколов клеточной инженерии, необходимых для вставки кассетного кодирования флуоресцентного репортера в ген-мишень и доставки ETR, нельзя считать само собой разумеющимся, что они уже могут быть доступны для клеточной линии, которая больше всего похожа на конечную терапевтическую мишень. В этом случае могут быть применены различные стратегии смягчения последствий: а) использование наборов оптимизации, предоставляемых поставщиками, для внутренней оптимизации протокола трансфекции для целевой клеточной линии; б) переключение на другие клеточные линии, все еще экспрессирующие этот ген-мишень, но принадлежащие тканям, отличным от конечной терапевтической мишени, для которых инженерные протоколы были тщательно оптимизированы. В случае, если эти варианты недоступны, можно рассмотреть возможность переключения на первичные типы клеток или органоиды, представляющие конечную мишень. Как правило, как для доклинических исследований, так и для терапевтического применения эпигенетического подавления на основе ETR, сценарии, в которых ген-мишень важен для целевого типа клеток, должны быть отброшены. Полное, долгосрочное подавление важного гена, навязанное ETR, со временем приведет к контротбору клеток-мишеней (и, возможно, к токсичности лечения). В этих случаях предпочтение отдается альтернативным технологиям, обеспечивающим частичную отмену мишени, таким как РНК-интерференция33.

Оценка активности ETR по подавлению сигналов на цели
ETR, основанные на комбинации эффекторных доменов KRAB, DNMT3A и DNMT3L, доказали свою эффективность в отношении подавляющего большинства генов, кодирующих белки, с широким окном долгосрочного разрешающего таргетирования около 1 килобазы, сосредоточенным на начальном сайте транскрипции32. Чтобы получить представление о том, как выглядит хорошо проведенный эксперимент по эпигенетическому подавлению, здесь представлены технические детали и результаты подавления гена B2M в клетках K-562. Это можно считать важным положительным контролем, который должен быть включен не только исследователями, работающими с клетками К-562, но и теми, кто впервые приближается к технологии на основе ETR. Как указано в протоколе, искусственное разрушение генов на основе нуклеазы (например, CRISPR/Cas9) рекомендуется в качестве дополнительного контроля как эффективности доставки генов в интересующем типе клеток, так и фенотипа клеток, лишенных гена-мишени. После первоначального скрининга гРНК, которые должны быть соединены с ЭТР на основе CRISPR/dCas9, если ни одна из тестируемых гРНК не способна навсегда заставить замолчать ген-мишень, следует рассмотреть вопрос в следующем порядке: 1) увеличение количества доставляемых гРНК и ЭТР; 2) тестирование пулов топовых гРНК на предмет синергетических эффектов между ними. Если долгосрочное подавление по-прежнему не достигается, следует рассмотреть: 3) тестирование дополнительных гРНК, которые могут быть нацелены на сайты, более релевантные для инструктажа эпигенетического молчания; 4) переход на DBD-платформы на базе ZFP8 или TALE9, которые могут иметь улучшенную связывающую способность с целевым хроматином; 5) переход от переходного к стабильному — например, интеграция вирусной векторной экспрессии ETR (либо гРНК, либо конструкции слияния dCas9, либо и то, и другое при внедрении технологии CRISPR/dCas9). Поскольку наша группа разработала и имеет большой опыт совместной доставки трех отдельных ETR30, протокол и результаты, показанные здесь, основаны на этом подходе. Тем не менее, аналогичный концептуальный рабочий процесс, вероятно, может быть применен и к системе «все в одном» на основе CRISPR32.

Оценка нецелевой деятельности ЕТР
Многочисленные исследования показали предварительные признаки in vitro специфичности ETR, основанные на комбинации эффекторных доменов KRAB, DNMT3A и DNMT3L30,31,32. Однако, если среди исследованных гРНК ни одна из них не демонстрирует удовлетворительного профиля специфичности с точки зрения транскрипционной регуляции и/или метилирования ДНК de novo, можно использовать две невзаимоисключающие стратегии: а) сокращение времени пребывания ЭТР внутри клетки (и, следовательно, их потенциальной внецелевой активности) либо путем снижения доз ЭТР, либо путем тестирования альтернативных систем доставки. Например, по сравнению с плазмидами, ожидается, что доставка мРНК и белка сократит время воздействия на клетки ETR и, следовательно, вероятность нецелевой активности55; б) переход на более поздние варианты Cas9, оптимизированные для уменьшения нецелевого связывания платформы56, или на альтернативные технологии связывания ДНК на основе ZFP8 или TALE9. Важно учитывать, что, по сравнению с образцами, обработанными имитационной обработкой, на целевую и нецелевую активность подавления экспрессии генов влияет не только связывание DBD с их целевой последовательностью, но и потенциальная способность эпигенетических эффекторных доменов рекрутироваться в другие локусы их естественными эндогенными кофакторами. Таким образом, сокращение времени пребывания ETR в клетке-мишени может снизить не только вероятность связывания DBD с нецелевыми сайтами, но и вероятность взаимодействия ETR с эндогенными кофакторами, с потенциальными преимуществами с точки зрения специфичности и недостатков с точки зрения целевой активности. Наконец, по сравнению с образцами, обработанными имитационной обработкой, некоторые транскрипционные и менее вероятные изменения метилирования CpG, измеренные в молчащих клетках, могут быть просто получены в результате депривации гена-мишени. Они не считаются нецелевыми для технологии глушения. Для их идентификации необходимо также включить в экспериментальную панель 8,9,10 разрушение генов искусственной нуклеазой. Биологические изменения, вызванные функциональной потерей гена-мишени, будут общими между эпигенетическим подавлением и этой альтернативной технологией.

Disclosures

А.Л. является соучредителем, обладателем квоты и консультантом компании Chroma Medicine, Inc.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность Анджело Амабилье, Паоле Капассо, Иларии Казерта, Тане Бачега, Алисе Рескинья, Валерии Моллике и Деборе Сиприа за совместные усилия по разработке технологии эпигенетического подавления на протяжении многих лет; Деян Лазаревич (Dejan Lazarevic) и Франческа Джаннезе (Francesca Giannese) за критический обзор анализов RNA-seq и MeDIP-seq, описанных в протоколе. Эта работа была поддержана грантами А.Л. от Фонда «Телемарафон» (грант TIGET No F1) и программы ЕС «Горизонт 2020» (UPGRADE). Иллюстрации были созданы с помощью BioRender.com.

ВКЛАД АВТОРОВ
A.M., M.A.C., F.G. и A.C. внесли свой вклад в разработку протокола и написание рукописи; С.В., И.М. и Д.К. разработали разделы протокола по биоинформатике и отредактировали рукопись; А.М. и А.Л. разработали протокол, задумали и написали рукопись при участии всех авторов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4200 TapeStation System Agilent G2991BA DNA quantification
4D-Nucleofector X Unit Lonza Bioscience  AAF-1003X Nucleofection
B2M silencing gRNA #1   Lombardo's lab  GCAATCAGGACAAGGCCCGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #2  Lombardo's lab  GGGGTAGGAGAGACTCACGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #3  Lombardo's lab  GAGTCCAGGGCTGGATCTCG Gene silencing
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer BD Biosciences https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion Fluorescence Activated Cell Sorting
bedtools Bedtools http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Processing of genomic intervals
bwa Ih3 https://github.com/lh3/bwa Alignment of MeDIP-seq reads
Chopchop  Valen's lab http://chopchop.cbu.uib.no/ gRNA selection software
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine Corning 10-040-CV Cell culture
cqn Bioconductor http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html Region-wise normalization by GC-content
CRISPR design suite Zhang's lab https://zlab.bio/resources-2 off-target gRNA binding prediction 
CRISPRoff-v2.1 plasmid Addgene  167981 Gene silencing
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer  Beckman Coulter C01161 Flow cytometry
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab 

ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt
actgtgggcataaattaatttttcagttaagttttgg
aagcttaaataactctccaaaagtcataaagcc
agtaactggttgagcccaaattcaaacccagc
ctgtctgatacttgtcctcttcttagaaaagattac
agtgatgctctcacaaaatcttgccgccttccct
caaacagagagttccaggcaggatgaatctgt
gctctgatccctgaggcatttaatatgttcttatta
ttagaagctcagatgcaaagagctctcttagct
tttaatgttatgaaaaaaatcaggtcttcattaga
ttccccaatccacctcttactagtctgacctcttct
cttcctcccacagggataactagatgactcgag
ggatccgaattcctgcaggcctcgacgagggc
cggcgcgccgcggccgctacgtaaattccgc
cccccccccccctctccctcccccccccctaac
gttactggccgaagccgcttggaataaggccg
gtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgc
cgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacct
ggccctgtcttcttgacgagcattcctagggg
tctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtc
tgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctg
gaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagc
gaccctttgcaggcagcggaaccccccacctg
gcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacg
tgtataagatacacctgcaaaggcggcacaac
cccagtgccacgttgtgagttggatagttgtgga
aagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaac
aaggggctgaaggatgcccagaaggtacccc
attgtatgggatctgatctggggcctcggtgcaca
tgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacg
tctaggccccccgaaccacggggacgtggtttt
cctttgaaaaacacgatgataatatggccacaa
ccatggtgagcaagggcgaggaggtcatcaa
agagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcgaggg
cgagggcgagggccgcccctacgagggcac
ccagaccgccaagctgaaggtgaccaaggg
cggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtc
cccccagttcatgtacggctccaaggcgtacg
tgaagcaccccgccgacatccccgattacaag
aagctgtccttccccgagggcttcaagtgggag
cgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtg
accgtgacccaggactcctccctgcaggacgg
cacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggca
ccaacttcccccccgacggccccgtaatgcag
aagaagaccatgggctgggaggcctccaccg
agcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaa
gggcgagatccaccaggccctgaagctgaa
ggacggcggccactacctggtggagttcaag
accatctacatggccaagaagcccgtgcaac
tgcccggctactactacgtggacaccaagctg
gacatcacctcccacaacgaggactacacca
tcgtggaacagtacgagcgctccgagggccg
ccaccacctgttcctggggcatggcaccggca
gcaccggcagcggcagctccggcaccgcctc
ctccgaggacaacaacatggccgtcatcaaa
gagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcga
gggcgagggcgagggccgcccctacgag
ggcacccagaccgccaagctgaaggtgac
caagggcggccccctgcccttcgcctgggac
atcctgtccccccagttcatgtacggctccaa
ggcgtacgtgaagcaccccgccgacatcccc
gattacaagaagctgtccttccccgagggcttc
aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggac
ggcggtctggtgaccgtgacccaggactcct
ccctgcaggacggcacgctgatctacaaggt
gaagatgcgcggcaccaacttcccccccga
cggccccgtaatgcagaagaagaccatggg
ctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccc
cgcgacggcgtgctgaagggcgagatccac
caggccctgaagctgaaggacggcggcca
ctacctggtggagttcaagaccatctacatggc
caagaagcccgtgcaactgcccggctactact
acgtggacaccaagctggacatcacctccca
caacgaggactacaccatcgtggaacagtac
gagcgctccgagggccgccaccacctgttcct
gtacggcatggacgagctgtacaagtaagcgg
ccgcgtcgacctgtgccttctagttgccagccatc
tgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccct
ggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataa
aatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtagg
tgtcattctattctggggggtggggtggggcag
gacagcaagggggaggattgggaagacaat
agcaggcatgctggggatgcggtgggctctat
ggcttaagtgatggggctagtagcctttccttaa
tgatagggtgtttctagagagatatatctggtca
aggtggcctggtactcctccttctccccacagc
ctcccagacaaggaggagtagctgccttttag
tgatcatgtaccctgaatataagtgtatttaaaag
aattttatacacatatatttagtgtcaatctgtatat
ttagtagcactaacacttctcttcattttcaatga
aaaatatagagtttataatattttcttcccacttc
cccatggatggtctagtcatgcctctcattttgg
aaagtactgtttctgaaacattaggcaatatatt
cccaacctggctagtttacagcaactgca

 Genetic engineering
E220 Focused-ultrasonicator Covaris 500239 DNA sonication
edgeR Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html Differential abundance testing
EnGen Mutation Detection Kit NEB E3321 Gene disruption quantification
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 Cell culture
Flowjo BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo Flow cytometry data analysis software
Gel Loading Dye, Purple (6x) NEB B7024S DNA gel loading
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase Promega M7401 PCR amplification
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AGGCTACTAGCCCCATCAAG Genetic engineering
hCas9 plasmid Addgene  41815 Genetic engineering
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent 5067-5585 DNA quantification
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 DNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 RNA quantification
IPure kit Diagenode C03010011  Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product
K-562 cells ATCC CCL-243 Cell engineering
KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824 MeDIP-Seq libraries preparation
MACS2 Taoliu https://github.com/macs3-project/MACS Identification of methyl-enriched regions
MagMeDIP kit Diagenode C02010020  5-methylcytosine immunoprecipitation
NextFlex Methylseq kit 1  Bioo Scientific 5118-01 MeDIP-Seq libraries preparation
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 Illumina SY-415-1002 / 20012850 Next Generation Sequencing
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA Macherey-nagel 740410.50 Midiprep plasmid preparation
One Shot TOP10 Chemically Competent  cells  ThermoFisher C404010 Plasmid transformation
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid Addgene  48240 Gene activation
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Cell culture
phU6.sgRNA plasmid Addgene  53188 Genetic engineering
PowerPac Basic Power Supply Biorad 1645050 Agarose gel electrophoresis
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  GTATTTGCTGGTTATGTTAG Genetic engineering
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AATGGTTGAGTTGGAC Genetic engineering
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen 51304 DNA extraction
Qubit Thermo Fisher Q33238 DNA quantification
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32852 RNA quantification
Restriction enzymes NEB DNA digestion
RNeasy Mini kit  Qiagen 74106 RNA extraction
Rsubread Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html Quantification of gene expression
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza Bioscience  V4XC-2032 Nucleofection
SnapGene Dotmatics https://www.snapgene.com/ Molecular biology design software
STAR Alexander Dobin https://github.com/alexdobin/STAR Alignment of RNA-seq reads
T100 Thermal Cycler Biorad 1861096 PCR amplification
T4 DNA Ligase Promega M1801 DNA ligation
TAE Buffer Fisher scientific BP1332500 Agarose gel electrophoresis
TruSeq Stranded Total RNA kit  Illumina 20020597 RNA-Seq library preparation
UltraPure Agarose ThermoFisher 16500500 Agarose gel 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cummings, C. J., Zoghbi, H. Y. Fourteen and counting: unraveling trinucleotide repeat diseases. Human Molecular Genetics. 9 (6), 909-916 (2000).
  2. Tebas, P., et al. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. The New England Journal of Medicine. 370 (10), 901-910 (2014).
  3. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. Murty, T., Gene Mackall, C. L. Gene editing to enhance the efficacy of cancer cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3153-3162 (2021).
  5. Lanza, R., Russell, D. W., Nagy, A. Engineering universal cells that evade immune detection. Nature Reviews Immunology. 19 (12), 723-733 (2019).
  6. Matharu, N., Ahituv, N. Modulating gene regulation to treat genetic disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (11), 757-775 (2020).
  7. Sgro, A., Blancafort, P. Epigenome engineering: New technologies for precision medicine. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12453-12482 (2020).
  8. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  9. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: A widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  11. Gilbert, L. A., et al. XCRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442 (2013).
  12. Snowden, A. W., Gregory, P. D., Case, C. C., Pabo, C. O. Gene-specific targeting of H3K9 methylation is sufficient for initiating repression in vivo. Current Biology. 12 (24), 2159-2166 (2002).
  13. Chen, X., et al. Construction and validation of the CRISPR/dCas9-EZH2 system for targeted H3K27Me3 modification. Biochemical and Biophysical Research Communications. 511 (2), 246-252 (2019).
  14. Kwon, D. Y., Zhao, Y. T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nature Communications. 8, 15215 (2017).
  15. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  16. Ecco, G., Imbeault, M., Trono, D. KRAB zinc finger proteins. Development. 144 (15), 2719-2729 (2017).
  17. Witzgall, R., O'leary, E., Leaf, A., Onaldi, D., Bonventre, J. The Kruppel-associated box-A (KRAB-A) domain of zinc finger proteins mediates transcriptional repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (10), 4514-4518 (1994).
  18. Mannini, R., et al. Structure/function of KRAB repression domains: Structural properties of KRAB modules inferred from hydrodynamic, circular dichroism, and FTIR spectroscopic analyses. Proteins: Structure, Function and Genetics. 62 (3), 604-616 (2006).
  19. Friedman, J. R., et al. KAP-1, a novel corepressor for the highly conserved KRAB repression domain. Genes and Development. 10 (16), 2067-2078 (1996).
  20. Iyengar, S., Farnham, P. J. KAP1 protein: An enigmatic master regulator of the genome. The Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26267-26276 (2011).
  21. Schultz, D. C., Friedman, J. R., Rauscher, F. J. Targeting histone deacetylase complexes via KRAB-zinc finger proteins: The PHD and bromodomains of KAP-1 form a cooperative unit that recruits a novel isoform of the Mi-2α subunit of NuRD. Genes and Development. 15 (4), 428-443 (2001).
  22. Schultz, D. C., Ayyanathan, K., Negorev, D., Maul, G. G., Rauscher, F. J. SETDB1: A novel KAP-1-associated histone H3, lysine 9-specific methyltransferase that contributes to HP1-mediated silencing of euchromatic genes by KRAB zinc-finger proteins. Genes and Development. 16 (8), 919-932 (2002).
  23. Nielsen, A. L., et al. Interaction with members of the heterochromatin protein 1 (HP1) family and histone deacetylation are differentially involved in transcriptional silencing by members of the TIF1 family. The EMBO Journal. 18 (22), 6385-6395 (1999).
  24. Sripathy, S. P., Stevens, J., Schultz, D. C. The KAP1 corepressor functions to coordinate the assembly of de novo HP1-demarcated microenvironments of heterochromatin required for KRAB zinc finger protein-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 26 (22), 8623-8638 (2006).
  25. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. ChemBioChem. 12 (2), 206-222 (2011).
  26. Jia, D., Jurkowska, R. Z., Zhang, X., Jeltsch, A., Cheng, X. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature. 449 (7159), 248-251 (2007).
  27. Tajima, S., Suetake, I., Takeshita, K., Nakagawa, A., Kimura, H. Domain structure of the Dnmt1, Dnmt3a, and Dnmt3b DNA methyltransferases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 945, 63-86 (2016).
  28. Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  29. Ishiyama, S., et al. Structure of the Dnmt1 reader module complexed with a unique two-mono-ubiquitin mark on histone H3 reveals the basis for DNA methylation maintenance. Molecular Cell. 68 (2), 350.e7-360.e7 (2017).
  30. Amabile, A., et al. Inheritable silencing of endogenous genes by hit-and-run targeted epigenetic editing. Cell. 167 (1), 219.e14-232.e14 (2016).
  31. Mlambo, T., et al. Designer epigenome modifiers enable robust and sustained gene silencing in clinically relevant human cells. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4456-4468 (2018).
  32. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503.e17-2519.e17 (2021).
  33. Davidson, B. L., McCray, P. B. Current prospects for RNA interference-based therapies. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 329-340 (2011).
  34. Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B., Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nature Medicine. 24 (7), 927-930 (2018).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  37. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  38. Uhlén, M., et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), (2015).
  39. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  40. Kent, W. J., et al. The Human Genome Browser at UCSC. Genome Research. 12 (6), 996-1006 (2002).
  41. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  42. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
  43. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  44. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. The Subread aligner: fast, accurate and scalable read mapping by seed-and-vote. Nucleic Acids Research. 41 (10), e108-e108 (2013).
  45. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. GenomeBiology. 17, 13 (2016).
  46. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  47. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  48. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  49. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), R137 (2008).
  50. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 47, (2014).
  51. Hansen, K. D., Irizarry, R. A., Wu, Z. Removing technical variability in RNA-seq data using conditional quantile normalization. Biostatistics. 13 (2), 204-216 (2012).
  52. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  53. Zeitler, B., et al. Allele-selective transcriptional repression of mutant HTT for the treatment of Huntington's disease. Nature Medicine. 25 (7), 1131-1142 (2019).
  54. Andersson, R., Sandelin, A. Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements. Nature Reviews Genetics. 21 (2), 71-87 (2020).
  55. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  56. Han, H. A., Pang, J. K. S., Soh, B. -S. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. Journal of Molecular Medicine. 98 (5), 615-632 (2020).

Tags

Биоинженерия выпуск 195 Таргетное эпигенетическое молчание Инактивация генов РНК-интерференция Искусственные нуклеазы Двухцепочечный разрыв ДНК Эпигенетическое редактирование Программируемый ДНК-связывающий домен Домен KRAB DNMT3A DNMT3L Наследуемые репрессивные эпигенетические состояния Природа «Бей и беги» Деметилирование ДНК
<em>In Vitro</em> Выбор инженерных транскрипционных репрессоров для таргетного эпигенетического подавления
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Migliara, A., Cappelluti, M. A.,… More

Migliara, A., Cappelluti, M. A., Giannese, F., Valsoni, S., Coglot, A., Merelli, I., Cittaro, D., Lombardo, A. In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing. J. Vis. Exp. (195), e64403, doi:10.3791/64403 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter