Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro Utvalg av konstruerte transkripsjonsrepressorer for målrettet epigenetisk deaktivering

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64403
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 2, 1,4
1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget), IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences, IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

Summary

Her presenterer vi en protokoll for in vitro-utvelgelse av konstruerte transkripsjonsrepressorer (ETR) med høy, langsiktig, stabil, on-target silencing effektivitet og lav genom-bred, off-target aktivitet. Denne arbeidsflyten gjør det mulig å redusere et innledende, komplekst repertoar av kandidat-ETR til en kort liste, egnet for videre evaluering i terapeutisk relevante innstillinger.

Abstract

Geninaktivering er medvirkende til å studere genfunksjon og representerer en lovende strategi for behandling av et bredt spekter av sykdommer. Blant tradisjonelle teknologier lider RNA-interferens av delvis målopphevelse og kravet om livslang behandling. I motsetning til dette kan kunstige nukleaser pålegge stabil geninaktivering gjennom induksjon av et DNA-dobbeltstrengbrudd (DSB), men nyere studier stiller spørsmål ved sikkerheten til denne tilnærmingen. Målrettet epigenetisk redigering via konstruerte transkripsjonsrepressorer (ETR) kan representere en løsning, da en enkelt administrering av spesifikke ETR-kombinasjoner kan føre til varig deaktivering uten å indusere DNA-brudd.

ETR er proteiner som inneholder et programmerbart DNA-bindende domene (DBD) og effektorer fra naturlig forekommende transkripsjonsrepressorer. Spesielt ble en kombinasjon av tre ETRer utstyrt med KRAB-domenet til humant ZNF10, det katalytiske domenet til humant DNMT3A og humant DNMT3L, vist å indusere arvelige repressive epigenetiske tilstander på ETR-målgenet. Hit-and-run-naturen til denne plattformen, mangelen på innvirkning på DNA-sekvensen til målet, og muligheten til å gå tilbake til den undertrykkende tilstanden ved DNA-demetylering på forespørsel, gjør epigenetisk silencing til et spillskiftende verktøy. Et kritisk skritt er identifisering av riktig ETRs posisjon på målgenet for å maksimere on-target og minimere off-target silencing. Å utføre dette trinnet i den endelige ex vivo eller in vivo prekliniske innstillingen kan være tungvint.

Ved å ta CRISPR / katalytisk død Cas9-systemet som en paradigmatisk DBD for ETR, beskriver denne artikkelen en protokoll som består av in vitro-skjermen av guide-RNA (gRNA) koblet til trippel-ETR-kombinasjonen for effektiv on-target silencing, etterfulgt av evaluering av genom-wide spesifisitetsprofilen til topptreff. Dette muliggjør reduksjon av det opprinnelige repertoaret av kandidat-gRNA til en kort liste over lovende, hvis kompleksitet er egnet for deres endelige evaluering i den terapeutisk relevante innstillingen av interesse.

Introduction

Geninaktivering har tradisjonelt spilt en nøkkelrolle for å studere genfunksjon i både cellulære og dyremodeller. Videre, i de siste to tiårene, med fremveksten av genterapi, har det blitt foreslått som en potensielt spillskiftende tilnærming til å behandle sykdommer forårsaket av gevinst-av-funksjon mutasjoner1, smittsomme sykdommer2 eller patologier der deaktivering av ett gen kan kompensere for en arvelig defekt i en annen3. Endelig har genetisk inaktivering av nøkkelregulatorer for cellekondisjon og funksjonell kontroll blitt foreslått for å øke effektiviteten av celleprodukter for kreftimmunterapi4 og regenerativ medisin5.

Blant de forskjellige teknologiene for å oppnå geninaktivering, er en av de mest lovende målrettet epigenetisk inaktivering 6,7. Kjernen i denne teknologien er de såkalte konstruerte transkripsjonsrepressorene (ETR), kimære proteiner som består av et programmerbart DNA-bindende domene (DBD) og et effektordomene (ED) med epigenetisk repressiv funksjon. Zinkfingerproteiner (ZFPs)8, transkripsjonsaktivatorlignende effektorer (TALEs)9 eller CRISPR/dCas910-baserte DBD-er kan utformes for å selektivt binde ED til promotor/forsterkersekvensen til målgenet som skal deaktiveres. En gang der utfører ED av ETR sin silencing aktivitet ved å pålegge heterokromatin-induserende repressive epigenetiske merker som histonmodifikasjoner (H3K9 11,12 eller H3K27 13 metylering, H3 eller H4 deacetylering 14) og CpG DNA-metylering 15, i henhold til det repressive domenet som brukes.

Spesielt inspirert av de molekylære prosessene for permanent transkripsjonell undertrykkelse av endogene retrovirus som forekommer i preimplantasjonsembryoet16, har en kombinasjon av tre ETR blitt generert for å utnytte følgende ED: i) Krüppel-assosiert boks (KRAB) domene av human ZNF10; ii) det katalytiske domenet til human de novo DNA-metyltransferase 3A (DNMT3A); og iii) full-lengde humant DNA metyltransferase 3-lignende (DNMT3L). KRAB er et konservert repressivt domene som deles av flere ZFP-er hos høyere virveldyr17,18, hvis silencingaktivitet hovedsakelig er basert på dets evne til å rekruttere KAP1 19-et stillasprotein som deretter interagerer med flere andre heterokromatinduktorer20-som omfatter nukleosomremodellering og deacetylering (NuRD) kompleks 21, H3K9 histonmetyltransferase SETDB1 22 og H3K9-metyleringsleseren HP1 23, 24, blant annet.

DNMT3A overfører aktivt metylgrupper på DNA ved CpG-sekvenser25. Den katalytiske aktiviteten til DNMT3A forsterkes av dens fysiske tilknytning til DNMT3L, en embryo- og kimcellebegrenset paralog av DNMT3A som mangler det katalytiske domenet som er ansvarlig for metylgruppeoverføring26,27. DNA-metylering ved CpG-rike regioner - referert til som CpG-øyer (CGI) - innebygd i promotor / forsterkerelementene i pattedyrgener er vanligvis forbundet med transkripsjonsdemping28. Det er viktig at når den er deponert, kan CpG-metylering arves stabilt gjennom mitose av et UHRF1-DNMT1-basert molekylært kompleks29.

Stabil overekspresjon av ETR i målcellen kan være problematisk, sannsynligvis på grunn av den økende risikoen for aktivitet utenfor målet og squelching av endogene interaktorer fra deres fysiologiske målsteder over tid. Imidlertid kan forbigående uttrykk for enkelt-ETR-deler mislykkes i å indusere langvarig deaktivering med høy effektivitet30, noe som hemmer deres terapeutiske anvendelse. Derfor var et banebrytende gjennombrudd i feltet beviset på at kombinasjonen av de tre KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-baserte ETRene kan synergisere og, selv når de bare er forbigående levert samtidig, pålegge promotorsekvensen av målgenet H3K9 og CpG-metylering. Disse blir deretter lest og forplantet av cellen gjennom mitose, noe som fører til arvelig silencing i flere humane og murine cellelinjer, samt ex vivo dyrkede primære celler30.

Merk at den epigenetiske deaktiveringen pålagt av ETR-ene kan tilbakeføres på forespørsel ved målrettet (f.eks. rekruttering av CRISPR / dCas9-basert TET1 DNA-demetylase på det lydløse stedet) eller farmakologisk (administrering av DNA-metyltransferasehemmeren 5-Aza) DNA-demetylering30, en potensiell motgift i tilfelle ETR-relaterte bivirkninger. Alt-i-ett-ETR med de tre KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-baserte ED-ene ble også beskrevet, noe som viser signifikant deaktiveringseffektivitet i cellelinjer31,32 mot det store flertallet av proteinkodende gener. Videre rapporterte flere studier som brukte ETRene en høy sikkerhetsprofil, uten større aktivitet utenfor målet når det gjelder de novo CpG-metylering eller endring av kromatintilgjengelighet30,31,32. Imidlertid anbefales en dedikert analyse av spesifisitetsprofilen til ETR utstyrt med en nydesignet DBD før kliniske anvendelser.

Fra et klinisk perspektiv kan målrettet epigenetisk silencing gi kritiske fordeler for både RNA-interferens (RNAi)-basert knockdown33 og kunstig nukleasebasert genforstyrrelse8. I motsetning til RNAi kan målrettet epigenetisk silencing indusere full opphevelse av målet per celle og krever ikke periodisk behandling for å sikre langvarig silencing; i motsetning til genforstyrrelser, etterlater den DNA-sekvensen uendret, og unngår generering av DNA-dobbeltstrengbrudd (DSB). DSB kan da indusere apoptose og cellesyklusstans, noe som potensielt kan føre til en seleksjon mot celler med en funksjonell p53-bane 34,35 og, spesielt i multiplex genredigeringsinnstillinger, kromosomale omorganiseringer35. Videre, ved å videresende det irreversible mosaikkutfallet av ikke-homologt-ende-sammenføyende-mediert DNA DSB-reparasjon36, kan genforstyrrelser ikke unngå reparasjon av målet i rammen til funksjonelle kodingssekvenser som et av de endelige utfallene, og i motsetning til epigenetisk deaktivering, kan det ikke slettes på forespørsel.

Endelig har epigenetisk silencing potensialet til å utvide rekkevidden av målrettede genetiske elementer til klasser helt eller i det minste delvis ildfaste mot RNAi og genforstyrrelser, for eksempel ikke-transkriberte regulatoriske elementer og ikke-kodende RNA30,32. Det første kritiske trinnet for enhver målrettet epigenetisk deaktiveringsapplikasjon er å designe et panel av ETR som dekker de forskjellige regulatoriske sekvensene av målgenet og identifisere de best presterende seg. Antall ETR som skal testes kan være avgjørende, med tanke på den økende delen av genomet som kan målrettes av de programmerbare DNA-bindingsteknologiene som stadig er under utvikling37. Å utføre skjermen av ETRene direkte på celletypen for terapeutisk å stille målgenet, vil representere det mest relevante alternativet. Imidlertid kan skjermer med høy gjennomstrømning være teknisk tungvint i primære celler på grunn av deres begrensede overlevelse i kultur og deres ofte suboptimale tekniske kapasitet. Store skjermer kan være enda mer ugjennomførbare in vivo.

Et mer praktisk alternativ består i å utføre en innledende screening av et stort panel av ETR i lett konstruerbare cellelinjer først, og deretter bare validere de mest lovende i terapeutisk relevant celletype. Et parallelt problem er valget av en passende avlesning for å måle deaktiveringseffektiviteten til ETR-ene. Direkte vurdering av transkript- eller proteinnivåene til målgenet ved RT-qPCR, western blot eller ELISA kan være kostbart og tidkrevende og kan mangle tilstrekkelig følsomhet, og dermed begrense deres anvendelse på skalaer med høy gjennomstrømning. Genereringen av ad hoc-konstruerte reportercellelinjer der en fluorofor er plassert under transkripsjonskontroll av regulatoriske sekvenser av målgenet, tillater utnyttelse av den flowcytometribaserte tilnærmingen til å lese epigenetisk silencing på enkeltcellenivå og i høyt gjennomstrømningstempo.

Etter disse generelle betraktningene beskriver denne artikkelen en protokoll som består av in vitro-arrayed screen av ETR for on-target silencing efficiency, etterfulgt av evaluering av den genombrede off-target-aktiviteten til topptreffene. Denne arbeidsflyten gjør det mulig å redusere det opprinnelige repertoaret av kandidat-ETR til en kort liste over lovende, hvis kompleksitet er egnet for deres endelige evaluering i den terapeutisk relevante celletypen av interesse.

Blant de forskjellige programmerbare DBD-ene som kan utnyttes til å generere ETR, vil denne protokollen fokusere på CRISPR / dCas9-basert teknologi på grunn av den enkle utformingen av gRNA som spenner over målgenpromotoren på en høy gjennomstrømningsskala. Den samme konseptuelle arbeidsflyten som er beskrevet nedenfor, kan imidlertid vedtas for å evaluere effektiviteten og spesifisiteten til ETR-er utstyrt med andre DBD-er.

Protocol

1. Engineering en fluorescensbasert reportercellelinje for å overvåke transkripsjonsaktiviteten til målgenet ved flowcytometri

  1. Identifiser cellelinjer som uttrykker målgenet som skal dempes. Bla gjennom målgenet som skal dempes i Human Protein Atlas38 og naviger gjennom delen "Cellelinje" for å identifisere de linjene som er representative for det somatiske vevet av interesse (f.eks. En levercellelinje hvis de endelige målene er leverhepatocytter). Alternativt kan du forhøre en offentlig tilgjengelig RNA-sekvenseringsdatabase (RNA-Seq) (f.eks.
  2. Blant kandidatene, prioriter cellelinjer for hvilke effektive forbigående genleveringsprotokoller - instrumentelle for ETR-levering - er tilgjengelige.
    MERK: Blant de forskjellige modalitetene representerer nukleofeksjon et av de beste alternativene, da det sikrer høy transfeksjonseffektivitet. Her har human erythroleukemia K-562 celler blitt valgt for å generere en cellelinje som rapporterer transkripsjonsaktiviteten til beta-2-mikroglobulin (B2M) genet (heretter referert til B2MTdTomato K-562 celler).
  3. Videre prioritere kandidatene for å unngå cellelinjer der målgenet er avgjørende for cellens levedyktighet, da dette svekker vedlikehold av celler med stabil silencing av målgenet i kultur. Hvis ikke tidligere rapportert, for å få en følelse av essensen av målgenet i den valgte celletypen, generere en genetisk forstyrrelseskontroll ved å transfektere cellene med Cas9-nuklease og et gRNA rettet mot en av de første kodende eksonene av genet.
    MERK: Genetisk forstyrrelse er per definisjon en stabil hendelse; Motseleksjon av forstyrrede celler over tid indikerer at målgenet er essensielt for fysiologien til den valgte cellen.
    1. Identifiser målskjøtingsisoformen som fortrinnsvis brukes i den valgte cellelinjen (isoformen NM_004048.4 av B2M-genet er målrettet i denne protokollen).
    2. Identifiser et gRNA som kan kutte effektivt og spesifikt i den første kodende eksonen til målisoformen (f.eks. Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/) 39, som er et gyldig og brukervennlig online gRNA-utvalgsverktøy).
    3. For K-562-celler, transfekt 1 μg spCas9-kodende plasmid (hCas9; se materialtabell) og 250 ng gRNA-kodende plasmid (phU6-gRNA; se materialtabell) per 5 × 105 celler gjennom nukleofeksjon (i henhold til produsentens instruksjoner).
    4. Dyrk cellene (K-562 celler ved 37 ° C under 5% CO2 i RPMI-1640 supplert med 10% føtal bovint serum [FBS], L-glutamin og penicillin / streptomycin [100 U / ml]) og overvåke nivåene av genforstyrrelser over tid ved å utnytte et mutasjonsdeteksjonssett (følg produsentens instruksjoner).
  4. Klone en donormal for homolog rekombinasjonsmediert integrasjon av en fluorescerende reporter under transkripsjonskontroll av målgenet av interesse (figur 1).
    1. Identifiser regionen av målgenet for å integrere fluoroforuttrykkskassetten.
      MERK: Unngå å målrette transkripsjonelt relevante elementer, for eksempel CpG-øyer og regioner beriket for H3K27-acetylering (markør for aktive promotorer og forsterkere). Endring av disse regulatoriske elementene (potensielt viktig for å bli målrettet av ETR for å instruere epigenetisk silencing) gjør reportercellelinjen mindre prediktiv for den fysiologiske reguleringen av målgenet.
      1. Hvis målgenet ikke koder for et utskilt protein, smelter du reporteren til det siste kodonet i målgenet gjennom et 2A selvspaltende peptid for å opprettholde funksjonaliteten til målgenet.
      2. Hvis målgenet koder for et utskilt protein, for å unngå potensiell sekresjon av reporteren, plasser reporteren i en intronisk region av målgenet. Tvangsintegrering av reporteren i det spleisede transkripsjonen gjennom et spleisakseptorsted (SA) og påfølgende oversettelse gjennom en intern ribosominngangssekvens (IRES) svekker funksjonaliteten til målgenet.
    2. Bruk Chopchop til å velge gRNA-skjæring i målområdet (her velges et gRNA for å målrette sekvensen 5'-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3' av det første intronet av B2M-genet ).
    3. Design en donormal for gRNA-kuttstedet som består av: i) en venstre homologiarm (n basepar [bp] som samsvarer med regionen like oppstrøms for gRNA-kuttstedet); ii) en promotorfri transgen uttrykkskassett (i tilfellet her vist, en SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH poly (A) som favoriserer spleising med det første intronet av B2M-genet ); og iii) en høyre homologisk arm (n bp som matcher regionen nedstrøms for gRNA-kuttstedet).
      MERK: Lengden på homologiarmene som er nødvendige for effektivt å indusere homolog rekombinasjon, kan variere mellom forskjellige celletyper (100-500 bp er et riktig område for K-562-celler).
  5. Lever CRISPR / Cas9 nukleasesystemet og donormalen inne i målcellelinjen. For K-562-celler, transfekt 1 μg spCas9-kodende plasmid (hCas9; se materialtabell), 250 ng gRNA-kodende plasmid (phU6-gRNA; se materialfortegnelse) og 1 μg donormalkodende plasmid per 5 × 105 celler gjennom nukleofeksjon (i henhold til produsentens instruksjoner).
  6. Dyrk cellene i minst 14 dager (for K-562-celler) og overvåk ekspresjonsnivåene til den fluorescerende reporteren over tid ved å bruke et flowcytometer (aktiver phycoerythrin (PE) -kanalen for å måle fluorescensintensiteten til tdTomato-reporteren og følg produsentens instruksjoner for å utføre flowcytometri).
    MERK: Donormalen - spesielt hvis plasmidbasert - kan inneholde kryptiske promotorsekvenser, noe som fører til uttrykk for den fluorescerende reporteren fra ikke-integrerte donorkopier. Dyrking av cellene tillater fortynning av disse ikke-integrerte kopiene ved celledeling og til slutt opprettholder ekspresjonen av reporteren bare fra donorkopiene integrert i målgenomet.
  7. Klonreporter-positive celler gjennom fluorescensaktivert cellesortering (FACS) på enkeltcellenivå. For denne protokollen, aktiver PE-kanalen for å måle fluorescensintensiteten til tdTomato-reporteren og følg produsentens instruksjoner for å sortere enkelt tdTomato-positive K-562-celler per brønn på en 96-brønnsplate.
  8. Ved celleutvidelse i kultur (vanligvis 20-30 dager for K-562-celler), skjermreporter-positive kloner ved PCR for å velge en som bærer en bi-allelisk integrasjon av reporterkassetten inne i mållokuset.
    MERK: Dette maksimerer reporterens uttrykk og letter ytterligere oppløsning mellom reporter-uttrykkende og reporter-silenced celler ved flowcytometri ved ETR-behandling.
    1. Ekstraher genomisk DNA fra 1 × 105 celler per reporter-positiv klon ved hjelp av et DNA-ekstraksjonssett (i henhold til produsentens instruksjoner).
    2. Forsterk B2M-målområdet med forover- (5'-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3') og omvendt (5'-AATGGTTGAGTTGGAC-3') primere i henhold til instruksjonene i PCR-forsterkningssettet. Glødningstemperaturen for dette primerparet er 47,7 °C med Taq-baserte DNA-polymeraser og 0,5 μM primerkonsentrasjoner.
    3. Analyser PCR-produktet ved hjelp av 1% agarosegelelektroforese (etter produsentens instruksjoner). Skjerm for kloner som viser båndet relatert til integrering av tdTomato i B2M-mållokuset (3,413 bp), uten båndet relatert til villtype-mållokuset ( 1,027 bp).

2. Designe gRNA for CRISPR/dCas 9-basert epigenetisk deaktivering av målgenet

  1. Bla gjennom målgenet i UCSC-genomleseren40 og trekk ut nukleotidsekvensen av regioner som potensielt regulerer transkripsjonsaktiviteten, for eksempel CpG-øyer og steder beriket for H3K27-acetylering (markør for aktive promotorer og forsterkere).
    MERK: Ifølge en nylig studie er den beste målrettingsregionen et 1 kilobase (kb) vindu sentrert på transkripsjonsstartstedet til målgenet32.
  2. Lim inn de valgte sekvensene i Chopchop online-verktøyet og velg undertrykkelse som formålet med gRNAene som skal hentes. Vent til Chopchop gir en liste over gRNA kartlagt på den genetiske sekvensen av interesse og oppført i henhold til en poengsum med tanke på både antall off-target kamper og den forventede effektiviteten på målet (figur 2).
  3. Velg minst 10 gRNA per målsekvens. Hvis mulig, prøv å velge gRNA som spenner over hele regionen som skal undersøkes, uten fulle treff med andre intragene sekvenser gjennom hele genomet.

3. Arrayed transient levering av CRISPR / dCas 9-baserte ETR i reporterens cellelinje

  1. Blant de transgene leveringssystemene som tidligere er rapportert for målcellelinjen, velg de som bare tillater forbigående transgenuttrykk, maksimerer leveringseffektiviteten og minimerer cellemanipulasjonsrelatert toksisitet. Når det gjelder K-562-celler, anbefales både plasmid- og mRNA-nukleofeksjon sterkt, med plasmidproduksjon som representerer et teknisk enklere og billigere alternativ.
  2. Klon både gRNAene valgt i seksjon 2 og CRISPR / dCas9-baserte ETR i det transgene leveringssystemet du velger. Se følgende trinn for en protokoll for kloning av ETRer i plasmid-DNAer.
    MERK: Plasmider som kodes separat for dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A og dCas9:DNMT3L30 er ikke tilgjengelig på Addgene. De ble klonet ved å erstatte VP160-transaktivatoren fra plasmidet pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41 (se materialfortegnelse) med enten KRAB-, DNMT3A- eller DNMT3L-domenekodingssekvensen30. En plasmidkoding for en alt-i-ett ETR, kalt CRISPRoff-v2.132, er tilgjengelig (se materialfortegnelse).
    1. Transformer plasmider som koder for ETR i kjemisk kompetente E. coli-celler (i henhold til produsentens instruksjoner). Skjerm koloniene for tilstedeværelsen av det ETR-bærende plasmidet ved restriksjonsenzymfordøyelse og Sanger-sekvensering, og velg til slutt en av de positive koloniene for plasmid-DNA Midiprep-produksjon (etter produsentens instruksjoner).
    2. Klon gRNAene inne i phU6-gRNA-ryggraden (figur 3).
      1. Ved hjelp av molekylærbiologisk designprogramvare, legg til en 5'-CACCG-3' sekvens oppstrøms for protospaceren (de første variable 20 nukleotidene [nt] av det valgte gRNA) for å generere en 25 nt-lang oligo i silico, referert til som SGfw.
      2. På samme måte legger du til en 5'-AAAC-3' sekvens oppstrøms for det omvendte komplementet til protospaceren til det valgte gRNA og en 5'-C-3' nedstrøms for å generere en 25 nt-lang oligo referert til som SGrv.
      3. Bestill både SGfw- og SGrv-sekvensene som saltfrie enkeltstrengede DNA-oligoer, resuspendert i vann ved 100 μM.
      4. Tilsett 1 μL av hver oligo til 2 μL glødebuffer (10 mM Tris [pH 7,5-8,0], 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) og 16 μL vann.
      5. Utfør oligoglødning ved å plassere løsningen i en termosyklist som er programmert til å starte ved 95 °C i 10 minutter. Deretter avkjøles den gradvis til 25 °C i løpet av 45 minutter.
      6. Fortynn 1 μL av de glødde oligoene med 99 μL nukleasefritt vann, og liger deretter 1 μL av denne fortynningen med 50 ng phU6-gRNA-plasmid som tidligere er fordøyd med BsaI-restriksjonsenzymet (følg instruksjonene fra BsaI og ligasesettleverandører for fordøyelses- og ligeringsprosedyren).
      7. Transformer 20 μL kjemisk kompetente E. coli-celler med 2 μL av ligeringsproduktet (følg produsentens instruksjoner for transformasjonsprosedyren).
      8. Velg flere kolonier for plasmid DNA Miniprep-produksjon (følg instruksjonene fra leverandøren) og kontroller vellykket kloning av protospaceren ved Sanger-sekvensering med følgende primer som samsvarer med U6-promotoren 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'.
      9. Velg en av de positive koloniene for plasmid DNA Midiprep produksjon (i henhold til produsentens instruksjoner).
  3. Lever de valgte gRNAene og CRISPR/dCas9-baserte ETRene i reportercellelinjen i array (ett spesifikt gRNA per tilstand) (figur 3).
    MERK: Som et representativt tilfelle vises arbeidsflyten for nukleofeksjon av plasmidkoding for dCas9: KRAB, dCas9: DNMT3A, dCas9: DNMT3L og gRNA rettet mot B2M CpG-øya i B2M TdTomato K-562-celler i følgende trinn.
    1. Forbered separate rør som inneholder 500 ng av hver av dCas9: KRAB-, dCas9: DNMT3A- og dCas9: DNMT3L-kodende plasmider, men forskjellig for gRNA som skal testes (125 ng av et gRNA-kodende plasmid per rør). Inkluder en gRNA- og ETR-fri nukleofeksjonstilstand som mock-behandlet prøve. Utfør skjermen med minst tre tekniske replikater per prøve.
    2. Pellet 5 × 105 B2MTdTomato K-562 celler per rør og nukleofect dem med plasmidblandingen (i henhold til produsentens instruksjoner).
    3. Resuspender cellene i 200 μL av tidligere oppvarmede RPMI-1640 pattedyrcellekulturmedier og plasser dem tilbake i inkubatoren.

4. Analysere transkripsjonsaktiviteten til målgenet over tid

  1. Bruk flowcytometri for å måle prosentandelen av stilleceller ved ulike tidspunkter etter levering av etr (figur 4). Bruk villtype (WT) celler - som ikke bærer fluorofor-kodende sekvens - for å sette terskelen for reporter-negative celler. Bruk den mock-behandlede prøven til å angi porten for reporter-positive celler.
    MERK: Som foreslått i trinn 1.3, inkluder en genetisk forstyrrelseskontroll i eksperimentet. Dette kan være nyttig både for å overvåke CRISPR-leveringseffektiviteten og kondisjonen til celler som er fratatt målgenet; Tapet av både transkripsjonell inaktivering og genetisk forstyrrelse over tid kan tilskrives essensen av målgenet i den valgte celletypen. Inkluder både kortsiktige (dag 3, dag 7, dag 10) og langsiktige (dag 21, dag 35) for å få en indikasjon på både akutt og langsiktig effektivitet av deaktiveringen.
  2. Identifiser de tre beste gRNAene når det gjelder langsiktig deaktiveringseffektivitet. Bruk FACS til å velge den rapporteringsnegative underpopulasjonen som opprettholdes stabilt i disse utvalgene. Utfør også FACS av bulk mock-behandlede prøver for å holde dem under samme behandling som testprøvene for å tillate riktig sammenligning i de påfølgende analysene.

5. Evaluering av spesifisiteten til ETR-behandlingen ved RNA-seq og metylert DNA-immunutfelling (MeDIP)-seq

  1. Bruk RNA-seq for å evaluere eventuell genomomfattende transkripsjonell deregulering ved ETR-levering.
    1. For både den reporter-silenced subpopulasjonen av prøvene behandlet med de tre topppresterende gRNAene og mock-behandlede celler, ekstraherer RNA ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett. Vurdere kvaliteten og konsentrasjonen av RNA ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett.
    2. Utfør RNA-fragmentering, retrotranskripsjon og bibliotekforberedelse ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett for utarbeidelse av RNA-seq-biblioteker (i henhold til produsentens instruksjoner).
    3. Utfør bibliotekkvantifisering og kvalitetskontroll ved hjelp av kvalitetskontrollinstrumenter som er kompatible med neste generasjons sekvensering og digital elektroforese.
    4. Sekvensbiblioteker på en neste generasjons sequencer etter produsentens instruksjoner, med en 100 bp sammenkoblet protokoll og sikte på et gjennomsnitt på 45 M leser / prøve.
    5. Juster lesekoder til riktig referansegenom og kvantifiser transkripsjonsuttrykk. Utfør justering på tdTomato-sekvensen og kvantifiser den separat.
      MERK: Her brukes STAR aligner (v 2.3.0) 43, med standardparametere, koblet til Rsubread-pakke44.
    6. Utføre analyse av RNA-seq-data i henhold til publisert beste praksis45.
      MERK: R/Bioconductor-pakken edgeR46 brukes her, og bruker et filter på minst ett antall per million (cpm) i minst tre prøver for å forkaste lavuttrykte gener. Alternativt kan filterByExtr-funksjonen i edgeR brukes.
    7. Evaluere differensialgenuttrykk ved hjelp av en negativ binomisk generalisert log-lineær modell implementert edgeR (funksjon glmFit)47. Sett en terskel på 0,01 på justerte p-verdier (Benjamini-Hochberg [BH] korreksjon) for å beholde differensielt regulerte gener.
  2. Evaluer eventuell off-target CpG-metyleringsaktivitet av ETRene ved MeDIP-seq.
    1. For både den reporter-silenced subpopulasjonen av prøvene behandlet med de tre øverste gRNAene og mock-behandlede celler, ekstrahere genomisk DNA ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett (i henhold til produsentens instruksjoner).
    2. Sonikere 500 ng genomisk DNA ved hjelp av en ultralydapparat og følgende parametere: Plikt: 20 %; PIP: 175; Sykluser per serie: 200; Tid: 40 s.
    3. Forbered sekvenseringsbiblioteker med de kommersielt tilgjengelige settene for MeDIP-seq (i henhold til produsentens instruksjoner).
    4. Etter adapterligeringstrinnet, kvantifiser biblioteker ved fluorometrisk analyse og kontroller ligeringseffektiviteten ved qPCR ved hjelp av kommersielt tilgjengelige bibliotekkvantifiseringssett (i henhold til produsentens instruksjoner).
    5. Hent biblioteksutvalg ved å blande tilfeldig valgte biblioteker for å redusere tekniske skjevheter. Bruk et likt bibliotekbeløp (ng) for hvert bibliotek for å balansere utvalgene. Til hvert basseng, legg til det metylerte og ikke-metylerte piggkontroll-DNA-et som er gitt i settet. For kontrollformål, hold et 10% volum av biblioteket, merket som "input" og ikke immunutfelt. Utfør immunutfelling på de resterende 90% av biblioteket ved bruk av det monoklonale antistoffet rettet mot 5-metylcytosin gitt i MeDIP-seq-settet.
    6. Rens berikede og inngangsbiblioteker ved hjelp av settene for rensing av 5-metylcytosinimmunoprecipitasjonsproduktet, i henhold til produsentens instruksjoner.
    7. Evaluer anrikningseffektiviteten ved å utføre kvantitativ sanntids-PCR på den interne piggen i kontroller ved hjelp av primere som følger med settet. For hver immunutfelling (IP), beregne anrikningsspesifisitet fra utvinning av metylert og ikke-metylert DNA, ved bruk av syklusterskelverdiene (Ct) for MeDIP og inngangsfraksjoner oppnådd fra qPCR-reaksjonen (se ligningene 1 og 2):
      Equation 1 (1)
      Equation 2 (2)
      Vurder IP-biblioteker som vellykkede hvis spesifisitetsverdiene er ≥0,95.
    8. Forsterk bibliotekene ved hjelp av MeDIP-seq-bibliotekforberedelsessett, i henhold til produsentens instruksjoner, og utfør kvantifisering og bibliotekstørrelsesdistribusjonsanalyse av produktet.
    9. Utfør biblioteksekvensering på neste generasjons sequencere. Bruk par-end-sekvensering, med en leselengde på 100 bp, med sikte på et gjennomsnitt på 30 M leser / prøve.
    10. Juster sekvenseringslesekodene til det aktuelle referansegenomet (f.eks. hg38) ved hjelp av bwa (v 0.7.5 eller høyere)48 og identifiser deretter topper ved hjelp av MACS (v 2.0.10 eller høyere)49, slik at det kan identifiseres brede topper (-slocal = 0,-llocal = 500000).
    11. Opprett et felles sett med regioner fra forskjellige prøver ved hjelp av BEDTools' multiintersection-verktøy50, som aktiverer klyngealternativet.
    12. Beregn per-prøvedekning over den endelige regionlisten ved hjelp av BEDTools 'multicov, og forkast dupliserte lesninger.
    13. Utfør analyse av matriseantallet ved hjelp av edgeR. Bruk et filter på minst ett antall per million (cpm) i minst tre eksempler for å forkaste områder med lav anrikethet.
      MERK: Alternativt kan filterByExtr-funksjonen i edgeR brukes.
    14. Identifisere differensialmetylering ved å ta i bruk den generaliserte log-lineære modellen implementert i edgeR (funksjon glmFit) og normalisere ved bruk av betinget kvantilnormalisering51 for å korrigere for regionvis GC-innhold. Velg differensielt metylerte regioner ved å bruke en terskel på 0,01 på BH-justerte p-verdier . Utfør analysen av gjentatte sekvenser som følger.
      MERK: Se edgeR-brukerhåndboken for den fullstendige listen over alternativer og parametere (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html).
      1. Filtrer MeDIP-seq-resultater for en nominell p-verdi <0,01 og opprett to sett med regioner: velg regioner som har logFC >1 i det første settet, og regioner som har logFC <-1 i det andre settet.
      2. Hent RepeatMasker-merknaden for det valgte genomet som en sengefil og tell antall elementer i hvert sett. Konverter antallet som et forholdstall over antall områder for hvert datasett.
      3. Trekk ut forholdet mellom metylom som overlapper hver klasse av repetisjoner og utfør en Chi-kvadrert test for å oppdage noen signifikant anrikning.
  3. Evaluer om differensielt transkriberte eller differensielt metylerte regioner mellom ETR- og mock-behandlede prøver kartlegges til i silico-predikert off-target gRNA-binding.
    1. Bruk CRISPR design suite52 som prediksjonsverktøy for gRNA-binding utenfor mål.
    2. For hvert antatt off-target-område, se på nærmeste transkripsjonsstartsted (TSS) og nærmeste metylerte region. Tenk som en sann off-target effekt en region assosiert enten til et gen regulert med FDR <0.01 og en avstand til TSS mindre enn 10 Kb, eller en metylert region regulert med FDR <0.01 og en avstand lavere enn 1 Kb.
    3. Identifiser antall og egenskaper i regionene transkripsjonelt endret eller overmetylert i prøver behandlet med hvert av de tre topppresterende gRNAene sammenlignet med mock-behandlede prøver (figur 5) for å identifisere de mest spesifikke blant gRNAene. Ranger den potensielle innvirkningen av et sted utenfor målet på målcellens fysiologi i følgende rekkefølge (fra den mest påvirkende til den mindre påvirkende):
      i) Intragent, regulatorisk region-fysiologisk uttrykt gen
      ii) Intragent, eksonisk region-fysiologisk uttrykt gen
      iii) Intragent, intronisk region-fysiologisk uttrykt gen
      iv) Intragent, regulatorisk region-ikke uttrykt gen
      v) Intragent, eksonisk region-ikke uttrykt gen
      vi) Intragent, intronisk region-ikke uttrykt gen
      vii) Intergenisk region

Representative Results

Ved levering av en donormal for homolog rekombinasjonsmediert integrering av fluorescerende reporter i mållokuset kombinert med CRISPR/Cas9-systemet (f.eks. ved plasmidnukleofeksjon i tilfelle K-562-celler), vises reporterpositive celler i den behandlede prøven (figur 1, nederst). Hvis dette ikke skjer, må du kontrollere nøyaktigheten av design og kloning av både donormalen og CRISPR/Cas9-reagensene. Hvis bekreftet, prøv å optimalisere dosene av reagenser og selve leveringsprotokollen.

Når reportercellelinjen er oppnådd, velg promotor / forsterkersekvenser av målgenet og design et panel med matchende gRNAer. Bruk i silico-prediksjonsverktøy som Chopchop for både å identifisere gRNA-sekvensene og rangere dem når det gjelder predikert effektivitet og spesifisitet (figur 2). Hvis ingen gRNA hentes, kontroller tilstedeværelsen av det kanoniske Cas9 protospacer tilstøtende motivet (PAM) (5'-NGG-3') i målsekvensen. Hvis ingen PAM-sekvenser er til stede, bør du vurdere å enten skifte til ETR basert på alternative PAM-uavhengige Cas9-varianter (ingen ETR-er publisert med disse variantene ennå) eller bytte til alternative DNA-bindende domeneplattformer, for eksempel ZFP53 eller TALEs30. Men hvis bare gRNA med lav predikert effekt / spesifisitet hentes, bør du vurdere enten 1) å teste disse lavkvalitets gRNAene eller 2) utvide mål-DNA-sekvensen, på jakt etter bedre gRNAer. Ved forbigående levering av trippel ETR-kombinasjonen (eller CRISPRoff; v2.1) sammen med gRNA, utfør langsgående flowcytometrianalyser for ekspresjonen av den fluorescerende reporteren, og observerer ofte en topp i reporterundertrykkelse ved akutte analyser, som deretter i det minste delvis reabsorberes på grunn av mitotisk fortynning av ETR-kodende plasmider over tid (figur 4C). Hvis ETR / gRNA-kombinasjonen effektivt avsetter CpG-metylering på mållokuset, vil permanent undertrykkelse av reporteren forekomme i en betydelig brøkdel av behandlede celler (figur 4C). Ulike gRNA kan vise variabel langsiktig deaktiveringseffektivitet (figur 4B,C).

For genombrede spesifisitetsvurderinger, bruk MeDIP-seq for å identifisere de differensielt metylerte områdene mellom celler der målet har vært langvarige lydløse og ubehandlede celler. Ideelt sett vil et svært spesifikt gRNA bare indusere en topp av de novo CpG-metylering på målstedet (figur 5). Hvis ikke, kan man vurdere å karakterisere aktiviteten utenfor målet til gRNAene rangert i en lavere posisjon i effektivitetslisten på målet.

Figure 1
Figur 1: Integrasjon av en tdTomato reporter under regulatoriske elementer av det humane B2M-genet ved homologi-rettet reparasjon. Øverst: Skjema over strategien for å integrere en tdTomato fluorescerende reporter i det første intronet av det humane B2M-genet ved CRISPR / Cas9-indusert homologirettet reparasjon. Nederst: representative punktplott av K-562-celler før og etter integrering av tdTomato-reporteren i det første intronet av B2M-genet . Forkortelser: HA = homologisk arm; HDR = homologi-rettet reparasjon; IRES = intern ribosom oppføringssted; pa = BGH poly (A); SA = spleis akseptor nettsted; WT = vill type; 3XSTOP = tre tandemstoppkodoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: I silico identifisering av gRNA rettet mot CpG-øya av B2M-genet , rangert for predikert effektivitet og spesifisitet. Chopchops utgangsgrensesnitt som viser gRNA rettet mot CpG-øya innebygd i promotorsekvens av B2M-genet , rangert for både antall off-target-sekvenser med 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) eller 3 (MM3) uoverensstemmelser og den forventede effektiviteten på målet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kloning og arrayed nucleofection av gRNA for dCas9 ETR-mediert epigenetisk silencing. Øverst: oligomediert protospacerkloning i et humant U6-gRNA som uttrykker plasmid. Nederst: arrayed skjerm av B2M-målrettede gRNA for CRISPR / dCas9-basert epigenetisk silencing ved plasmidnukleofeksjon i K-562B2M / tdTomato-celler . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Skjerm for gRNA som effektivt induserer langvarig deaktivering av B2M-genet. (A) Øverst: skjematisk fremstilling av B2MtdTomato-genet avbildet i det forstørrede området, den relative rekkefølgen og orienteringen av binding av dCas9-baserte ETR kompleksert med gRNA. Nederst: representative punktdiagrammer av B2MtdTomato K-562-celler enten før (venstre) eller etter (høyre) ETR-silencing. Analyser 30 dager etter transfeksjon med plasmidkoding for gRNA og trippelkombinasjonen dCas9:KRAB+ dCas9:D3A + dCas9:D3L. (B) Silencing aktivitet av de angitte gRNAene (enten i bassenger eller som individuelle gRNAer) rettet mot CpG-øya B2M (røde piler i det øverste skjemaet indikerer orientering av gRNAene) i K-562 B2M tdTomato celler på dag 30 etter transfeksjon. Data viser prosentandelen av tdTomat-negative celler (gjennomsnittlig ± SEM; n = fire uavhengige transfeksjoner for hver behandlingstilstand). (C) Tidskursanalyse av B2MtdTomato K-562-celler ved transfeksjon med plasmider som uttrykker trippel ETR-kombinasjonen og de angitte B2M CpG-øymålrettede gRNAene eller mock (gRNA- og ETR-fri transfeksjon). Data viser prosentandelen av tdTomat-negative celler (gjennomsnittlig ± SEM; n = tre uavhengige transfeksjoner for hver behandlingstilstand). Upubliserte data. Panel A og B tilpasset fra Amabile et al.30. Forkortelser: CGI = CpG øy; IRES = intern ribosom oppføringssted; pa = BGH poly (A); SA = spleis akseptor nettsted; SD = spleise donor nettsted; TSS = transkripsjon startsted; UT = utransfektet; 3XSTOP = 3 tandemstoppkodoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Genom-bred analyse av ETR-spesifisiteten ved RNA-seq og ved MeDIP-seq. Venstre: sammenligning av ekspresjonsnivåer i mock-behandlede B2MtdTomato K-562 celler og celler behandlet med trippel dCas9: KRAB, dCas9: DNMT3A, dCas9: DNMT3L ETR kombinasjon og med et gRNA rettet mot CpG-øya i B2M-genet. Verdier uttrykkes i log2 av avlesninger per kilobase per million (RPKM) av tilordnede avlesninger. Svarte prikker representerer gener uttrykt på sammenlignbare nivåer under alle forhold; gule sirkler representerer gener differensielt regulert under en FDR <0,01; rød sirkel representerer B2M-IRES-tdTomato-transkripsjonen. Øverst til høyre: circos-plott som viser hele genomet MeDIP-seq-profiler av mock-behandlede B2MtdTomato K-562-celler (blå) eller celler behandlet med trippel dCas9: KRAB, dCas9: DNMT3A, dCas9: DNMT3L ETR-kombinasjonen og med et gRNA rettet mot CpG-øya (CGI) av B2M-genet (grønn). Nederst til høyre: metyleringsstatusen til B2MtdTomato-lokuset i de angitte prøvene vises. Tre replikater er representert i hver haug; Bunken med justerte avlesninger ble glattet ut ved hjelp av et gaussisk vindu. Denne figuren ble tilpasset fra Amabile et al.30. Forkortelse: TSS = transkripsjon startsted. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Målrettet epigenetisk inaktivering kan representere en lovende løsning for å behandle lidelser som kan dra nytte av permanent geninaktivering, inkludert sykdommer forårsaket av gain-of-function-mutasjoner1, smittsomme sykdommer2 og patologier der deaktivering av ett gen enten kan kompensere for en arvelig defekt i en annen3 eller frigjøre det fulle potensialet for adoptivcelleterapier4, 5. Ved å virke på kromatinnivå og bli automatisk forplantet av cellen 7,30,32, kan epigenetisk silencing unngå giftige endringer (f.eks. kromosomale omorganiseringer) av DNA-sekvensen til målgenet og delvis, forbigående deaktivering av målet, som er begrensninger av henholdsvis kunstig nukleasebasert genforstyrrelse8,34,35 og RNAi-basert knockdown 33.

Et av de viktigste foreløpige trinnene i enhver epigenetisk silencing-protokoll er å identifisere riktig posisjon på målgenet for å lede ETRene som vil deponere de repressive epigenetiske merkene som er nødvendige for å slå av transkripsjonsaktiviteten til målet. Ulike transkripsjonelle startsted-proksimale og -distale regulatoriske elementer kan sammenfalle for å støtte transkripsjonsutgangen av et gitt humant gen54. Videre kan forskjellige målsteder per spesifikt regulatorisk element nå identifiseres takket være det økende antallet programmerbare DNA-bindingsteknologier6. Derfor kan protokoller, som den som er beskrevet her i konstruerte cellelinjer, brukes til å nominere individuelle målsteder og / eller genomiske regioner som er mottagelige for ETR-mediert epigenetisk deaktivering, før du går i gang med tungvint og tidkrevende evalueringsarbeid av de beste kandidatene i den endelige terapeutiske innstillingen. Noen kritiske aspekter ved protokollen er nærmere beskrevet nedenfor.

Konstruksjon av en reportercellelinje som forutsier det endelige terapeutiske målet
Til tross for den konstante optimaliseringen av celletekniske protokoller - som kreves her for å sette inn kassettkodingen for den fluorescerende reporteren i målgenet og for å levere ETR-ene, kan det ikke tas for gitt at de allerede kan være tilgjengelige for cellelinjen som ligner mest på det endelige terapeutiske målet mest. I dette tilfellet kan forskjellige avbøtende strategier brukes: a) dra nytte av optimaliseringssett levert av leverandører for å optimalisere internt transfeksjonsprotokollen for målcellelinjen; b) bytte til andre cellelinjer som fortsatt uttrykker dette målgenet, men som tilhører andre vev enn det endelige terapeutiske målet - for hvilke ingeniørprotokoller har blitt omfattende optimalisert. I tilfelle disse alternativene ikke er tilgjengelige, kan man vurdere å bytte til primære celletyper eller organoider som representerer det endelige målet. Som en generell vurdering for både prekliniske studier og terapeutiske anvendelser av ETR-basert epigenetisk inaktivering, bør scenarier der målgenet er essensielt for målcelletypen forkastes. Den fullstendige, langsiktige silencing av et essensielt gen pålagt av ETR vil føre til motvalg av målcellene over tid (og potensielt toksisitet av behandlingen). Alternative teknologier som gir delvis målavbrudd, som RNAi33, foretrekkes i disse tilfellene.

Evaluering av ETRs on-target silencing aktivitet
ETR basert på kombinasjonen av KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-effektordomener har vist seg å være effektive mot det store flertallet av proteinkodende gener, med et bredt rundt 1 kilobase langt tillatt målrettingsvindu sentrert på transkripsjonsstartstedet32. For å få en følelse av hvordan et godt utført epigenetisk silencing eksperiment ser ut, er de tekniske detaljene og resultatene av å slå av B2M-genet i K-562-celler gitt her. Dette kan betraktes som en viktig positiv kontroll som skal inkluderes, ikke bare av forskere som arbeider med K-562-celler, men også av de som nærmer seg ETR-basert teknologi for første gang. Som det fremgår av protokollen, anbefales kunstig nuklease (f.eks. CRISPR / Cas9)-basert genforstyrrelse som en ekstra kontroll av både effektiviteten av genlevering i celletypen av interesse og av fenotypen av celler som er fratatt målgenet. Etter den første skjermen av gRNA som skal kobles til CRISPR / dCas9-baserte ETR, hvis ingen av de testede gRNAene er i stand til å permanent dempe målgenet, bør man vurdere i følgende rekkefølge: 1) øke mengden gRNA og ETR levert; 2) testing av bassenger av de beste gRNAene på jakt etter synergistiske effekter mellom dem. Hvis langvarig silencing fortsatt ikke oppnås, bør man vurdere: 3) teste flere gRNAer, som kan målrette mot steder som er mer relevante for å instruere epigenetisk silencing; 4) bytte til ZFP8- eller TALE9-baserte DBD-plattformer, som kan ha en forbedret bindingskapasitet til målkromatinet; 5) bytte fra forbigående til stabil - for eksempel integrering av viralt vektorbasert uttrykk av ETR (enten gRNA eller dCas9-fusjonskonstruksjonene eller begge deler når man tar i bruk CRISPR / dCas9-teknologien). Siden vår gruppe utviklet, og har solid erfaring med, samlevering av de tre separate ETRene30, er protokollen og resultatene som vises her basert på denne tilnærmingen. Imidlertid kan en lignende konseptuell arbeidsflyt sannsynligvis brukes for et alt-i-ett CRISPR-basert system32.

Evaluering av ETRs off-target-aktivitet
Flere studier har vist foreløpige in vitro-indikasjoner på spesifisiteten til ETR basert på kombinasjonen av KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-effektordomenene30,31,32. Imidlertid, hvis ingen av dem blant de testede gRNAene viser en tilfredsstillende spesifisitetsprofil når det gjelder transkripsjonsregulering og / eller de novo DNA-metylering, kan man forfølge to ikke-gjensidig utelukkende strategier: a) redusere oppholdstiden til ETRene inne i cellen (og dermed deres potensielle aktivitet utenfor målet) ved enten å redusere dosene av ETR eller teste alternative leveringssystemer. For eksempel, sammenlignet med plasmider, forventes både mRNA og proteinlevering å redusere celleeksponeringstiden for ETR og følgelig sannsynligheten for aktivitet utenfor målet55; b) bytte til nyere Cas9-varianter, optimalisert for å redusere off-target-bindingen til plattform56, eller til alternative ZFP8- eller TALE9-baserte DNA-bindingsteknologier. Det er viktig å vurdere at, sammenlignet med mock-behandlede prøver, påvirkes on-target og off-target aktiviteten av geninaktivering ikke bare av bindingen av DBD til deres målsekvens, men også av den potensielle kapasiteten til de epigenetiske effektordomenene som skal rekrutteres til andre loci av deres naturlige, endogene kofaktorer. Derfor kan reduksjon av oppholdstiden for ETR i målcellen redusere ikke bare sannsynligheten for binding av DBD til off-target nettsteder, men også sannsynligheten for at ETR skal samhandle med endogene kofaktorer, med potensielle fordeler når det gjelder spesifisitet og ulemper når det gjelder målaktivitet. Til slutt, sammenlignet med mock-behandlede prøver, kan noen av de transkripsjonelle og mindre sannsynlige CpG-metyleringsendringene målt i lydløse celler ganske enkelt avledes ved berøvelse av målgenet. Disse anses ikke som utenfor målene for lyddempingsteknologien. For å identifisere dem bør man også inkludere genforstyrrelser ved kunstig nuklease i forsøkspanelet 8,9,10. Biologiske endringer på grunn av det funksjonelle tapet av målgenet vil bli delt mellom epigenetisk silencing og denne alternative teknologien.

Disclosures

AL er medstifter, kvoteinnehaver og konsulent for Chroma Medicine, Inc.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica og Deborah Cipria for samarbeidet med å utvikle den epigenetiske silencing-teknologien gjennom årene; Dejan Lazarevic og Francesca Giannese for kritisk gjennomgang av RNA-seq og MeDIP-seq analysene beskrevet i protokollen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til A.L. fra Telethon Foundation (TIGET grant no. F1) og EU Horizon 2020 Program (UPGRADE). Illustrasjoner er laget med BioRender.com.

FORFATTERE BIDRAG
A.M., M.A.C., F.G. og A.C. bidro med utforming av protokollen og skriving av manuskriptet; S.V., I.M. og D.C. utformet bioinformatikkseksjonene i protokollen og reviderte manuskriptet; A.M. og A.L. utformet protokollen, unnfanget og skrev manuskriptet med innspill fra alle forfatterne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4200 TapeStation System Agilent G2991BA DNA quantification
4D-Nucleofector X Unit Lonza Bioscience  AAF-1003X Nucleofection
B2M silencing gRNA #1   Lombardo's lab  GCAATCAGGACAAGGCCCGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #2  Lombardo's lab  GGGGTAGGAGAGACTCACGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #3  Lombardo's lab  GAGTCCAGGGCTGGATCTCG Gene silencing
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer BD Biosciences https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion Fluorescence Activated Cell Sorting
bedtools Bedtools http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Processing of genomic intervals
bwa Ih3 https://github.com/lh3/bwa Alignment of MeDIP-seq reads
Chopchop  Valen's lab http://chopchop.cbu.uib.no/ gRNA selection software
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine Corning 10-040-CV Cell culture
cqn Bioconductor http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html Region-wise normalization by GC-content
CRISPR design suite Zhang's lab https://zlab.bio/resources-2 off-target gRNA binding prediction 
CRISPRoff-v2.1 plasmid Addgene  167981 Gene silencing
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer  Beckman Coulter C01161 Flow cytometry
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab 

ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt
actgtgggcataaattaatttttcagttaagttttgg
aagcttaaataactctccaaaagtcataaagcc
agtaactggttgagcccaaattcaaacccagc
ctgtctgatacttgtcctcttcttagaaaagattac
agtgatgctctcacaaaatcttgccgccttccct
caaacagagagttccaggcaggatgaatctgt
gctctgatccctgaggcatttaatatgttcttatta
ttagaagctcagatgcaaagagctctcttagct
tttaatgttatgaaaaaaatcaggtcttcattaga
ttccccaatccacctcttactagtctgacctcttct
cttcctcccacagggataactagatgactcgag
ggatccgaattcctgcaggcctcgacgagggc
cggcgcgccgcggccgctacgtaaattccgc
cccccccccccctctccctcccccccccctaac
gttactggccgaagccgcttggaataaggccg
gtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgc
cgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacct
ggccctgtcttcttgacgagcattcctagggg
tctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtc
tgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctg
gaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagc
gaccctttgcaggcagcggaaccccccacctg
gcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacg
tgtataagatacacctgcaaaggcggcacaac
cccagtgccacgttgtgagttggatagttgtgga
aagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaac
aaggggctgaaggatgcccagaaggtacccc
attgtatgggatctgatctggggcctcggtgcaca
tgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacg
tctaggccccccgaaccacggggacgtggtttt
cctttgaaaaacacgatgataatatggccacaa
ccatggtgagcaagggcgaggaggtcatcaa
agagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcgaggg
cgagggcgagggccgcccctacgagggcac
ccagaccgccaagctgaaggtgaccaaggg
cggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtc
cccccagttcatgtacggctccaaggcgtacg
tgaagcaccccgccgacatccccgattacaag
aagctgtccttccccgagggcttcaagtgggag
cgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtg
accgtgacccaggactcctccctgcaggacgg
cacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggca
ccaacttcccccccgacggccccgtaatgcag
aagaagaccatgggctgggaggcctccaccg
agcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaa
gggcgagatccaccaggccctgaagctgaa
ggacggcggccactacctggtggagttcaag
accatctacatggccaagaagcccgtgcaac
tgcccggctactactacgtggacaccaagctg
gacatcacctcccacaacgaggactacacca
tcgtggaacagtacgagcgctccgagggccg
ccaccacctgttcctggggcatggcaccggca
gcaccggcagcggcagctccggcaccgcctc
ctccgaggacaacaacatggccgtcatcaaa
gagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcga
gggcgagggcgagggccgcccctacgag
ggcacccagaccgccaagctgaaggtgac
caagggcggccccctgcccttcgcctgggac
atcctgtccccccagttcatgtacggctccaa
ggcgtacgtgaagcaccccgccgacatcccc
gattacaagaagctgtccttccccgagggcttc
aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggac
ggcggtctggtgaccgtgacccaggactcct
ccctgcaggacggcacgctgatctacaaggt
gaagatgcgcggcaccaacttcccccccga
cggccccgtaatgcagaagaagaccatggg
ctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccc
cgcgacggcgtgctgaagggcgagatccac
caggccctgaagctgaaggacggcggcca
ctacctggtggagttcaagaccatctacatggc
caagaagcccgtgcaactgcccggctactact
acgtggacaccaagctggacatcacctccca
caacgaggactacaccatcgtggaacagtac
gagcgctccgagggccgccaccacctgttcct
gtacggcatggacgagctgtacaagtaagcgg
ccgcgtcgacctgtgccttctagttgccagccatc
tgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccct
ggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataa
aatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtagg
tgtcattctattctggggggtggggtggggcag
gacagcaagggggaggattgggaagacaat
agcaggcatgctggggatgcggtgggctctat
ggcttaagtgatggggctagtagcctttccttaa
tgatagggtgtttctagagagatatatctggtca
aggtggcctggtactcctccttctccccacagc
ctcccagacaaggaggagtagctgccttttag
tgatcatgtaccctgaatataagtgtatttaaaag
aattttatacacatatatttagtgtcaatctgtatat
ttagtagcactaacacttctcttcattttcaatga
aaaatatagagtttataatattttcttcccacttc
cccatggatggtctagtcatgcctctcattttgg
aaagtactgtttctgaaacattaggcaatatatt
cccaacctggctagtttacagcaactgca

 Genetic engineering
E220 Focused-ultrasonicator Covaris 500239 DNA sonication
edgeR Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html Differential abundance testing
EnGen Mutation Detection Kit NEB E3321 Gene disruption quantification
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 Cell culture
Flowjo BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo Flow cytometry data analysis software
Gel Loading Dye, Purple (6x) NEB B7024S DNA gel loading
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase Promega M7401 PCR amplification
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AGGCTACTAGCCCCATCAAG Genetic engineering
hCas9 plasmid Addgene  41815 Genetic engineering
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent 5067-5585 DNA quantification
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 DNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 RNA quantification
IPure kit Diagenode C03010011  Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product
K-562 cells ATCC CCL-243 Cell engineering
KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824 MeDIP-Seq libraries preparation
MACS2 Taoliu https://github.com/macs3-project/MACS Identification of methyl-enriched regions
MagMeDIP kit Diagenode C02010020  5-methylcytosine immunoprecipitation
NextFlex Methylseq kit 1  Bioo Scientific 5118-01 MeDIP-Seq libraries preparation
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 Illumina SY-415-1002 / 20012850 Next Generation Sequencing
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA Macherey-nagel 740410.50 Midiprep plasmid preparation
One Shot TOP10 Chemically Competent  cells  ThermoFisher C404010 Plasmid transformation
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid Addgene  48240 Gene activation
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Cell culture
phU6.sgRNA plasmid Addgene  53188 Genetic engineering
PowerPac Basic Power Supply Biorad 1645050 Agarose gel electrophoresis
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  GTATTTGCTGGTTATGTTAG Genetic engineering
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AATGGTTGAGTTGGAC Genetic engineering
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen 51304 DNA extraction
Qubit Thermo Fisher Q33238 DNA quantification
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32852 RNA quantification
Restriction enzymes NEB DNA digestion
RNeasy Mini kit  Qiagen 74106 RNA extraction
Rsubread Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html Quantification of gene expression
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza Bioscience  V4XC-2032 Nucleofection
SnapGene Dotmatics https://www.snapgene.com/ Molecular biology design software
STAR Alexander Dobin https://github.com/alexdobin/STAR Alignment of RNA-seq reads
T100 Thermal Cycler Biorad 1861096 PCR amplification
T4 DNA Ligase Promega M1801 DNA ligation
TAE Buffer Fisher scientific BP1332500 Agarose gel electrophoresis
TruSeq Stranded Total RNA kit  Illumina 20020597 RNA-Seq library preparation
UltraPure Agarose ThermoFisher 16500500 Agarose gel 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cummings, C. J., Zoghbi, H. Y. Fourteen and counting: unraveling trinucleotide repeat diseases. Human Molecular Genetics. 9 (6), 909-916 (2000).
  2. Tebas, P., et al. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. The New England Journal of Medicine. 370 (10), 901-910 (2014).
  3. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. Murty, T., Gene Mackall, C. L. Gene editing to enhance the efficacy of cancer cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3153-3162 (2021).
  5. Lanza, R., Russell, D. W., Nagy, A. Engineering universal cells that evade immune detection. Nature Reviews Immunology. 19 (12), 723-733 (2019).
  6. Matharu, N., Ahituv, N. Modulating gene regulation to treat genetic disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (11), 757-775 (2020).
  7. Sgro, A., Blancafort, P. Epigenome engineering: New technologies for precision medicine. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12453-12482 (2020).
  8. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  9. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: A widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  11. Gilbert, L. A., et al. XCRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442 (2013).
  12. Snowden, A. W., Gregory, P. D., Case, C. C., Pabo, C. O. Gene-specific targeting of H3K9 methylation is sufficient for initiating repression in vivo. Current Biology. 12 (24), 2159-2166 (2002).
  13. Chen, X., et al. Construction and validation of the CRISPR/dCas9-EZH2 system for targeted H3K27Me3 modification. Biochemical and Biophysical Research Communications. 511 (2), 246-252 (2019).
  14. Kwon, D. Y., Zhao, Y. T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nature Communications. 8, 15215 (2017).
  15. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  16. Ecco, G., Imbeault, M., Trono, D. KRAB zinc finger proteins. Development. 144 (15), 2719-2729 (2017).
  17. Witzgall, R., O'leary, E., Leaf, A., Onaldi, D., Bonventre, J. The Kruppel-associated box-A (KRAB-A) domain of zinc finger proteins mediates transcriptional repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (10), 4514-4518 (1994).
  18. Mannini, R., et al. Structure/function of KRAB repression domains: Structural properties of KRAB modules inferred from hydrodynamic, circular dichroism, and FTIR spectroscopic analyses. Proteins: Structure, Function and Genetics. 62 (3), 604-616 (2006).
  19. Friedman, J. R., et al. KAP-1, a novel corepressor for the highly conserved KRAB repression domain. Genes and Development. 10 (16), 2067-2078 (1996).
  20. Iyengar, S., Farnham, P. J. KAP1 protein: An enigmatic master regulator of the genome. The Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26267-26276 (2011).
  21. Schultz, D. C., Friedman, J. R., Rauscher, F. J. Targeting histone deacetylase complexes via KRAB-zinc finger proteins: The PHD and bromodomains of KAP-1 form a cooperative unit that recruits a novel isoform of the Mi-2α subunit of NuRD. Genes and Development. 15 (4), 428-443 (2001).
  22. Schultz, D. C., Ayyanathan, K., Negorev, D., Maul, G. G., Rauscher, F. J. SETDB1: A novel KAP-1-associated histone H3, lysine 9-specific methyltransferase that contributes to HP1-mediated silencing of euchromatic genes by KRAB zinc-finger proteins. Genes and Development. 16 (8), 919-932 (2002).
  23. Nielsen, A. L., et al. Interaction with members of the heterochromatin protein 1 (HP1) family and histone deacetylation are differentially involved in transcriptional silencing by members of the TIF1 family. The EMBO Journal. 18 (22), 6385-6395 (1999).
  24. Sripathy, S. P., Stevens, J., Schultz, D. C. The KAP1 corepressor functions to coordinate the assembly of de novo HP1-demarcated microenvironments of heterochromatin required for KRAB zinc finger protein-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 26 (22), 8623-8638 (2006).
  25. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. ChemBioChem. 12 (2), 206-222 (2011).
  26. Jia, D., Jurkowska, R. Z., Zhang, X., Jeltsch, A., Cheng, X. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature. 449 (7159), 248-251 (2007).
  27. Tajima, S., Suetake, I., Takeshita, K., Nakagawa, A., Kimura, H. Domain structure of the Dnmt1, Dnmt3a, and Dnmt3b DNA methyltransferases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 945, 63-86 (2016).
  28. Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  29. Ishiyama, S., et al. Structure of the Dnmt1 reader module complexed with a unique two-mono-ubiquitin mark on histone H3 reveals the basis for DNA methylation maintenance. Molecular Cell. 68 (2), 350.e7-360.e7 (2017).
  30. Amabile, A., et al. Inheritable silencing of endogenous genes by hit-and-run targeted epigenetic editing. Cell. 167 (1), 219.e14-232.e14 (2016).
  31. Mlambo, T., et al. Designer epigenome modifiers enable robust and sustained gene silencing in clinically relevant human cells. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4456-4468 (2018).
  32. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503.e17-2519.e17 (2021).
  33. Davidson, B. L., McCray, P. B. Current prospects for RNA interference-based therapies. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 329-340 (2011).
  34. Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B., Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nature Medicine. 24 (7), 927-930 (2018).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  37. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  38. Uhlén, M., et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), (2015).
  39. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  40. Kent, W. J., et al. The Human Genome Browser at UCSC. Genome Research. 12 (6), 996-1006 (2002).
  41. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  42. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
  43. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  44. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. The Subread aligner: fast, accurate and scalable read mapping by seed-and-vote. Nucleic Acids Research. 41 (10), e108-e108 (2013).
  45. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. GenomeBiology. 17, 13 (2016).
  46. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  47. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  48. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  49. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), R137 (2008).
  50. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 47, (2014).
  51. Hansen, K. D., Irizarry, R. A., Wu, Z. Removing technical variability in RNA-seq data using conditional quantile normalization. Biostatistics. 13 (2), 204-216 (2012).
  52. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  53. Zeitler, B., et al. Allele-selective transcriptional repression of mutant HTT for the treatment of Huntington's disease. Nature Medicine. 25 (7), 1131-1142 (2019).
  54. Andersson, R., Sandelin, A. Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements. Nature Reviews Genetics. 21 (2), 71-87 (2020).
  55. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  56. Han, H. A., Pang, J. K. S., Soh, B. -S. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. Journal of Molecular Medicine. 98 (5), 615-632 (2020).

Tags

Bioteknologi utgave 195 målrettet epigenetisk deaktivering geninaktivering RNA-interferens kunstige nukleaser DNA dobbeltstrengbrudd epigenetisk redigering programmerbart DNA-bindende domene KRAB-domene DNMT3A DNMT3L arvelige repressive epigenetiske tilstander hit-and-run natur DNA-demetylering
<em>In vitro</em> Utvalg av konstruerte transkripsjonsrepressorer for målrettet epigenetisk deaktivering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Migliara, A., Cappelluti, M. A.,… More

Migliara, A., Cappelluti, M. A., Giannese, F., Valsoni, S., Coglot, A., Merelli, I., Cittaro, D., Lombardo, A. In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing. J. Vis. Exp. (195), e64403, doi:10.3791/64403 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter