Summary
Denne protokol beskriver Open-Top Organ-Chips kapaciteter og væsentlige kulturmetoder til vellykket etablering og modning af fuldtykkelse organ-on-chip-kulturer af primære væv (hud, alveolus, luftveje og tarm), hvilket giver mulighed for at undersøge forskellige funktionelle aspekter af den humane epitel/mesenkymale og vaskulære nichegrænseflade in vitro.
Abstract
Næsten alle menneskelige organer er foret med epitelvæv, der omfatter et eller flere lag tæt forbundne celler organiseret i tredimensionelle (3D) strukturer. En af epitelens hovedfunktioner er dannelsen af barrierer, der beskytter understregningsvævene mod fysiske og kemiske fornærmelser og infektiøse stoffer. Derudover medierer epitel transporten af næringsstoffer, hormoner og andre signalmolekyler, hvilket ofte skaber biokemiske gradienter, der styrer cellepositionering og opdeling i organet. På grund af deres centrale rolle i bestemmelsen af organstruktur og funktion er epitel vigtige terapeutiske mål for mange menneskelige sygdomme, der ikke altid fanges af dyremodeller. Ud over de åbenlyse forskelle mellem arter forværres gennemførelsen af forskningsundersøgelser af epitelens barrierefunktion og transportegenskaber hos dyr yderligere af vanskeligheden ved at få adgang til disse væv i et levende system. Mens todimensionelle (2D) humane cellekulturer er nyttige til at besvare grundlæggende videnskabelige spørgsmål, giver de ofte dårlige in vivo-forudsigelser . For at overvinde disse begrænsninger har der i det sidste årti vist sig en overflod af mikrokonstruerede biomimetiske platforme, kendt som organer-på-en-chip, som et lovende alternativ til traditionelle in vitro - og dyreforsøg. Her beskriver vi en Open-Top Organ-Chip (eller Open-Top Chip), en platform designet til modellering af organspecifikke epitelvæv, herunder hud, lunger og tarme. Denne chip giver nye muligheder for at rekonstituere den multicellulære arkitektur og funktion af epitelvæv, herunder evnen til at genskabe en 3D-stromalkomponent ved at inkorporere vævsspecifikke fibroblaster og endotelceller i et mekanisk aktivt system. Denne Open-Top Chip giver et hidtil uset værktøj til at studere epitel / mesenkymale og vaskulære interaktioner på flere opløsningsskalaer, fra enkeltceller til flerlags vævskonstruktioner, hvilket muliggør molekylær dissektion af den intercellulære krydstale af epiteliserede organer i sundhed og sygdom.
Introduction
Historisk set har forskere været afhængige af prækliniske dyreforsøg til lægemiddelopdagelse, men et stigende antal af disse metoder er blevet stillet spørgsmålstegn ved på grund af dårlig korrelation med humant resultat1. Implementeringen af "3R"-principperne om at erstatte, reducere og forfine dyreforsøg opfordrer forskere til at finde nye in vitro-alternative metoder til støtte for præklinisk lægemiddel- og kemisk toksikologisk risikovurdering2. Imidlertid mangler mange in vitro-modeller, der er udviklet til dato, den biologiske arkitektur, cellulære kompleksitet og det mekaniske miljø, der er nødvendigt for at rekapitulere den dynamiske natur af menneskelige levende organer 3,4.
Konventionelle in vitro prækliniske systemer anvender typisk 2D-monokulturer af humane celler dyrket på en stiv plastoverflade. Disse metoder giver et værktøj til at gennemføre enkle mekanistiske undersøgelser og muliggør hurtig screening af lægemiddelkandidater. På grund af deres relativt lave omkostninger og høje robusthed parres 2D-modeller ofte med automatiske high-throughput-systemer og anvendes til hurtig identifikation af potentielle lægemiddelkandidater i den tidlige fase af lægemiddeludviklingsprocessen 5,6. Sådanne 2D-modeller giver imidlertid ikke en translationel tilgang til modellering af vævsniveau, organniveau eller systemiske reaktioner på terapeutiske kandidater, hvilket er nødvendigt for nøjagtige forudsigelser af lægemiddelsikkerhed og effektivitet i det prækliniske stadium af deres udvikling. Fladcellekulturer rekapitulerer ikke det oprindelige vævsmikromiljø, herunder det komplekse flercellede samspil, biomekaniske egenskaber og tredimensionelle (3D) arkitektur af humant væv7. Celler, der vokser på en plan overflade, erhverver ofte ikke en moden fænotype og kan derfor ikke reagere på farmakologiske stimuli, som de ville i det oprindelige væv. For eksempel udviser primære humane alveolære epitelceller dyrket in vitro en pladefænotype og mister vigtige fænotypiske markører, herunder overfladeaktive proteiner C og B (SP-C og SP-B)8. Ud over utilstrækkelig differentiering bliver primære celler ofte ufølsomme over for biologiske stressfaktorer in vitro, da visse biokemiske veje forbundet med vævsbetændelse bliver ikke-funktionelle9. Et sådant tab af cellefunktion synes primært at være forbundet med brugen af stive substrater samt manglen på opløselige faktorer, der naturligt frigives af vævsspecifikke stromale celler såsom lungefibroblaster og glatte muskelceller10,11.
At forstå, at manglen på kemo-fysisk og biologisk kompleksitet begrænser cellernes fysiologiske adfærd in vitro, har fremmet udviklingen af mere sofistikerede flercellede modeller, som har vist sig bedre at fange kompleksiteten af humant væv uden for kroppen12,13. Siden oprettelsen af de første samkulturmodeller i begyndelsen af 1970'erne14 har introduktionen af syntetiske og naturlige hydrogeler signifikant forbedret evnen til at efterligne indfødte vævsmikromiljøer og er blevet et uvurderligt værktøj til at drive cellulær differentiering, styre cellernes selvorganisering i vævslignende strukturer og genoprette indfødte vævsfunktioner15,16. For eksempel, når de dyrkes i det passende 3D-stillads, kan menneskelige celler selv arrangere sig i funktionelle strukturer såsom sfæroider eller organoider, der udtrykker stamcellemarkører, og er i stand til selvfornyelse17. I modsætning hertil ældes humane celler (inklusive stamceller), når de dyrkes på traditionelle 2D-substrater, hurtigt og gennemgår ældning efter et par passager18. Derudover kan hydrogeler "skræddersys" til at matche specifikke vævsegenskaber såsom porøsitet, porestørrelse, fibertykkelse, viskoelasticitet, topografi og stivhed eller yderligere konstrueres med vævsafledte cellulære komponenter og / eller bioaktive molekyler, der muliggør emulering af de fysiologiske eller patologiske tilstande19,20. På trods af deres enorme potentiale for lægemiddeltest rekapitulerer 3D-hydrogelbaserede modeller, der anvendes i farmaceutisk forskning, ikke fuldt ud den komplekse cytoarkitektur af in vivo-vævene og mangler vigtige hæmodynamiske og mekaniske stimuli, der normalt er til stede i menneskekroppen, herunder hydrostatisk tryk, cyklisk strækning og væskeforskydning21.
Mikrofysiologiske systemer (MPS'er) såsom Organs-on-chips (OOC'er) er for nylig opstået som værktøjer, der er i stand til at fange komplekse fysiologiske reaktioner in vitro22,23. Disse modeller anvender ofte brugen af mikrofluidiske platforme, som muliggør modellering af levende organers dynamiske mikromiljø.
Vi har kombineret principperne for 3D-vævsbioteknologi og mekanobiologi for at skabe en Open-Top Chip-model af komplekst humant epitelvæv. Dette gjorde det muligt for os nøje at rekapitulere det multicellulære og dynamiske mikromiljø af epitelvæv. Dette omfatter vævsspecifikke biokemiske og biomekaniske signaler, der forekommer naturligt i levende organer, men som ofte overses af traditionelle in vitro-modeller 24. Open-Top Chip indeholder to rum: et vaskulært rum (figur 1A) og et stromaltum (figur 1B) adskilt af en porøs membran, hvilket muliggør diffusion af næringsstoffer mellem de to kamre (figur 1C). Det vaskulære rum udsættes for kontinuerlig væskestrøm for at rekapitulere fysiologisk forskydningsspænding, mens stromalkammerets strækbare design muliggør modellering af den mekaniske belastning forbundet med vejrtrækningsbevægelser eller intestinal peristaltik. Det stromale rum huser det justerbare 3D-hydrogelstillads designet til at understøtte den fysiologiske vækst af vævsspecifikke fibroblaster. Det har et aftageligt låg, der letter etableringen af en luft-væske-grænseflade, en tilstand, der muliggør større emulering af human fysiologi af slimhindevæv samt direkte adgang til vævet til administration af lægemidler direkte på epitellaget. Supplerende figur 1 viser nogle af nøglekomponenterne i Open-Top Chip-designet, herunder dimensioner og biologiske rum (supplerende figur 1A-D) samt de vigtigste tekniske trin, der er beskrevet i denne protokol (supplerende figur 1E).
Perfusion af Open-Top Chip opnås med en programmerbar peristaltisk pumpe (figur 1D). Den peristaltiske pumpeopsætning gør det muligt at perfusere 12 Open-Top chips samtidigt. De fleste inkubatorer kan huse to opsætninger, der muliggør dyrkning af op til 24 chips pr. Inkubator. Mekanisk strækning opnås ved hjælp af en specialfremstillet programmerbar vakuumtrykregulator (figur 1E). Den består af en elektropneumatisk vakuumregulator, der styres elektronisk af en digital-til-analog konverter. Med andre ord genererer den elektropneumatiske vakuumregulator en sinusformet vakuumprofil med en amplitude og frekvens, der bestemmes af brugeren. Cyklisk belastning fra 0% til 15% genereres ved at anvende negativt tryk på vakuumkanalen i Open-Top Chip ved en amplitude fra 0 til -90 kPa og en frekvens på 0, 2 Hz. Det er et skræddersyet system svarende til den kommercielt tilgængelige Flexcell Strain Unit, der tidligere er vedtaget og beskrevet i andre papirer25. For at efterligne den mekaniske vævsdeformation, der for eksempel er forbundet med lungens vejrtrækningsbevægelse eller tarmens peristaltik, anvender den pneumatiske aktuator sinusformede vakuum-/belastningsbølger, hvis størrelse og amplitude kan justeres for at matche det fysiologiske belastningsniveau og frekvens, som menneskelige celler oplever i deres oprindelige væv.
Her beskriver vi en effektiv og reproducerbar metode til konstruktion og dyrkning af organotypiske epitelækvivalenter på en prototype Open-Top Chip-platform. Det tillader generering af komplekse organmodeller såsom hud, alveolus, luftveje og tyktarm, samtidig med at der integreres en vaskulær væskestrøm og mekanisk strækning. Vi vil skitsere vigtige tekniske aspekter, der skal overvejes, når vi implementerer principper for vævsteknik til generering af komplekse epitelmodeller. Vi vil diskutere fordele og mulige begrænsninger ved det nuværende design.
En oversigt over de vigtigste trin, der anvendes til at opnå modning af væv og organer, herunder flow- og strækparametre, er rapporteret i: figur 2 for huden, figur 3 for alveolen, figur 4 for luftvejene og figur 5 for tarmen. Yderligere oplysninger om mediesammensætning og reagenser, der anvendes til dyrkning af de forskellige organmodeller, findes i de supplerende tabeller (supplerende tabel 1 for huden; Supplerende tabel 2 for alveolen; Supplerende tabel 3 for luftvejene og supplerende tabel 4 for tarmen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humane koloroder blev opnået fra tarmresektioner i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Biosafety Committee of the Cincinnati Children's Hospital (IBC 2017-2011).
1. Aktivering af Surface
- Forberedelse af aktiveringsbuffer
- Tværbindingsmidlet og opløsningsmiddelbufferreagenserne anbringes under biosikkerhedsskabet (BSC), og lad dem ekvilibrere ved stuetemperatur (RT) i 10 minutter før brug.
- 5 mg tværbinding rekonstitueres i 5 ml af opløsningsmiddelbufferen ved hjælp af en steril lysuigennemtrængelig beholder eller et gennemsigtigt 15 ml konisk rør indpakket i aluminiumsfolie for at beskytte tværbindingsopløsningen mod direkte lyseksponering.
- Vortexopløsningen i 1 min for at fjerne alle klumper, og pipette derefter 50 μL af tværbindingsopløsningen direkte ind i chippens bundkanal og 150 μL ind i det åbne kammer.
- Fjern ethvert overskud af tværbindingsopløsning fra overfladen af chippen ved hjælp af en aspirator. Derefter pipetteres yderligere 50 μL af tværbindingsopløsningen direkte ind i chippens bundkanal og 150 μL ind i det åbne kammer for at fjerne eventuelle resterende luftbobler.
- Aktivering med UV-tværbindingsmaskine
- Fjern forsigtigt låget fra chippen under BSC og opbevar det i en steril beholder.
- Overfør chipsene indeholdende tværbindingsopløsningen til en petriskål, luk petriskålen for at undgå forurening, og læg skålen med chipsene under UV-tværbindingsmaskinen.
BEMÆRK: Fjern petriskållåget for at maksimere UV-eksponeringen. - Indstil UV-tværbindingsmaskinen med en maksimal bølgelængde på 365 nm ved en intensitet på 100 μJ/cm2, og tænd UV-lyset i 20 minutter.
BEMÆRK: Efter 20 minutters UV-behandling vil tværbindingsopløsningen se mørkere (brun) ud. - Bring chipsene tilbage under BSC og aspirer den oxiderede tværbindingsopløsning. Skyl derefter alle spånerne tre gange med opløsningsmiddelbufferen, og lad spånerne tørre under BSC i 5-10 minutter for at fuldføre den kemiske funktionalisering af polydimethylsiloxanoverfladen (PDMS).
2. Forberedelse af stromaækvivalenten
- Klargøring af 10x rekonstruktionsbuffer (100 ml)
- 2,2 g natriumbicarbonat opløses i 75 ml 0,067 M NaOH i dobbeltdestilleret vand.
- Tilsæt 4,76 g HEPES og bring volumenet til 100 ml ved hjælp af dobbeltdestilleret vand.
- Sterilt filtrer opløsningen under BSC ved hjælp af et sterilt engangsflaskefilter med en 0,22 μm membran.
BEMÆRK: Opløsningen er stabil i ca. 6 måneder, når den opbevares ved 4 °C.
- Estimering af prægelopløsningens volumen
- Antallet af chips, der er nødvendige til forsøget, multipliceres med 150 μL (indre volumen af det centrale åbne kammer) for at estimere den mængde forgelopløsning, der kræves til eksperimentet:
Nødvendigt volumen = (Antal chips x 150) μL - Forbered kollagen-forgelopløsningen på is ved at blande: 1 volumen 10x EMEM indeholdende de valgte celler, 1 volumen 10x rekonstruktionsbuffer (se trin 2.1), 8 volumener kollagen I-opløsning (10 mg/ml) og 1 μL 1 N NaOH-opløsning for hver mg kollagen I.
BEMÆRK: Det anbefales at forberede en ekstra +15% volumen for at tage højde for eksperimentelle fejl; Eksemplet beskrevet i afsnit 2.2 giver en detaljeret trin-for-trin procedure til fremstilling af tilstrækkelig forgelopløsning til 12 chips og et ekstra volumen på 15%.
- Antallet af chips, der er nødvendige til forsøget, multipliceres med 150 μL (indre volumen af det centrale åbne kammer) for at estimere den mængde forgelopløsning, der kræves til eksperimentet:
- Fremstilling af forgelopløsning til stromaækvivalenten (til 12 chips)
- Bring følgende løsninger under BSC på is: 10x EMEM; 10x Rekonstruktionsbuffer (se trin 2.1); Kollagen I-opløsning (10 mg/ml); og steril 1 N NaOH-opløsning.
- Dyrk vævsspecifikke mesenkymale celler som anvist af udbyderne, indtil 80% -90% sammenflydende, og dissocier derefter cellerne ved hjælp af trypsin eller andre metoder som anbefalet af celleudbyderen. Cellerne opsamles i en pille ved centrifugering ved 250 x g i 5 minutter ved 24 °C.
- Cellepillen resuspenderes i 225 μL iskold 10x EMEM, og der tilsættes 225 μL iskold 10x rekonstruktionsbuffer (se trin 2.1). Bland opløsningen ved forsigtigt pipettering op og ned, og tilsæt derefter 1.800 μL iskold kollagen I-opløsning.
- Pipette op og ned 5-6 gange, undgå bobler for at blande pre-gel-opløsningen, mens du er på is.
- Inkorporering af stromaækvivalenten på chip (til 12 chips)
- Forgelopløsningen neutraliseres med 18 μL 1 N NaOH. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned 5-6 gange, og pipette derefter 150 μL cellebelastet hydrogel ind i det centrale kammer i Open-Top Chip og undgå bobler.
BEMÆRK: Hvis mikromønster er påkrævet, skal du gå til næste trin (afsnit 3). - Chipsene grupperes i separate petriskåle, herunder en centrifugerørhætte fyldt med 2 ml steril ddH 2 O i hverpetriskål, og petriskålen(e) inkuberes i inkubatoren ved 37 °C, 5 % CO2.
BEMÆRK: Efter 90 minutter polymeriseres den cellebelastede hydrogel fuldstændigt.
- Forgelopløsningen neutraliseres med 18 μL 1 N NaOH. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned 5-6 gange, og pipette derefter 150 μL cellebelastet hydrogel ind i det centrale kammer i Open-Top Chip og undgå bobler.
3. Overflademikromønster (valgfrit)
- Udfør overflademikromønster af stromalhydrogelen efter pipettering af den neutraliserede kollagenhydrogel (stadig i flydende tilstand) ved hjælp af 3D-printede frimærker.
BEMÆRK: De 3D-printede frimærker kan fås i forskellige design, der kan tilpasses, som tidligere beskrevet andetsteds24. - Pipette 20 μL af den neutraliserede kollagen I pre-gel-opløsning på den mønstrede overflade af et sterilt 3D-printet stempel og indsæt stemplet inde (ovenpå) i det åbne kammer, mens stromalhydrogelen stadig er i flydende form.
- Fjern eventuelle rester af hydrogelen, der kan spildes fra toppen af det åbne kammer, ved hjælp af en aspirator (eller en pipette). Gruppér alle chips i separate petriskåle og inkluder en centrifuge 15 ml konisk rørhætte fyldt med 2 ml steril ddH2O i hver petriskål.
- Kuber alle petriskåle ved 37 °C, 5% CO2 i 90 minutter, og bring derefter chipsene tilbage under BSC og fjern forsigtigt stemplerne med præcisionspincet for at reducere risikoen for at beskadige hydrogelen.
4. Overtræk af epitel- og vaskulæroverfladen med vævsspecifikke ECM-proteiner
- Belægning af det vaskulære mikrofluidiske kammer med ekstracellulære matrixproteiner
- Antallet af chips, der er nødvendige til forsøget, multipliceres med 20 μL (volumen af vaskulærkanalen) for at estimere mængden af vaskulær ECM-belægningsopløsning, der kræves til eksperimentet:
Nødvendigt volumen = (Antal chips x 20) μL
BEMÆRK: Det anbefales at forberede en ekstra 15% volumen for at tage højde for eksperimentelle fejl. - Forbered den vaskulære ECM-belægningsopløsning til alle chips (for eksempel 300 μL pr. 12 chips) ved hjælp af iskold PBS eller HBSS.
BEMÆRK: Se den specifikke organprotokoltabel i afsnittet om supplerende materialer (supplerende tabel 1 for huden; Supplerende tabel 2 for alveolen; Supplerende tabel 2 for luftvejene og supplerende tabel 4 for tarmen) for at identificere de specifikke reagenser og anbefalet ECM-sammensætning. - Der pipetteres 20 μL vaskulær ECM-belægningsopløsning i vaskulærkanalen i hver chip.
- Antallet af chips, der er nødvendige til forsøget, multipliceres med 20 μL (volumen af vaskulærkanalen) for at estimere mængden af vaskulær ECM-belægningsopløsning, der kræves til eksperimentet:
- Belægning af den apikale overflade af stromalækvivalenten med ekstracellulære matrixproteiner
- Antallet af chips, der er nødvendige til forsøget, multipliceres med 50 μL (volumen af vaskulærkanalen) for at estimere mængden af epitelial ECM-belægningsopløsning, der kræves til eksperimentet:
Nødvendigt volumen = (Antal chips x 50) μL
BEMÆRK: Det anbefales at forberede en ekstra volumen på 15% for at tage højde for eksperimentelle fejl. - Forbered tilstrækkelig ECM-belægningsopløsning til alle chips (for eksempel 750 μL pr. 12 chips) i iskold PBS eller HBSS, og overfør 50 μL epitel-ECM-belægningsopløsning direkte oven på hydrogeloverfladen.
BEMÆRK: Se den specifikke organprotokoltabel i afsnittet om supplerende materialer (supplerende tabel 1 for huden; Supplerende tabel 2 for alveolen; Supplerende tabel 2 for luftvejene og supplerende tabel 4 for tarmen) for at identificere de specifikke reagenser og anbefalet ECM-sammensætning. - Chipsene grupperes i separate petriskåle, herunder en centrifuge 15 ml konisk rørhætte fyldt med 2 ml steril ddH 2 O i hver petriskål, og petriskålen(e) inkuberes i inkubatoren ved 37 °C, 5% CO 2 i2timer, før der fortsættes med epitelcellesåning.
- Antallet af chips, der er nødvendige til forsøget, multipliceres med 50 μL (volumen af vaskulærkanalen) for at estimere mængden af epitelial ECM-belægningsopløsning, der kræves til eksperimentet:
5. Såning af epitelceller på stromalækvivalenten
- Epitelcellekultur
- Kultur vævsspecifikke epitelceller som anvist af udbyderne indtil 80% -90% sammenflydende.
- Dissocier cellerne ved hjælp af proteolytiske enzymprocedurer som anbefalet af celleudbyderen.
BEMÆRK: For de bedste resultater høstes epitelceller ved lav passage (P1-P2) i den aktive vækstfase, når de når mellem 70% -90% sammenløb. - Når de er dissocieret, centrifugeres cellerne og samles som en pellet.
- Epitelcellerne resuspenderes til den relevante celle-/fragmenttæthed som angivet i den specifikke organprotokoltabel.
BEMÆRK: I dette studie blev celleopløsning anvendt med en densitet på 3 x 10 6 celler/ml for huden, 1 x 10 6 celler/ml for alveolus, 6 x 10 6 celler/ml for luftvejene og 8 x 10 6 fragmenter/ml for tarmen.
- Epitelcelle såning
- Overfør chipsene fra inkubatoren til BSC. Opsug belægningsopløsningen fra vaskulærkanalen, og skyl den vaskulære mikrofluidiske kanal tre gange med 50 μL frisk endotelcellekulturmedium.
- Opsug belægningsopløsningen fra hydrogeloverfladen, og skyl stromaloverfladen tre gange med 100 μL frisk epitelcellekulturmedium for at fjerne overskydende belægningsopløsning.
- Opsug det stigende medium og frø hydrogeloverfladen med 50 μL af epitelcellesuspensionen ved hjælp af passende celletæthed, som angivet i de supplerende tabeller, og overfør derefter chipsene tilbage i inkubatoren i 2 timer (eller natten over for colonoider).
- Skyl forsigtigt hydrogeloverfladen med cellekulturmediet to gange for at fjerne celleaffald. Til sidst skal du opdatere mediet ved autoklavering i forseglede autoklaverbare beholdere og forbinde chipsene til den peristaltiske pumpe.
6. Tilslutning af chips til flow
- Forberedelse af de flydende dele
- Skær 2 tommer biokompatibel polypropylenbaseret termoplastisk elastomer (TPE) overførselsrør (materialetabel) for at forberede den korte mikrofluidiske slange, der kræves for at forbinde chipsene til mediereservoirerne.
- Skær 7,5 tommer biokompatibel TPE-overførselsslange for at producere den lange mikrofluidiske slange.
- Forbered nok 18 G og 19 G metalstik (materialetabel).
BEMÆRK: Det anbefales at klargøre og sterilisere slangerne og konnektorerne beskrevet i trin 6.1.1 og 6.1.2 mindst 1 dag, før Open-Top Chips tilsluttes de peristaltiske pumper. - Pierce låget på hvert medium reservoirer med en 4-tommer hypodermisk nål (Tabel over materialer).
- Medium afgasning
- Lad cellekulturmediet ekvilibrere til stuetemperatur (RT).
- Overfør det nødvendige medium til et konisk filtreringsrør.
- Påfør et undervakuumtryk på -20 PSI for at afgasse mediet (vakuumdrevet filtrering).
BEMÆRK: Hvis et vakuum ikke er tilgængeligt, kan cellekulturmediet overlades til ligevægt i inkubatoren natten over for at opnå lignende resultater.
- Forbered Open-Top Chip til væskestrøm
- Bring spånerne og de sterile væskedele under BSC'en, og juster låget (den øverste del) på Open-Top-chippen til forsegling af Open-Top Chip-prototypen, inden væskestrømmen startes.
- Der pipetteres 200 μL af det afgassede cellekulturmedium (se organspecifikke tabeller) ind i indløbsporten på både chippens øverste og nederste kanal, samtidig med at man er opmærksom på at undgå bobler.
- Pipette 300 μL af dyrkningsmediet pipetteres ind i det korte mikrofluidiske rør for at prime rørets indre overflade og forbinde den korte slange til indløbene i chippens øverste og nederste kanaler.
- Tilslut og prim de mikrofluidiske overflader
- Placer de mellemstore reservoirer i gårdstativet, tilslut den hypodermiske nål til chipsens bundindløb, og til sidst rumme alle chips i husbæreren (e) inde i inkubatoren.
- Tilslut chipsene til den peristaltiske pumpe, og inspicer derefter alle stik for at sikre, at alle chips er korrekt tilsluttet, og at der ikke er nogen synlig lækage af cellekulturmedier.
- Brug knappen Rens på pumpen, og hold den nede i ca. 15 sekunder, eller indtil dråberne i cellekulturmediet vises for enden af udstrømningsslangen.
- Brug styresystemet på pumpen til at indstille den passende organflisstrømningshastighed (figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5).
7. Vedligeholdelse af chips
- Organ-chip vedligeholdelse
- Der fremstilles frisk cellekulturmedium til epitelet og/eller endotelet, og afgasningstrinnene udføres (som tidligere beskrevet i trin 6.2).
- Sæt den peristaltiske pumpe på pause, frakobl forsigtigt spånerne fra pumpen, og træk chiphusbæreren (e) ud. Overfør chipsene fra inkubatoren til BSC og fjern mængden af medier, der er tilbage i reservoirerne.
- Udskift cellekulturmediet til de øverste og nederste indløbsreservoirer med 5 ml friske cellekulturmedier, og placer chiphusbæreren (e) tilbage i inkubatoren. Tilslut chipsene til den peristaltiske pumpe og genstart strømmen.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge rensefunktionen til hurtigt at opdatere mediet til det vaskulære rum og reducere risikoen for luftbobler. - Gentag trin 7.1.1-7.1.3 hver anden dag i henhold til figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5.
- Etablering af luft-væske-grænseflade (ALI)
- Sæt den peristaltiske pumpe på pause, frakobl forsigtigt spånerne fra pumpen, og træk chiphusbæreren (e) ud. Overfør chipsene fra inkubatoren til biosikkerhedsskabet, og fjern mængden af medium, der er tilbage i topreservoiret.
- Opsug forsigtigt alt mediet fra den øverste mikrofluidiske kanal, og fastspænd det korte mikrofluidiske rør, der er forbundet til de øverste indløb, ved hjælp af bindeclips for at reducere mediefordampning og vedligeholdelse af ALI.
- Placer Open-Top Chip på husbæreren (e) tilbage i inkubatoren, og tilslut chipsene til den peristaltiske pumpe igen.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge rensefunktionen til hurtigt at opdatere mediet til det vaskulære rum og reducere risikoen for luftbobler. - Genoptag flowet ved at starte den peristaltiske pumpe.
- Strækning (valgfrit)
- Sæt den peristaltiske pumpe på pause, og tilslut chipsens vakuumporte til vakuummodulet ved hjælp af to lange mikrofluidiske rør pr. chip.
- Brug vakuummodulet til at justere strækindstillingen til den tilstand, der anbefales for hvert organ som angivet i organprotokoltabellerne: Supplerende tabel 1 for huden; Supplerende tabel 2 for alveolen; Supplerende tabel 2 for luftvejene; og supplerende tabel 4 for tarmen.
- Undersøg visuelt rørforbindelserne for at sikre, at alle chips er korrekt tilsluttet, og at der ikke er synlige dråber af medium, der drypper.
- Genoptag flowet ved at starte den peristaltiske pumpe.
8. Såning af endotelceller i vaskulærrummet
- Forbered celler og chips til vaskulær cellesåning
- Dyrk de vævsspecifikke endotelceller som anvist af udbyderne, indtil 80% -90% sammenflydende. Dissocier cellerne ved hjælp af en proteolytisk enzymprocedure (som anbefalet af udbyderen) og til sidst resuspender endotelcellerne i en opløsning på 3 x 106 celler / ml.
BEMÆRK: For de bedste resultater høstes endotelcellerne ved lav passage (P2-P4) i den aktive vækstfase, når de når mellem 70% -90% sammenløb. - Sæt den peristaltiske pumpe på pause. Overfør chipsene fra inkubatoren til BSC, frakobl chipsene fra mediereservoirerne og eventuelle tilsluttede slanger, og gruppér derefter chipsene i separate petriskåle.
- Opdater cellekulturmediet i epitelrummet med frisk epitelcellekulturmedium. Skyl den vaskulære kanal med frisk endotelcellekulturmedium to gange, og aspirer derefter mediet fra vaskulærrummet.
- Dyrk de vævsspecifikke endotelceller som anvist af udbyderne, indtil 80% -90% sammenflydende. Dissocier cellerne ved hjælp af en proteolytisk enzymprocedure (som anbefalet af udbyderen) og til sidst resuspender endotelcellerne i en opløsning på 3 x 106 celler / ml.
- Endotelcelle såning
- Frø den nederste (vaskulære) kanal med 25 μL endotelcellesuspension (3 x 106 celler / ml), vend chipsene på hovedet for at tillade endotelceller at binde sig til den øvre overflade af det mikrofluidiske kammer.
BEMÆRK: Tilsæt 50 μL cellesuspension pr. chip (600 μL pr. 12 chips). - Gruppér chipsene i petriskåle. Sæt dem tilbage i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2, og lad endotelcellerne binde sig i 1 time.
- Efter 1 time overføres chipsene fra inkubatoren til BSC. Skyl den vaskulære kanal med endotelcellekulturmedium to gange for at fjerne cellulært affald.
- Gentag trin 8.2.1-8.2.2 for at frø vaskulærkanalen igen med endotelceller og læg chipsene flade for at lette vedhæftningen af endotelcellerne til bunden af vaskulærkanalen.
- Frø den nederste (vaskulære) kanal med 25 μL endotelcellesuspension (3 x 106 celler / ml), vend chipsene på hovedet for at tillade endotelceller at binde sig til den øvre overflade af det mikrofluidiske kammer.
- Tilslut chippen til flow igen
- Fyld det vaskulære mediumreservoir op med det afgassede vaskulære cellekulturmedium under BSC.
- Placer chipsene tilbage inde i chiphusbæreren/-bærerne, og tilslut chipsene til de mellemstore reservoirer i den ene ende til den peristaltiske pumpe i den anden ende.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge rensefunktionen til hurtigt at opdatere mediet til det vaskulære rum og reducere risikoen for luftbobler. - Undersøg visuelt de mikrofluidiske forbindelser for at sikre, at alle chips er korrekt tilsluttet, og at der ikke er synlige dråber af medium, der drypper. Genoptag derefter væskestrømmen ved at starte den peristaltiske pumpe.
9. Almindelige effektparameterassays
- Afbryd chips til slutpunktsanalyser
- Sæt den peristaltiske pumpe på pause, frakobl forsigtigt spånerne fra pumpen, og træk chiphusbæreren (e) ud. Overfør chiphusbæreren (e) fra inkubatoren til BSC, og sæt chipsene fri.
- Det centrale kammer i Open-Top Chip vaskes forsigtigt med epitelcellekulturmediet og vaskulærkanalen med endotelkulturmediet to gange for at fjerne celleaffald.
- Fjern låget på Open-Top Chip for at få adgang til chippens apikale rum ved hjælp af pincet.
- Immunfarvning til fluorescensmikroskopi
- Fortsæt med konventionel prøvefiksering, permeabilisering og blokering.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev prøverne fikseret i 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time efterfulgt af skylning med PBS, permeabilisering i 0,1% Triton X-100 i 40 minutter og blokering i 1% bovint serumalbumin i 1 time. - Chipsene inkuberes med primære antistoffer (Table of Materials) ved 4 °C natten over. og vask derefter både epitel- og endotelrum i chipsene med 200 μL PBS to gange. Fortsæt derefter med de relevante sekundære antistoffer i 2 timer.
BEMÆRK: Fortynd de primære antistoffer og sekundære antistoffer i PBS + 1% BSA ved en fortynding på 1:100 (primært antistof) og 1:200 (sekundært antistof).
- Fortsæt med konventionel prøvefiksering, permeabilisering og blokering.
- Immunhistokemi
- Uddrag stromale ækvivalenter fra hovedkammeret i Open-Top Chip ved hjælp af pincet, saml dem i et 1,5 ml rør fyldt med 10% neutralt bufret formalin og inkuber i mindst 24 timer.
- Overfør den faste stromale ækvivalent til vævsprocessoren, og følg nedenstående trin for at opnå optimal prøvedehydrering.
- Nedsænk hydrogelen i 70% ethanol i 90 min.
- Fjern 70% ethanol og nedsænk hydrogelen i 80% ethanol i 90 min.
- Fjern 80% ethanol og nedsænk hydrogelen i 95% ethanol i 90 min.
- Fjern 95% ethanol og nedsænk hydrogelen i 100% ethanol i 90 min to gange.
- Fjern 100% ethanol og nedsænk hydrogelen i en opløsning af xylen i 120 minutter to gange.
- Xylenopløsningen fjernes, og de forarbejdede stromale ækvivalenter infiltreres i paraffinvoks i 120 minutter (~2 timer) to gange.
- Integrer de infiltrerede stromale ækvivalenter i sektionsparaffinblokke.
- På dette tidspunkt kan de stromale ækvivalenter skæres som paraffinblokke ved hjælp af et mikrotomt og behandles i henhold til konventionelle histologiske teknikker26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikromønster på overfladen
Mikromønster af den ekstracellulære matrix (ECM) kan bruges til at replikere den rumlige konfiguration af tarmkryptgrænsefladen. Open-Top Chip-konfigurationen kan ændres til at integrere mikromønstrede frimærker, der er specielt designet til at efterligne den naturlige topografi af grænsefladen mellem kolon og epitel (figur 6A, B) og tarmkrypterne i mikrometerskala (figur 6C-E). Bemærk, at vi brugte en flad (ikke mønstret) overflade til hud-, luftvejs- og alveolmodellerne. Frimærket blev brugt i dette tilfælde til at opnå en ensartet hydrogeloverflade til frø epitelceller. Vi valgte et design, der kunne efterligne den naturlige arkitektur i den menneskelige tarmslimhinde, der består af vekslen mellem positive og negative kupler, der efterligner tarmkrypterne.
Orgel-modeller
Vi dyrkede og differentierede fire forskellige epitel (hud, alveol, luftveje og tarm) ved hjælp af Open-Top Chip-prototypen for at bevise denne biomimetiske platforms alsidighed. Histologiske sektioner af organchipsene bekræfter tilstedeværelsen af epitelceller, der er fænotypisk forskellige og repræsentative for: et stratificeret epitel i tilfælde af huden (figur 7) pseudostratificeret søjleepitel i tilfælde af luftvejene (figur 8 og supplerende video 1) simpelt pladeepitel i tilfælde af alveolus (figur 9) og simpelt søjleepitel i tilfælde af tarmen (figur 10). Hud-, luftvejs- og alveolære celler blev alle hentet fra kommercielt tilgængelige leverandører (som specificeret i materialetabellen).
Figur 1: Skematisk oversigt over Open-Top Chip og den mikrofluidiske opsætning, der anvendes i denne undersøgelse. (A-C) Set ovenfra, lag-for-lag-projektion og 3D-gengivelse, der viser prototypen Open-Top Chip-design, der omfatter det aftagelige øverste låg med indkapslet mikrofluidisk kanal (blå), de to halvmånevakuumkanaler langs kulturkammeret (grå) og de nederste spiraliserede endotelmikrofluidiske kanaler (magenta). (D) Specialfremstillet chipholder (også kaldet "Farm system"), herunder chiphusbæreren (rød pil), den peristaltiske pumpe og reservoirer (gul pil) arrangeret i en konfiguration, der passer ind i en fælles cellekulturinkubator. € Pneumatisk aktuator, instrumentet, der styrer det negative tryk, der påføres chipens vakuumkanal, som bruges til at generere den cykliske mekaniske kraftceller, der opleves under vejrtrækning eller peristaltikbevægelse (strækning). Dette tal er tilpasset med tilladelse fra Varone et al.24. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Teknisk oversigt over open-top skin-chip-protokollen. (A) Skematisk, der viser rækkefølgen af handlinger for open-top skin-chip-præparatet, og (B) giver det vigtigste biologiske trin i open-top skin-chip-kulturen. I den indledende fase af chippræparatet indlejres mesenkymale celler (fibroblaster) i gelen og lægges i Open-Top Chip for at danne stromallaget, som er belagt i 2-4 timer og podet med epitelceller. Når epitelcellerne har dannet et kompakt monolag, udsættes de for luft (ALI). Det biologiske system holdes under ALI-regimet, indtil det ofres til analyse på dag 14. Mekanisk strækning kan påføres, mens systemet er under flow og ved ALI. Strækningen holdes, indtil vævene ofres til analyse. Yderligere oplysninger om mediesammensætning, specifikke reagenser og celletyper findes i supplerende tabel 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Teknisk oversigt over open-top alveolus-chip-protokollen. (A) Skematisk, der viser rækkefølgen af handlinger for open-top alveolus-chip-præparatet, og (B) angivelse af det vigtigste biologiske trin i open-top alveolus-chip-kulturen. I den indledende fase af chippræparatet indlejres mesenkymale celler (fibroblaster) i gelen og lægges i Open-Top Chip for at danne stromallaget, som er belagt i 2-4 timer og podet med luftvejsepitelceller i et medium suppleret med KIAD (se supplerende tabel 2). EGF-suppleret medium opretholdes i ~ 4 dage for at understøtte epitelcellevækst. Epitelet udsættes derefter for luft (ALI) i ~ 10 dage for at opnå fuldstændig vævsmodning. Pulmonale mikrovaskulære endotelceller podes på dag 14, og det biologiske system holdes under ALI og flowregime, indtil de ofres til analyse på dag 21. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Teknisk oversigt over open-top airway-chip-protokollen . (A) Skematisk, der viser rækkefølgen af handlinger for open-top luftvejschippræparatet og (B) giver det vigtigste biologiske trin i open-top luftvejschipkulturen. I den indledende fase af chippræparatet indlejres mesenkymale celler (fibroblaster og/eller glatte muskelceller) i gelen og lægges i Open-Top Chip for at danne stromalaget, som er belagt i 2-4 timer og podet med epitelceller i medium suppleret med EGF (se supplerende tabel 3). EGF-suppleret medium opretholdes i ~ 4 dage for at understøtte epitelcellevækst. Epitelet udsættes derefter for luft (ALI) i ~ 10 dage for at opnå fuldstændig vævsmodning. Pulmonale mikrovaskulære endotelceller podes på dag 14, og det biologiske system holdes under ALI og flowregime, indtil de ofres til analyse på dag 21. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Teknisk oversigt over open-top tarm-chip-protokollen. (A) Skematisk visning af rækkefølgen af handlinger for open-top tarm-chip-præparatet og (B) tilvejebringelse af det vigtigste biologiske trin i open-top tarm-chip-kulturen. I den indledende fase af chippræparatet indlejres mesenkymale celler (colonfibroblaster) i gelen og lægges i Open-Top Chip for at danne stromallaget, som er belagt i 2-4 timer og podet med fragmenter af epitelkolonoider opnået fra kliniske resektioner. Cellekulturmedium, herunder kosttilskud (ROCK og CHIR, se supplerende tabel 4) er påkrævet under såningstrinnet for at opretholde colonoid cellelevedygtighed og fysiologisk morfologi. Forskellige medier bruges derefter til at drive udvidelsen (dag 1 til 6) og modning (dag 6 til 9) af kolonepitelet. Koloninære mikrovaskulære endotelceller podes på dag 6 ved hjælp af et endotelcellekulturmedium (EGM2 MV) og dyrkes derefter under flow med et epitelekspansionsmedium i op til 10 dage mere. Epitelet udsættes for ALI fra dag 10 for yderligere at fremme epitelcellemodning. Mekanisk strækning kan påføres systemet fra dag 13 og opretholdes indtil dag 16, hvor orgelmodellen ofres til endepunktsanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Mikromønsterstempling. (A) Side- og overbilledet af stemplet, der viser tekstur i mikroskala (500 μm i højden og 250 μm bredde søjle-array), bruges til at genskabe grænsefladen mellem kolon og kryptvæv og øverste og laterale billede af stempelchipenheden, der viser tilpasningen af de to elementer, når de bruges til at støbe geloverfladen. (B) Vinklet sidebillede, der viser stempel- og chipgrænsefladen. (C-E) Billeder af den mikromønstrede geloverflade med og uden celler. Skalastænger: 200 μm. Dette tal er tilpasset med tilladelse fra Varone et al.24. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Repræsentative data opnået med open-top skin-chip. (A) Skematisk oversigt over virkningsrækkefølgen for open-top skin-chip-præparatet og angivelse af de vigtigste biologiske trin i open-top skin-chip-kulturen. (B) PCNA cytokeratin 14, cytokeratin10, involucrin og fillagrin fluorescensfarvning og H&E, der viser moden flerlags stratificeret epidermis differentieret on-chip. Skalastænger: 100 μm. (C) Set ovenfra billede af hudspånen (skalastænger: 5 mm) og H&E-tværsnittet (skalastænger: 100 μm), der viser tilstedeværelsen af fibroblasterne inde i hudlaget. D) PECAM-1, VE-Cadherin og Von Willebrand fluorescensfarvning, der viser differentiering af humane mikrovaskulære endotelceller, der dyrkes sammen i den åbne hudchip. Skalabjælker: 20 μm. (E) 3D Cartoon-konceptgengivelse af den åbne skin-chip. Dette tal er tilpasset med tilladelse fra Varone et al.24. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Repræsentative data opnået med open-top luftvejschippen. A) Skema, der viser virkningssekvensen for open-top luftvejschippræparatet og angiver det vigtigste biologiske trin i open-top luftvejschipkulturen. (B) MUC5AC (bæger), α og β-Tubulin (cilierede celler), Clara-celleprotein 16 (klubceller), p63 (basale / stamceller) og ZO-1-fluorescensfarvning, der viser modent luftvejsepitel. Skalastænger: 20 μm. (C) Video/billede med fasekontrast, der viser tilstedeværelsen af bankende cilier. Skalabjælker: 50 μm. (D) H&E-farvning (skalabjælker: 20 μm) og TEM-billede (skalabjælker: 5 μm), der viser modent pseudostratificeret epitel differentieret på chippen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Repræsentative data opnået med open-top alveolus-chippen. A) Skematisk oversigt over virkningssekvensen for open-top alveoluschippræparatet og det vigtigste biologiske trin i open-top alveolus-chipkulturen. B) Type I (HTI-56, AT1-α), Type II (HTII-280, LAMP3, ABCA3, overfladeaktivt stof (C) og E-cadherinfluorescensfarvning, der viser tilstedeværelsen af modne pneumocytter på chippen. Skalastænger: 20 μm. (C) SEM- og TEM-billede, der viser tilstedeværelsen af mikrovilli og lysosomale vesikler, tegn på moden alveolær fænotype. Skalastænger: 5 μm. (D) H&E-tværsnit (skalastænger: 5 μm), der bekræfter tilstedeværelsen af flade, pladeceller i overensstemmelse med type I-fænotype og kubformede, brostenslignende celler, der er i overensstemmelse med type II-fænotype, og (E), der viser tilstedeværelsen af fibroblasterne inde i dermallaget (skalastænger: 10 μm). (F) 3D-tegneseriekonceptgengivelse af den åbne alveoluschip. Dette tal er tilpasset med tilladelse fra Varone et al.24. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Repræsentative data opnået med den åbne tarmchip. A) Skematisk oversigt over virkningsrækkefølgen for Open-Top Intestinal Chip præparatet og tilvejebringelse af det vigtigste biologiske trin i Open-Top Intestinal Chip kulturen. (B) Vinklet sidebillede, der viser stempel- og chipsamlingen under gelstøbningsfasen, tegneseriekonceptet for den mikromønstrede gel og fasekontrastbilleder af en kryptlignende struktur mikromønstret på geloverfladen og podet med kolonoider i to forskellige højder. Skalastænger: 200 μm. (C) Mucin 2 og E-Cadherin fluorescensfarvning, der viser tilstedeværelsen af enterocytter og modne bægerceller på chippen. Skalastænger: 200 μm. (D) H&E-tværsnit af en kryptlignende struktur, der viser tilstedeværelsen af fibroblasterne inde i dermallaget og bekræfter tilstedeværelsen af et simpelt søjleepitel. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende video 1: Fasekontrastvideo, der viser bankende cilier. Skalabjælker: 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 1: Open-top chip samling. (A) Skematisk gengivelse af den tredimensionelle gengivelse af Open-Top Chip-enheden og tegneseriegengivelsen af den åbne skin-chip med de forskellige biologiske rum fremhævet og inklusive epitel (blå), dermal (gul) og vaskulær (rød). (B) Den samlede mikrofluidiske platform har et format på 35 mm x 17 mm, et vævskulturareal på 0,32 cm2, en bundspiralformet mikrofluidisk kanal og et kammerlåg med en mikrofluidisk kanal. C) Platformen består af et kammer med en 5 graders vinklet væg, som har en diameter på 6 mm i membranniveau og 5,7 mm øverst på PDMS-kammervæggen og en højde på 4 mm og bredde. Den porøse membran er 50 μm tyk og porerne er 7 μm i diameter. (D) Den nederste spiralformede mikrofluidiske kanal har tværsnitsdimensioner på 400 μm (højde) x 600 μm (bredde). e) En oversigt over forsøgstidsplanen og de trin, der kræves for at forberede den åbne orgelchip. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Hud. Tabellen giver en oversigt over de vigtigste daglige trin og de stræknings- og flowparametre, der anvendes i de tre faser af Open-Top Skin-Chip-kulturen (vækst, spredning og differentiering). Tabellen indeholder også listen over materialer, medieformuleringerne og instruktioner om, hvordan man forbereder de medier, der er nødvendige for denne protokol. Sammensætningen af de tre medier er optimeret til protokollens forskellige faser. Specifikt er Medium I optimeret til såning og tidlig keratinocytkulturfase. Medium II er optimeret til spredning og tidlig differentiering (dannelse af et stratificeret epitel). ALI-mediet er optimeret til at opretholde keratinocytter ved en luft-væske-grænseflade, indtil der produceres en fuldt differentieret epidermis. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2: Alveolus. Tabellen giver et resumé af de vigtigste daglige trin og de stræknings- og flowparametre, der anvendes i de tre faser af den åbne alveoluschipkultur (vækst, spredning og differentiering). Tabellen indeholder også listen over materialer, medieformuleringerne og instruktioner om, hvordan man forbereder de medier, der er nødvendige for denne protokol. Sammensætningen af de to medier er optimeret til protokollens forskellige faser. Bemærk, at tilsætning af kosttilskud (KIAD) til cellekulturmediet er afgørende for at opnå optimal differentiering af pneumocytterne. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 3: Luftveje. Tabellen giver en oversigt over de vigtigste daglige trin og de stræknings- og flowparametre, der anvendes i de tre faser af open-top luftvejschipkulturen (vækst, spredning og differentiering). Tabellen indeholder også listen over materialer, medieformuleringen og instruktioner om, hvordan man forbereder det medium, der er nødvendigt for denne protokol. Mediets sammensætning er optimeret til opretholdelse af luftvejsceller ved luft-væske-grænsefladen, hvilket igen inducerer terminal differentiering og stimulerer produktionen af slim. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 4: Tarm. Tabellen giver et resumé af de vigtigste daglige trin og de stræknings- og flowparametre, der anvendes i de tre faser af den åbne tarmchipkultur (vækst, spredning og differentiering). Tabellen indeholder også listen over materialer, medieformuleringerne og instruktioner om, hvordan man forbereder de medier, der er nødvendige for denne protokol. Sammensætningerne af begge medier er optimeret til protokollens forskellige faser. Specifikt er ekspansionsmediet suppleret med CHIR- og ROCK-hæmmerne optimeret til såning og tidlig fase af kultur, fordi det fremmer overlevelsen og væksten af tyktarmsorganoidfragmentet som et monolag. Ekspansionsmediet er optimeret til spredning og tidlig differentiering af epitelmonolag. Differentieringsmediet er optimeret til terminal differentiering af epitelmonolaget før eksponering for luft-væske-grænsefladen. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Open-Top Chip repræsenterer en muliggørende platform til at undersøge det komplekse cellulære samspil, der forekommer mellem endotel, stroma, og epitel i et kontrolleret mikromiljø i realtid. Denne teknologi giver kritiske fordele i forhold til konventionelle organotypiske og organoide kulturer, såsom integration af fysiske og biokemiske signaler, der er relevante for at rekonstituere det humane vævs mikromiljø, herunder fluidforskydning (flow), cyklisk strækning og rekonstruktion af epiteloverfladetopografien opnået via mikromønster. Humane celler, der vokser inden for denne platform, virker i synergi for at rekapitulere vævsspecifikke funktioner, der kan analyseres via konventionelle teknikker, herunder immunhistokemi og biokemiske assays ved hjælp af udstrømningsvæsker (eller spildevand) fra det øverste og / eller nederste rum. Det nuværende design giver nem adgang til epitellaget, hvor celler vokser i direkte kontakt med vævsspecifikke fibroblaster og andre stromale celler, der efterligner den multicellulære arkitektur af epitelvæv. Især tilbyder Open-Top Chip-prototypen en levedygtig løsning på almindelige udfordringer forbundet med brugen af andre organ-on-chip-platforme. Mens det muliggør inkorporering af flere forskellige celletyper i et stromalt rum, der fører til oprettelse af meget komplekse 3D-væv, giver det også mulighed for let ekstraktion af de etablerede vævskonstruktioner fra chipenheden til nedstrømsanalyse, herunder konventionel H&E-farvning.
Det nuværende design præsenterer et par begrænsninger. For eksempel er den elastiske membran, der er indskudt mellem den vaskulære mikrokanal og stromale rum (hydrogel) i prototypen Open-Top Chip, betydeligt tykkere (≈ 50 μm versus ≈ 1 μm) end det interstitielle rum, der adskiller endotelvæv fra stroma i de indfødte menneskelige organer. Selvom den elastiske membran ikke repræsenterer en fysisk barriere for diffusion af store molekyler, såsom hormoner og andre parakrinfaktorer, der formidler den intercellulære krydstale mellem væv, kan det begrænse de direkte, celle-celle-interaktioner og migrationen af celler fra det vaskulære til det stromale rum. Endelig er prototypen Open-Top Chip lavet af PDMS, som er kendt for at absorbere et stort antal hydrofobe forbindelser. Denne begrænsning deles af mange PDMS-baserede platforme, som kan være en alvorlig hindring i applikationer, der er beregnet til at teste farmakodynamikken og farmakokinetikken af små terapeutiske forbindelser27.
En af de største udfordringer ved at integrere 3D-hydrogeler i en mikrofluidisk enhed som Open-Top Chip er, at PDMS ikke giver et optimalt substrat til binding af humane proteiner eller celler. Kemisk funktionalisering af PDMS-overfladen er derfor et kritisk trin i denne protokol, der er nødvendigt for at sikre korrekt ECM-belægning og hydrogelvedhæftning til gelkammeret i Open-Top Chip-modellen. For at opnå optimale resultater skal tværbindingsmidlet i ER1-løsningen altid beskyttes mod direkte eksponering for lys. En vigtig indikator for tværbindingens reaktive status er dens farve. Tværbindingen i ER1 gennemgår faktisk en farveovergang fra strålende orange til mørkebrun, når den oxiderer. Farveovergangen kan bruges som indikator efter UV-aktiveringstrinnet for at kontrollere, om opløsningen effektivt har reageret med PDMS-overfladen. Under fremstillingen af tværbindingsopløsningen skal farveovergangen overvåges for at sikre, at en utilsigtet eksponering for direkte lys ikke fotobleger den kemiske forbindelse i opløsningen. For at beskytte tværbindingsopløsningen og undgå uønsket fotoblegning foreslår vi at indpakke aluminiumsfolie, ca. 15 cm x 15 cm, omkring et 15 ml konisk rør eller ved hjælp af et ravrør, der findes på markedet. Brugen af ER1 giver mulighed for en enkel og effektiv metode til at opnå hurtig funktionalisering af PDMS-overfladerne; Der er dog andre molekyler, der kan bruges i stedet for ER1. For eksempel er de kemiske tværbindinger 3-aminopropyl-trimethoxysilan (APTMES) ikke så lysfølsomme som ER1, og det kan bruges til at opnå lignende resultater med et par yderligere trin, som vi tidligere har beskrevet andetsteds28,29. Uafhængigt af det valgte molekyle er en af de vigtigste begrænsninger ved at arbejde med en kemisk tværbinding tilstedeværelsen af restrester, som kan inducere cytotoksicitet. Efter aktiveringsreaktionen er det vigtigt at skylle de mikrofluidiske overflader med rigelige mængder vaskeopløsning.
Fordi luftbobler har tendens til at danne og vokse inden for de hydrofobe grænseflader mellem chips, slanger og stik, er det vigtigt at vurdere, om den mikrofluidiske vej er fri for luftbobler, før væskestrømmen startes. Bobler kan faktisk forstyrre strømmen og endda dræbe cellerne, når chips er forbundet til flow. Priming af de mikrofluidiske komponenter, før væskestrømmen startes, reducerer risikoen for at generere luftbobler og hjælper med at opnå optimale og reproducerbare resultater. Hvis primingcyklussen beskrevet i denne protokol ikke var tilstrækkelig, vil skylning af de mikrofluidiske rør med ethanol (5 min) og derefter med HBSS (20 min) yderligere mindske risikoen for at generere luftbobler inde i de fluidiske stik.
På trods af sine begrænsninger besidder PDMS en sjælden kombination af kemiske egenskaber, der har muliggjort fremstilling af meget biokompatible, gennemsigtige og elastiske mikrofluidiske enheder. Alle disse egenskaber har gjort PDMS til det mest anvendte materiale til konstruktionen af Organ-on-Chip-modellerne i løbet af det sidste årti. Nylige fremskridt inden for materialevidenskab og kemiteknik30,31 tyder på, at PDMS-komponenten på denne platform i den nærmeste fremtid kan erstattes med nye syntetiske polymerer eller biomaterialer. Hvis det lykkes, kan det muliggøre rekapitulation af vævsspecifikke egenskaber, herunder porøsitet, ECM-sammensætning af det interstitielle rum, der giver tættere efterligning til humant naturligt væv og mere avancerede modeller til farmakologiske undersøgelser. Vi forventer, at den fremtidige udvikling af Open-Top Chip-designet vil muliggøre modellering af humane væv og organer med et hidtil uset detaljeringsniveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer følgende økonomiske interesser / personlige forhold, som kan betragtes som potentielle konkurrerende interesser: Varone Antonio er tidligere ansat hos Emulate Inc. og kan have aktieinteresser i Emulate.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
References
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
- Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
- MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
- Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
- Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
- Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
- Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
- Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
- Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
- Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
- Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P.
- Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
- Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
- Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
- Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).
