Summary
本协议描述了开顶器官芯片在成功建立和成熟原代组织（皮肤、肺泡、气道和肠）的全层器官芯片培养物方面的能力和基本培养方式，提供了研究人上皮/间充质和血管生态 位界面的不同功能方面的机会体外。
Abstract
几乎所有人体器官都衬有上皮组织，包括一层或多层紧密连接的细胞，这些细胞组织成三维（3D）结构。上皮的主要功能之一是形成屏障，保护下层组织免受物理和化学侮辱和感染因子的侵害。此外，上皮介导营养物质、激素和其他信号分子的转运，通常产生指导细胞在器官内定位和区室化的生化梯度。由于其在决定器官结构和功能方面的核心作用，上皮是许多人类疾病的重要治疗靶点，这些疾病并不总是被动物模型捕获。除了明显的物种间差异外，对动物上皮的屏障功能和运输特性进行研究由于难以在生命系统中访问这些组织而进一步复杂化。虽然二维（2D）人类细胞培养物可用于回答基本的科学问题，但它们通常产生较差 的体内 预测。为了克服这些限制，在过去十年中，大量被称为器官芯片的微工程仿生平台已成为传统 体外 和动物试验的有前途的替代方案。在这里，我们描述了一个开顶器官芯片（或开顶芯片），一个设计用于模拟器官特异性上皮组织的平台，包括皮肤、肺和肠道。该芯片为重建上皮组织的多细胞结构和功能提供了新的机会，包括通过将组织特异性成纤维细胞和内皮细胞整合到机械活性系统中来重建3D基质成分的能力。这种开顶芯片为从单细胞到多层组织构建体的多种分辨率尺度研究上皮/间充质和血管相互作用提供了一种前所未有的工具，从而允许分子解剖健康和疾病中上皮化器官的细胞间串扰。
Introduction
从历史上看，科学家们一直依靠临床前动物试验来发现药物，但由于与人类结果的相关性差，越来越多的这些方法受到质疑1。实施“3R”原则来替代、减少和改进动物实验，促使科学家寻找新的体外替代方法，以支持临床前药物和化学毒理学风险评估2。然而，迄今为止开发的许多体外模型缺乏概括人类活体器官动态性质所必需的生物结构，细胞复杂性和机械环境3，4。
传统的 体外 临床前系统通常采用在刚性塑料表面上生长的人类细胞的2D单培养物。这些方法为进行简单的机理研究提供了一种工具，并能够快速筛选候选药物。由于其相对较低的成本和高稳健性，2D模型通常与自动高通量系统配对，并在药物开发过程的早期阶段用于快速识别潜在的候选药物5，6。然而，这种2D模型不能提供一种转化方法来模拟对候选治疗药物的组织水平、器官水平或全身反应，这是在其开发的临床前阶段准确预测药物安全性和有效性所必需的。扁平细胞培养不能概括天然组织微环境，包括复杂的多细胞相互作用、生物力学特性和人体组织的三维（3D）结构7。在平坦表面上生长的细胞通常不会获得成熟的表型，因此不能像在天然组织中那样对药理学刺激做出反应。例如， 体外 生长的原代人肺泡上皮细胞表现出鳞状表型并失去关键表型标记，包括表面活性蛋白 C 和 B（SP-C 和 SP-B）8。除了分化不足外，原代细胞经常在 体外对生物应激源不敏感，因为与组织炎症相关的某些生化途径变得无功能9。这种细胞功能的丧失似乎主要与使用坚硬的底物以及缺乏组织特异性基质细胞（如肺成纤维细胞和平滑肌细胞）自然释放的可溶性因子有关10，11。
认识到缺乏化学物理和生物学复杂性限制了体外细胞的生理行为，促进了更复杂的多细胞模型的发展，这些模型已被证明可以更好地捕获体 外 人体组织的复杂性12，13。自 1970 年代初创建第一个共培养模型14 以来，合成和天然水凝胶的引入显着提高了模拟天然组织微环境的能力，并已成为驱动细胞分化、引导细胞自组织成组织样结构和恢复天然组织功能的宝贵工具15，16.例如，当在适当的3D支架中生长时，人类细胞可以自我排列成功能结构，如球状体或类器官，表达干细胞标志物，并且能够自我更新17。相比之下，人类细胞（包括干细胞）在传统的2D基质上生长时，在几次传代后会迅速老化并衰老18。此外，水凝胶可以“定制”以匹配特定的组织特性，如孔隙率、孔径、纤维厚度、粘弹性、形貌和刚度，或者进一步设计组织来源的细胞成分和/或生物活性分子，从而模拟生理或病理条件19，20.尽管它们在药物测试方面具有巨大的潜力，但用于药物研究的基于3D水凝胶的模型并不能完全概括 体内 组织的复杂细胞结构，并且缺乏通常存在于人体中的重要血液动力学和机械刺激，包括静水压力，循环拉伸和流体剪切21。
微生理系统（MPS），如器官芯片（OOCs）最近成为能够在体外捕获复杂生理反应的工具22，23。这些模型通常使用微流体平台，可以对活器官的动态微环境进行建模。
我们将3D组织生物工程和机械生物学的原理相结合，创建了复杂人类上皮组织的开顶芯片模型。这使我们能够密切概括上皮组织的多细胞和动态微环境。这包括天然存在于活体器官中的组织特异性生化和生物力学线索，但经常被传统的体外模型所忽视24。开顶芯片包含两个隔室：一个血管隔室（图1A）和一个基质隔室（图1B），由多孔膜隔开，允许营养物质在两个腔室之间扩散（图1C）。血管室暴露于连续的流体流动以概括生理剪切应力，而基质室的可拉伸设计允许模拟与呼吸运动或肠道蠕动相关的机械应变。基质室容纳可调谐的3D水凝胶支架，旨在支持组织特异性成纤维细胞的生理生长。它有一个可拆卸的盖子，便于建立气液界面，这种情况允许更好地模拟粘膜组织的人体生理学，以及直接进入组织以将药物直接施用到上皮层。补充图1捕获了开顶芯片设计的一些关键组件，包括尺寸和生物隔室（补充图1A-D）以及该协议中描述的主要技术步骤（补充图1E）。
开顶芯片的灌注是通过可编程蠕动泵实现的（图1D）。蠕动泵设置允许同时灌注 12 个开顶芯片。大多数培养箱可以容纳两种设置，每个培养箱最多可培养 24 个芯片。机械拉伸是使用定制的可编程真空压力调节器实现的（图1E）。它由一个由数模转换器电子控制的电动气动真空调节器组成。换句话说，电-气真空调节器产生正弦真空曲线，其幅度和频率由用户决定。通过以 0 至 -90 kPa 的振幅和 0.2 Hz 的频率向开顶芯片的真空通道施加负压，产生 0% 至 15% 的循环应变。它是一个定制的系统，相当于之前在其他论文25中采用和描述的市售Flexcell应变单元。为了模拟与例如肺的呼吸运动或肠道蠕动相关的机械组织变形，气动执行器应用正弦真空/应变波，其幅度和振幅可以调节以匹配人体细胞在其天然组织中经历的生理应变水平和频率。
在这里，我们描述了一种在原型开顶芯片平台上工程和培养器官型上皮等效物的高效且可重复的方法。它允许生成复杂的器官模型，如皮肤、肺泡、气道和结肠，同时整合血管液流和机械拉伸。我们将概述在实施组织工程原理以生成复杂的上皮模型时必须考虑的关键技术方面。我们将讨论当前设计的优点和可能的局限性。
用于实现组织和器官成熟的主要步骤的概述，包括流动和拉伸参数，报告如下：图2为皮肤，图3为肺泡，图4为气道，图5为肠道。有关培养基组成和用于培养不同器官模型的试剂的其他信息包含在补充表中（皮肤补充表1;肺泡补充表2;补充表3为气道，补充表4为肠道）。
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Protocol
根据辛辛那提儿童医院机构生物安全委员会（IBC 2017-2011）的指南，从肠切除术中获得人类结肠样体。
1. 表面活化
- 活化缓冲液的制备
- 将交联剂和溶剂缓冲试剂置于生物安全柜（BSC）下，并在使用前在室温（RT）下平衡10分钟。
- 使用无菌不透光容器或用铝箔包裹的透明 15 mL 锥形管在 5 mL 溶剂缓冲液中复溶 5 mg 交联剂，以保护交联剂溶液免受直接光照。
- 将溶液涡旋1分钟以除去所有团块，然后将50μL交联剂溶液直接移液到芯片的底部通道中，将150μL移液到开顶室中。
- 使用吸气器从芯片表面去除任何多余的交联溶液。然后将另外 50 μL 的交联溶液直接移液到芯片的底部通道中，将 150 μL 移液到开顶腔室中，以去除任何残留的气泡。
- 使用UV交联机活化
- 轻轻地从BSC下方的芯片上取下盖子，并将其存放在无菌容器中。
- 将含有交联剂溶液的芯片转移到培养皿中，关闭培养皿以避免污染，然后将装有芯片的培养皿放在UV交联机下。
注意：取下培养皿盖以最大化紫外线暴露。 - 将峰值波长为365nm的UV交联机设置为100μJ / cm2的强度，并打开UV灯20分钟。
注意：紫外线处理20分钟后，交联剂溶液看起来更暗（棕色）。 - 将芯片放回平衡计分卡下并吸出氧化的交联剂溶液。然后，用溶剂缓冲液冲洗所有芯片三次，让芯片在BSC下干燥5-10分钟，以完成聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面的化学官能化。
2.准备基质等效物
- 制备 10x 重建缓冲液 （100 mL）
- 将 2.2 g 碳酸氢钠溶解在 75 mL 的 0.067 M NaOH 中双蒸水中。
- 加入 4.76 克 HEPES，并使用双蒸水使体积达到 100 mL。
- 使用带有0.22μm膜的一次性无菌瓶顶过滤器无菌过滤BSC下的溶液。
注意：当储存在4°C时，溶液可稳定保存约6个月。
- 预凝胶溶液体积的估算
- 将实验所需的芯片数量乘以 150 μL（中央开顶腔室的内部容积），以估计实验所需的预凝胶溶液量：
所需体积 = （芯片数量 x 150） μL - 通过混合在冰上制备胶原蛋白预凝胶溶液：1 体积的 10x EMEM 包含所选细胞、1 体积的 10x 重建缓冲液（参见步骤 2.1）、8 体积胶原蛋白 I 溶液 （10 mg/mL） 和 1 μL 1 N NaOH 溶液每毫克胶原蛋白 I。
注意：建议准备额外的 +15% 体积以解决实验误差;第2.2节中描述的示例提供了详细的分步程序，用于制备足够的预凝胶溶液，用于制备12个芯片和额外15%体积的预凝胶溶液。
- 将实验所需的芯片数量乘以 150 μL（中央开顶腔室的内部容积），以估计实验所需的预凝胶溶液量：
- 制备基质当量的预凝胶溶液（用于12个芯片）
- 在冰上将以下解决方案置于平衡计分卡下：10x EMEM;10倍重建缓冲区（见步骤2.1）;胶原蛋白I溶液（10毫克/毫升）;和无菌 1 N NaOH 溶液。
- 按照提供者的指示培养组织特异性间充质细胞，直到80%-90%汇合，然后使用胰蛋白酶或细胞提供者推荐的其他方法解离细胞。通过在24°C下以250× g 离心5分钟将细胞收集在沉淀中。
- 将细胞沉淀重悬于 225 μL 冰冷的 10x EMEM 中，并加入 225 μL 冰冷的 10x 重建缓冲液（参见步骤 2.1）。通过轻轻上下移液混合溶液，然后加入 1，800 μL 冰冷的胶原蛋白 I 溶液。
- 上下移液 5-6 次，避免气泡在冰上混合预凝胶溶液。
- 在芯片上加入基质等效物（用于 12 个芯片）
- 用 18 μL 1 N NaOH 中和预凝胶溶液。通过上下移液 5-6 次轻轻混合，然后将 150 μL 含有细胞的水凝胶移液到开顶芯片的中心腔室中，避免气泡。
注意：如果需要微图案化，请转到下一步（第 3 节）。 - 将芯片分组到单独的培养皿中，包括在每个培养皿中填充有2mL无菌ddH 2 O的离心管盖，并将培养皿在37°C，5%CO2的培养箱中孵育培养皿。
注意：90分钟后，含有细胞的水凝胶将完全聚合。
- 用 18 μL 1 N NaOH 中和预凝胶溶液。通过上下移液 5-6 次轻轻混合，然后将 150 μL 含有细胞的水凝胶移液到开顶芯片的中心腔室中，避免气泡。
3. 表面微图案（可选）
- 使用3D打印印章移液中和的胶原蛋白水凝胶（仍处于液态）后，对基质水凝胶进行表面微图案化。
注意：3D打印的邮票可以以各种可定制的设计获得，如前面在其他地方24所述。 - 将 20 μL 中和胶原蛋白 I 预凝胶溶液移液到无菌 3D 打印印章的图案表面上，并将印章插入开顶腔室内（顶部），同时基质水凝胶仍为液体形式。
- 使用吸气器（或移液器）清除可能从开顶腔室顶部溢出的任何水凝胶残留物。将所有芯片分组到单独的培养皿中，并包括离心机15 mL锥形管帽，在每个培养皿中填充2 mL无菌ddH2O。
- 将所有培养皿在37°C，5%CO2 下孵育90分钟，然后将芯片带回BSC下，并使用精密镊子轻轻去除印章，以降低损坏水凝胶的风险。
4. 用组织特异性 ECM 蛋白涂覆上皮和血管表面
- 用细胞外基质蛋白涂覆血管微流体室
- 将实验所需的芯片数量乘以 20 μL（血管通道体积），以估计实验所需的血管 ECM 涂层溶液的体积：
所需体积 = （芯片数 x 20） μL
注意：建议额外准备 15% 的体积以解决实验误差。 - 使用冰冷的PBS或HBSS为所有芯片制备血管ECM包衣溶液（例如，每12个芯片300 μL）。
注意：请参阅补充材料部分的具体器官方案表（皮肤补充表1 ;肺泡补充 表2 ; 补充表2 用于气道， 补充表4 用于肠道）以确定特定的试剂和推荐的ECM组成。 - 将 20 μL 血管 ECM 涂层溶液移液到每个芯片的血管通道中。
- 将实验所需的芯片数量乘以 20 μL（血管通道体积），以估计实验所需的血管 ECM 涂层溶液的体积：
- 用细胞外基质蛋白涂覆基质等效物的顶端表面
- 将实验所需的芯片数量乘以 50 μL（血管通道体积），以估计实验所需的上皮 ECM 涂层溶液的体积：
所需体积 =（芯片数 x 50）μL
注意：建议准备额外的 15% 体积以解决实验误差。 - 在冰冷的PBS或HBSS中为所有芯片准备足够的ECM涂层溶液（例如，每12个芯片750μL），并将50μL上皮ECM涂层溶液直接转移到水凝胶表面。
注意：请参阅补充材料部分的具体器官方案表（皮肤补充表1 ;肺泡补充 表2 ; 补充表2 用于气道， 补充表4 用于肠道）以确定特定的试剂和推荐的ECM组成。 - 将芯片分组到单独的培养皿中，包括在每个培养皿中填充2mL无菌ddH 2 O的离心机15mL锥形管帽，并将培养皿在培养箱中于37°C，5%CO 2孵育2小时，然后进行上皮细胞接种。
- 将实验所需的芯片数量乘以 50 μL（血管通道体积），以估计实验所需的上皮 ECM 涂层溶液的体积：
5. 将上皮细胞接种在基质当量上
- 上皮细胞培养
- 按照提供者的指示培养组织特异性上皮细胞，直到80%-90%汇合。
- 按照细胞提供者的建议，使用蛋白水解酶程序解离细胞。
注意：为获得最佳结果，请在活跃生长期（P1-P2）的低传代（P1-P2）收获上皮细胞，当它们达到70%-90%汇合度时。 - 解离后，离心细胞并将它们收集为沉淀。
- 将上皮细胞重悬至特定器官方案表中所示的适当细胞/片段密度。
注意：在本研究中，细胞溶液的密度为3 x 10 6个细胞/ mL用于皮肤，1 x 10 6个细胞/ mL用于肺泡，6 x 10 6个细胞/ mL用于气道，8 x 10 6片段/ mL用于肠道。
- 上皮细胞接种
- 将芯片从培养箱转移到平衡计分卡中。从血管通道吸出涂层溶液，并用50μL新鲜内皮细胞培养基冲洗血管微流体通道三次。
- 从水凝胶表面吸出涂层溶液，并用 100 μL 新鲜上皮细胞培养基冲洗基质表面三次，以去除任何多余的涂层溶液。
- 如补充表所示，吸出上升培养基并使用适当的细胞密度用 50 μL 上皮细胞悬液接种水凝胶表面，然后将芯片转移回培养箱 2 小时（或结肠样过夜）。
- 用细胞培养基轻轻冲洗水凝胶表面两次，以去除细胞碎片。最后，通过在密封的可高压灭菌容器中高压灭菌来刷新培养基，并将芯片连接到蠕动泵。
6. 将芯片连接到流动
- 准备流体部件
- 切割 2 英寸的生物相容性聚丙烯基热塑性弹性体 （TPE） 转移管（材料表），以制备将芯片连接到介质储液器所需的短微流体管。
- 切割 7.5 英寸的生物相容性 TPE 转移管以生产长微流体管。
- 准备足够的 18 G 和 19 G 金属连接器（材料表）。
注意：建议在将开顶芯片连接到蠕动泵之前至少 1 天准备和消毒步骤 6.1.1 和 6.1.2 中描述的管道和连接器。 - 用4英寸皮下注射针刺穿每个培养基储液器的盖子（材料表）。
- 介质脱气
- 让细胞培养基平衡至室温（RT）。
- 将所需介质的体积转移到锥形过滤管中。
- 施加 -20 PSI 的负真空压力对介质进行脱气（真空驱动过滤）。
注意：如果没有真空，可以将细胞培养基在培养箱中平衡过夜，以获得类似的结果。
- 为流体流动准备开顶切屑
- 在开始流体流动之前，将芯片和无菌流体部件放在 BSC 下，并对齐开顶芯片的盖子（顶部）以密封开顶芯片原型。
- 将 200 μL 脱气的细胞培养基（参见器官特异性表）移液到芯片顶部和底部通道的入口中，同时注意避免气泡。
- 将 300 μL 培养基移液到短微流体管中，以灌注管的内表面，并将短管连接到芯片顶部和底部通道的入口。
- 连接并灌注微流体表面
- 将培养基储液器放入猪场架中，将皮下注射针头连接到薯片的底部入口，最后，将所有薯片放入培养箱内的外壳载体中。
- 将芯片连接到蠕动泵，然后检查所有连接器，以确保所有芯片都正确连接并且细胞培养基没有可见的泄漏。
- 使用泵上的 “清除” 按钮并保持约15秒或直到细胞培养基的液滴出现在流出管的末端。
- 使用泵上的控制系统设置适当的器官芯片流速（图 2、图 3、图 4 和图 5）。
7. 芯片的维护
- 器官芯片维护
- 为上皮和/或内皮制备新鲜细胞培养基，并进行脱气步骤（如前面的步骤6.2中所述）。
- 暂停蠕动泵，小心地断开切屑与泵的连接，然后取出切屑外壳托架。将芯片从培养箱转移到平衡计分卡，并去除残留在储液槽中的培养基体积。
- 用 5 mL 新鲜细胞培养基将细胞培养基更换到顶部和底部入口储液槽中，并将芯片外壳载体放回培养箱中。将芯片连接到蠕动泵并重新启动流动。
注意：建议使用 清除 功能将培养基快速刷新到血管室并降低气泡的风险。 - 每隔一天重复步骤7.1.1-7.1.3，如图2，图3，图4和图5所示。
- 建立气液界面
- 暂停蠕动泵，小心地断开切屑与泵的连接，然后取出切屑外壳托架。将芯片从培养箱转移到生物安全柜中，并将剩余的培养基体积移入顶部储液罐中。
- 从顶部微流体通道轻轻吸出所有介质，并使用粘合剂夹夹住连接到顶部入口的短微流体管，以减少介质蒸发和ALI的维持。
- 将开顶芯片放在外壳载体上，放回培养箱中，然后将芯片重新连接到蠕动泵。
注意：建议使用 清除 功能将培养基快速刷新到血管室并降低气泡的风险。 - 通过启动蠕动泵恢复流动。
- 拉伸（可选）
- 暂停蠕动泵，并使用每个芯片的两个长微流体管将芯片的真空端口连接到真空模块。
- 使用真空模块将拉伸设置调整为器官协议表中指定的每个器官的建议条件：皮肤补充 表1 ;肺泡补充 表2 ;气道补充 表2 ;和肠道补充 表4 。
- 目视检查管连接，确保所有芯片都正确连接，并且没有可见的介质滴落液滴。
- 通过启动蠕动泵恢复流动。
8. 在血管室中接种内皮细胞
- 准备用于血管细胞接种的细胞和芯片
- 按照提供者的指示培养组织特异性内皮细胞，直到80%-90%汇合。使用蛋白水解酶程序（根据提供者的建议）解离细胞，最后将内皮细胞重悬于3 x 106 细胞/ mL的溶液中。
注意：为获得最佳结果，请在活跃生长期以低传代（P2-P4）收获内皮细胞，当它们达到70%-90%汇合度时。 - 暂停蠕动泵。将芯片从培养箱转移到平衡计分卡，断开芯片与培养基储液器和任何连接的管子的连接，然后将芯片分组到单独的培养皿中。
- 用新鲜的上皮细胞培养基刷新上皮隔室的细胞培养基。用新鲜的内皮细胞培养基冲洗血管通道两次，然后从血管室吸出培养基。
- 按照提供者的指示培养组织特异性内皮细胞，直到80%-90%汇合。使用蛋白水解酶程序（根据提供者的建议）解离细胞，最后将内皮细胞重悬于3 x 106 细胞/ mL的溶液中。
- 内皮细胞接种
- 用 25 μL 内皮细胞悬液（3 x 106 个细胞/mL）接种底部（血管）通道，将芯片倒置以使内皮细胞附着在微流体室的上表面。
注意：每个芯片添加 50 μL 细胞悬液（每 12 个芯片添加 600 μL）。 - 将薯片分组到培养皿中。将它们放回37°C，5%CO 2的培养箱中， 并让内皮细胞附着1小时。
- 1小时后，将芯片从培养箱转移到BSC。用内皮细胞培养基冲洗血管通道两次以去除细胞碎片。
- 重复步骤8.2.1-8.2.2，再次用内皮细胞播种血管通道，并将芯片平放，以促进内皮细胞粘附到血管通道的底面。
- 用 25 μL 内皮细胞悬液（3 x 106 个细胞/mL）接种底部（血管）通道，将芯片倒置以使内皮细胞附着在微流体室的上表面。
- 将芯片重新连接到流动
- 在BSC下用脱气的维管细胞培养基填充血管培养基储液器。
- 将芯片放回芯片外壳托架内，并将芯片重新连接到一端的介质储液罐，另一端的蠕动泵。
注意：建议使用 清除 功能将培养基快速刷新到血管室并降低气泡的风险。 - 目视检查微流体连接，以确保所有芯片都正确连接，并且没有可见的介质滴落。然后，通过启动蠕动泵恢复流体流动。
9. 常见终点检测
- 断开终点测定的芯片
- 暂停蠕动泵，小心地断开切屑与泵的连接，然后取出切屑外壳托架。将芯片外壳载体从培养箱转移到平衡计分卡并释放芯片。
- 用上皮细胞培养基轻轻清洗开顶芯片的中心腔室，用内皮培养基轻轻清洗血管通道两次，以去除任何细胞碎片。
- 取下开顶芯片的盖子，使用镊子进入芯片的顶端隔间。
- 荧光显微镜的免疫染色
- 继续进行常规样品固定、透化和封闭。
注意：在本研究中，将样品固定在 200 μL 4% 多聚甲醛 （PFA） 中 1 小时，然后用 PBS 冲洗，在 0.1% Triton X-100 中透化 40 分钟，并在 1% 牛血清白蛋白中封闭 1 小时。 - 将芯片与一抗（材料表）在4°C孵育过夜。然后用200μLPBS洗涤芯片的上皮和内皮隔室两次。然后，使用适当的二抗进行2小时。
注意：以1：100（一抗）和1：200（二抗）的稀释度稀释PBS + 1%BSA中的一抗和二抗。
- 继续进行常规样品固定、透化和封闭。
- 免疫组化
- 使用镊子从开顶芯片的主室中提取基质当量，将它们收集到装有 10% 中性缓冲福尔马林的 1.5 mL 管中并孵育至少 24 小时。
- 转移相当于组织处理器的固定基质，并按照以下步骤实现最佳样品脱水。
- 将水凝胶浸入70%乙醇中90分钟。
- 除去70%乙醇并将水凝胶浸入80%乙醇中90分钟。
- 除去80%乙醇并将水凝胶浸入95%乙醇中90分钟。
- 除去95%乙醇，将水凝胶浸入100%乙醇中90分钟两次。
- 除去100%乙醇，将水凝胶浸入二甲苯溶液中120分钟两次。
- 除去二甲苯溶液，将处理过的基质当量浸润在石蜡中120分钟（~2小时）两次。
- 将浸润的基质等效物嵌入切片石蜡块中。
- 此时，可以使用切片机将基质等效物切片为石蜡块，并根据常规组织学技术进行处理26。
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Representative Results
表面微图案化
细胞外基质（ECM）的微图案可用于复制肠隐窝界面的空间配置。可以修改开顶芯片配置，以集成专门设计的微图案邮票，以模仿结肠上皮-基质界面（图6A，B）和微米级的肠隐窝的自然形貌（图6C-E）。请注意，我们为皮肤、气道和肺泡模型使用了平坦（无图案）的表面。在这种情况下，该印章用于获得均匀的水凝胶表面以接种上皮细胞。我们选择了一种可以模仿人类肠粘膜自然结构的设计，由模拟肠隐窝的正负圆顶交替组成。
器官模型
我们使用Open-Top Chip原型培养和区分了四种不同的上皮（皮肤，肺泡，气道和肠道），以证明该仿生平台的多功能性。器官芯片的组织学切片证实了表型上皮细胞的存在，这些细胞在表型上是不同的，并且具有代表性： 皮肤情况下的分层上皮（图7），气道情况下的假分层柱状上皮（图8和补充视频1）， 肺泡情况下的简单鳞状上皮（图9）， 在肠道的情况下，和简单的柱状上皮（图10）。皮肤、气道和肺泡细胞均从市售供应商处获得（如材料表中所述）。
图 1：本研究中使用的开顶芯片和微流体设置的示意图。 （A-C） 顶视图、逐层投影和 3D 渲染，显示原型 开顶芯片设计包括带有包裹微流体通道的可拆卸上盖（蓝色）、沿培养室的两个半月亮真空通道（灰色）和底部螺旋化内皮微流体通道（洋红色）。（D）定制的芯片支架（也称为“农场系统”），包括芯片外壳载体（红色箭头），蠕动泵和储液器（黄色箭头），以适合普通细胞培养箱的配置排列。€ 气动执行器，控制施加到芯片真空通道的负压的仪器，用于在呼吸或蠕动运动（拉伸）期间产生循环机械力单元体验。该图经Varone等人许可改编24。请点击此处查看此图的大图。
图 2：开顶皮芯片方案的技术概述。 （A） 显示开顶皮片制备作用顺序的示意图，以及 （B） 提供开顶皮片培养的关键生物学步骤。在芯片制备的初始阶段，间充质细胞（成纤维细胞）嵌入凝胶中并加载到开顶芯片中以形成基质层，其包被2-4小时并接种上皮细胞。一旦上皮细胞形成致密的单层，它们就会暴露在空气中（ALI）。生物系统保持在ALI制度下，直到第14天被牺牲进行分析。机械拉伸可以在系统流动和ALI时应用。保持拉伸直到牺牲组织进行分析。有关培养基组成、特异性试剂和细胞类型的更多信息，请参见补充表1。请点击此处查看此图的大图。
图 3：开顶肺泡芯片方案的技术概述。 （A） 显示开顶肺泡芯片制备的作用顺序的示意图，以及 （B） 提供开放顶部肺泡芯片培养的关键生物学步骤。在芯片制备的初始阶段，间充质细胞（成纤维细胞）嵌入凝胶中并加载到开顶芯片中以形成基质层，基质层包被2-4小时并在补充有KIAD的培养基中接种气道上皮细胞（见补充表2）。补充EGF的培养基维持~4天以支持上皮细胞生长。然后将上皮暴露在空气中（ALI）~10天，以实现组织完全成熟。在第14天接种肺微血管内皮细胞，并将生物系统保持在ALI和流动状态下，直到在第21天处死进行分析。请点击此处查看此图的大图。
图 4：开顶气道芯片方案的技术概述。 （A） 显示开顶气道芯片制备的作用顺序的示意图，以及 （B） 提供开顶气道芯片培养的关键生物学步骤。在芯片制备的初始阶段，间充质细胞（成纤维细胞和/或平滑肌细胞）嵌入凝胶中并加载到开顶芯片中以形成基质层，基质层包被2-4小时并在补充EGF的培养基中接种上皮细胞（见补充表3）。补充EGF的培养基维持~4天以支持上皮细胞生长。然后将上皮暴露在空气中（ALI）~10天，以实现组织完全成熟。在第14天接种肺微血管内皮细胞，并将生物系统保持在ALI和流动状态下，直到在第21天处死进行分析。请点击此处查看此图的大图。
图 5：开顶式肠芯片方案的技术概述。 （A） 显示开顶肠芯片制备作用顺序的示意图，以及 （B） 提供开顶式肠芯片培养的关键生物学步骤。在芯片制备的初始阶段，间充质细胞（结肠成纤维细胞）嵌入凝胶中并加载到开顶芯片中以形成基质层，其包被2-4小时并接种从临床切除获得的上皮结肠样碎片。在接种步骤中需要细胞培养基，包括补充剂（ROCK和CHIR，参见补充表4），以维持结肠样细胞活力和生理形态。然后使用不同的培养基来驱动结肠上皮的扩增（第 1 至 6 天）和成熟（第 6 至 9 天）。结肠微血管内皮细胞在第6天使用内皮细胞培养基（EGM2 MV）接种，然后用上皮扩张培养基在流动下培养长达10天。上皮从第10天开始暴露于ALI，以进一步促进上皮细胞成熟。机械拉伸可以从第13天开始应用于系统，并一直保持到第16天，此时牺牲器官模型进行终点分析。请点击此处查看此图的大图。
图 6：微图案冲压。 （A）印章的侧视图和顶视图显示微尺度纹理（高500μm，宽250μm柱阵列）用于重建结肠隐窝组织界面以及印章芯片组件的顶部和侧面视图，显示用于铸造凝胶表面时两个元件的拟合。（B） 显示印章和芯片接口的倾斜侧视图。（中欧）有和没有细胞的微图案凝胶表面的图像。比例尺：200 μm。该图经Varone等人许可改编24。请点击此处查看此图的大图。
图7：使用开顶皮芯片获得的代表性数据 。 （A）示意图显示了开顶皮芯片制备的作用顺序，并提供了开顶皮芯片培养的关键生物学步骤。（B）PCNA Cytokeratin 14，Cytokeratin10，Involucrin和Fillagrin荧光染色和H&E显示成熟的多层分层表皮在芯片上分化。比例尺：100 μm.（C）皮肤芯片（比例尺：5毫米）和H&E横截面（比例尺：100μm）的俯视图图片显示真皮层内成纤维细胞的存在。（D） PECAM-1、VE-钙粘蛋白和冯·维勒布兰德荧光染色显示开顶皮肤芯片中共培养的人微血管内皮细胞的分化。比例尺：20 μm。 （E） 开顶皮肤芯片的 3D 卡通概念渲染。该图经Varone等人许可改编24。 请点击此处查看此图的大图。
图8：使用开顶气道芯片获得的代表性数据 。 （A）显示开顶气道芯片制备的作用顺序的示意图，并提供开顶气道芯片培养的关键生物学步骤。（B）MUC5AC（高脚杯），α和β-微管蛋白（纤毛细胞），克拉拉细胞蛋白16（俱乐部细胞），p63（基底/祖细胞）和ZO-1荧光染色显示成熟气道上皮。比例尺：20 μm。 （C）相差视频/图像显示跳动纤毛的存在。比例尺：50 μm.（D）H&E染色（比例尺：20μm）和TEM图像（比例尺：5μm）显示成熟的假分层上皮分化芯片。 请点击此处查看此图的大图。
图 9：使用开顶肺泡芯片获得的代表性数据。 （A）示意图显示了开顶肺泡芯片制备的作用顺序，并提供了开顶肺泡芯片培养的关键生物学步骤。（B）I型（HTI-56，AT1-α），II型（HTII-280，LAMP3，ABCA3，表面活性剂（C）和E-钙粘蛋白荧光染色显示芯片上存在成熟肺细胞。比例尺：20 μm。 （C） SEM 和 TEM 图像显示存在微绒毛和溶酶体囊泡的成熟肺泡表型的证据。比例尺：5μm.（D）H&E横截面（比例尺：5μm）确认存在与I型表型一致的扁平鳞状细胞和与II型表型一致的立方体鹅卵石样细胞，以及（E）显示真皮层内成纤维细胞的存在（比例尺：10μm）。（F） 开顶肺泡芯片的3D卡通概念渲染。该图经Varone等人许可改编24。请点击此处查看此图的大图。
图10：使用开顶肠芯片获得的代表性数据。 （A） 示意图显示了开顶肠芯片制备的作用顺序，并提供了开顶肠芯片培养的关键生物学步骤。（B）倾斜的侧视图显示了凝胶浇注阶段的印章和芯片组件，微图案凝胶的卡通概念以及凝胶表面上微图案化并在两个不同高度接种结肠样的隐窝状结构的相差图像。比例尺：200 μm。 （C） 粘蛋白 2 和 E-钙粘蛋白荧光染色显示芯片上存在肠细胞和成熟杯状细胞。比例尺：200 μm。 （D）隐窝样结构的H&E横截面显示真皮层内成纤维细胞的存在，并确认存在简单的柱状上皮。比例尺：100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
补充视频1：相差视频显示跳动的纤毛。 比例尺：100 μm。 请点击这里下载此文件。
补充图1：开顶芯片组件。 （A） 示意图显示了开顶芯片组件的三维渲染和开顶皮肤芯片的卡通渲染，其中突出显示了不同的生物隔室，包括上皮（蓝色）、真皮（黄色）和血管（红色）。（B）组装的微流控平台具有35 mm x 17 mm格式，0.32 cm2的组织培养面积，底部螺旋微流体通道和带有微流体通道的腔室盖。（C）该平台包括一个具有5度角壁的腔室，该腔室在膜的水平处直径为6毫米，在PDMS室壁顶部的直径为5.7毫米，高度为4毫米和宽度。多孔膜厚50μm，孔径7μm。（D）底部螺旋形微流体通道的横截面尺寸为400μm（高度）x 600μm（宽度）。（E）实验时间表概述和制备开顶器官芯片所需的步骤。 请点击此处下载此文件。
补充表1：皮肤。 该表总结了在开顶皮芯片培养的三个阶段（生长、增殖和分化）中使用的关键日常步骤以及拉伸和流动参数。该表还提供了材料列表、培养基配方以及如何制备该协议所需的培养基的说明。三种培养基的组成针对协议的不同阶段进行了优化。具体而言，培养基I针对接种和早期角质形成细胞培养阶段进行了优化。培养基II针对增殖和早期分化（分层上皮的形成）进行了优化。ALI培养基经过优化，可将角质形成细胞维持在气液界面，直到产生完全分化的表皮。 请点击此处下载此文件。
补充表2：肺泡。 该表总结了开顶肺泡芯片培养的三个阶段（生长、增殖和分化）中关键的日常步骤以及拉伸和流动参数。该表还提供了材料列表、培养基配方以及如何制备该协议所需的培养基的说明。两种介质的组成针对协议的不同阶段进行了优化。请注意，在细胞培养基中添加添加剂（KIAD）对于实现肺细胞的最佳分化至关重要。 请点击此处下载此文件。
补充表3：气道。 该表总结了开顶气道芯片培养的三个阶段（生长、增殖和分化）中关键的日常步骤以及拉伸和流动参数。该表还提供了材料清单、培养基配方以及如何制备该协议所需培养基的说明。培养基的组成经过优化，以维持气液界面上的气道细胞，这反过来又诱导末端分化并刺激粘液的产生。 请点击此处下载此文件。
补充表4：肠。 该表总结了开顶肠芯片培养的三个阶段（生长、增殖和分化）中关键的日常步骤以及拉伸和流动参数。该表还提供了材料列表、培养基配方以及如何制备该协议所需的培养基的说明。两种培养基的组成都针对协议的不同阶段进行了优化。具体而言，补充有CHIR和ROCK抑制剂的扩增培养基针对播种和培养的早期阶段进行了优化，因为它促进了结肠类器官片段作为单层的存活和生长。扩增培养基针对上皮单层的增殖和早期分化进行了优化。分化培养基针对暴露于气液界面前的上皮单层的末端分化进行了优化。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
Open-Top Chip代表了一个使能平台，用于实时研究受控微环境中内皮、基质和上皮之间发生的复杂细胞相互作用。与传统的器官型和类器官培养相比，该技术具有关键优势，例如整合与重建人体组织微环境相关的物理和生化线索，包括流体剪切（流动）、循环拉伸和通过微图案 实现 的上皮表面形貌重建。在该平台内生长的人类细胞协同作用，以概括可以通过常规技术 分析 的组织特异性功能，包括使用顶部和/或底部隔室的流出流体（或流出物）的免疫组织化学和生化测定。目前的设计允许轻松进入上皮层，细胞与组织特异性成纤维细胞和其他基质细胞直接接触生长，模仿上皮组织的多细胞结构。值得注意的是，开顶芯片原型为与使用其他器官芯片平台相关的常见挑战提供了可行的解决方案。虽然它能够在基质隔室内结合几种不同的细胞类型，从而创建非常复杂的3D组织，但它也允许从芯片设备中轻松提取已建立的组织结构以进行下游分析，包括常规H&E染色。
当前的设计存在一些限制。例如，在血管微通道和原型开顶芯片的基质室（水凝胶）之间插入的弹性膜比将内皮组织与天然人体器官中的基质分离的间隙厚得多（≈50μm对≈1μm）。虽然弹性膜不代表大分子扩散的物理屏障，例如激素和其他介导组织间细胞间串扰的旁分泌因子，但它可能会限制直接的细胞间相互作用以及细胞从血管到基质室的迁移。最后，原型开顶芯片由PDMS制成，众所周知，PDMS可以吸收大量的疏水性化合物。许多基于PDMS的平台都有这种局限性，这些平台在用于测试小治疗化合物的药效学和药代动力学的应用中可能是一个严重的障碍27。
将3D水凝胶集成到微流体装置（如Open-Top Chip）中的主要挑战之一是PDMS不能为人类蛋白质或细胞的结合提供最佳底物。因此，PDMS表面的化学功能化是该协议中的一个关键步骤，以确保适当的ECM涂层和水凝胶粘附到开顶芯片模型的凝胶室上。为了获得最佳结果，必须始终保护ER1溶液中的交联剂免受直接暴露在光线下。交联剂反应状态的一个重要指标是其颜色。事实上，ER1中的交联剂在氧化时会经历从亮橙色到深棕色的颜色过渡。颜色过渡可用作UV活化步骤后的指示剂，以检查溶液是否与PDMS表面有效反应。在交联剂溶液的制备过程中，应监测颜色转变，以确保意外暴露在直射光下不会对溶液中的化合物进行光漂白。为了保护交联剂溶液并避免任何不必要的光漂白，我们建议将铝箔（约15 cm x 15 cm）包裹在15 mL锥形管周围或使用市场上的琥珀色管。ER1的使用提供了一种简单有效的方法来实现PDMS表面的快速功能化;然而，还有其他分子可以用来代替ER1。例如，化学交联剂3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMES）不像ER1那样光敏，它可以通过一些额外的步骤来实现类似的结果，正如我们之前在其他地方描述的那样28，29。与选择的分子无关，使用化学交联剂的主要限制之一是残留物的存在，这会引起细胞毒性。活化反应后，重要的是用大量的洗涤溶液冲洗微流体表面。
由于气泡倾向于在芯片、管道和连接器的疏水界面内形成和生长，因此在开始流体流动之前评估微流体路径是否没有气泡非常重要。气泡确实会破坏流动，甚至在芯片连接到流动时杀死细胞。在开始流体流动之前启动微流体组件将降低产生气泡的风险，并有助于获得最佳和可重复的结果。如果本协议中描述的启动周期不足，则用乙醇（5分钟）冲洗微流体管，然后用HBSS（20分钟）冲洗微流体管将进一步降低在流体连接器内产生气泡的风险。
尽管有其局限性，但PDMS具有罕见的化学性质组合，使制造高度生物相容性，透明和弹性的微流体装置成为可能。所有这些特性使PDMS成为过去十年中用于构建器官芯片模型的最广泛应用的材料。材料科学和化学工程领域的最新进展30，31表明，该平台的PDMS组件可以在不久的将来被新的合成聚合物或生物材料所取代。如果成功实现，它可以重现组织特异性特性，包括孔隙率，间隙空间的ECM组成，提供更接近人类天然组织的模拟，以及更先进的药理学研究模型。我们预计，开顶芯片设计的未来发展将使人体组织和器官的建模具有前所未有的细节水平。
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Disclosures
作者声明了以下经济利益/个人关系，这些利益/个人关系可能被视为潜在的竞争利益： Varone Antonio是Emulate Inc.的前雇员，可能持有Emulate的股权。
Acknowledgments
没有
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
References
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- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
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