Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Восстановление цитоархитектии и функции эпителиальных тканей человека на органе-чипе с открытым верхом

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64633
Automatic Translation
1, 2, 3, 2,3
1Merk Sharp & Dohme LLC, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

Настоящий протокол описывает возможности и основные методы культивирования органа-чипа с открытым верхом для успешного создания и созревания полнослойных культур первичных тканей (кожи, альвеол, дыхательных путей и кишечника), что дает возможность исследовать различные функциональные аспекты интерфейса эпителия/мезенхимы и сосудистой ниши человека in vitro.

Abstract

Почти все органы человека выстланы эпителиальными тканями, состоящими из одного или нескольких слоев плотно связанных клеток, организованных в трехмерные (3D) структуры. Одной из основных функций эпителия является формирование барьеров, защищающих подкладные ткани от физических и химических воздействий и инфекционных агентов. Кроме того, эпителий опосредует транспортировку питательных веществ, гормонов и других сигнальных молекул, часто создавая биохимические градиенты, которые определяют позиционирование и компартментализацию клеток в органе. Благодаря своей центральной роли в определении структуры и функции органов, эпителии являются важными терапевтическими мишенями для многих заболеваний человека, которые не всегда фиксируются на животных моделях. Помимо очевидных видовых различий, проведение научных исследований барьерной функции и транспортных свойств эпителия у животных еще больше усугубляется трудностью доступа к этим тканям в живой системе. В то время как двумерные (2D) клеточные культуры человека полезны для ответа на основные научные вопросы, они часто дают плохие прогнозы in vivo . Чтобы преодолеть эти ограничения, в последнее десятилетие появилось множество микроинженерных биомиметических платформ, известных как органы на чипе, в качестве многообещающей альтернативы традиционным испытаниям in vitro и испытаниям на животных. Здесь мы описываем Open-Top Organ-Chip (или Open-Top Chip), платформу, предназначенную для моделирования органоспецифических эпителиальных тканей, включая кожу, легкие и кишечник. Этот чип предлагает новые возможности для восстановления многоклеточной архитектуры и функции эпителиальных тканей, включая возможность воссоздания 3D-стромального компонента путем включения тканеспецифических фибробластов и эндотелиальных клеток в механически активную систему. Этот чип с открытым верхом представляет собой беспрецедентный инструмент для изучения эпителиальных/мезенхимальных и сосудистых взаимодействий в различных масштабах разрешения, от отдельных клеток до многослойных тканевых конструкций, что позволяет молекулярно рассекать межклеточные перекрестные помехи эпителизированных органов в здоровье и при болезнях.

Introduction

Исторически сложилось так, что ученые полагались на доклинические испытания на животных для открытия лекарств, но все большее число этих методов ставится под сомнение из-за плохой корреляции с человеческим исходом1. Внедрение принципов «3R» для замены, сокращения и уточнения экспериментов на животных побуждает ученых искать новые альтернативные методы in vitro для поддержки доклинической оценки риска лекарственной и химической токсикологии2. Однако многим моделям in vitro, разработанным на сегодняшний день, не хватает биологической архитектуры, клеточной сложности и механической среды, необходимых для повторения динамической природы живых органов человека 3,4.

Обычные доклинические системы in vitro обычно используют 2D-монокультуры клеток человека, выращенных на жесткой пластиковой поверхности. Эти методы обеспечивают инструмент для проведения простых механистических исследований и позволяют быстро проводить скрининг кандидатов на лекарства. Из-за их относительно низкой стоимости и высокой надежности 2D-модели часто сочетаются с автоматическими высокопроизводительными системами и используются для быстрой идентификации потенциальных кандидатов на лекарства на ранней стадии процесса разработки лекарств 5,6. Однако такие 2D-модели не обеспечивают трансляционного подхода к моделированию на тканевом, органном или системном уровне ответов на терапевтические кандидаты, что необходимо для точного прогнозирования безопасности и эффективности лекарственных средств на доклинической стадии их разработки. Плоскоклеточные культуры не повторяют микроокружение нативной ткани, включая сложное многоклеточное взаимодействие, биомеханические свойства и трехмерную (3D) архитектуру тканей человека7. Клетки, растущие на плоской поверхности, часто не приобретают зрелого фенотипа и, следовательно, не могут реагировать на фармакологические раздражители так, как в нативной ткани. Например, первичные альвеолярные эпителиальные клетки человека, выращенные in vitro, проявляют плоскоклеточный фенотип и теряют ключевые фенотипические маркеры, включая сурфактантные белки C и B (SP-C и SP-B)8. В дополнение к недостаточной дифференцировке первичные клетки часто становятся нечувствительными к биологическим стрессорам in vitro, поскольку определенные биохимические пути, связанные с воспалением тканей, становятся нефункциональными9. Такая потеря функции клеток, по-видимому, в первую очередь связана с использованием жестких субстратов, а также с отсутствием растворимых факторов, естественным образом высвобождаемых тканеспецифическими стромальными клетками, такими как фибробласты легких и гладкомышечные клетки10,11.

Понимание того, что отсутствие химиофизической и биологической сложности ограничивает физиологическое поведение клеток in vitro, способствовало разработке более сложных многоклеточных моделей, которые, как оказалось, лучше отражают сложность тканей человека вне тела12,13. С момента создания первых моделей совместной культуры в начале 1970-х годов14 внедрение синтетических и натуральных гидрогелей значительно улучшило способность имитировать микроокружение нативных тканей и стало бесценным инструментом для стимулирования клеточной дифференцировки, направления самоорганизации клеток в тканеподобные структуры и восстановления функций нативных тканей15,16. Например, при выращивании в соответствующем 3D-каркасе клетки человека могут самостоятельно организовываться в функциональные структуры, такие как сфероиды или органоиды, экспрессирующие маркеры стволовых клеток, и способны к самообновлению17. Напротив, клетки человека (включая стволовые клетки) при выращивании на традиционных 2D-субстратах быстро стареют и стареют после нескольких пассажей18. Кроме того, гидрогели могут быть «адаптированы» в соответствии с конкретными свойствами ткани, такими как пористость, размер пор, толщина волокна, вязкоупругость, топография и жесткость, или дополнительно сконструированы с использованием клеточных компонентов тканевого происхождения и/или биологически активных молекул, позволяющих имитировать физиологические или патологические состояния19,20. Несмотря на огромный потенциал для тестирования лекарств, 3D-модели на основе гидрогеля, используемые в фармацевтических исследованиях, не полностью повторяют сложную цитоархитектографию тканей in vivo и не имеют важных гемодинамических и механических стимулов, обычно присутствующих в организме человека, включая гидростатическое давление, циклическое растяжение и сдвиг жидкости21.

Микрофизиологические системы (МПС), такие как органы-на-чипах (OOC), недавно появились как инструменты, способные улавливать сложные физиологические реакции in vitro22,23. В этих моделях часто используются микрофлюидные платформы, которые позволяют моделировать динамическое микроокружение живых органов.

Мы объединили принципы 3D-биоинженерии тканей и механобиологии для создания модели сложной эпителиальной ткани человека с открытым верхом. Это позволило нам точно повторить многоклеточное и динамическое микроокружение эпителиальных тканей. Это включает в себя тканеспецифические биохимические и биомеханические сигналы, естественным образом присутствующие в живых органах, но часто игнорируемые традиционными моделями in vitro 24. Чип с открытым верхом включает в себя два отсека: сосудистый отсек (рис. 1А) и стромальный компартмент (рис. 1В), разделенные пористой мембраной, обеспечивающей диффузию питательных веществ между двумя камерами (рис. 1С). Сосудистый компартмент подвергается непрерывному потоку жидкости для повторения физиологического напряжения сдвига, в то время как растяжимая конструкция стромальной камеры позволяет моделировать механическое напряжение, связанное с дыхательными движениями или перистальтикой кишечника. В стромальном отсеке находится настраиваемый 3D-гидрогелевый каркас, предназначенный для поддержки физиологического роста тканеспецифических фибробластов. Он обладает съемной крышкой, которая облегчает установление границы раздела воздух-жидкость, что позволяет лучше имитировать физиологию тканей слизистой оболочки человека, а также прямой доступ к ткани для введения лекарств непосредственно на эпителиальный слой. На дополнительном рисунке 1 показаны некоторые ключевые компоненты конструкции микросхемы с открытым верхом, включая размеры и биологические отсеки (дополнительный рисунок 1A-D), а также основные технические этапы, описанные в этом протоколе (дополнительный рисунок 1E).

Перфузия чипа с открытым верхом достигается с помощью программируемого перистальтического насоса (рис. 1D). Перистальтический насос позволяет одновременно перфузировать 12 стружек с открытым верхом. Большинство инкубаторов могут содержать две установки, позволяющие выращивать до 24 чипов на инкубатор. Механическое растяжение достигается с помощью специально разработанного программируемого регулятора давления вакуума (рис. 1E). Он состоит из электропневматического регулятора вакуума, управляемого электронным способом цифро-аналоговым преобразователем. Другими словами, электропневматический регулятор вакуума генерирует синусоидальный вакуумный профиль с амплитудой и частотой, которые определяются пользователем. Циклическая деформация в диапазоне от 0% до 15% создается путем приложения отрицательного давления к вакуумному каналу микросхемы с открытым верхом с амплитудой от 0 до -90 кПа и частотой 0,2 Гц. Это специально разработанная система, эквивалентная коммерчески доступному блоку деформации Flexcell, ранее принятому и описанному в других документах25. Чтобы имитировать механическую деформацию ткани, связанную, например, с дыхательным движением легкого или перистальтикой кишечника, пневматический привод применяет синусоидальные волны вакуума/деформации, величина и амплитуда которых могут быть отрегулированы в соответствии с физиологическим уровнем напряжения и частотой, которые клетки человека испытывают в своих родных тканях.

Здесь мы описываем эффективный и воспроизводимый метод разработки и культивирования органотипических эквивалентов эпителия на прототипе платформы Open-Top Chip. Он позволяет создавать сложные модели органов, таких как кожа, альвеолы, дыхательные пути и толстая кишка, интегрируя поток сосудистой жидкости и механическое растяжение. Мы обозначим ключевые технические аспекты, которые необходимо учитывать при реализации принципов тканевой инженерии для создания сложных эпителиальных моделей. Мы обсудим преимущества и возможные ограничения текущей конструкции.

Обзор основных этапов, используемых для достижения созревания тканей и органов, включая параметры потока и растяжения, представлен в: Рисунок 2 для кожи, Рисунок 3 для альвеолы, Рисунок 4 для дыхательных путей и Рисунок 5 для кишечника. Дополнительная информация о составе среды и реагентах, используемых для культивирования различных моделей органов, включена в дополнительные таблицы (Дополнительная таблица 1 для кожи; Дополнительная таблица 2 для альвеол; Дополнительная таблица 3 для дыхательных путей и дополнительная таблица 4 для кишечника).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Колоноиды человека были получены из резекций кишечника в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по биобезопасности детской больницы Цинциннати (IBC 2017-2011).

1. Поверхностная активация

  1. Подготовка буфера активации
    1. Поместите сшивающий агент и буферные реагенты на основе растворителя под шкаф биобезопасности (BSC) и дайте им уравновеситься при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут перед использованием.
    2. Восстановите 5 мг сшивающего агента в 5 мл буфера растворителя, используя стерильный светонепроницаемый контейнер или прозрачную коническую трубку объемом 15 мл, обернутую алюминиевой фольгой, для защиты раствора сшивающего агента от воздействия прямого света.
    3. Встряхните раствор в течение 1 мин, чтобы удалить все комки, а затем пипеткой наберите 50 мкл раствора сшивающего агента непосредственно в нижний канал чипа и 150 мкл в камеру с открытым верхом.
    4. Удалите излишки сшивающего раствора с поверхности стружки с помощью аспиратора. Затем пипеткой вводят дополнительные 50 мкл сшивающего раствора непосредственно в нижний канал чипа и 150 мкл в камеру с открытым верхом, чтобы удалить оставшиеся пузырьки воздуха.
  2. Активация с помощью УФ-сшивающей машины
    1. Аккуратно снимите крышку с чипа под BSC и храните его в стерильном контейнере.
    2. Перенесите стружку, содержащую раствор сшивающего агента, в чашку Петри, закройте чашку Петри, чтобы избежать загрязнения, и поместите чашку с чипсами под машину для УФ-сшивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите крышку чашки Петри, чтобы максимизировать воздействие ультрафиолета.
    3. Установите УФ-сшивающий аппарат с пиковой длиной волны 365 нм на интенсивность 100 мкДж/см2 и включите ультрафиолетовый свет на 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После 20 минут УФ-обработки раствор сшивающего агента будет выглядеть темнее (коричневым).
    4. Верните стружку под BSC и аспирируйте окисленный раствор сшивающего агента. Затем трижды промойте всю стружку буфером растворителя и дайте стружке высохнуть под BSC в течение 5-10 минут, чтобы завершить химическую функционализацию поверхности полидиметилсилоксана (PDMS).

2. Подготовка эквивалента стромы

  1. Приготовление 10-кратного реконструкционного буфера (100 мл)
    1. Растворите 2,2 г бикарбоната натрия в 75 мл 0,067 М NaOH в двойной дистиллированной воде.
    2. Добавьте 4,76 г HEPES и доведите объем до 100 мл с помощью двойной дистиллированной воды.
    3. Стерильную фильтрацию раствора под БСК используют одноразовый стерильный флакон-фильтр с мембраной 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор стабилен в течение примерно 6 месяцев при хранении при 4 °C.
  2. Оценка объема прегелевого раствора
    1. Умножьте количество чипов, необходимых для эксперимента, на 150 мкл (внутренний объем центральной камеры с открытым верхом), чтобы оценить количество предварительного раствора геля, необходимого для эксперимента:
      Необходимый объем = (количество чипов x 150) мкл
    2. Приготовьте раствор коллагена на льду, смешав: 1 объем 10x EMEM, содержащий выбранные клетки, 1 объем 10x буфера реконструкции (см. шаг 2.1), 8 объемов раствора коллагена I (10 мг / мл) и 1 мкл 1 N раствора NaOH на каждый мг коллагена I.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подготовить дополнительный объем +15% для учета экспериментальных ошибок; Пример, описанный в разделе 2.2, предоставляет подробную пошаговую процедуру приготовления достаточного количества предварительного раствора геля для 12 чипсов и дополнительных 15% объема.
  3. Приготовление предварительного раствора геля для стромного эквивалента (на 12 чипов)
    1. Подвести под BSC на льду следующие решения: 10x EMEM; 10-кратный буфер реконструкции (см. шаг 2.1); Раствор коллагена I (10 мг/мл); и стерильный раствор NaOH 1 Н.
    2. Культивируйте тканеспецифические мезенхимальные клетки по указанию поставщиков до тех пор, пока 80-90% не слились воедино, а затем диссоциируют клетки с помощью трипсина или других методов в соответствии с рекомендациями поставщика клеток. Соберите клетки в гранулы центрифугированием при 250 x g в течение 5 мин при 24 °C.
    3. Ресуспендируют гранулу ячейки в 225 мкл ледяного 10x EMEM и добавляют 225 мкл ледяного 10-кратного буфера реконструкции (см. шаг 2.1). Смешайте раствор, аккуратно пипетируя вверх и вниз, а затем добавьте 1,800 мкл ледяного раствора коллагена I.
    4. Пипеткой вверх и вниз 5-6 раз, избегая пузырьков, чтобы перемешать предварительно гель-раствор на льду.
  4. Включение эквивалента стромы в чип (для 12 чипов)
    1. Нейтрализуйте раствор предварительного геля 18 мкл 1 N NaOH. Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз 5-6 раз, а затем введите пипеткой 150 мкл насыщенного клетками гидрогеля в центральную камеру чипа с открытым верхом, избегая пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется микропаттернирование, перейдите к следующему шагу (раздел 3).
    2. Сгруппируйте чипы в отдельные чашки Петри, включая крышку центрифужной пробирки, заполненную 2 мл стерильного ddH2 O в каждой чашке Петри, и инкубируйте чашки Петри в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через 90 минут нагруженный клетками гидрогель полностью полимеризуется.

3. Микроструктурирование поверхности (опционально)

  1. Выполните поверхностное микроструктурирование стромального гидрогеля после пипетки нейтрализованного коллагенового гидрогеля (все еще в жидком состоянии) с использованием штампов, напечатанных на 3D-принтере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Марки, напечатанные на 3D-принтере, могут быть получены в различных настраиваемых дизайнах, как описано ранее в другом месте24.
  2. Пипетку 20 мкл нейтрализованного раствора коллагена I предварительно геля на узорчатую поверхность стерильного штампа, напечатанного на 3D-принтере, и вставьте штамп внутрь (сверху) камеры с открытым верхом, пока стромальный гидрогель все еще находится в жидкой форме.
  3. Удалите остатки гидрогеля, которые могут пролиться из верхней части камеры с открытым верхом, с помощью аспиратора (или пипетки). Сгруппируйте все чипсы в отдельные чашки Петри и включите центрифугу 15 мл конической пробирки, заполненную 2 мл стерильного ddH2O в каждой чашке Петри.
  4. Инкубируйте все чашки Петри при 37 °C, 5% CO2 в течение 90 минут, а затем верните стружку под BSC и аккуратно удалите штампы с помощью прецизионного пинцета, чтобы снизить риск повреждения гидрогеля.

4. Покрытие эпителиальной и сосудистой поверхности тканеспецифическими белками ECM

  1. Покрытие сосудистой микрофлюидной камеры белками внеклеточного матрикса
    1. Умножьте количество чипов, необходимых для эксперимента, на 20 мкл (объем сосудистого русла), чтобы оценить объем раствора сосудистого ECM-покрытия, необходимого для эксперимента:
      Необходимый объем = (количество чипов x 20) мкл
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подготовить дополнительный 15% тома, чтобы учесть экспериментальные ошибки.
    2. Приготовьте раствор для покрытия сосудов ECM для всех чипов (например, 300 мкл на 12 чипов), используя ледяной PBS или HBSS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице конкретных органов-протоколов в разделе дополнительных материалов (Дополнительная таблица 1 для кожи; Дополнительная таблица 2 для альвеол; Дополнительная таблица 2 для дыхательных путей и дополнительная таблица 4 для кишечника) для определения конкретных реагентов и рекомендуемого состава ECM.
    3. Пипетка 20 мкл сосудистого раствора ECM-покрытия в сосудистый канал каждого чипа.
  2. Покрытие апикальной поверхности стромального эквивалента белками внеклеточного матрикса
    1. Умножьте количество чипов, необходимых для эксперимента, на 50 мкл (объем сосудистого канала), чтобы оценить объем раствора эпителиального покрытия ECM, необходимого для эксперимента:
      Необходимый объем = (Количество чипов x 50) мкл
      ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется подготовить дополнительный 15% тома для учета экспериментальных ошибок.
    2. Приготовьте достаточное количество раствора для покрытия ECM для всех чипов (например, 750 мкл на 12 чипов) в ледяном PBS или HBSS и перенесите 50 мкл раствора эпителиального покрытия ECM непосредственно на поверхность гидрогеля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице конкретных органов-протоколов в разделе дополнительных материалов (Дополнительная таблица 1 для кожи; Дополнительная таблица 2 для альвеол; Дополнительная таблица 2 для дыхательных путей и дополнительная таблица 4 для кишечника) для определения конкретных реагентов и рекомендуемого состава ECM.
    3. Сгруппируйте чипсы в отдельные чашки Петри, включая центрифугу объемом 15 мл конической пробирки, заполненную 2 мл стерильного ddH 2 O в каждой чашке Петри, и инкубируйте чашки Петри в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO 2 в течение2часов, прежде чем приступить к посеву эпителиальных клеток.

5. Посев эпителиальных клеток на стромальный эквивалент

  1. Культура эпителиальных клеток
    1. Культивирование тканеспецифических эпителиальных клеток по указанию поставщиков до слияния 80-90%.
    2. Диссоциируйте клетки с помощью процедур протеолитических ферментов в соответствии с рекомендациями поставщика клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов собирайте эпителиальные клетки при низком пассаже (P1-P2) во время активной фазы роста, когда они достигают слияния между 70% -90%.
    3. После диссоциации центрифугируйте клетки и собирайте их в виде гранул.
    4. Ресуспендируйте эпителиальные клетки до соответствующей плотности клеток/фрагментов, как указано в таблице протоколов конкретных органов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовали клеточный раствор с плотностью 3 x 10 6 клеток / мл для кожи, 1 x 10 6 клеток / мл для альвеолы, 6 x 106 клеток / мл для дыхательных путей и 8 x 106 фрагментов / мл для кишечника.
  2. Посев эпителиальных клеток
    1. Перенесите чипсы из инкубатора в BSC. Аспирируйте раствор покрытия из сосудистого канала и трижды промойте сосудистый микрофлюидный канал 50 мкл свежей среды для культивирования эндотелиальных клеток.
    2. Аспирируйте раствор покрытия с поверхности гидрогеля и трижды промойте стромальную поверхность 100 мкл свежей среды для культивирования эпителиальных клеток, чтобы удалить излишки раствора покрытия.
    3. Аспирируют поднимающуюся среду и засевают поверхность гидрогеля 50 мкл суспензии эпителиальных клеток, используя соответствующую плотность клеток, как указано в дополнительных таблицах, а затем переносят чипсы обратно в инкубатор на 2 ч (или на ночь для колоноидов).
    4. Аккуратно промойте поверхность гидрогеля питательной средой для культивирования клеток дважды, чтобы удалить клеточный мусор. Наконец, обновите среду, автоклавируя в герметичные автоклавируемые контейнеры, и подсоедините стружку к перистальтическому насосу.

6. Подключение чипов к потоку

  1. Подготовка жидких частей
    1. Отрежьте 2 дюйма биосовместимой трубки для переноса термопластичного эластомера (TPE) на основе полипропилена (таблица материалов), чтобы подготовить короткую микрофлюидную трубку, необходимую для соединения микросхем с резервуарами среды.
    2. Отрежьте 7.5 дюймов биосовместимой трубки для переноса TPE, чтобы получить длинную микрофлюидную трубку.
    3. Достаточно подготовить металлические разъемы 18 G и 19 G (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подготовить и стерилизовать трубки и соединители, описанные в шагах 6.1.1 и 6.1.2, по крайней мере, за 1 день до подключения микросхем с открытым верхом к перистальтическим насосам.
    4. Проткните крышку каждого резервуара среды 4-дюймовой иглой для подкожных инъекций (Таблица материалов).
  2. Средняя дегазация
    1. Дайте среде для культивирования клеток уравновеситься до комнатной температуры (RT).
    2. Переведите необходимый объем среды в коническую фильтрующую трубку.
    3. Примените отрицательное вакуумное давление -20 фунтов на квадратный дюйм для дегазации среды (вакуумная фильтрация).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вакуум недоступен, среду для культивирования клеток можно оставить для уравновешивания в инкубаторе на ночь для достижения аналогичных результатов.
  3. Подготовьте чип с открытым верхом к потоку жидкости
    1. Поднесите стружку и стерильные жидкие детали под BSC и совместите крышку (верхнюю часть) микросхемы с открытым верхом для герметизации прототипа микросхемы с открытым верхом перед запуском потока жидкости.
    2. Пипетка 200 мкл дегазированной среды для культивирования клеток (см. таблицы для конкретных органов) вводится во входное отверстие как верхнего, так и нижнего каналов чипа, обращая внимание на то, чтобы избежать пузырьков.
    3. Пипеткой 300 мкл питательной среды в короткую микрофлюидную трубку для заправки внутренней поверхности пробирок и соединения короткой трубки с входными отверстиями верхнего и нижнего каналов чипа.
  4. Соедините и загрунтуйте микрофлюидные поверхности
    1. Поместите средние резервуары в стойку фермы, подсоедините иглу для подкожных инъекций к нижнему входному отверстию чипсов и, наконец, разместите все чипсы в держателе (носителях) корпуса внутри инкубатора.
    2. Подключите чипы к перистальтическому насосу, а затем осмотрите все разъемы, чтобы убедиться, что все чипы правильно подключены и что нет видимой утечки среды для культивирования клеток.
    3. Используйте кнопку «Продувка » на насосе и удерживайте ее около 15 с или до тех пор, пока капли питательной среды клеток не появятся на конце выпускной трубки.
    4. Используйте систему управления на насосе, чтобы установить соответствующий расход органа-чипа (рис. 2, рис. 3, рис. 4 и рис. 5).

7. Обслуживание чипов

  1. Обслуживание органного чипа
    1. Подготавливают свежую среду для культивирования клеток эпителия и/или эндотелия и выполняют стадии дегазации (как ранее описано на шаге 6.2).
    2. Приостановите работу перистальтического насоса, осторожно отсоедините микросхемы от насоса и извлеките держатели корпуса стружки. Перенесите щепу из инкубатора в BSC и удалите объем среды, оставшийся в резервуарах.
    3. Замените питательные среды для клеточных культур в верхнем и нижнем входных резервуарах 5 мл свежих сред для культивирования клеток и поместите носитель (держатели) корпуса чипа обратно в инкубатор. Подсоедините стружку к перистальтическому насосу и перезапустите поток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать функцию продувки , чтобы быстро освежить среду в сосудистом отсеке и снизить риск образования пузырьков воздуха.
    4. Повторяйте шаги 7.1.1-7.1.3 через день, как показано на рисунке 2, рисунке 3, рисунке 4 и рисунке 5.
  2. Создание интерфейса воздух-жидкость (ALI)
    1. Приостановите работу перистальтического насоса, осторожно отсоедините микросхемы от насоса и извлеките держатели корпуса стружки. Перенесите чипсы из инкубатора в шкаф биобезопасности и удалите оставшийся объем среды в верхний резервуар.
    2. Аккуратно аспирируйте всю среду из верхнего микрофлюидного канала и зажмите короткую микрофлюидную трубку, соединенную с верхними входными отверстиями, с помощью связующих зажимов, чтобы уменьшить испарение среды и поддержание ALI.
    3. Поместите чип с открытым верхом на держатель (держатели) корпуса обратно в инкубатор и снова подключите чип к перистальтическому насосу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать функцию продувки , чтобы быстро освежить среду в сосудистом отсеке и снизить риск образования пузырьков воздуха.
    4. Возобновите поток, запустив перистальтический насос.
  3. Растяжка (опционально)
    1. Приостановите работу перистальтического насоса и подключите вакуумные порты микросхем к вакуумному модулю с помощью двух длинных микрофлюидных трубок на чип.
    2. Используйте вакуумный модуль, чтобы отрегулировать настройку растяжения в соответствии с условиями, рекомендованными для каждого органа, как указано в таблицах протоколов органов: Дополнительная таблица 1 для кожи; Дополнительная таблица 2 для альвеол; Дополнительная таблица 2 для дыхательных путей; и Дополнительная таблица 4 для кишечника.
    3. Визуально осмотрите соединения трубок, чтобы убедиться, что все микросхемы правильно подключены и нет видимых капель средней капли.
    4. Возобновите поток, запустив перистальтический насос.

8. Посев эндотелиальных клеток в сосудистый компартмент

  1. Подготовьте клетки и чипы для посева сосудистых клеток
    1. Культивируйте тканеспецифические эндотелиальные клетки по указанию поставщиков до тех пор, пока не произойдет слияние 80-90%. Диссоциируют клетки с помощью процедуры протеолитического фермента (в соответствии с рекомендациями поставщика) и, наконец, ресуспендируют эндотелиальные клетки в растворе 3 х 106 клеток / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов собирайте эндотелиальные клетки при низком пассаже (P2-P4) во время активной фазы роста, когда они достигают слияния между 70% -90%.
    2. Приостановите работу перистальтического насоса. Перенесите чипы из инкубатора в BSC, отсоедините чипы от резервуаров среды и любых подключенных трубок, а затем сгруппируйте чипы в отдельные чашки Петри.
    3. Освежите питательную среду эпителиального компартмента свежей средой для культивирования эпителиальных клеток. Дважды промойте сосудистое русло свежей питательной средой для клеток эндотелия, а затем аспирируйте среду из сосудистого компартмента.
  2. Посев эндотелиальных клеток
    1. Засейте нижний (сосудистый) канал 25 мкл суспензии эндотелиальных клеток (3 x 106 клеток/мл), переверните чипы вверх дном, чтобы эндотелиальные клетки могли прикрепиться к верхней поверхности микрофлюидной камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 50 мкл суспензии ячейки на чип (600 мкл на 12 чипов).
    2. Сгруппируйте чипсы в чашки Петри. Поместите их обратно в инкубатор при 37 ° C, 5% CO2 и дайте эндотелиальным клеткам прикрепиться в течение 1 часа.
    3. Через 1 ч перенесите чипсы из инкубатора в БСК. Дважды промойте сосудистый канал питательной средой эндотелиальных клеток, чтобы удалить клеточный мусор.
    4. Повторите шаги 8.2.1-8.2.2, чтобы снова засеять сосудистый канал эндотелиальными клетками и уложить стружку ровно, чтобы облегчить адгезию эндотелиальных клеток к нижней поверхности сосудистого канала.
  3. Снова подключите чип к потоку
    1. Заполните резервуар сосудистой среды дегазированной средой для культивирования сосудистых клеток под BSC.
    2. Поместите микросхемы обратно в держатель (держатели) корпуса микросхемы и снова подсоедините микросхемы к средним резервуарам на одном конце к перистальтическому насосу на другом конце.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать функцию продувки , чтобы быстро освежить среду в сосудистом отсеке и снизить риск образования пузырьков воздуха.
    3. Визуально осмотрите микрофлюидные соединения, чтобы убедиться, что все чипы правильно подключены и нет видимых капель среды. Затем возобновите поток жидкости, запустив перистальтический насос.

9. Общие анализы конечных точек

  1. Отключение микросхем для анализа конечных точек
    1. Приостановите работу перистальтического насоса, осторожно отсоедините микросхемы от насоса и извлеките держатели корпуса стружки. Перенесите держатель (держатели) корпуса чипа из инкубатора в BSC и освободите чипы.
    2. Аккуратно промойте центральную камеру чипа с открытым верхом средой для культивирования эпителиальных клеток и сосудистый канал питательной средой эндотелия дважды, чтобы удалить клеточный мусор.
    3. Снимите крышку чипа с открытым верхом, чтобы получить доступ к апикальному отсеку чипа с помощью пинцета.
  2. Иммуноокрашивание для флуоресцентной микроскопии
    1. Приступайте к обычной фиксации образца, пермеабилизации и блокировке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании образцы фиксировали в 200 мкл 4% параформальдегида (ПФА) в течение 1 ч с последующим промыванием PBS, пермеабилизацией в 0,1% Triton X-100 в течение 40 мин и блокированием 1% бычьего сывороточного альбумина в течение 1 ч.
    2. Инкубируйте чипы с первичными антителами (таблица материалов) при 4 ° C в течение ночи. а затем дважды промыть эпителиальный и эндотелиальный компартменты чипов 200 мкл PBS. Затем продолжайте прием соответствующих вторичных антител в течение 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте первичные антитела и вторичные антитела в PBS + 1% BSA в разведении 1:100 (первичное антитело) и 1:200 (вторичное антитело).
  3. Иммуногистохимия
    1. Экстрагируют стромальные эквиваленты из основной камеры чипа с открытым верхом с помощью пинцета, собирают их в пробирку объемом 1,5 мл, заполненную 10% нейтральным буферным формалином, и инкубируют не менее 24 часов.
    2. Перенесите фиксированный стромальный эквивалент в тканевый процессор и выполните следующие шаги для достижения оптимального обезвоживания образца.
      1. Погрузите гидрогель в 70% этанол на 90 мин.
      2. Удалите 70% этанол и погрузите гидрогель в 80% этанол на 90 минут.
      3. Удалите 80% этанол и погрузите гидрогель в 95% этанол на 90 минут.
      4. Удалите 95% этанол и погрузите гидрогель в 100% этанол на 90 минут дважды.
      5. Удалите 100% этанол и погрузите гидрогель в раствор ксилола на 120 мин дважды.
      6. Удалите раствор ксилола и инфильтрируйте обработанные стромальные эквиваленты в парафиновом воске в течение 120 мин (~ 2 ч) дважды.
    3. Встраивайте инфильтрированные стромальные эквиваленты в парафиновые блоки для секционирования.
    4. На этом этапе стромальные эквиваленты могут быть разделены на парафиновые блоки с использованием микротома и обработаны в соответствии с традиционными гистологическими методами26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Микропаттернирование поверхности
Микропаттернирование внеклеточного матрикса (ECM) может быть использовано для репликации пространственной конфигурации интерфейса кишечной крипты. Конфигурация чипа с открытым верхом может быть изменена для интеграции микроузорчатых штампов, специально разработанных для имитации естественной топографии границы раздела эпителий толстой кишки и строма (рис. 6A, B) и крипт кишечника в микрометровом масштабе (рис. 6C-E). Обратите внимание, что мы использовали плоскую (не узорчатую) поверхность для моделей кожи, дыхательных путей и альвеол. Клеймо использовалось в этом случае для получения однородной поверхности гидрогеля к эпителиальным клеткам семени. Мы выбрали дизайн, который мог бы имитировать естественную архитектуру слизистой оболочки кишечника человека, состоящую из чередования положительных и отрицательных куполов, имитирующих кишечные крипты.

Модели органов
Мы культивировали и дифференцировали четыре различных эпителия (кожа, альвеолы, дыхательные пути и кишечник) с использованием прототипа Open-Top Chip, чтобы доказать универсальность этой биомиметической платформы. Гистологические срезы чипов органов подтверждают наличие эпителиальных клеток, которые фенотипически отчетливы и репрезентативны: стратифицированный эпителий в случае кожи (рис. 7), псевдостратифицированный столбчатый эпителий в случае дыхательных путей (рис. 8 и дополнительное видео 1), простой плоский эпителий в случае альвеолы (рис. 9), и простой столбчатый эпителий в случае кишечника (рис. 10). Клетки кожи, дыхательных путей и альвеолярные клетки были получены от коммерчески доступных поставщиков (как указано в таблице материалов).

Figure 1
Рисунок 1: Схема чипа с открытым верхом и микрофлюидной установки, использованной в этом исследовании. (А-С) Вид сверху, послойная проекция и 3D-рендеринг, демонстрирующий прототип конструкции чипа с открытым верхом, включающий съемную верхнюю крышку с заключенным микрофлюидным каналом (синий), два полулунных вакуумных канала рядом с культуральной камерой (серый) и нижние спиралевидные эндотелиальные микрофлюидные каналы (пурпурный). (D) Изготовленный по индивидуальному заказу держатель чипа (также называемый «Фермерская система»), включающий держатель корпуса стружки (красная стрелка), перистальтический насос и резервуары (желтая стрелка), расположенные в конфигурации, подходящей для обычного инкубатора клеточных культур. € Пневматический привод, инструмент, который управляет отрицательным давлением, приложенным к вакуумному каналу стружки, который используется для создания циклической механической силы, испытываемой клетками во время дыхания или перистальтики (растяжения). Эта цифра была адаптирована с разрешения Varone et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Технический обзор протокола скин-чип с открытым верхом. (А) Схема, показывающая последовательность действий для получения скин-чипа с открытым верхом и (Б) предоставление ключевого биологического этапа культивирования скин-чипа с открытым верхом. В начальной фазе приготовления чипа мезенхимальные клетки (фибробласты) встраиваются в гель и загружаются в чип с открытым верхом для формирования стромального слоя, который покрывается в течение 2-4 ч и засеивается эпителиальными клетками. После того, как эпителиальные клетки сформировали компактный монослой, они подвергаются воздействию воздуха (ALI). Биологическая система хранится в режиме ALI до тех пор, пока не будет принесена в жертву для анализа на 14-й день. Механическое растяжение может быть применено, когда система находится под потоком и в ALI. Растяжение сохраняется до тех пор, пока ткани не будут принесены в жертву для анализа. Дополнительную информацию о составе среды, конкретных реагентах и типах клеток можно найти в дополнительной таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Технический обзор протокола альвеолы с открытым верхом. (A) Схема, показывающая последовательность действий для подготовки альвеолового чипа с открытым верхом и (B) обеспечение ключевого биологического этапа культивирования альвеолы с открытым верхом. В начальной фазе приготовления чипа мезенхимальные клетки (фибробласты) встраиваются в гель и загружаются в чип с открытым верхом для формирования стромального слоя, который покрывается в течение 2-4 ч и засеивается эпителиальными клетками дыхательных путей в среде, дополненной KIAD (см. Дополнительную таблицу 2). Среда с добавлением EGF поддерживается в течение ~ 4 дней для поддержки роста эпителиальных клеток. Затем эпителий подвергается воздействию воздуха (ALI) в течение ~ 10 дней для достижения полного созревания ткани. Легочные микрососудистые эндотелиальные клетки высевают на 14-й день, а биологическую систему поддерживают в режиме ОПГ и потока до тех пор, пока они не будут принесены в жертву для анализа на 21-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Технический обзор протокола чипа дыхательных путей с открытым верхом. (А) Схема, показывающая последовательность действий по приготовлению чипа из дыхательных путей с открытым верхом и (Б) обеспечение ключевого биологического этапа культивирования чипа из дыхательных путей с открытым верхом. На начальном этапе приготовления чипа мезенхимальные клетки (фибробласты и/или гладкомышечные клетки) встраиваются в гель и загружаются в чип с открытым верхом для формирования стромального слоя, который покрывается в течение 2-4 ч и засеивается эпителиальными клетками в среде, дополненной EGF (см. Дополнительную таблицу 3). Среда с добавлением EGF поддерживается в течение ~ 4 дней для поддержки роста эпителиальных клеток. Затем эпителий подвергается воздействию воздуха (ALI) в течение ~ 10 дней для достижения полного созревания ткани. Легочные микрососудистые эндотелиальные клетки высевают на 14-й день, а биологическую систему поддерживают в режиме ОПГ и потока до тех пор, пока они не будут принесены в жертву для анализа на 21-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Технический обзор протокола кишечного чипа с открытым верхом. (A) Схема, показывающая последовательность действий для приготовления кишечного чипа с открытым верхом и (B) предоставление ключевого биологического этапа культивирования кишечного чипа с открытым верхом. В начальной фазе приготовления чипа мезенхимальные клетки (фибробласты толстой кишки) внедряются в гель и загружаются в Open-Top Chip с образованием стромального слоя, который покрывается в течение 2-4 ч и засеивается фрагментами эпителиальных колоноидов, полученных в результате клинических резекций. Среда для культивирования клеток, включая добавки (ROCK и CHIR, см. Дополнительную таблицу 4), требуется на этапе посева для поддержания жизнеспособности колоноидных клеток и физиологической морфологии. Затем используются различные среды для стимулирования расширения (с 1 по 6 день) и созревания (с 6 по 9 день) эпителия толстой кишки. Микрососудистые эндотелиальные клетки толстой кишки высевают на 6-й день с использованием среды для культивирования эндотелиальных клеток (EGM2 MV), а затем культивируют под потоком с эпителиальной расширяющей средой еще до 10 дней. Эпителий подвергается воздействию ALI с 10-го дня для дальнейшего стимулирования созревания эпителиальных клеток. Механическое растяжение может применяться к системе с 13-го дня и поддерживаться до 16-го дня, когда модель органа приносится в жертву анализу конечной точки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Микропаттерн-тиснение. (A) Вид сбоку и сверху штампа, показывающий микромасштабную текстуру (500 мкм в высоту и 250 мкм в ширину столба-массива), используется для воссоздания интерфейса ткани толстой кишки и верхнего и бокового вида узла штамп-чип, демонстрируя подгонку двух элементов при использовании для отливки поверхности геля. (B) Вид под углом сбоку, показывающий пересечение штампа и чипа. (С-Е) Изображения поверхности геля с микрорисунком с клетками и без них. Масштабные линейки: 200 мкм. Эта цифра была адаптирована с разрешения Varone et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Репрезентативные данные, полученные с помощью скин-чипа с открытым верхом. (А) Схема, показывающая последовательность действий для получения скин-чипа с открытым верхом и обеспечивающая ключевые биологические этапы культивирования скин-чипа с открытым верхом. (B) Флуоресцентное окрашивание цитокератина PCNA 14, цитокератина10, инволюкрина и филлагрина, а также H&E, демонстрирующее зрелый многослойный стратифицированный эпидермис, дифференцированный на чипе. Масштабные линейки: 100 мкм. (C) Вид сверху на скин-чип (масштабные линейки: 5 мм) и поперечное сечение H&E (масштабные линейки: 100 мкм), показывающее присутствие фибробластов внутри дермального слоя. (D) PECAM-1, VE-Cadherin и флуоресцентное окрашивание фон Виллебранда, показывающее дифференцировку микрососудистых эндотелиальных клеток человека, совместно культивируемых в кожном чипе с открытым верхом. Масштабные линейки: 20 мкм. (E) Концептуальный 3D-мультипликационный рендеринг чипа кожи с открытым верхом. Эта цифра была адаптирована с разрешения Varone et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Репрезентативные данные, полученные с помощью чипа дыхательных путей с открытым верхом. (A) Схема, показывающая последовательность действий для подготовки чипа для дыхательных путей с открытым верхом и обеспечивающая ключевой биологический этап культивирования чипа дыхательных путей с открытым верхом. (B) MUC5AC (кубок), α и β-тубулин (реснитчатые клетки), белок Clara Cell 16 (клубные клетки), p63 (базальные/прогениторные клетки) и флуоресцентное окрашивание ZO-1, показывающее зрелый эпителий дыхательных путей. Масштабные линейки: 20 мкм. (C) Фазово-контрастное видео/изображение, показывающее наличие бьющихся ресничек. Масштабные линейки: 50 мкм. (D) окрашивание H&E (масштабные линейки: 20 мкм) и изображение ПЭМ (масштабные линейки: 5 мкм), показывающее зрелый псевдостратифицированный эпителий, дифференцированный на чипе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Репрезентативные данные, полученные с помощью альвеолового чипа с открытым верхом. (A) Схема, показывающая последовательность действий для подготовки альвеолы с открытым верхом и обеспечивающая ключевой биологический этап культивирования альвеолы с открытым верхом. (B) Флуоресцентное окрашивание типа I (HTI-56, AT1-α), типа II (HTII-280, LAMP3, ABCA3, поверхностно-активное вещество (C) и флуоресцентное окрашивание E-кадгерина, показывающее наличие зрелых пневмоцитов на чипе. Масштабные линейки: 20 мкм. (C) Изображение SEM и TEM, показывающее наличие микроворсинок и лизосомальных везикул, свидетельствующих о зрелом альвеолярном фенотипе. Масштабные линейки: 5 мкм. (D) поперечное сечение H&E (масштабные линейки: 5 мкм), подтверждающее наличие плоских плоскоклеточных клеток, соответствующих фенотипу I типа, и кубовидных, булыжниковых клеток, когерентных с фенотипом II типа, и (E), показывающих присутствие фибробластов внутри дермального слоя (масштабные столбцы: 10 мкм). (F) 3D-мультипликационный концептуальный рендеринг альвеолового чипа с открытым верхом. Эта цифра была адаптирована с разрешения Varone et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Репрезентативные данные, полученные с помощью кишечного чипа с открытым верхом. (A) Схема, показывающая последовательность действий для приготовления кишечного чипа с открытым верхом и обеспечивающая ключевой биологический этап культивирования кишечного чипа с открытым верхом. (B) Вид под углом сбоку, показывающий сборку штампа и чипа на этапе литья геля, мультяшную концепцию геля с микрорисунком и фазово-контрастные изображения криптоподобной структуры, нанесенной на поверхность геля и засеянной колоноидами на двух разных высотах. Масштабные линейки: 200 мкм. (C) Флуоресцентное окрашивание муцина 2 и E-кадгерина, показывающее наличие энтероцитов и зрелых бокаловидных клеток на чипе. Масштабные линейки: 200 мкм. (D) Поперечное сечение H&E криптоподобной структуры, показывающее наличие фибробластов внутри дермального слоя и подтверждающее наличие простого столбчатого эпителия. Масштабные линейки: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительное видео 1: Фазово-контрастное видео, показывающее взбивание ресничек. Масштабные линейки: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 1: Сборка микросхемы с открытым верхом. (A) Схема, показывающая трехмерный рендеринг сборки чипа с открытым верхом и мультяшный рендеринг чипа кожи с открытым верхом с выделенными различными биологическими компартментами, включая эпителиальный (синий), кожный (желтый) и сосудистый (красный). (B) Собранная микрофлюидная платформа имеет формат 35 мм x 17 мм, площадь культивирования тканей 0,32см2, микрофлюидный канал с нижней спиралью и крышку камеры с микрофлюидным каналом. (C) Платформа содержит камеру со стенкой, наклоненной под углом 5°, которая имеет диаметр 6 мм на уровне мембраны и 5,7 мм в верхней части стенки камеры PDMS и высоту 4 мм и ширину. Пористая мембрана имеет толщину 50 мкм, а поры - 7 мкм в диаметре. (D) Нижний спиралевидный микрофлюидный канал имеет размеры поперечного сечения 400 мкм (высота) х 600 мкм (ширина). (E) Обзор графика эксперимента и шагов, необходимых для подготовки органного чипа с открытым верхом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Кожа. В таблице представлена сводная информация о ключевых ежедневных шагах, а также о параметрах растяжения и потока, используемых во время трех фаз культуры Open-Top Skin-Chip (рост, пролиферация и дифференциация). В таблице также приведен список материалов, составов сред и инструкции по приготовлению среды, необходимой для этого протокола. Состав трех сред оптимизирован для различных фаз протокола. В частности, Medium I оптимизирован для посева и ранней фазы культивирования кератиноцитов. Среда II оптимизирована для пролиферации и ранней дифференцировки (образования многослойного эпителия). Среда ALI оптимизирована для поддержания кератиноцитов на границе раздела воздух-жидкость до тех пор, пока не будет получен полностью дифференцированный эпидермис. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Альвеолы. В таблице представлена сводная информация об основных ежедневных шагах, а также о параметрах растяжения и потока, используемых во время трех фаз культивирования альвеол с открытым верхом (рост, пролиферация и дифференцировка). В таблице также приведен список материалов, составов сред и инструкции по приготовлению среды, необходимой для этого протокола. Состав двух носителей оптимизирован для различных этапов протокола. Обратите внимание, что добавление добавок (KIAD) в среду для культивирования клеток имеет решающее значение для достижения оптимальной дифференцировки пневмоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 3: Дыхательные пути. В таблице представлена сводка основных ежедневных этапов и параметров растяжения и потока, используемых во время трех фаз культивирования чипов дыхательных путей с открытым верхом (рост, пролиферация и дифференцировка). В таблице также приведен список материалов, рецептура среды и инструкции по приготовлению среды, необходимой для этого протокола. Состав среды оптимизирован для поддержания клеток дыхательных путей на границе раздела воздух-жидкость, что, в свою очередь, индуцирует терминальную дифференцировку и стимулирует выработку слизи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный стол 4: Кишечник. В таблице представлена сводная информация о ключевых ежедневных шагах, а также о параметрах растяжения и потока, используемых во время трех фаз культивирования кишечного чипа с открытым верхом (рост, пролиферация и дифференцировка). В таблице также приведен список материалов, составов сред и инструкции по приготовлению среды, необходимой для этого протокола. Композиции обеих сред оптимизированы для различных этапов протокола. В частности, расширяющая среда, дополненная ингибиторами CHIR и ROCK, оптимизирована для посева и ранней фазы культуры, поскольку она способствует выживанию и росту фрагмента органоида толстой кишки в виде монослоя. Расширяющая среда оптимизирована для пролиферации и ранней дифференцировки монослоя эпителия. Дифференциирующая среда оптимизирована для терминальной дифференцировки монослоя эпителия перед воздействием на границу раздела воздух-жидкость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Чип с открытым верхом представляет собой платформу для исследования сложного клеточного взаимодействия, происходящего между эндотелием, стромой и эпителием в контролируемой микросреде в режиме реального времени. Эта технология предлагает критические преимущества по сравнению с обычными органотипическими и органоидными культурами, такие как интеграция физических и биохимических сигналов, которые имеют отношение к воссозданию микроокружения тканей человека, включая сдвиг жидкости (поток), циклическое растяжение и реконструкцию топографии поверхности эпителия, достигаемую с помощью микропаттернинга. Клетки человека, растущие на этой платформе, действуют в синергии, повторяя тканеспецифические функции, которые могут быть проанализированы с помощью обычных методов, включая иммунную гистохимию и биохимические анализы с использованием выходных жидкостей (или стоков) из верхнего и/или нижнего отсеков. Современная конструкция обеспечивает легкий доступ к эпителиальному слою, где клетки растут в непосредственном контакте с тканеспецифическими фибробластами и другими стромальными клетками, имитируя многоклеточную архитектуру эпителиальных тканей. Примечательно, что прототип чипа с открытым верхом предлагает жизнеспособное решение общих проблем, связанных с использованием других платформ «орган-на-чипе». Несмотря на то, что он позволяет включать несколько различных типов клеток в стромальный компартмент, что приводит к созданию очень сложных 3D-тканей, он также позволяет легко извлекать установленные тканевые конструкции из чипового устройства для последующего анализа, включая обычное окрашивание H&E.

Текущий дизайн имеет несколько ограничений. Например, эластичная мембрана, расположенная между сосудистым микроканалом и стромальным компартментом (гидрогелем) прототипа чипа с открытым верхом, значительно толще (≈ 50 мкм против ≈ 1 мкм), чем интерстициальное пространство, отделяющее эндотелиальные ткани от стромы в нативных органах человека. Хотя эластичная мембрана не представляет собой физического барьера для диффузии больших молекул, таких как гормоны и другие паракринные факторы, которые опосредуют межклеточные перекрестные помехи между тканями, она может ограничивать прямые межклеточные взаимодействия и миграцию клеток из сосудистого в стромальный компартмент. Наконец, прототип чипа с открытым верхом изготовлен из PDMS, который, как известно, поглощает огромное количество гидрофобных соединений. Это ограничение характерно для многих платформ на основе PDMS, которые могут быть серьезным препятствием в приложениях, предназначенных для тестирования фармакодинамики и фармакокинетики малых терапевтических соединений27.

Одна из основных проблем интеграции 3D-гидрогелей в микрофлюидное устройство, такое как чип с открытым верхом, заключается в том, что PDMS не обеспечивает оптимальный субстрат для связывания белков или клеток человека. Таким образом, химическая функционализация поверхности PDMS является одним из важнейших шагов в этом протоколе, который необходим для обеспечения надлежащего покрытия ECM и адгезии гидрогеля к гелевой камере модели Open-Top Chip. Для достижения оптимальных результатов сшивающий агент в растворе ER1 всегда должен быть защищен от прямого воздействия света. Важным показателем реактивного состояния сшивающего агента является его цвет. Сшивающий агент в ER1, по сути, претерпевает цветовой переход от ярко-оранжевого до темно-коричневого при окислении. Цветовой переход можно использовать в качестве индикатора после этапа УФ-активации, чтобы проверить, эффективно ли раствор вступил в реакцию с поверхностью PDMS. Во время приготовления раствора сшивающего агента следует контролировать цветовой переход, чтобы гарантировать, что случайное воздействие прямого света не приведет к фотоотбеливанию химического соединения в растворе. Чтобы защитить раствор сшивающего агента и избежать нежелательного фотообесцвечивания, мы рекомендуем обернуть алюминиевую фольгу размером примерно 15 см x 15 см вокруг конической трубки объемом 15 мл или использовать янтарную трубку, доступную на рынке. Использование ER1 позволяет получить простой и эффективный метод достижения быстрой функционализации поверхностей PDMS; однако есть и другие молекулы, которые можно использовать вместо ER1. Например, химический сшивающий агент 3-аминопропилтриметоксисилан (APTMES) не так светочувствителен, как ER1, и его можно использовать для достижения аналогичных результатов с помощью нескольких дополнительных шагов, как мы ранее описывали в другом месте28,29. Независимо от выбранной молекулы, одним из основных ограничений при работе с химическим сшивающим агентом является наличие остатков, которые могут вызывать цитотоксичность. После реакции активации важно промыть микрофлюидные поверхности обильными объемами моющего раствора.

Поскольку пузырьки воздуха имеют тенденцию образовываться и расти в гидрофобных границах раздела микросхем, трубок и соединителей, важно оценить, свободен ли микрофлюидный тракт от пузырьков воздуха, прежде чем начинать поток жидкости. Пузырьки действительно могут нарушить поток и даже убить клетки, когда чипы подключены к потоку. Заливка микрофлюидных компонентов перед запуском потока жидкости снизит риск образования пузырьков воздуха и поможет достичь оптимальных и воспроизводимых результатов. Если цикл заливки, описанный в этом протоколе, был недостаточным, промывка микрофлюидных трубок этанолом (5 мин), а затем HBSS (20 мин) еще больше снизит риск образования пузырьков воздуха внутри жидкостных соединителей.

Несмотря на свои ограничения, PDMS обладает редким сочетанием химических свойств, которое позволило изготавливать высокобиосовместимые, прозрачные и эластичные микрофлюидные устройства. Все эти свойства сделали PDMS наиболее широко применяемым материалом для создания моделей Organ-on-Chip за последнее десятилетие. Последние достижения в области материаловедения и химической инженерии30,31 позволяют предположить, что компонент PDMS этой платформы может быть заменен в ближайшем будущем новыми синтетическими полимерами или биоматериалами. В случае успешного достижения это может позволить повторить тканеспецифические свойства, включая пористость, состав ECM интерстициального пространства, обеспечивающий более близкую мимикрию к нативным тканям человека, и более продвинутые модели для фармакологических исследований. Мы ожидаем, что будущая эволюция дизайна чипов с открытым верхом позволит моделировать ткани и органы человека с беспрецедентным уровнем детализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют о следующих финансовых интересах/личных отношениях, которые могут рассматриваться как потенциальные конкурирующие интересы: Вароне Антонио является бывшим сотрудником Emulate Inc. и может владеть долей участия в Emulate.

Acknowledgments

Никакой

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x EMEM  Lonza 12-684F Medium; Stroma
18 Gauge needle MicroGroup 316H18RW Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard 
19 Gauge needle MicroGroup 316H19RW Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT  Cole-Palmer  EW-95723-12 Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes   -   -  For surface sterilization 
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) Sigma B7880 Medium supplement 
A-83-01  Tocris  2939
Adenine Sigma A9795
Advanced DMEM/F12  Thermo 12634010
Airway Epithelial Cells Lifeline Cell Technology FC-0016
Aluminum foil   -   -   -
Alveolar cells Cell Biologics H6621
Anti-ABCA3   ABCAM  ab24751  Mouse monoclonal antibody [3C9] 
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647  ABCAM  ab215225   Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]  
Anti-Aquaporin5  ABCAM  ab92320  Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] 
Anti-beta IV Tubulin   ABCAM  ab11315  Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] 
Anti-CD31 (PECAM-1)  ABCAM  ab9498  Mouse monoclonal [JC/70A] antibody  
Anti-CK5   ABCAM  ab75869  Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] 
Anti-Cytokeratin 10   ThermoFisher  MA5-13705  Mouse monoclonal antibody (DE-K10) 
Anti-Cytokeratin 14   ABCAM  ab7800  Mouse monoclonal antibody 
Anti-E-Cadherin   ABCAM  ab1416   Mouse monoclonal antibody 
Anti-Filaggrin   ThermoFisher  PA5-79267  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-HTI-56  Terrace Biotech  TB-29AHT1-56   Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-HTII-280  Terrace Biotech  TB-27AHT2-280  Mouse monoclonal antibody (IgM) 
Anti-Involucrin   ThermoFisher  MA5-11803  Mouse monoclonal antibody (SY5) 
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ   Biolengend  618902  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Ki67   ABCAM  ab8191  Mouse monoclonal antibody [B126.1] 
Anti-LAMP3   ABCAM  ab111090  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Mature SP-B  Seven Hill  WRAB-48604  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-MUC5AC   ThermoFisher  PA5-34612  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Mucin-2  SantaCruz Biotechnology sc-7314 Mouse monoclonal antibody (IgG1) 
Anti-p63   Dako  GA662  Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 
Anti-PCNA   ThermoFisher  PA5-32541  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-Podoplanin (AT-1α)   ABCAM  ab128994  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B  ABCAM  ab40876  Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Surfactant C    Seven Hill   WRAB-9337   Rabbit polyclonal antibody 
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1  Hycult Biotech  HM2178  Mouse monoclonal antibody [AY1E6] 
Anti-VE-cadherin   ABCAM  ab33168  Rabbit polyclonal antibody  
Anti-ZO-1   ThermoFisher  33-9100  Mouse monoclonal antibody [1A12] 
Ascorbic acid Sigma A4544
Aspirating pipettes  Corning / Falcon  357558  2 mL, polystyrene, individually wrapped 
Aspirating tips   -   -  Sterile (autoclaved) 
B27 Thermo 17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution   ThermoFisher  37525  Blocker agent 
Calcium Chloride Sigma C7902
CHIR 99021 Tocris 4423
Collagen I Advanced Biomatrix 5133 10 mg/mL (Stroma)
Collagen I  Advanced BioMatrix 5005 3 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IV Sigma  C5533
Collagen-IV Sigma  C5533-5MG  Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL 
Colonic Fibroblasts  Cell Biologics  H6231
Colonic microvascular endothelial cells  Cell Biologics H6203 
Conical tubes    -   -  15 mL and 50 mL polypropylene, sterile 
Crosslinker (ER-1)  Emulate  10461 5 mg powder 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)   ThermoFisher  D3571  DNA probe 
Dermal fibroblasts ATCC PCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cells ATCC CRL-3243
Dexamethasone Sigma D4902
DMEM ThermoFisher 11054020
DMEM/F-12  GIBCO  11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX   GIBCO  10565-018  Basal medium for ALI medium 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)   ABCAM  ab150105  Donkey Anti-Mouse secondary antibody  
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)   ABCAM  ab175472  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)   ABCAM  ab150107  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)   ABCAM   ab150073  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)   ABCAM  ab175470  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)   ABCAM  ab150075  Donkey Anti-Mouse secondary antibody 
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+)  Corning  21-031-CV  1x 
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli PromoCell C-60170 Medium supplement 
F-12 Ham’s Invitrogen  21700-108 For vascular ECM
FibriCol  Advanced BioMatrix  5133-20ML  Collagen-I solution (10 mg/mL)
Fibronectin Corning 356008
Fibronectin, Human, Natural,   Corning  47743-654  human plasma fibronectin 
Fine-tip precision tweezers  Aven 18056USA  Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
Glutamax Invitrogen  21700-108
Glutamax  Invitrogen  35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)   ABCAM  ab150080  Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)   ABCAM  ab150115  Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)   ABCAM  ab6785  Goat Anti-Mouse secondary antibody  
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568   ThermoFisher  A-21124  Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody 
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488   ThermoFisher  A-21042  Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody 
Handheld vacuum aspirator  Corning  4930   - 
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS)  GE Healthcare Life Sciences SH30066.03
Hemocytometer   -   -  - 
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma H3149
HEPES Thermo 15630080
Human [Leu15] - Gastrin  Sigma G9145
Human colonoids Obtained from clinical resections Obtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein  Thermo PHG0311L
human epithelial growth factor  Thermo  PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)   GE Healthcare  SH30066.02HI   Sterile FBS heat-inactivated 
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma H4881
Hydrocortisone  PromoCell   C-64420  Medium supplement  
Ice bucket   -   -   - 
Ismatec IPC-N  Cole-Palmer EW-78000-41 Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITES BioWhittaker 17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK PromoCell C-63821
Keratinocytes ATCC PCS-200-010
Laminin  Biolamina CT521-0501 
Laminin, 521 CTG (CT521)  Biolamina   CT521-0501  human recombinant laminin 521    
Lung Fibroblast Cell Biologics H6013
Lung Fibroblast Lifeline Cell Technology FC-0049
Lung microvascular endothelial cells Lonza CC-2527
Lung smooth muscle cells Lifeline Cell Technology FC-0046
Manual counter   -   -   -
Masterflex (TPE) Transfer Tubing  Cole-Palmer FV-96880-02 PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol red Thermo  11043023
Microcentrifuge tube   -    -   1.5 mL, sterile 
Microscope (with camera)   -   -  For bright-field imaging 
N2 Sigma 17502001
N-acetyl cysteine Sigma A5099
Noggin (HEK293T conditioned medium) Sigma N17001
Normal Goat Serum   ThermoFisher  50062Z  Blocking solution  
O-phosphosrylethanolamine  Sigma P0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)   EMS  15710  Fixing agent 
Penicillin Streptomycin GIBCO 15140122
Penicillin-streptomycin  Sigma  P4333  10,000 U/mL; 10 mg/mL 
Pipette tips    -   -  P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette  Gilson   F167380  P20, P200, and P1000 
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) AMSBIO (or Thermo) N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides   Sigma  P0425  Glass slides 
Primocin InvivoGen ant-pm-1
Progesterone Sigma P8783
ProLong Gold   ThermoFisher  P36931  Antifade Mountant with DAPI 
Retinoic Acid  Sigma R2625
ROCK inhibitor (Y27632) Tocris TB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium) Sigma SCC111
SAGM SingleQuots supplements  Lonza CC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM  Lonza  CC-4124  Medium supplements 
SB2001190  Tocris  1264/10
Serological pipettes   -   -  2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile 
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) Lonza  CC-4124 
Solvent Buffer (ER-2)  Emulate  10462 25 mL bottle 
Steriflip-HV  Millipore SE1M003M00 Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes Thermo 103 Sterile, 1 per 6 chips 
T25 flasks   -   -   -
T75 flasks   -   -   - 
Tri-iodothyronine Sigma T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)   Sigma  T8787  Permeabilization agent 
Trypan blue  Sigma  93595  0.4% solution 
TrypEE solution  Sigma  12604013  Cell detaching solution 
TWEEN-20  Sigma  P2287  Permeabilization agent 
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) VWR 21474-598 UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up   -   -  Minimum pressure: -70 kPa 
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli PromoCell C-64420
VEGF-165   PromoCell   C-64420  Medium supplement 
Von Willebrand Factor conjugated FITC   ABCAM  ab8822  Sheep polyclonal antibody 
Water bath (or beads)   -   -  Set to 37 °C 
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) ATCC CRL-2647

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
  2. Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
  3. Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
  4. Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
  5. MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
  6. Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  7. Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
  8. Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
  9. Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
  10. Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
  11. Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
  12. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  13. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  14. Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
  15. Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
  16. Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
  17. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  18. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  19. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
  20. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  21. Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
  22. Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
  23. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  24. Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
  25. Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  26. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking. 1897, 253-268 (2019).
  27. Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
  28. Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
  29. Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  30. Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
  31. Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 192
Восстановление цитоархитектии и функции эпителиальных тканей человека на органе-чипе с открытым верхом
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Antonio, V., Panchal, A., Kasendra,… More

Antonio, V., Panchal, A., Kasendra, M., Riccardo, B. Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip. J. Vis. Exp. (192), e64633, doi:10.3791/64633 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter