Summary
Bu protokol, Primer dokuların (deri, alveolus, hava yolu ve bağırsak) tam kalınlıkta çip üstü organ kültürlerinin başarılı bir şekilde kurulması ve olgunlaşması için Open-Top Organ-Chip'in yeteneklerini ve temel kültür modalitelerini açıklamakta ve insan epitelyal/mezenkimal ve vasküler niş arayüzünün farklı fonksiyonel yönlerini in vitro olarak araştırma fırsatı sunmaktadır.
Abstract
Neredeyse tüm insan organları, üç boyutlu (3B) yapılar halinde organize edilmiş, sıkıca bağlanmış hücrelerin bir veya daha fazla katmanından oluşan epitel dokularıyla kaplıdır. Epitelin temel işlevlerinden biri, altı çizili dokuları fiziksel ve kimyasal hakaretlere ve enfeksiyöz ajanlara karşı koruyan bariyerlerin oluşmasıdır. Ek olarak, epitel, besinlerin, hormonların ve diğer sinyal moleküllerinin taşınmasına aracılık eder ve genellikle organ içindeki hücre konumlandırmasını ve bölümlenmesini yönlendiren biyokimyasal gradyanlar oluşturur. Organ yapısını ve fonksiyonunu belirlemedeki merkezi rolleri nedeniyle, epitel, her zaman hayvan modelleri tarafından yakalanmayan birçok insan hastalığı için önemli terapötik hedeflerdir. Türler arası bariz farklılıkların yanı sıra, hayvanlarda epitelin bariyer fonksiyonu ve taşıma özellikleri üzerine araştırma çalışmaları yapmak, canlı bir sistemde bu dokulara erişmenin zorluğu ile daha da artmaktadır. İki boyutlu (2B) insan hücre kültürleri temel bilimsel soruları cevaplamak için yararlı olsa da, genellikle zayıf in vivo tahminler verirler. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, son on yılda, çip üzerinde organlar olarak bilinen çok sayıda mikro mühendislik biyomimetik platform, geleneksel in vitro ve hayvan testlerine umut verici bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Burada, deri, akciğerler ve bağırsaklar dahil olmak üzere organa özgü epitel dokularını modellemek için tasarlanmış bir platform olan Open-Top Organ Chip'i (veya Open-Top Chip) açıklıyoruz. Bu çip, dokuya özgü fibroblastları ve endotel hücrelerini mekanik olarak aktif bir sisteme dahil ederek bir 3D stromal bileşeni yeniden oluşturma yeteneği de dahil olmak üzere, epitel dokularının çok hücreli mimarisini ve işlevini yeniden oluşturmak için yeni fırsatlar sunmaktadır. Bu Open-Top Chip, epitelyal/mezenkimal ve vasküler etkileşimleri tek hücrelerden çok katmanlı doku yapılarına kadar çoklu çözünürlük ölçeklerinde incelemek için benzeri görülmemiş bir araç sağlar, böylece epitelize organların hücreler arası çapraz konuşmasının sağlık ve hastalıkta moleküler diseksiyonuna izin verir.
Introduction
Tarihsel olarak, bilim adamları ilaç keşfi için klinik öncesi hayvan testlerine güvenmişlerdir, ancak insan sonuçlarıyla zayıf korelasyon nedeniyle bu yöntemlerin giderek artan bir kısmı sorgulanmıştır1. Hayvan deneylerini Değiştirmek, Azaltmak ve İyileştirmek için "3R" ilkelerinin uygulanması, bilim insanlarını klinik öncesi ilaç ve kimyasal toksikoloji risk değerlendirmesini desteklemek için yeni in vitro alternatif yöntemler bulmaya çağırmaktadır2. Bununla birlikte, bugüne kadar geliştirilen birçok in vitro model, insan canlı organlarının dinamik doğasını özetlemek için gerekli biyolojik mimariden, hücresel karmaşıklıktan ve mekanik ortamdan yoksundur 3,4.
Geleneksel in vitro preklinik sistemler tipik olarak sert bir plastik yüzey üzerinde yetiştirilen insan hücrelerinin 2D monokültürlerini kullanır. Bu yöntemler, basit mekanik çalışmaların yürütülmesi için bir araç sağlar ve ilaç adaylarının hızlı bir şekilde taranmasını sağlar. Nispeten düşük maliyetleri ve yüksek sağlamlıkları nedeniyle, 2D modeller genellikle otomatik yüksek verimli sistemlerle eşleştirilir ve ilaç geliştirme sürecinin erken aşamasında potansiyel ilaç adaylarının hızlı bir şekilde tanımlanması için kullanılır 5,6. Bununla birlikte, bu tür 2D modeller, gelişimlerinin klinik öncesi aşamasında ilaç güvenliği ve etkinliğinin doğru tahminleri için gerekli olan terapötik adaylara doku seviyesi, organ düzeyinde veya sistemik yanıtları modellemek için translasyonel bir yaklaşım sağlamaz. Düz hücre kültürleri, karmaşık çok hücreli etkileşim, biyomekanik özellikler ve insan dokularının üç boyutlu (3B) mimarisi dahil olmak üzere doğal doku mikro ortamını özetlemez7. Düz bir yüzeyde büyüyen hücreler genellikle olgun bir fenotip kazanmazlar ve bu nedenle doğal dokuda olduğu gibi farmakolojik uyaranlara cevap veremezler. Örneğin, in vitro olarak yetiştirilen birincil insan alveoler epitel hücreleri skuamöz bir fenotip sergiler ve sürfaktan proteinleri C ve B (SP-C ve SP-B)8 dahil olmak üzere anahtar fenotipik belirteçleri kaybeder. Yetersiz farklılaşmaya ek olarak, birincil hücreler sıklıkla in vitro biyolojik stresörlere karşı duyarsız hale gelir, çünkü doku iltihabı ile ilişkili bazı biyokimyasal yollar fonksiyonel olmayan hale gelir9. Bu tür hücre fonksiyon kaybı, öncelikle sert substratların yanı sıra akciğer fibroblastları ve düz kas hücreleri gibi dokuya özgü stromal hücreler tarafından doğal olarak salınan çözünür faktörlerin eksikliği ile ilişkili görünmektedir10,11.
Kemo-fiziksel ve biyolojik karmaşıklık eksikliğinin in vitro hücrelerin fizyolojik davranışını sınırladığını anlamak, vücut dışındaki insan dokularının karmaşıklığını daha iyi yakaladığı kanıtlanmış daha sofistike çok hücreli modellerin geliştirilmesini teşvik etmiştir12,13. 1970'lerin başında ilk ko-kültür modellerinin oluşturulmasından buyana14, sentetik ve doğal hidrojellerin piyasaya sürülmesi, doğal doku mikro ortamlarını taklit etme yeteneğini önemli ölçüde geliştirmiş ve hücresel farklılaşmayı yönlendirmek, hücrelerin doku benzeri yapılara kendi kendini organize etmesine rehberlik etmek ve doğal doku fonksiyonlarının restorasyonu için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir15,16. Örneğin, uygun 3D iskelede yetiştirildiğinde, insan hücreleri sferoidler veya organoidler gibi fonksiyonel yapılara kendi kendine düzenleyebilir, kök hücre belirteçlerini eksprese edebilir ve kendini yenileyebilir17. Buna karşılık, insan hücreleri (kök hücreler dahil), geleneksel 2D substratlar üzerinde yetiştirildiğinde, birkaç pasajdan sonra hızla yaşlanır ve yaşlanmaya uğrar18. Ek olarak, hidrojeller gözeneklilik, gözenek boyutu, lif kalınlığı, viskoelastisite, topografya ve sertlik gibi spesifik doku özelliklerine uyacak şekilde "uyarlanabilir" veya fizyolojik veya patolojik koşulların öykünmesini sağlayan doku kaynaklı hücresel bileşenler ve / veya biyoaktif moleküller ile daha fazla mühendislik yapılabilir19,20. İlaç testi için muazzam potansiyellerine rağmen, farmasötik araştırmalarda kullanılan 3D hidrojel bazlı modeller, in vivo dokuların karmaşık sitomimarisini tam olarak özetlememektedir ve hidrostatik basınç, siklik gerilme ve sıvı makası21 dahil olmak üzere normalde insan vücudunda bulunan önemli hemodinamik ve mekanik uyaranlardan yoksundur.
Çip üzerinde organlar (OOC'ler) gibi mikrofizyolojik sistemler (MPS'ler) son zamanlarda in vitro22,23 karmaşık fizyolojik yanıtları yakalayabilen araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Bu modeller genellikle canlı organların dinamik mikro ortamının modellenmesini sağlayan mikroakışkan platformların kullanımını kullanır.
Karmaşık insan epitel dokusunun Open-Top Chip modelini oluşturmak için 3D doku biyomühendisliği ve mekanobiyoloji ilkelerini birleştirdik. Bu, epitel dokularının çok hücreli ve dinamik mikro ortamını yakından özetlememize izin verdi. Bu, canlı organlarda doğal olarak bulunan, ancak geleneksel in vitro modeller tarafından sıklıkla ihmal edilen dokuya özgü biyokimyasal ve biyomekanik ipuçlarını içerir24. Üstü Açık Çip iki bölmeden oluşur: bir vasküler bölme (Şekil 1A) ve gözenekli bir zarla ayrılmış bir stromal bölme (Şekil 1B), iki oda arasında besin maddelerinin difüzyonuna izin verir (Şekil 1C). Vasküler bölme, fizyolojik kayma stresini özetlemek için sürekli sıvı akışına maruz kalırken, stromal odanın gerilebilir tasarımı, solunum hareketleri veya bağırsak peristalsisi ile ilişkili mekanik gerilmenin modellenmesine izin verir. Stromal bölme, dokuya özgü fibroblastların fizyolojik büyümesini desteklemek için tasarlanmış ayarlanabilir 3D hidrojel iskelesini barındırır. Bir hava-sıvı arayüzünün kurulmasını kolaylaştıran çıkarılabilir bir kapağa sahiptir, bu durum mukozal dokuların insan fizyolojisinin daha fazla öykünmesine ve ayrıca ilaçların doğrudan epitel tabakasına uygulanması için dokuya doğrudan erişime izin veren bir durumdur. Ek Şekil 1, Boyutlar ve biyolojik bölmeler (Ek Şekil 1A-D) dahil olmak üzere Üstü Açık Çip tasarımının bazı önemli bileşenlerini ve bu protokolde açıklanan ana teknik adımları (Ek Şekil 1E) yakalar.
Üstü Açık Çipin perfüzyonu, programlanabilir bir peristaltik pompa ile sağlanır (Şekil 1D). Peristaltik pompa kurulumu, 12 Üstü Açık Talaş'ın aynı anda perfüze edilmesini sağlar. Çoğu inkübatör, inkübatör başına 24 talaşa kadar kültür sağlayan iki kuruluma ev sahipliği yapabilir. Mekanik germe, özel yapım programlanabilir bir vakum basınç regülatörü kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 1E). Dijital-analog dönüştürücü tarafından elektronik olarak kontrol edilen bir elektro-pnömatik vakum regülatöründen oluşur. Başka bir deyişle, elektro-pnömatik vakum regülatörü, kullanıcı tarafından belirlenen bir genlik ve frekansa sahip bir sinüzoidal vakum profili oluşturur. %0 ila %15 arasında değişen döngüsel gerinim, Üstü Açık Çipin vakum kanalına 0 ila -90 kPa arasında değişen bir genlikte ve 0,2 Hz frekansında negatif basınç uygulanarak üretilir. Daha önce kabul edilen ve diğer makalelerde açıklanan ticari olarak temin edilebilen Flexcell Gerinim Ünitesine eşdeğer ısmarlama bir sistemdir25. Örneğin, akciğerin solunum hareketi veya bağırsağın peristalsisi ile ilişkili mekanik doku deformasyonunu taklit etmek için, pnömatik aktüatör, büyüklüğü ve genliği, insan hücrelerinin doğal dokularında yaşadıkları fizyolojik gerinim ve frekans seviyesine uyacak şekilde ayarlanabilen sinüzoidal vakum / gerinim dalgaları uygular.
Burada, prototip Open-Top Chip platformunda organotipik epitel eşdeğerlerinin mühendisliği ve kültürü için verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklıyoruz. Deri, alveolus, hava yolu ve kolon gibi karmaşık organ modellerinin oluşturulmasına izin verirken, vasküler sıvı akışını ve mekanik germeyi entegre eder. Karmaşık epitel modelleri oluşturmak için doku mühendisliği ilkelerini uygularken göz önünde bulundurulması gereken temel teknik hususları özetleyeceğiz. Mevcut tasarımın avantajlarını ve olası sınırlamalarını tartışacağız.
Akış ve gerilme parametreleri de dahil olmak üzere doku ve organ olgunlaşmasını sağlamak için kullanılan ana adımlara genel bir bakış aşağıda bildirilmiştir: Cilt için Şekil 2, alveolus için Şekil 3, hava yolu için Şekil 4 ve bağırsak için Şekil 5. Farklı organ modellerinin kültürlenmesinde kullanılan ortam bileşimi ve reaktifler ile ilgili ek bilgiler ek tablolarda yer almaktadır (Cilt için Ek Tablo 1; Alveolus için Ek Tablo 2; Hava yolu için Ek Tablo 3 ve bağırsak için Ek Tablo 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan kolonoidleri, Cincinnati Çocuk Hastanesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC 2017-2011) yönergelerine uygun olarak bağırsak rezeksiyonlarından elde edildi.
1. Yüzey aktivasyonu
- Aktivasyon tamponunun hazırlanması
- Çapraz bağlayıcı ve çözücü tampon reaktiflerini biyogüvenlik kabininin (BSC) altına yerleştirin ve kullanmadan önce 10 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) dengelenmelerini sağlayın.
- Crosslinker çözeltisini doğrudan ışığa maruz kalmaktan korumak için steril ışık geçirimsiz bir kap veya alüminyum folyoya sarılmış şeffaf bir 15 mL konik tüp kullanarak çözücü tamponunun 5 mL'sinde 5 mg çapraz bağlayıcıyı yeniden oluşturun.
- Tüm kümeleri çıkarmak için çözeltiyi 1 dakika boyunca vorteksleyin ve ardından çapraz bağlayıcı çözeltisinin 50 μL'sini doğrudan çipin alt kanalına ve 150 μL'sini üstü açık odaya pipetin.
- Bir aspiratör kullanarak çipin yüzeyindeki fazla çapraz bağlama solüsyonunu temizleyin. Ardından, kalan hava kabarcığını çıkarmak için 50 μL çapraz bağlama çözeltisini doğrudan çipin alt kanalına ve 150 μL'lik çapraz bağlama çözeltisini açık bölmeye pipetin.
- UV çapraz bağlama makinesi ile aktivasyon
- Kapağı BSC'nin altındaki çipten yavaşça çıkarın ve steril bir kapta saklayın.
- Çapraz bağlayıcı çözeltisini içeren talaşları bir Petri kabına aktarın, kontaminasyonu önlemek için Petri kabını kapatın ve kabı talaşlarla birlikte UV çapraz bağlama makinesinin altına yerleştirin.
NOT: UV ışınlarına maruz kalmayı en üst düzeye çıkarmak için Petri kabının kapağını çıkarın. - UV çapraz bağlama makinesini 100 μJ/cm2 yoğunlukta 365 nm tepe dalga boyuna ayarlayın ve UV ışığını 20 dakika boyunca açın.
NOT: 20 dakikalık UV işleminden sonra, çapraz bağlayıcı çözeltisi daha koyu (kahverengi) görünecektir. - Talaşları BSC'nin altına geri getirin ve oksitlenmiş çapraz bağlayıcı çözeltisini aspire edin. Daha sonra, tüm talaşları çözücü tamponla üç kez durulayın ve polidimetilsiloksan (PDMS) yüzeyinin kimyasal işlevini tamamlamak için talaşların BSC altında 5-10 dakika kurumasını bekleyin.
2. Stroma eşdeğerinin hazırlanması
- 10x rekonstrüksiyon tamponunun hazırlanması (100 mL)
- 2.2 g sodyum bikarbonat, çift damıtılmış suda 75 mL 0.067 M NaOH içinde çözülür.
- 4.76 g HEPES ekleyin ve çift damıtılmış su kullanarak hacmi 100 mL'ye getirin.
- BSC altındaki çözeltiyi 0,22 μm membranlı tek kullanımlık steril bir şişe üstü filtre kullanarak steril filtreleyin.
NOT: Çözelti, 4 °C'de saklandığında yaklaşık 6 ay boyunca stabildir.
- Ön jel çözelti hacminin tahmini
- Deney için gereken ön jel çözeltisinin miktarını tahmin etmek için deney için gereken talaş sayısını 150 μL (merkezi üstü açık odanın iç hacmi) ile çarpın:
Gerekli hacim = (Çip sayısı x 150) μL - Kollajen ön jel çözeltisini buz üzerinde karıştırarak hazırlayın: Tercih edilen hücreleri içeren 1 hacim 10x EMEM, 1 hacim 10x rekonstrüksiyon tamponu (bkz. adım 2.1), 8 hacim kollajen I çözeltisi (10 mg / mL) ve her bir mg kollajen I için 1 μL 1 N NaOH çözeltisi.
NOT: Deneysel hataları hesaba katmak için fazladan +%15 hacim hazırlanması önerilir; Bölüm 2.2'de açıklanan örnek, 12 talaş ve ekstra% 15'lik bir hacim için yeterli ön jel çözeltisi hazırlamak için ayrıntılı bir adım adım prosedür sağlar.
- Deney için gereken ön jel çözeltisinin miktarını tahmin etmek için deney için gereken talaş sayısını 150 μL (merkezi üstü açık odanın iç hacmi) ile çarpın:
- Stroma eşdeğeri için ön jel çözeltisinin hazırlanması (12 cips için)
- Buz üzerinde BSC altında aşağıdaki çözümleri getirin: 10x EMEM; 10x Rekonstrüksiyon tamponu (bkz. adım 2.1); Kollajen I çözeltisi (10 mg / mL); ve Steril 1 N NaOH çözeltisi.
- Kültür dokusuna özgü mezenkimal hücreler, sağlayıcılar tarafından yönlendirildiği şekilde% 80-90 oranında birleşir ve daha sonra hücre sağlayıcı tarafından önerilen tripsin veya diğer yöntemleri kullanarak hücreleri ayrıştırır. Hücreleri 24 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleme yoluyla bir pelet içinde toplayın.
- Hücre peletini 225 μL buz gibi soğuk 10x EMEM'de yeniden askıya alın ve 225 μL buz gibi soğuk 10x rekonstrüksiyon tamponu ekleyin (bkz. adım 2.1). Çözeltiyi yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve ardından 1.800 μL buz gibi soğuk kollajen I çözeltisi ekleyin.
- 5-6 kez yukarı ve aşağı pipet yapın, buzdayken ön jel çözeltisini karıştırmak için kabarcıklardan kaçının.
- Stroma eşdeğerinin çip üzerine dahil edilmesi (12 çip için)
- Ön jel çözeltisini 18 μL 1 N NaOH ile nötralize edin. 5-6 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın ve ardından 150 μL hücre yüklü hidrojeli Üstü Açık Çipin merkezi odasına pipetleyerek kabarcıkları önleyin.
NOT: Mikro modelleme gerekiyorsa, lütfen bir sonraki adıma geçin (bölüm 3). - Cipsleri, her Petri kabında 2 mL steril ddH 2 O ile doldurulmuş bir santrifüj tüpü kapağı da dahil olmak üzere ayrı Petri kapları halinde gruplandırın ve inkübatördeki Petri kaplarını 37 ° C,% 5 CO2'deinkübe edin.
NOT: 90 dakika sonra, hücre yüklü hidrojel tamamen polimerize olacaktır.
- Ön jel çözeltisini 18 μL 1 N NaOH ile nötralize edin. 5-6 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın ve ardından 150 μL hücre yüklü hidrojeli Üstü Açık Çipin merkezi odasına pipetleyerek kabarcıkları önleyin.
3. Yüzey mikro desenleme (isteğe bağlı)
- 3D baskılı pullar kullanarak nötralize edilmiş kollajen hidrojelini (hala sıvı halinde) pipetledikten sonra stromal hidrojelin yüzey mikrodesenlemesini gerçekleştirin.
NOT: 3D baskılı pullar, daha önce24'te açıklandığı gibi çeşitli özelleştirilebilir tasarımlarda elde edilebilir. - Nötralize edilmiş kollajen I ön jel çözeltisinin 20 μL'lik pipeti, steril 3D baskılı bir damganın desenli yüzeyine yerleştirin ve stromal hidrojel hala sıvı formdayken damgayı üstü açık odanın içine (üste) yerleştirin.
- Bir aspiratör (veya pipet) kullanarak üstü açık odanın üstünden dökülebilecek hidrojel kalıntılarını temizleyin. Tüm cipsleri ayrı Petri kaplarında gruplandırın ve her Petri kabına 2 mL steril ddH2O ile doldurulmuş bir santrifüj 15 mL konik tüp kapağı ekleyin.
- Tüm Petri kaplarını 37 ° C'de,% 5 CO2'de 90 dakika boyunca inkübe edin ve ardından talaşları BSC'nin altına geri getirin ve hidrojele zarar verme riskini azaltmak için hassas cımbız kullanarak damgaları yavaşça çıkarın.
4. Epitel ve vasküler yüzeyin dokuya özgü ECM proteinleri ile kaplanması
- Vasküler mikroakışkan odanın hücre dışı matriks proteinleri ile kaplanması
- Deney için gereken vasküler ECM kaplama çözeltisinin hacmini tahmin etmek için deney için gereken çip sayısını 20 μL (vasküler kanalın hacmi) ile çarpın:
Gerekli hacim = (Çip sayısı x 20) μL
NOT: Deneysel hataları hesaba katmak için fazladan %15'lik bir hacim hazırlanması önerilir. - Buz gibi soğuk PBS veya HBSS kullanarak tüm talaşlar için vasküler ECM kaplama solüsyonunu (örneğin, 12 talaş başına 300 μL) hazırlayın.
NOT: Ek materyaller bölümündeki spesifik organ-protokol tablosuna bakın (Cilt için Ek Tablo 1 ; Alveolus için Ek Tablo 2 ; Hava yolu için Ek Tablo 2 ve bağırsak için Ek Tablo 4 ) spesifik reaktifleri ve önerilen ECM bileşimini tanımlamak için. - Pipet, her bir çipin vasküler kanalına 20 μL vasküler ECM kaplama çözeltisi ekleyin.
- Deney için gereken vasküler ECM kaplama çözeltisinin hacmini tahmin etmek için deney için gereken çip sayısını 20 μL (vasküler kanalın hacmi) ile çarpın:
- Stromal eşdeğerin apikal yüzeyinin hücre dışı matriks proteinleri ile kaplanması
- Deney için gereken epitelyal ECM kaplama çözeltisinin hacmini tahmin etmek için deney için gereken çip sayısını 50 μL (vasküler kanalın hacmi) ile çarpın:
Gerekli hacim = (Çip sayısı x 50) μL
NOT: Deneysel hataları hesaba katmak için fazladan %15'lik bir hacim hazırlanması önerilir. - Buz gibi soğuk PBS veya HBSS'de tüm talaşlar için yeterli ECM kaplama çözeltisi hazırlayın (örneğin, 12 talaş başına 750 μL) ve 50 μL epitelyal ECM kaplama çözeltisini doğrudan hidrojel yüzeyinin üzerine aktarın.
NOT: Ek materyaller bölümündeki spesifik organ-protokol tablosuna bakın (Cilt için Ek Tablo 1 ; Alveolus için Ek Tablo 2 ; Hava yolu için Ek Tablo 2 ve bağırsak için Ek Tablo 4 ) spesifik reaktifleri ve önerilen ECM bileşimini tanımlamak için. - Cipsleri, her Petri kabında 2 mL steril ddH 2 O ile doldurulmuş bir santrifüj 15 mL konik tüp kapağı da dahil olmak üzere ayrı Petri kapları halinde gruplandırın ve epitel hücre tohumlamasına devam etmeden önce inkübatörde Petri kaplarını 37 ° C'de,% 5 CO2'de2 saat boyunca inkübe edin.
- Deney için gereken epitelyal ECM kaplama çözeltisinin hacmini tahmin etmek için deney için gereken çip sayısını 50 μL (vasküler kanalın hacmi) ile çarpın:
5. Epitel hücrelerinin stromal eşdeğeri üzerine tohumlanması
- Epitel hücre kültürü
- Kültür dokusuna özgü epitel hücreleri %80-90 oranında birleşene kadar sağlayıcılar tarafından yönlendirilir.
- Hücre sağlayıcısı tarafından önerilen proteolitik enzim prosedürlerini kullanarak hücreleri ayırın.
NOT: En iyi sonuçlar için, epitel hücrelerini% 70 -% 90 arasında akıcılığa ulaştıklarında aktif büyüme fazı sırasında düşük pasajda (P1-P2) hasat edin. - Ayrıştıktan sonra, hücreleri santrifüj edin ve bir pelet olarak toplayın.
- Epitel hücrelerini, spesifik organ protokolü tablosunda belirtildiği gibi uygun hücre / fragman yoğunluğuna yeniden askıya alın.
NOT: Bu çalışmada cilt için 3 x 10 6 hücre/mL, alveolus için 1 x 10 6 hücre/mL, hava yolu için 6 x 10 6 hücre/mL ve bağırsak için 8 x 10 6 hücre/mL yoğunlukta hücre solüsyonu kullanılmıştır.
- Epitel hücre tohumlaması
- Talaşları inkübatörden BSC'ye aktarın. Kaplama çözeltisini vasküler kanaldan aspire edin ve vasküler mikroakışkan kanalı 50 μL taze endotel hücre kültürü ortamı ile üç kez durulayın.
- Kaplama çözeltisini hidrojel yüzeyinden aspire edin ve fazla kaplama çözeltisini gidermek için stromal yüzeyi 100 μL taze epitel hücre kültürü ortamı ile üç kez durulayın.
- Yükselen ortamı aspire edin ve hidrojel yüzeyini, ek tablolarda belirtildiği gibi uygun hücre yoğunluğunu kullanarak 50 μL epitel hücre süspansiyonu ile tohumlayın ve daha sonra cipsleri 2 saat boyunca inkübatöre geri aktarın (veya kolonoidler için bir gecede).
- Hücresel kalıntıları gidermek için hidrojel yüzeyini hücre kültürü ortamıyla iki kez nazikçe durulayın. Son olarak, kapalı otoklavlanabilir kaplarda otoklavlama yaparak ortamı yenileyin ve talaşları peristaltik pompaya bağlayın.
6. Çipleri akışa bağlama
- Akışkan parçaların hazırlanması
- Çipleri ortam rezervuarlarına bağlamak için gereken kısa mikroakışkan boruyu hazırlamak için 2 inç biyouyumlu polipropilen bazlı termoplastik elastomer (TPE) transfer borusunu (Malzeme Tablosu) kesin.
- Uzun mikroakışkan boruyu üretmek için 7,5 inç biyouyumlu TPE transfer borusunu kesin.
- Yeterince 18 G ve 19 G metal konektör hazırlayın (Malzeme Tablosu).
NOT: Üstü Açık Talaşları peristaltik pompalara bağlamadan en az 1 gün önce 6.1.1 ve 6.1.2 adımlarında açıklanan boru ve konektörlerin hazırlanması ve sterilize edilmesi önerilir. - Her orta rezervuarın kapağını 4 inçlik bir hipodermik iğne ile delin (Malzeme Tablosu).
- Orta gaz giderme
- Hücre kültürü ortamının oda sıcaklığına (RT) dengelenmesine izin verin.
- İhtiyaç duyulan ortamın hacmini konik bir filtreleme tüpüne aktarın.
- Ortamın gazını gidermek için -20 PSI negatif vakum basıncı uygulayın (vakum tahrikli filtrasyon).
NOT: Bir vakum mevcut değilse, benzer sonuçlar elde etmek için hücre kültürü ortamı gece boyunca inkübatörde dengelenmeye bırakılabilir.
- Üstü Açık Çipi sıvı akışı için hazırlama
- Talaşları ve steril akışkan parçaları BSC'nin altına getirin ve sıvı akışını başlatmadan önce Open-Top Chip prototipini sızdırmaz hale getirmek için Open-Top Chip'in kapağını (üst kısmı) hizalayın.
- Gazdan arındırılmış hücre kültürü ortamının 200 μL'lik pipetini (organa özgü tablolara bakın) çipin hem üst hem de alt kanallarının giriş portuna yerleştirin ve kabarcıkları önlemeye dikkat edin.
- Tüplerin iç yüzeyini astarlamak ve kısa boruyu çipin üst ve alt kanallarının girişlerine bağlamak için kısa mikroakışkan boruya 300 μL kültür ortamının pipetini ekleyin.
- Mikroakışkan yüzeyleri bağlayın ve astarlayın
- Orta rezervuarları çiftlik rafına yerleştirin, hipodermik iğneyi talaşların alt girişine bağlayın ve son olarak, inkübatörün içindeki muhafaza taşıyıcılarındaki tüm talaşları yerleştirin.
- Talaşları peristaltik pompaya bağlayın ve ardından tüm yongaların düzgün bir şekilde bağlandığından ve hücre kültürü ortamının gözle görülür bir sızıntısı olmadığından emin olmak için tüm konektörleri inceleyin.
- Pompa üzerindeki Temizleme düğmesini kullanın ve yaklaşık 15 saniye boyunca veya hücre kültürü ortamının damlacıkları çıkış borusunun sonunda görünene kadar basılı tutun.
- Uygun organ-çip akış hızını ayarlamak için pompa üzerindeki kontrol sistemini kullanın (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5).
7. Talaşların bakımı
- Organ-çip bakımı
- Epitel ve / veya endotel için taze hücre kültürü ortamı hazırlayın ve gaz giderme adımlarını uygulayın (daha önce adım 6.2'de açıklandığı gibi).
- Peristaltik pompayı duraklatın, talaşları pompadan dikkatlice ayırın ve talaş gövdesi taşıyıcılarını çıkarın. Talaşları inkübatörden BSC'ye aktarın ve rezervuarlara bırakılan ortam hacmini çıkarın.
- Hücre kültürü ortamını üst ve alt giriş haznelerine 5 mL taze hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve talaş muhafazası taşıyıcılarını inkübatöre geri yerleştirin. Talaşları peristaltik pompaya bağlayın ve akışı yeniden başlatın.
NOT: Ortamı damar bölmesine hızlı bir şekilde yenilemek ve hava kabarcığı riskini azaltmak için Temizleme işlevinin kullanılması önerilir. - 7.1.1-7.1.3 adımlarını Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5'e göre iki günde bir yineleyin.
- Hava-sıvı arayüzünün (ALI) kurulması
- Peristaltik pompayı duraklatın, talaşları pompadan dikkatlice ayırın ve talaş gövdesi taşıyıcılarını çıkarın. Çipleri inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktarın ve kalan ortamın hacmini üst hazneye çıkarın.
- Üst mikroakışkan kanaldan tüm ortamı nazikçe aspire edin ve ortam buharlaşmasını ve ALI'nin bakımını azaltmak için bağlayıcı klipsler kullanarak üst girişlere bağlı kısa mikroakışkan boruyu sıkıştırın.
- Üstü Açık Çipi gövde taşıyıcı(lar)ına tekrar inkübatöre yerleştirin ve talaşları peristaltik pompaya yeniden bağlayın.
NOT: Ortamı damar bölmesine hızlı bir şekilde yenilemek ve hava kabarcığı riskini azaltmak için Temizleme işlevinin kullanılması önerilir. - Peristaltik pompayı başlatarak akışa devam edin.
- Germe (İsteğe bağlı)
- Peristaltik pompayı duraklatın ve çip başına iki uzun mikroakışkan tüp kullanarak çiplerin vakum portlarını vakum modülüne bağlayın.
- Esneme ayarını, organ protokolü tablolarında belirtildiği gibi her organ için önerilen duruma ayarlamak için vakum modülünü kullanın: Cilt için Ek Tablo 1 ; Alveolus için Ek Tablo 2 ; Hava yolu için Ek Tablo 2 ; ve bağırsak için Ek Tablo 4 .
- Tüm talaşların düzgün bir şekilde bağlandığından ve görünür bir orta damlama damlacığı olmadığından emin olmak için boru bağlantılarını görsel olarak inceleyin.
- Peristaltik pompayı başlatarak akışa devam edin.
8. Vasküler kompartmanda endotel hücrelerinin tohumlanması
- Hücreleri ve cipsleri vasküler hücre tohumlaması için hazırlayın
- Kültür, dokuya özgü endotel hücrelerini sağlayıcılar tarafından yönlendirildiği şekilde% 80-90 oranında birleşene kadar birleştirir. Proteolitik bir enzim prosedürü kullanarak hücreleri ayırın (sağlayıcı tarafından önerildiği gibi) ve son olarak, endotel hücrelerini 3 x 106 hücre / mL'lik bir çözelti içinde yeniden askıya alın.
NOT: En iyi sonuçlar için, endotel hücrelerini% 70 -% 90 arasında akıcılığa ulaştıklarında aktif büyüme fazı sırasında düşük pasajda (P2-P4) toplayın. - Peristaltik pompayı duraklatın. Talaşları inkübatörden BSC'ye aktarın, talaşları ortam rezervuarlarından ve bağlı borulardan ayırın ve ardından talaşları ayrı Petri kaplarında gruplandırın.
- Epitel bölmesinin hücre kültürü ortamını taze epitel hücre kültürü ortamı ile yenileyin. Vasküler kanalı taze endotel hücre kültürü ortamı ile iki kez durulayın ve ardından ortamı vasküler bölmeden aspire edin.
- Kültür, dokuya özgü endotel hücrelerini sağlayıcılar tarafından yönlendirildiği şekilde% 80-90 oranında birleşene kadar birleştirir. Proteolitik bir enzim prosedürü kullanarak hücreleri ayırın (sağlayıcı tarafından önerildiği gibi) ve son olarak, endotel hücrelerini 3 x 106 hücre / mL'lik bir çözelti içinde yeniden askıya alın.
- Endotel hücre tohumlaması
- Alt (vasküler) kanalı 25 μL endotel hücre süspansiyonu (3 x 106 hücre / mL) ile tohumlayın, endotel hücrelerinin mikroakışkan odanın üst yüzeyine yapışmasını sağlamak için çipleri baş aşağı çevirin.
NOT: Çip başına 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin (12 yonga başına 600 μL). - Cipsleri Petri kapları halinde gruplandırın. Onları 37 ° C,% 5 CO2'de inkübatöre geri yerleştirin ve endotel hücrelerinin 1 saat boyunca bağlanmasına izin verin.
- 1 saat sonra, cipsleri inkübatörden BSC'ye aktarın. Hücresel kalıntıları gidermek için vasküler kanalı endotel hücre kültürü ortamıyla iki kez durulayın.
- Vasküler kanalı endotel hücreleriyle bir kez daha tohumlamak için 8.2.1-8.2.2 adımlarını tekrarlayın ve endotel hücrelerinin vasküler kanalın alt yüzeyine yapışmasını kolaylaştırmak için çipleri düz bir şekilde yerleştirin.
- Alt (vasküler) kanalı 25 μL endotel hücre süspansiyonu (3 x 106 hücre / mL) ile tohumlayın, endotel hücrelerinin mikroakışkan odanın üst yüzeyine yapışmasını sağlamak için çipleri baş aşağı çevirin.
- Çipi akışa yeniden bağlayın
- Vasküler ortam rezervuarını, BSC altında gazdan arındırılmış vasküler hücre kültürü ortamı ile doldurun.
- Talaşları tekrar talaş gövdesi taşıyıcılarının içine yerleştirin ve talaşları bir ucundaki orta haznelere, diğer ucundaki peristaltik pompaya yeniden bağlayın.
NOT: Ortamı damar bölmesine hızlı bir şekilde yenilemek ve hava kabarcığı riskini azaltmak için Temizleme işlevinin kullanılması önerilir. - Tüm çiplerin düzgün bir şekilde bağlandığından ve görünür bir orta damlama damlacığı olmadığından emin olmak için mikroakışkan bağlantıları görsel olarak inceleyin. Ardından, peristaltik pompayı başlatarak sıvı akışını sürdürün.
9. Ortak bitiş noktası testleri
- Uç nokta testleri için yongaların bağlantısını kesin
- Peristaltik pompayı duraklatın, talaşları pompadan dikkatlice ayırın ve talaş gövdesi taşıyıcılarını çıkarın. Talaş gövdesi taşıyıcılarını inkübatörden BSC'ye aktarın ve talaşları serbest bırakın.
- Herhangi bir hücresel kalıntıyı çıkarmak için Open-Top Chip'in merkezi odasını epitel hücre kültürü ortamı ve vasküler kanalı endotel kültürü ortamı ile iki kez nazikçe yıkayın.
- Cımbız kullanarak çipin apikal bölmesine erişmek için Üstü Açık Çipin kapağını çıkarın.
- Floresan mikroskopi için immün boyama
- Geleneksel numune fiksasyonu, geçirgenleştirme ve bloke etme ile devam edin.
NOT: Bu çalışmada, örnekler 1 saat boyunca 200 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitlendi, ardından PBS ile durulandı, 40 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100'de geçirgenlik ve 1 saat boyunca% 1 sığır serum albümininde bloke edildi. - Cipsleri bir gecede 4 ° C'de birincil antikorlarla (Malzeme Tablosu) inkübe edin. ve daha sonra cipslerin hem epitel hem de endotel bölmelerini iki kez 200 μL PBS ile yıkayın. Ardından, 2 saat boyunca uygun ikincil antikorlarla devam edin.
NOT: PBS +% 1 BSA'daki birincil antikorları ve ikincil antikorları 1:100 (birincil antikor) ve 1:200 (ikincil antikor) seyreltmede seyreltin.
- Geleneksel numune fiksasyonu, geçirgenleştirme ve bloke etme ile devam edin.
- İmmünohistokimya
- Stromal eşdeğerlerini cımbız kullanarak Open-Top Chip'in ana odasından çıkarın,% 10 nötr tamponlu formalin ile doldurulmuş 1,5 mL'lik bir tüpe toplayın ve en az 24 saat boyunca inkübe edin.
- Sabit stromal eşdeğerini doku işlemcisine aktarın ve optimum numune dehidrasyonu elde etmek için aşağıdaki adımları izleyin.
- Hidrojeli 90 dakika boyunca% 70 etanol içine batırın.
- % 70 etanol çıkarın ve hidrojeli 90 dakika boyunca% 80 etanol içine batırın.
- % 80 etanol çıkarın ve hidrojeli 90 dakika boyunca% 95 etanol içine batırın.
- % 95 etanol çıkarın ve hidrojeli iki kez 90 dakika boyunca% 100 etanol içine batırın.
- % 100 etanol çıkarın ve hidrojeli iki kez 120 dakika boyunca bir ksilen çözeltisine batırın.
- Ksilen çözeltisini çıkarın ve işlenmiş stromal eşdeğerlerini parafin mumunda iki kez 120 dakika (~ 2 saat) boyunca infiltre edin.
- Sızmış stromal eşdeğerleri parafin bloklarına yerleştirin.
- Bu noktada, stromal eşdeğerleri bir mikrotom kullanılarak parafin blokları olarak bölümlenebilir ve geleneksel histolojik tekniklere göre işlenebilir26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yüzey mikro desenleme
Hücre dışı matrisin (ECM) mikro modellemesi, bağırsak kript arayüzünün uzamsal konfigürasyonunu çoğaltmak için kullanılabilir. Open-Top Chip konfigürasyonu, kolonik epitel-stroma arayüzünün doğal topografyasını (Şekil 6A, B) ve bağırsak kriptolarını mikrometre ölçeğinde (Şekil 6C-E) taklit etmek için özel olarak tasarlanmış mikro desenli pulları entegre edecek şekilde değiştirilebilir. Cilt, hava yolu ve alveolus modelleri için düz (desenli olmayan) bir yüzey kullandığımızı lütfen unutmayın. Bu durumda damga, epitel hücrelerini tohumlamak için düzgün bir hidrojel yüzeyi elde etmek için kullanıldı. İnsan bağırsak mukozasının doğal mimarisini taklit edebilen, bağırsak kriptlerini taklit eden pozitif ve negatif kubbelerin alternatifinden oluşan bir tasarım seçtik.
Organ modelleri
Bu biyomimetik platformun çok yönlülüğünü kanıtlamak için Open-Top Chip prototipini kullanarak dört farklı epiteli (cilt, alveolus, hava yolu ve bağırsak) kültüre aldık ve farklılaştırdık. Organ çiplerinin histolojik kesitleri, fenotipik olarak farklı ve temsil eden epitel hücrelerinin varlığını doğrulamaktadır: deri durumunda tabakalı bir epitel (Şekil 7), hava yolu durumunda psödo-tabakalı kolumnar epitel (Şekil 8 ve Ek Video 1), alveolus durumunda basit skuamöz epitel (Şekil 9), ve bağırsak durumunda basit kolumnar epitel (Şekil 10). Deri, hava yolu ve alveolar hücrelerin hepsi ticari olarak temin edilebilen satıcılardan elde edildi (Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi).
Şekil 1: Üstü Açık Çipin şeması ve bu çalışmada kullanılan mikroakışkan kurulum. (A-C) Üstten görünümlü, katman katman projeksiyon ve prototip Üstü Açık Çip tasarımını gösteren 3D render, kapalı mikro-akışkan kanallı çıkarılabilir üst kapak (mavi), kültür odasının yanındaki iki yarı ay vakum kanalı (gri) ve alt spiralize endotelyal mikro-akışkan kanallar (macenta). (D) Talaş gövdesi taşıyıcısı (kırmızı ok), peristaltik pompa ve ortak bir hücre kültürü inkübatörüne uyan bir konfigürasyonda düzenlenmiş rezervuarlar (sarı ok) dahil olmak üzere ısmarlama talaş tutucu ("Çiftlik sistemi" olarak da adlandırılır). € Pnömatik aktüatör, solunum veya peristalsis hareketi (gerilme) sırasında siklik mekanik kuvvet hücrelerinin deneyimini üretmek için kullanılan, talaşların vakum kanalına uygulanan negatif basıncı kontrol eden cihazdır. Bu rakam Varone ve ark.24'ün izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Üstü açık kaplama çipi protokolüne teknik genel bakış . (A) Üstü açık skin-chip preparatı için eylem sırasını gösteren şematik ve (B) üstü açık skin-chip kültürünün temel biyolojik adımını sağlamak. Talaş preparatının ilk aşamasında, mezenkimal hücreler (fibroblastlar) jelin içine gömülür ve 2-4 saat boyunca kaplanmış ve epitel hücreleri ile tohumlanmış stromal tabakayı oluşturmak için Open-Top Chip'e yüklenir. Epitel hücreleri kompakt bir tek tabaka oluşturduktan sonra, havaya (ALI) maruz kalırlar. Biyolojik sistem, 14. günde analiz için kurban edilene kadar ALI rejimi altında tutulur. Mekanik germe, sistem akış altındayken ve ALI'de uygulanabilir. Germe, dokular analiz için feda edilene kadar tutulur. Medya bileşimi, spesifik reaktifler ve hücre tipleri hakkında ek bilgi Ek Tablo 1'de bulunabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Üstü açık alveolus-çip protokolüne teknik genel bakış. (A) Üstü açık alveolus-çip preparasyonu için eylem sırasını gösteren şematik ve (B) üstü açık alveolus-çip kültürünün temel biyolojik adımını sağlamak. Talaş preparatının ilk aşamasında, mezenkimal hücreler (fibroblastlar) jelin içine gömülür ve 2-4 saat boyunca kaplanmış ve KIAD ile desteklenmiş bir ortamda hava yolu epitel hücreleri ile tohumlanan stromal tabakayı oluşturmak için Üstü Açık Çipe yüklenir (bakınız Ek Tablo 2). EGF takviyeli ortam, epitel hücre büyümesini desteklemek için ~ 4 gün boyunca korunur. Epitel daha sonra tam doku olgunlaşmasını sağlamak için ~ 10 gün boyunca havaya (ALI) maruz bırakılır. Pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri 14. günde tohumlanır ve biyolojik sistem 21. günde analiz için feda edilene kadar ALI ve akış rejimi altında tutulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Üstü açık hava yolu çip protokolüne teknik genel bakış. (A) Üstü açık hava yolu çipi hazırlığı için eylem sırasını gösteren şematik ve (B) üstü açık hava yolu çipi kültürünün temel biyolojik adımını sağlamak. Talaş preparatının ilk aşamasında, mezenkimal hücreler (fibroblastlar ve / veya düz kas hücreleri) jelin içine gömülür ve 2-4 saat boyunca kaplanmış ve EGF ile desteklenmiş ortamda epitel hücreleri ile tohumlanan stromal tabakayı oluşturmak için Üstü Açık Çipe yüklenir (bakınız Ek Tablo 3). EGF takviyeli ortam, epitel hücre büyümesini desteklemek için ~ 4 gün boyunca korunur. Epitel daha sonra tam doku olgunlaşmasını sağlamak için ~ 10 gün boyunca havaya (ALI) maruz bırakılır. Pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri 14. günde tohumlanır ve biyolojik sistem 21. günde analiz için feda edilene kadar ALI ve akış rejimi altında tutulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Üstü açık bağırsak çipi protokolüne teknik genel bakış. (A) Üstü açık bağırsak çipi preparatı için eylem sırasını gösteren şematik ve (B) üstü açık bağırsak çipi kültürünün anahtar biyolojik adımını sağlamak. Çip preparatının ilk aşamasında, mezenkimal hücreler (kolonik fibroblastlar) jelin içine gömülür ve 2-4 saat boyunca kaplanan ve klinik rezeksiyonlardan elde edilen epitelyal kolonoid parçaları ile tohumlanan stromal tabakayı oluşturmak için Open-Top Chip'e yüklenir. Kolonoid hücre canlılığını ve fizyolojik morfolojisini korumak için tohumlama adımı sırasında takviyeler (ROCK ve CHIR, Ek Tablo 4'e bakınız) dahil olmak üzere hücre kültürü ortamı gereklidir. Daha sonra kolonik epitelin genişlemesini (1. ila 6. gün) ve olgunlaşmasını (6. ila 9. gün) yönlendirmek için farklı ortamlar kullanılır. Kolonik mikrovasküler endotel hücreleri, bir endotel hücre kültürü ortamı (EGM2 MV) kullanılarak 6. günde tohumlanır ve daha sonra 10 güne kadar bir epitel genişleme ortamı ile akış altında kültürlenir. Epitel, epitel hücre olgunlaşmasını daha da teşvik etmek için 10. günden itibaren ALI'ye maruz kalır. Mekanik germe, 13. günden itibaren sisteme uygulanabilir ve organ modelinin son nokta analizi için feda edildiği 16. güne kadar korunabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Mikrodesen damgalama. (A) Mikro ölçekli dokuyu (500 μm yükseklikte ve 250 μm genişlikte sütun dizisi) gösteren damganın yanal ve üstten görünümü, kolonik kript doku arayüzünü ve damga çipi tertibatının üst ve yanal görünümünü yeniden oluşturmak için kullanılır ve jel yüzeyini dökmek için kullanıldığında iki elemanın uyumunu gösterir. (B) Damga ve Talaş arayüzünü gösteren açılı yanal görünüm. (C-E) Hücreli ve hücresiz mikrodesenli jel yüzeyinin görüntüleri. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakam Varone ve ark.24'ün izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Üstü açık kaplama çipi ile elde edilen temsili veriler. (A) Üstü açık deri çipi preparatı için etki sırasını gösteren ve üstü açık skin-chip kültürünün temel biyolojik adımlarını sağlayan şematik. (B) PCNA Cytokeratin 14, Cytokeratin10, Involucrin ve Fillagrin floresan boyaması ve H&E'nin Chip üzerinde farklılaşmış olgun çok katmanlı tabakalı epidermisi göstermesi. Ölçek çubukları: 100 μm. (C) Dermal tabaka içindeki fibroblastların varlığını gösteren Cilt Çipinin (Ölçek çubukları: 5 mm) ve H&E kesitinin (Ölçek çubukları: 100 μm) üstten görünüm resmi. (D) PECAM-1, VE-Cadherin ve Von Willebrand Floresan boyaması, üstü açık deri çipinde birlikte kültürlenmiş insan mikrovasküler endotel hücrelerinin farklılaşmasını gösterir. Ölçek çubukları: 20 μm. (E) Üstü açık kaplama çipinin 3B Karikatür konseptiyle oluşturulması. Bu rakam Varone ve ark.24'ün izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Üstü açık hava yolu çipi ile elde edilen temsili veriler. (A) Üstü açık hava yolu çipi hazırlığı için eylem sırasını gösteren ve Üstü Açık Hava Yolu Çipi kültürünün temel biyolojik adımını sağlayan şematik. (B) MUC5AC (Kadeh), α ve β-Tubulin (Siliyer hücreler), Clara Hücre proteini 16 (Club Hücreleri), p63 (Bazal/progenitör hücreler) ve olgun hava yolu epitelini gösteren ZO-1 floresan boyaması. Ölçek çubukları: 20 μm. (C) Dayak kirpiklerinin varlığını gösteren faz kontrast videosu/görüntüsü. Ölçek çubukları: 50 μm. (D) H&E boyama (Ölçek çubukları: 20 μm) ve Çip üzerinde farklılaşmış olgun psödo-tabakalı epitel gösteren TEM görüntüsü (Ölçek çubukları: 5 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Üstü açık alveolus çipi ile elde edilen temsili veriler. (A) Üstü açık alveolus-çip preparasyonu için etki sırasını gösteren ve üstü açık alveolus-çip kültürünün temel biyolojik adımını sağlayan şematik. (B) Tip I (HTI-56, AT1-α), Tip II (HTII-280, LAMP3, ABCA3, Yüzey Aktif Madde (C) ve Çip üzerinde olgun pnömositlerin varlığını gösteren E-Kadherin floresan boyaması. Ölçek çubukları: 20 μm. (C) Mikrovillus ve lizozomal veziküllerin varlığını gösteren SEM ve TEM görüntüsü olgun alveoler fenotipin kanıtıdır. Ölçek çubukları: 5 μm. (D) Tip I fenotiple uyumlu düz, skuamöz hücrelerin varlığını doğrulayan H&�m. (Ölçek çubukları: 5 μm) ve Tip II fenotiple uyumlu küboidal, parke taşı benzeri hücrelerin varlığını doğrulayan ve (E) dermal tabaka içindeki fibroblastların varlığını gösteren (Ölçek çubukları: 10 μm). (F) Üstü açık alveolus çipinin 3D karikatür konsepti oluşturulması. Bu rakam Varone ve ark.24'ün izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Üstü açık bağırsak çipi ile elde edilen temsili veriler. (A) Üstü Açık Bağırsak-Çip preparatı için etki sırasını gösteren ve Üstü Açık Bağırsak-Çip kültürünün anahtar biyolojik adımını sağlayan şematik. (B) Jel döküm aşamasında Damga ve Talaş düzeneğini gösteren açılı yanal görünüm, mikrodesenli jelin karikatür konsepti ve jel yüzeyinde mikrodesenli ve iki farklı yükseklikte kolonoidlerle tohumlanmış kript benzeri bir yapının faz kontrast görüntüleri. Ölçek çubukları: 200 μm. (C) Mucin 2 ve E-Kadherin floresan boyaması, Çip üzerinde enterositlerin ve olgun kadeh hücrelerinin varlığını gösterir. Ölçek çubukları: 200 μm. (D) Dermal tabaka içindeki fibroblastların varlığını gösteren ve basit bir sütunlu epitelin varlığını doğrulayan kript benzeri bir yapının H&E kesiti. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 1: Dayak kirpiklerini gösteren faz kontrast videosu. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Üstü açık çip tertibatı. (A) Üstü Açık Çip tertibatının üç boyutlu olarak işlenmesini ve üstü açık deri çipin farklı biyolojik bölmeleri vurgulanmış ve epitel (mavi), dermal (sarı) ve vasküler (kırmızı) dahil olmak üzere karikatür gösterimini gösteren şematik. (B) Birleştirilmiş mikroakışkan platform, 35 mm x 17 mm formatında, 0,32cm2'lik bir doku kültürü alanına, alttan spiralli bir mikroakışkan kanala ve mikroakışkan kanallı bir oda kapağına sahiptir. (C) Platform, membran seviyesinde 6 mm ve PDMS oda duvarının tepesinde 5,7 mm çapa ve 4 mm ve genişliğe sahip, 5 derecelik açılı duvara sahip bir odadan oluşur. Gözenekli membran 50 μm kalınlığındadır ve gözenekler 7 μm çapındadır. (D) Alt spiral şekilli mikroakışkan kanal, 400 μm (yükseklik) x 600 μm (genişlik) kesit boyutlarına sahiptir. (E) Deney zaman çizelgesine ve Üstü Açık Organ Çipinin hazırlanması için gerekli adımlara genel bir bakış. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Cilt. Tablo, önemli günlük adımların ve Open-Top Skin-Chip kültürünün üç aşamasında (büyüme, çoğalma ve farklılaşma) kullanılan esneme ve akış parametrelerinin bir özetini sunmaktadır. Tablo ayrıca malzemelerin listesini, ortam formülasyonlarını ve bu protokol için gerekli ortamın nasıl hazırlanacağına dair talimatları da sağlar. Üç ortamın bileşimi, protokolün farklı aşamaları için optimize edilmiştir. Spesifik olarak, Orta I, tohumlama ve erken keratinosit kültürü aşaması için optimize edilmiştir. Medium II, proliferasyon ve erken farklılaşma (tabakalı bir epitel oluşumu) için optimize edilmiştir. ALI ortamı, tamamen farklılaşmış bir epidermis üretilene kadar keratinositleri hava-sıvı arayüzünde tutmak için optimize edilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 2: Alveolus. Tablo, temel günlük adımların ve üstü açık alveolus-çip kültürünün üç aşamasında (büyüme, çoğalma ve farklılaşma) kullanılan gerilme ve akış parametrelerinin bir özetini sunmaktadır. Tablo ayrıca malzemelerin listesini, ortam formülasyonlarını ve bu protokol için gerekli ortamın nasıl hazırlanacağına dair talimatları da sağlar. İki ortamın bileşimi, protokolün farklı aşamaları için optimize edilmiştir. Hücre kültürü ortamına takviyelerin (KIAD) eklenmesinin, pnömositlerin optimal farklılaşmasını sağlamak için kritik öneme sahip olduğunu lütfen unutmayın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 3: Hava yolu. Tablo, temel günlük adımların ve üstü açık hava yolu-çip kültürünün üç aşamasında (büyüme, çoğalma ve farklılaşma) kullanılan germe ve akış parametrelerinin bir özetini sunmaktadır. Tablo ayrıca malzemelerin listesini, ortam formülasyonunu ve bu protokol için gerekli ortamın nasıl hazırlanacağına dair talimatları da sağlar. Ortamın bileşimi, hava yolu hücrelerini hava-sıvı arayüzünde tutmak için optimize edilmiştir, bu da terminal farklılaşmasını indükler ve mukus üretimini uyarır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 4: Bağırsak. Tablo, önemli günlük adımların ve üstü açık bağırsak çipi kültürünün üç aşamasında (büyüme, çoğalma ve farklılaşma) kullanılan germe ve akış parametrelerinin bir özetini sunmaktadır. Tablo ayrıca malzemelerin listesini, ortam formülasyonlarını ve bu protokol için gerekli ortamın nasıl hazırlanacağına dair talimatları da sağlar. Her iki ortamın bileşimleri protokolün farklı aşamaları için optimize edilmiştir. Spesifik olarak, CHIR ve ROCK inhibitörleri ile desteklenen genleşme ortamı, kültürün tohumlanması ve erken fazı için optimize edilmiştir, çünkü kolonik organoid fragmanın tek katmanlı olarak hayatta kalmasını ve büyümesini teşvik eder. Genleşme ortamı, epitel monolayer'ın proliferasyonu ve erken farklılaşması için optimize edilmiştir. Diferansiyasyon ortamı, hava-sıvı arayüzüne maruz kalmadan önce epitel monokatmanının terminal farklılaşması için optimize edilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Open-Top Chip, kontrollü bir mikro ortamda endotel, stroma ve epitel arasında meydana gelen karmaşık hücresel etkileşimi gerçek zamanlı olarak araştırmak için uygun bir platformu temsil eder. Bu teknoloji, akışkan kayma (akış), siklik germe ve mikrodesenleme yoluyla elde edilen epitel yüzey topografyasının yeniden yapılandırılması dahil olmak üzere insan dokusu mikroçevresini yeniden oluşturmakla ilgili fiziksel ve biyokimyasal ipuçlarının entegrasyonu gibi geleneksel organotipik ve organoid kültürlere göre kritik avantajlar sunmaktadır. Bu platformda büyüyen insan hücreleri, üst ve / veya alt bölmelerden çıkış sıvılarını (veya atık suları) kullanarak immün histokimya ve biyokimyasal analizler de dahil olmak üzere geleneksel tekniklerle analiz edilebilen dokuya özgü fonksiyonları özetlemek için sinerji içinde hareket eder. Mevcut tasarım, hücrelerin dokuya özgü fibroblastlar ve diğer stromal hücrelerle doğrudan temas halinde büyüdüğü ve epitel dokularının çok hücreli mimarisini taklit ettiği epitel tabakasına kolay erişim sağlar. Özellikle, Open-Top Chip prototipi, diğer çip üzerinde organ platformlarının kullanımıyla ilgili yaygın zorluklara uygulanabilir bir çözüm sunuyor. Çok karmaşık 3D dokuların oluşturulmasına yol açan stromal bir bölme içinde birkaç farklı hücre tipinin birleştirilmesini sağlarken, aynı zamanda geleneksel H&E boyama da dahil olmak üzere aşağı akış analizi için çip cihazından yerleşik doku yapılarının kolayca çıkarılmasına izin verir.
Mevcut tasarım birkaç sınırlama sunuyor. Örneğin, vasküler mikrokanal ile prototip Open-Top Chip'in stromal bölmesi (hidrojel) arasına yerleştirilen elastik membran, endotel dokularını doğal insan organlarındaki stromadan ayıran interstisyel boşluktan önemli ölçüde daha kalındır (≈ 50 μm'ye karşı ≈ 1 μm). Elastik zar, dokular arasındaki hücreler arası çapraz etkileşime aracılık eden hormonlar ve diğer parakrin faktörler gibi büyük moleküllerin difüzyonuna fiziksel bir engel oluşturmasa da, doğrudan, hücre-hücre etkileşimlerini ve hücrelerin vasküler bölmeden stromal bölmeye göçünü sınırlayabilir. Son olarak, prototip Open-Top Chip, çok sayıda hidrofobik bileşiği emdiği bilinen PDMS'den yapılmıştır. Bu sınırlama, küçük terapötik bileşiklerin farmakodinamiğini ve farmakokinetiğini test etmeye yönelik uygulamalarda ciddi bir engel oluşturabilecek birçok PDMS tabanlı platform tarafından paylaşılmaktadır27.
3D hidrojelleri Open-Top Chip gibi mikroakışkan bir cihaza entegre etmenin ana zorluklarından biri, PDMS'nin insan proteinlerinin veya hücrelerinin bağlanması için en uygun substratı sağlamamasıdır. Bu nedenle, PDMS yüzeyinin kimyasal işlevselleştirilmesi, bu protokolde, Open-Top Chip modelinin jel odasına uygun ECM kaplaması ve hidrojel yapışmasını sağlamak için gerekli olan kritik bir adımdır. En iyi sonuçları elde etmek için, ER1 çözeltisindeki çapraz bağlama maddesi her zaman ışığa doğrudan maruz kalmaktan korunmalıdır. Çapraz bağlayıcının reaktif durumunun önemli bir göstergesi rengidir. Aslında, ER1'deki çapraz bağlayıcı, oksitlendiğinde parlak turuncudan koyu kahverengiye renk geçişine uğrar. Renk geçişi, çözeltinin PDMS yüzeyiyle etkili bir şekilde reaksiyona girip girmediğini kontrol etmek için UV aktivasyon adımından sonra bir gösterge olarak kullanılabilir. Çapraz bağlayıcı çözeltisinin hazırlanması sırasında, doğrudan ışığa yanlışlıkla maruz kalmanın çözelti içindeki kimyasal bileşiği foto-ağartmadığından emin olmak için renk geçişi izlenmelidir. Crosslinker çözümünü korumak ve istenmeyen fotobeyazlatmayı önlemek için, alüminyum folyoyu yaklaşık 15 cm x 15 cm, 15 mL'lik bir konik tüpün etrafına veya piyasada bulunan kehribar bir tüp kullanarak sarmanızı öneririz. ER1'in kullanımı, PDMS yüzeylerinin hızlı bir şekilde işlevselleştirilmesini sağlamak için basit ve etkili bir yöntem sağlar; Bununla birlikte, ER1 yerine kullanılabilecek başka moleküller de vardır. Örneğin, kimyasal çapraz bağlayıcılar 3-aminopropil-trimetoksisilan (APTMES), ER1 kadar ışığa duyarlı değildir ve daha önce başka bir yerde tanımladığımız gibi birkaç ek adımla benzer sonuçlar elde etmek için kullanılabilir28,29. Tercih edilen molekülden bağımsız olarak, kimyasal bir çapraz bağlayıcı ile çalışmadaki ana kısıtlamalardan biri, sitotoksisiteyi indükleyebilecek artık kalıntıların varlığıdır. Aktivasyon reaksiyonunu takiben, mikroakışkan yüzeylerin bol miktarda yıkama çözeltisi ile durulanması önemlidir.
Hava kabarcıkları, talaşların, boruların ve konektörlerin hidrofobik arayüzleri içinde oluşma ve büyüme eğiliminde olduğundan, sıvı akışına başlamadan önce mikroakışkan yolun hava kabarcıklarından arındırılmış olup olmadığını değerlendirmek önemlidir. Kabarcıklar gerçekten akışı bozabilir ve hatta çipler akışa bağlandığında hücreleri öldürebilir. Sıvı akışına başlamadan önce mikroakışkan bileşenlerin astarlanması, hava kabarcıkları oluşma riskini azaltacak ve optimum ve tekrarlanabilir sonuçların elde edilmesine yardımcı olacaktır. Bu protokolde açıklanan astarlama döngüsü yeterli değilse, mikroakışkan tüplerin etanol (5 dakika) ve daha sonra HBSS (20 dakika) ile durulanması, akışkan konektörlerin içinde hava kabarcıkları oluşma riskini daha da azaltacaktır.
Sınırlamalarına rağmen, PDMS, biyouyumlu, şeffaf ve elastik mikroakışkan cihazların üretilmesini sağlayan nadir bir kimyasal özellik kombinasyonuna sahiptir. Tüm bu özellikler, PDMS'yi son on yılda Organ-on-Chip modellerinin yapımında en geniş çapta uygulanan malzeme haline getirmiştir. Malzeme bilimi ve kimya mühendisliği alanlarındaki son gelişmeler30,31, bu platformun PDMS bileşeninin yakın gelecekte yeni sentetik polimerler veya biyomalzemelerle değiştirilebileceğini göstermektedir. Başarılı bir şekilde elde edilirse, gözeneklilik, interstisyel boşluğun ECM bileşimi de dahil olmak üzere dokuya özgü özelliklerin özetlenmesini sağlayabilir, böylece insan doğal dokularına daha yakın taklit sağlar ve farmakoloji çalışmaları için daha gelişmiş modeller elde edilebilir. Open-Top Chip tasarımının gelecekteki evriminin, insan dokularının ve organlarının benzeri görülmemiş bir ayrıntı seviyesiyle modellenmesini sağlayacağını öngörüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, potansiyel rakip çıkarlar olarak kabul edilebilecek aşağıdaki finansal çıkarları / kişisel ilişkileri beyan ederler: Varone Antonio, Emulate Inc.'in eski bir çalışanıdır ve Emulate'de hisse senedi payına sahip olabilir.
Acknowledgments
Hiç kimse
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
References
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
- Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
- MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
- Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
- Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
- Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
- Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
- Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
- Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
- Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
- Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P.
- Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
- Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
- Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
- Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).
