Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Fähigkeiten und die wesentlichen Kulturmodalitäten des Open-Top Organ-Chips für die erfolgreiche Etablierung und Reifung von Organ-on-Chip-Kulturen in voller Dicke von primären Geweben (Haut, Alveole, Atemwege und Darm) und bietet die Möglichkeit, verschiedene funktionelle Aspekte der humanen epithelial/mesenchymalen und vaskulären Nischenschnittstelle in vitro zu untersuchen.
Abstract
Fast alle menschlichen Organe sind mit Epithelgewebe ausgekleidet, das aus einer oder mehreren Schichten eng verbundener Zellen besteht, die in dreidimensionalen (3D) Strukturen organisiert sind. Eine der Hauptfunktionen von Epithelien ist die Bildung von Barrieren, die das darunter liegende Gewebe vor physikalischen und chemischen Beleidigungen und Infektionserregern schützen. Darüber hinaus vermitteln Epithelien den Transport von Nährstoffen, Hormonen und anderen Signalmolekülen, wodurch oft biochemische Gradienten entstehen, die die Zellpositionierung und Kompartimentierung innerhalb des Organs steuern. Aufgrund ihrer zentralen Rolle bei der Bestimmung der Organstruktur und -funktion sind Epithelien wichtige therapeutische Angriffspunkte für viele menschliche Krankheiten, die nicht immer von Tiermodellen erfasst werden. Neben den offensichtlichen Unterschieden zwischen den Arten wird die Durchführung von Forschungsstudien über die Barrierefunktion und die Transporteigenschaften von Epithelien bei Tieren durch die Schwierigkeit des Zugangs zu diesen Geweben in einem lebenden System noch verstärkt. Während zweidimensionale (2D) menschliche Zellkulturen für die Beantwortung grundlegender wissenschaftlicher Fragen nützlich sind, liefern sie oft schlechte In-vivo-Vorhersagen . Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat sich in den letzten zehn Jahren eine Vielzahl von mikrotechnisch hergestellten biomimetischen Plattformen, die als Organs-on-a-Chip bekannt sind, als vielversprechende Alternative zu herkömmlichen In-vitro - und Tierversuchen herausgestellt. Hier beschreiben wir einen Open-Top-Organ-Chip (oder Open-Top-Chip), eine Plattform zur Modellierung organspezifischer Epithelgewebe, einschließlich Haut, Lunge und Darm. Dieser Chip bietet neue Möglichkeiten für die Rekonstruktion der multizellulären Architektur und Funktion von Epithelgeweben, einschließlich der Fähigkeit, eine 3D-Stromakomponente durch den Einbau gewebespezifischer Fibroblasten und Endothelzellen in ein mechanisch aktives System nachzubilden. Dieser Open-Top-Chip bietet ein noch nie dagewesenes Werkzeug für die Untersuchung von epithelialen/mesenchymalen und vaskulären Interaktionen auf verschiedenen Auflösungsskalen, von einzelnen Zellen bis hin zu mehrschichtigen Gewebekonstrukten, und ermöglicht so die molekulare Zerlegung der interzellulären Wechselwirkung epithelialisierter Organe in Gesundheit und Krankheit.
Introduction
In der Vergangenheit haben sich Wissenschaftler bei der Arzneimittelforschung auf präklinische Tierversuche verlassen, aber eine wachsende Zahl dieser Methoden wurde aufgrund der schlechten Korrelation mit dem menschlichen Ergebnis in Frage gestellt1. Die Umsetzung der "3R"-Prinzipien zum Ersetzen, Reduzieren und Verfeinern von Tierversuchen drängt Wissenschaftler, neue alternative In-vitro-Methoden zu finden, um die präklinische Risikobewertung von Arzneimitteln und chemischer Toxikologiezu unterstützen 2. Vielen bisher entwickelten In-vitro-Modellen fehlt jedoch die biologische Architektur, die zelluläre Komplexität und die mechanische Umgebung, die erforderlich sind, um die dynamische Natur menschlicher lebender Organe zu rekapitulieren 3,4.
Konventionelle präklinische In-vitro-Systeme verwenden in der Regel 2D-Monokulturen menschlicher Zellen, die auf einer starren Kunststoffoberfläche gezüchtet werden. Diese Methoden bieten ein Werkzeug für die Durchführung einfacher mechanistischer Studien und ermöglichen ein schnelles Screening von Wirkstoffkandidaten. Aufgrund ihrer relativ geringen Kosten und hohen Robustheit werden 2D-Modelle häufig mit automatischen Hochdurchsatzsystemen kombiniert und zur schnellen Identifizierung potenzieller Wirkstoffkandidaten in der frühen Phase des Arzneimittelentwicklungsprozesses verwendet 5,6. Solche 2D-Modelle bieten jedoch keinen translationalen Ansatz zur Modellierung von Gewebe-, Organ- oder systemischen Reaktionen auf therapeutische Kandidaten, der für genaue Vorhersagen der Arzneimittelsicherheit und -wirksamkeit während der präklinischen Phase ihrer Entwicklung erforderlich ist. Flachzellkulturen rekapitulieren nicht die native Gewebemikroumgebung, einschließlich des komplexen multizellulären Zusammenspiels, der biomechanischen Eigenschaften und der dreidimensionalen (3D) Architektur menschlicher Gewebe7. Zellen, die auf einer flachen Oberfläche wachsen, erhalten oft keinen reifen Phänotyp und können daher nicht auf pharmakologische Reize reagieren, wie dies im nativen Gewebe der Fall wäre. Zum Beispiel weisen primäre menschliche Alveolarepithelzellen, die in vitro gezüchtet wurden, einen Plattenepitheltyp auf und verlieren wichtige phänotypische Marker, einschließlich der Tensidproteine C und B (SP-C und SP-B)8. Neben einer unzureichenden Differenzierung werden Primärzellen in vitro häufig unempfindlich gegenüber biologischen Stressoren, da bestimmte biochemische Signalwege, die mit Gewebeentzündungen assoziiert sind, funktionsunfähig werden9. Ein solcher Verlust der Zellfunktion scheint in erster Linie mit der Verwendung steifer Substrate sowie dem Mangel an löslichen Faktoren verbunden zu sein, die auf natürliche Weise von gewebespezifischen Stromazellen wie Lungenfibroblasten und glatten Muskelzellen freigesetzt werden10,11.
Das Verständnis, dass der Mangel an chemophysikalischer und biologischer Komplexität das physiologische Verhalten von Zellen in vitro einschränkt, hat die Entwicklung ausgefeilterer multizellulärer Modelle gefördert, die nachweislich die Komplexität des menschlichen Gewebes außerhalb des Körpers besser erfassen12,13. Seit der Entwicklung der ersten Co-Kulturmodelle in den frühen 1970er Jahren14 hat die Einführung synthetischer und natürlicher Hydrogele die Fähigkeit, native Gewebemikroumgebungen nachzuahmen, erheblich verbessert und ist zu einem unschätzbaren Werkzeug geworden, um die zelluläre Differenzierung voranzutreiben, die Selbstorganisation von Zellen in gewebeähnliche Strukturen zu lenken und native Gewebefunktionen wiederherzustellen15,16. Wenn menschliche Zellen beispielsweise im entsprechenden 3D-Gerüst gezüchtet werden, können sie sich selbst zu funktionellen Strukturen wie Sphäroiden oder Organoiden anordnen, Stammzellmarker exprimieren und sich selbst erneuern17. Im Gegensatz dazu altern menschliche Zellen (einschließlich Stammzellen), wenn sie auf herkömmlichen 2D-Substraten gezüchtet werden, schnell und durchlaufen nach wenigen Passagen eine Seneszenz18. Darüber hinaus können Hydrogele auf bestimmte Gewebeeigenschaften wie Porosität, Porengröße, Faserdicke, Viskoelastizität, Topographie und Steifigkeit "zugeschnitten" oder mit aus Gewebe gewonnenen zellulären Komponenten und/oder bioaktiven Molekülen weiterentwickelt werden, um eine Nachahmung der physiologischen oder pathologischen Bedingungen zu ermöglichen19,20. Trotz ihres enormen Potenzials für Arzneimitteltests rekapitulieren 3D-Hydrogel-basierte Modelle, die in der pharmazeutischen Forschung verwendet werden, die komplexe Zytoarchitektur des In-vivo-Gewebes nicht vollständig und es fehlen wichtige hämodynamische und mechanische Reize, die normalerweise im menschlichen Körper vorhanden sind, einschließlich hydrostatischem Druck, zyklischer Dehnung und Flüssigkeitsscherung21.
Mikrophysiologische Systeme (MPS) wie Organs-on-Chips (OOCs) haben sich in jüngster Zeit als Werkzeuge herausgestellt, die in der Lage sind, komplexe physiologische Reaktionen in vitro zu erfassen 22,23. Diese Modelle verwenden häufig mikrofluidische Plattformen, die die Modellierung der dynamischen Mikroumgebung lebender Organe ermöglichen.
Wir haben die Prinzipien des 3D-Gewebe-Bioengineerings und der Mechanobiologie kombiniert, um ein Open-Top-Chip-Modell von komplexem menschlichem Epithelgewebe zu erstellen. Dies ermöglichte es uns, die multizelluläre und dynamische Mikroumgebung des Epithelgewebes genau zu rekapitulieren. Dazu gehören gewebespezifische biochemische und biomechanische Hinweise, die natürlicherweise in lebenden Organen vorhanden sind, aber von herkömmlichen In-vitro-Modellen oft vernachlässigt werden24. Der Open-Top-Chip besteht aus zwei Kompartimenten: einem Gefäßkompartiment (Abbildung 1A) und einem Stromakompartiment (Abbildung 1B), die durch eine poröse Membran getrennt sind und die Diffusion von Nährstoffen zwischen den beiden Kammern ermöglichen (Abbildung 1C). Das Gefäßkompartiment ist einem kontinuierlichen Flüssigkeitsfluss ausgesetzt, um die physiologische Scherbelastung zu rekapitulieren, während das dehnbare Design der Stromakammer die Modellierung der mechanischen Belastung ermöglicht, die mit Atembewegungen oder Darmperistaltik verbunden ist. Das Stromakompartiment beherbergt das einstellbare 3D-Hydrogel-Gerüst, das das physiologische Wachstum gewebespezifischer Fibroblasten unterstützt. Es verfügt über einen abnehmbaren Deckel, der die Einrichtung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche erleichtert, eine Bedingung, die eine bessere Nachahmung der menschlichen Physiologie von Schleimhautgeweben sowie einen direkten Zugang zum Gewebe für die Verabreichung von Medikamenten direkt auf die Epithelschicht ermöglicht. Ergänzende Abbildung 1 zeigt einige der Schlüsselkomponenten des Open-Top-Chip-Designs, einschließlich Abmessungen und biologischer Kompartimente (ergänzende Abbildung 1A-D) sowie die wichtigsten technischen Schritte, die in diesem Protokoll beschrieben sind (ergänzende Abbildung 1E).
Die Perfusion des Open-Top-Chips wird mit einer programmierbaren Peristaltikpumpe erreicht (Abbildung 1D). Der Aufbau der Peristaltikpumpe ermöglicht die gleichzeitige Perfundierung von 12 Open-Top-Chips. Die meisten Inkubatoren können zwei Setups beherbergen, so dass bis zu 24 Chips pro Inkubator kultiviert werden können. Die mechanische Streckung wird durch einen speziell angefertigten programmierbaren Vakuumdruckregler erreicht (Abbildung 1E). Es besteht aus einem elektropneumatischen Vakuumregler, der elektronisch von einem Digital-Analog-Wandler gesteuert wird. Mit anderen Worten, der elektropneumatische Vakuumregler erzeugt ein sinusförmiges Vakuumprofil mit einer vom Benutzer festgelegten Amplitude und Frequenz. Eine zyklische Dehnung von 0 % bis 15 % wird erzeugt, indem Unterdruck auf den Vakuumkanal des Open-Top-Chips mit einer Amplitude von 0 bis -90 kPa und einer Frequenz von 0,2 Hz ausgeübt wird. Es handelt sich um ein maßgeschneidertes System, das der kommerziell erhältlichen Flexcell-Dehnungseinheit entspricht, die zuvor verwendet und in anderen Veröffentlichungen25 beschrieben wurde. Um die mechanische Gewebeverformung nachzuahmen, die beispielsweise mit der Atembewegung der Lunge oder der Peristaltik des Darms verbunden ist, wendet der pneumatische Aktuator sinusförmige Vakuum-/Dehnungswellen an, deren Größe und Amplitude an das physiologische Belastungsniveau und die Frequenz angepasst werden können, die menschliche Zellen in ihrem nativen Gewebe erfahren.
Hier beschreiben wir eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Entwicklung und Kultivierung organotypischer Epitheläquivalente auf einer prototypischen Open-Top-Chip-Plattform. Es ermöglicht die Erzeugung komplexer Organmodelle wie Haut, Alveole, Atemwege und Dickdarm unter gleichzeitiger Integration eines Gefäßflüssigkeitsflusses und mechanischer Dehnung. Wir werden die wichtigsten technischen Aspekte skizzieren, die bei der Umsetzung der Prinzipien des Tissue Engineering zur Erzeugung komplexer Epithelmodelle berücksichtigt werden müssen. Wir werden die Vorteile und möglichen Einschränkungen des aktuellen Designs diskutieren.
Einen Überblick über die wichtigsten Schritte zur Gewebe- und Organreifung, einschließlich der Fluss- und Dehnungsparameter, finden Sie in: Abbildung 2 für die Haut, Abbildung 3 für die Alveole, Abbildung 4 für die Atemwege und Abbildung 5 für den Darm. Weitere Informationen zur Zusammensetzung der Medien und zu den Reagenzien, die für die Kultivierung der verschiedenen Organmodelle verwendet werden, sind in den Ergänzungstabellen enthalten (Ergänzungstabelle 1 für die Haut; Ergänzende Tabelle 2 für die Alveole; Ergänzungstabelle 3 für die Atemwege und Ergänzungstabelle 4 für den Darm).
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Protocol
Humane Kolonoide wurden aus Darmresektionen gemäß den Richtlinien des Institutional Biosafety Committee des Cincinnati Children's Hospital (IBC 2017-2011) gewonnen.
1. Aktivierung der Oberfläche
- Vorbereitung des Aktivierungspuffers
- Legen Sie den Vernetzer und die Lösungsmittelpufferreagenzien unter die Biosicherheitswerkbank (BSC) und lassen Sie sie vor Gebrauch 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) äquilibrieren.
- Rekonstituieren Sie 5 mg Vernetzer in 5 ml des Lösungsmittelpuffers unter Verwendung eines sterilen, lichtundurchlässigen Behälters oder eines transparenten konischen 15-ml-Röhrchens, das in Aluminiumfolie eingewickelt ist, um die Vernetzerlösung vor direkter Lichteinwirkung zu schützen.
- Sprühen Sie die Lösung 1 Minute lang, um alle Klumpen zu entfernen, und pipettieren Sie dann 50 μl der Vernetzerlösung direkt in den unteren Kanal des Chips und 150 μl in die offene Kammer.
- Entfernen Sie überschüssige Vernetzungslösung mit einem Absauger von der Oberfläche des Chips. Dann pipettieren Sie weitere 50 μl der Vernetzungslösung direkt in den unteren Kanal des Chips und 150 μl in die offene Kammer, um die verbleibende Luftblase zu entfernen.
- Aktivierung mit UV-Vernetzungsmaschine
- Entfernen Sie vorsichtig den Deckel vom Chip unter dem BSC und bewahren Sie ihn in einem sterilen Behälter auf.
- Übertragen Sie die Späne mit der Vernetzerlösung in eine Petrischale, verschließen Sie die Petrischale, um eine Kontamination zu vermeiden, und stellen Sie die Schale mit den Spänen unter die UV-Vernetzungsmaschine.
Anmerkungen: Entfernen Sie den Deckel der Petrischale, um die UV-Exposition zu maximieren. - Stellen Sie die UV-Vernetzungsmaschine mit einer Spitzenwellenlänge von 365 nm auf eine Intensität von 100 μJ/cm2 ein und schalten Sie das UV-Licht für 20 min ein.
Anmerkungen: Nach 20 Minuten UV-Behandlung sieht die Vernetzerlösung dunkler (braun) aus. - Bringen Sie die Späne wieder unter den BSC und saugen Sie die oxidierte Vernetzerlösung ab. Spülen Sie dann alle Späne dreimal mit dem Lösungsmittelpuffer ab und lassen Sie die Späne 5-10 Minuten unter dem BSC trocknen, um die chemische Funktionalisierung der Polydimethylsiloxan-Oberfläche (PDMS) abzuschließen.
2. Vorbereitung des Stroma-Äquivalents
- Herstellung von 10x Rekonstruktionspuffer (100 mL)
- 2,2 g Natriumbicarbonat werden in 75 ml 0,067 M NaOH in doppelt destilliertem Wasser gelöst.
- Fügen Sie 4,76 g HEPES hinzu und bringen Sie das Volumen mit doppelt destilliertem Wasser auf 100 ml.
- Sterilfiltrieren Sie die Lösung unter dem BSC mit einem sterilen Einweg-Flaschenaufsatzfilter mit einer 0,22-μm-Membran.
HINWEIS: Die Lösung ist bei Lagerung bei 4 °C ca. 6 Monate haltbar.
- Abschätzung des Volumens der Vorgellösung
- Multiplizieren Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten Chips mit 150 μL (Innenvolumen der zentralen offenen Kammer), um die für das Experiment erforderliche Menge an Pre-Gel-Lösung abzuschätzen:
Benötigtes Volumen = (Anzahl der Chips x 150) μL - Bereiten Sie die Kollagen-Vorgellösung auf Eis vor, indem Sie Folgendes mischen: 1 Volumen 10x EMEM, das die Zellen Ihrer Wahl enthält, 1 Volumen 10-facher Rekonstruktionspuffer (siehe Schritt 2.1), 8 Volumen Kollagen-I-Lösung (10 mg/ml) und 1 μl 1 N NaOH-Lösung für jedes mg Kollagen I.
HINWEIS: Es wird empfohlen, ein zusätzliches Volumen von +15 % vorzubereiten, um experimentelle Fehler zu berücksichtigen. Das in Abschnitt 2.2 beschriebene Beispiel bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Herstellung einer ausreichenden Vorgellösung für 12 Chips und zusätzliche 15 % Volumen.
- Multiplizieren Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten Chips mit 150 μL (Innenvolumen der zentralen offenen Kammer), um die für das Experiment erforderliche Menge an Pre-Gel-Lösung abzuschätzen:
- Herstellung von Pre-Gel-Lösung für das Stroma-Äquivalent (für 12 Chips)
- Bringen Sie die folgenden Lösungen unter die BSC auf Eis: 10x EMEM; 10x Rekonstruktionspuffer (siehe Schritt 2.1); Kollagen-I-Lösung (10 mg/ml); und sterile 1 N NaOH-Lösung.
- Kultur gewebespezifischer mesenchymaler Zellen nach Anweisung der Anbieter bis zu 80%-90% Konfluent und dissoziieren Sie dann die Zellen mit Trypsin oder anderen Methoden, die vom Zellanbieter empfohlen werden. Die Zellen werden in einem Pellet durch Zentrifugieren bei 250 x g für 5 min bei 24 °C gesammelt.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 225 μl eiskaltem 10x EMEM und fügen Sie 225 μl eiskalten 10x Rekonstruktionspuffer hinzu (siehe Schritt 2.1). Mischen Sie die Lösung, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, und fügen Sie dann 1.800 μl eiskalte Kollagen-I-Lösung hinzu.
- Pipettieren Sie 5-6 Mal auf und ab und vermeiden Sie Blasen, um die Pre-Gel-Lösung auf Eis zu mischen.
- Einbau des Stroma-Äquivalents auf Chip (für 12 Chips)
- Neutralisieren Sie die Pre-Gel-Lösung mit 18 μl 1 N NaOH. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie 5-6 Mal auf und ab pipettieren und dann 150 μl zellbeladenes Hydrogel in die zentrale Kammer des Open-Top-Chips pipettieren, um Blasen zu vermeiden.
HINWEIS: Wenn eine Mikrostrukturierung erforderlich ist, fahren Sie bitte mit dem nächsten Schritt (Abschnitt 3) fort. - Gruppieren Sie die Chips in separate Petrischalen mit einer Zentrifugenröhrchenkappe, die mit 2 ml sterilem ddH 2 O in jeder Petrischale gefüllt ist, und inkubieren Sie die Petrischale(n) im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2.
HINWEIS: Nach 90 Minuten ist das zellbeladene Hydrogel vollständig polymerisiert.
- Neutralisieren Sie die Pre-Gel-Lösung mit 18 μl 1 N NaOH. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie 5-6 Mal auf und ab pipettieren und dann 150 μl zellbeladenes Hydrogel in die zentrale Kammer des Open-Top-Chips pipettieren, um Blasen zu vermeiden.
3. Mikrostrukturierung der Oberfläche (optional)
- Führen Sie eine Oberflächenmikrostrukturierung des Stroma-Hydrogels durch, nachdem Sie das neutralisierte Kollagen-Hydrogel (noch in seinem flüssigen Zustand) mit 3D-gedruckten Stempeln pipettiert haben.
HINWEIS: Die 3D-gedruckten Stempel sind in verschiedenen anpassbaren Designs erhältlich, wie bereits an anderer Stelle24 beschrieben. - Pipettieren Sie 20 μl der neutralisierten Kollagen-I-Vorgellösung auf die strukturierte Oberfläche eines sterilen 3D-gedruckten Stempels und führen Sie den Stempel in die (oben) der offenen Kammer ein, während das Stroma-Hydrogel noch in flüssiger Form vorliegt.
- Entfernen Sie alle Rückstände des Hydrogels, die von der Oberseite der offenen Kammer verschüttet werden könnten, mit einem Absauger (oder einer Pipette). Gruppieren Sie alle Chips in separate Petrischalen und legen Sie in jede Petrischale eine konische Zentrifugenkappe mit 15 ml konischem Röhrchen, die mit 2 ml sterilem ddH2O gefüllt ist.
- Inkubieren Sie alle Petrischale(n) 90 min lang bei 37 °C, 5 % CO2 , und bringen Sie dann die Chips wieder unter die BSC und entfernen Sie die Stempel vorsichtig mit einer Präzisionspinzette, um das Risiko einer Beschädigung des Hydrogels zu verringern.
4. Beschichtung der Epithel- und Gefäßoberfläche mit gewebespezifischen EZM-Proteinen
- Beschichtung der vaskulären mikrofluidischen Kammer mit Proteinen der extrazellulären Matrix
- Multiplizieren Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten Chips mit 20 μl (Volumen des Gefäßkanals), um das für das Experiment erforderliche Volumen der vaskulären ECM-Beschichtungslösung abzuschätzen:
Benötigtes Volumen = (Anzahl der Chips x 20) μL
HINWEIS: Es wird empfohlen, ein zusätzliches Volumen von 15 % vorzubereiten, um experimentelle Fehler zu berücksichtigen. - Bereiten Sie die vaskuläre ECM-Beschichtungslösung für alle Chips (z. B. 300 μl pro 12 Chips) mit eiskaltem PBS oder HBSS vor.
ANMERKUNG: Beachten Sie die Tabelle mit den spezifischen Organprotokollen im Abschnitt "Ergänzende Materialien" (Ergänzende Tabelle 1 für die Haut; Ergänzende Tabelle 2 für die Alveole; Ergänzende Tabelle 2 für die Atemwege und Ergänzende Tabelle 4 für den Darm), um die spezifischen Reagenzien und die empfohlene EZM-Zusammensetzung zu identifizieren. - Pipettieren Sie 20 μl vaskuläre ECM-Beschichtungslösung in den Gefäßkanal jedes Chips.
- Multiplizieren Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten Chips mit 20 μl (Volumen des Gefäßkanals), um das für das Experiment erforderliche Volumen der vaskulären ECM-Beschichtungslösung abzuschätzen:
- Beschichtung der apikalen Oberfläche des Stroma-Äquivalents mit Proteinen der extrazellulären Matrix
- Multiplizieren Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten Chips mit 50 μl (Volumen des Gefäßkanals), um das für das Experiment erforderliche Volumen der epithelialen ECM-Beschichtungslösung abzuschätzen:
Benötigtes Volumen = (Anzahl der Chips x 50) μL
HINWEIS: Es wird empfohlen, ein zusätzliches Volumen von 15 % vorzubereiten, um experimentelle Fehler zu berücksichtigen. - Bereiten Sie genügend ECM-Beschichtungslösung für alle Chips (z. B. 750 μl pro 12 Chips) in eiskaltem PBS oder HBSS vor und übertragen Sie 50 μl epitheliale ECM-Beschichtungslösung direkt auf die Hydrogeloberfläche.
ANMERKUNG: Beachten Sie die Tabelle mit den spezifischen Organprotokollen im Abschnitt "Ergänzende Materialien" (Ergänzende Tabelle 1 für die Haut; Ergänzende Tabelle 2 für die Alveole; Ergänzende Tabelle 2 für die Atemwege und Ergänzende Tabelle 4 für den Darm), um die spezifischen Reagenzien und die empfohlene EZM-Zusammensetzung zu identifizieren. - Gruppieren Sie die Chips in separate Petrischale, einschließlich einer konischen Zentrifugenkappe mit 15 ml, die mit 2 ml sterilem ddH 2O in jeder Petrischale gefüllt ist, und inkubieren Sie die Petrischale(n) im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 h lang, bevor Sie mit der Epithelzellaussaat fortfahren.
- Multiplizieren Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten Chips mit 50 μl (Volumen des Gefäßkanals), um das für das Experiment erforderliche Volumen der epithelialen ECM-Beschichtungslösung abzuschätzen:
5. Aussaat von Epithelzellen auf das Stromaäquivalent
- Epithelzellkultur
- Kultur gewebespezifischer Epithelzellen nach Anweisung der Anbieter bis 80%-90% konfluent.
- Dissoziieren Sie die Zellen mit proteolytischen Enzymverfahren, wie vom Zellanbieter empfohlen.
Anmerkungen: Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie Epithelzellen bei niedriger Passage (P1-P2) während der aktiven Wachstumsphase ernten, wenn sie eine Konfluenz zwischen 70 % und 90 % erreichen. - Nach der Dissoziation zentrifugieren Sie die Zellen und sammeln sie als Pellet.
- Resuspendieren Sie die Epithelzellen auf die entsprechende Zell-/Fragmentdichte, wie in der spezifischen Organprotokolltabelle angegeben.
HINWEIS: In dieser Studie wurde Zelllösung mit einer Dichte von 3 x 10 6 Zellen/ml für die Haut, 1 x 10 6 Zellen/ml für die Alveole, 6 x 10 6 Zellen/ml für die Atemwege und 8 x 10 6 Fragmente/ml für den Darm verwendet.
- Aussaat von Epithelzellen
- Übertragen Sie die Chips aus dem Inkubator in den BSC. Saugen Sie die Beschichtungslösung aus dem Gefäßkanal ab und spülen Sie den mikrofluidischen Gefäßkanal dreimal mit 50 μl frischem Endothelzellkulturmedium.
- Saugen Sie die Beschichtungslösung von der Hydrogeloberfläche ab und spülen Sie die Stromaoberfläche dreimal mit 100 μl frischem Epithelzellkulturmedium ab, um überschüssige Beschichtungslösung zu entfernen.
- Aspirieren Sie das aufsteigende Medium und besiedeln Sie die Hydrogeloberfläche mit 50 μl der Epithelzellsuspension bei entsprechender Zelldichte, wie in den ergänzenden Tabellen angegeben, und übertragen Sie die Chips dann für 2 h (oder über Nacht für Kolonoide) zurück in den Inkubator.
- Spülen Sie die Hydrogeloberfläche zweimal vorsichtig mit dem Zellkulturmedium ab, um Zellreste zu entfernen. Zum Schluss wird das Medium durch Autoklavieren in versiegelten autoklavierbaren Behältern aufgefrischt und die Chips an die Peristaltikpumpe angeschlossen.
6. Verbinden von Spänen mit dem Fluss
- Vorbereitung der fluidischen Teile
- Schneiden Sie 2 Zoll biokompatiblen Transferschlauch aus thermoplastischem Elastomer (TPE) auf Polypropylenbasis (TPE) (Materialtabelle) zu, um den kurzen mikrofluidischen Schlauch vorzubereiten, der für den Anschluss der Chips an die Medienbehälter erforderlich ist.
- Schneiden Sie 7,5 Zoll biokompatiblen TPE-Transferschlauch zu, um den langen mikrofluidischen Schlauch herzustellen.
- Bereiten Sie genügend 18-G- und 19-G-Metallverbinder vor (Materialtabelle).
Anmerkungen: Es wird empfohlen, die in den Schritten 6.1.1 und 6.1.2 beschriebenen Schläuche und Anschlüsse mindestens 1 Tag vor dem Anschließen der Open-Top-Chips an die Peristaltikpumpen vorzubereiten und zu sterilisieren. - Durchstechen Sie den Deckel jedes mittleren Reservoirs mit einer 4-Zoll-Injektionsnadel (Materialtabelle).
- Mittlere Entgasung
- Lassen Sie das Zellkulturmedium auf Raumtemperatur (RT) ausgleichen.
- Fördern Sie das benötigte Medium in ein konisches Filterrohr.
- Wenden Sie einen Unterdruck von -20 PSI an, um das Medium zu entgasen (vakuumgetriebene Filtration).
Anmerkungen: Wenn kein Vakuum zur Verfügung steht, kann das Zellkulturmedium über Nacht im Inkubator im Gleichgewicht gelassen werden, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen.
- Bereiten Sie den Open-Top-Chip für den Flüssigkeitsfluss vor
- Bringen Sie die Chips und die sterilen fluidischen Teile unter den BSC und richten Sie den Deckel (oberer Teil) des Open-Top-Chips aus, um den Open-Top-Chip-Prototyp abzudichten, bevor Sie den Flüssigkeitsfluss starten.
- Pipettieren Sie 200 μl des entgasten Zellkulturmediums (siehe organspezifische Tabellen) in die Einlassöffnung des oberen und unteren Kanals des Chips und achten Sie dabei auf die Vermeidung von Blasenbildung.
- Pipettieren Sie 300 μl des Nährmediums in den kurzen mikrofluidischen Schlauch, um die Innenfläche der Röhrchen zu grundieren, und verbinden Sie den kurzen Schlauch mit den Einlässen des oberen und unteren Kanals des Chips.
- Verbinden und grundieren Sie die mikrofluidischen Oberflächen
- Positionieren Sie die Mediumreservoirs im Farm-Rack, verbinden Sie die Injektionsnadel mit dem unteren Einlass der Chips und nehmen Sie schließlich alle Chips in den Gehäuseträgern im Inkubator auf.
- Schließen Sie die Chips an die Peristaltikpumpe an und überprüfen Sie dann alle Anschlüsse, um sicherzustellen, dass alle Chips richtig angeschlossen sind und keine sichtbaren Leckagen von Zellkulturmedien auftreten.
- Verwenden Sie die Spültaste an der Pumpe und halten Sie sie etwa 15 Sekunden lang gedrückt oder bis die Tröpfchen des Zellkulturmediums am Ende des Auslassschlauchs erscheinen.
- Verwenden Sie das Steuerungssystem an der Pumpe, um die entsprechende Durchflussrate zwischen Organchip und Chip einzustellen (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5).
7. Wartung der Späne
- Instandhaltung von Organchips
- Bereiten Sie frisches Zellkulturmedium für das Epithel und/oder Endothel vor und führen Sie die Entgasungsschritte durch (wie zuvor in Schritt 6.2 beschrieben).
- Halten Sie die Peristaltikpumpe an, trennen Sie die Späne vorsichtig von der Pumpe und entnehmen Sie den/die Chipgehäuseträger. Übertragen Sie die Späne aus dem Inkubator in den BSC und entfernen Sie das in den Behältern verbleibende Medienvolumen.
- Ersetzen Sie die Zellkulturmedien in den oberen und unteren Einlassbehältern durch 5 ml frisches Zellkulturmedium und setzen Sie den/die Chipgehäuseträger wieder in den Inkubator ein. Schließen Sie die Chips an die Peristaltikpumpe an und starten Sie den Durchfluss neu.
Anmerkungen: Es wird empfohlen, die Spülfunktion zu verwenden, um das Medium schnell in das Gefäßkompartiment einzuspeisen und das Risiko von Luftblasen zu verringern. - Wiederholen Sie die Schritte 7.1.1 bis 7.1.3 jeden zweiten Tag gemäß Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5.
- Etablierung der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI)
- Halten Sie die Peristaltikpumpe an, trennen Sie die Späne vorsichtig von der Pumpe und entnehmen Sie den/die Chipgehäuseträger. Übertragen Sie die Chips aus dem Inkubator in die Biosicherheitswerkbank und entfernen Sie das verbleibende Volumen des Mediums in den oberen Behälter.
- Saugen Sie vorsichtig das gesamte Medium aus dem oberen mikrofluidischen Kanal ab und klemmen Sie den kurzen mikrofluidischen Schlauch, der mit den oberen Einlässen verbunden ist, mit Binderklammern fest, um die Verdunstung des Mediums und die Aufrechterhaltung von ALI zu reduzieren.
- Setzen Sie den Open-Top-Chip auf den/die Gehäuseträger(n) wieder in den Inkubator ein und schließen Sie die Chips wieder an die Peristaltikpumpe an.
Anmerkungen: Es wird empfohlen, die Spülfunktion zu verwenden, um das Medium schnell in das Gefäßkompartiment einzuspeisen und das Risiko von Luftblasen zu verringern. - Setzen Sie den Durchfluss fort, indem Sie die Peristaltikpumpe starten.
- Dehnen (optional)
- Halten Sie die Peristaltikpumpe an und verbinden Sie die Vakuumanschlüsse der Chips mit zwei langen Mikrofluidikschläuchen pro Chip mit dem Vakuummodul.
- Verwenden Sie das Vakuummodul, um die Dehnungseinstellung an die für jedes Organ empfohlene Bedingung anzupassen, wie in den Organprotokolltabellen angegeben: Ergänzende Tabelle 1 für die Haut; Ergänzende Tabelle 2 für die Alveole; Ergänzende Tabelle 2 für die Atemwege; und Ergänzungstabelle 4 für den Darm.
- Überprüfen Sie die Schlauchverbindungen visuell, um sicherzustellen, dass alle Chips richtig angeschlossen sind und keine sichtbaren Tropfen des Mediums tropfen.
- Setzen Sie den Durchfluss fort, indem Sie die Peristaltikpumpe starten.
8. Aussaat von Endothelzellen im Gefäßkompartiment
- Vorbereiten von Zellen und Chips für die Aussaat von Gefäßzellen
- Kultivieren Sie die gewebespezifischen Endothelzellen nach Anweisung der Anbieter, bis sie zu 80%-90% konfluieren. Dissoziieren Sie die Zellen mit einem proteolytischen Enzymverfahren (wie vom Anbieter empfohlen) und resuspendieren Sie schließlich die Endothelzellen in einer Lösung von 3 x 106 Zellen/ml.
Anmerkungen: Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie die Endothelzellen während der aktiven Wachstumsphase bei niedriger Passage (P2-P4) ernten, wenn sie zwischen 70 % und 90 % Konfluenz erreichen. - Halten Sie die Peristaltikpumpe an. Übertragen Sie die Chips aus dem Inkubator in den BSC, trennen Sie die Chips von den Medienbehältern und allen angeschlossenen Schläuchen und gruppieren Sie die Chips dann in separate Petrischalen .
- Das Zellkulturmedium des Epithelkompartiments wird mit frischem Epithelzellkulturmedium aufgefrischt. Spülen Sie den Gefäßkanal zweimal mit frischem Endothelzellkulturmedium und saugen Sie das Medium dann aus dem Gefäßkompartiment ab.
- Kultivieren Sie die gewebespezifischen Endothelzellen nach Anweisung der Anbieter, bis sie zu 80%-90% konfluieren. Dissoziieren Sie die Zellen mit einem proteolytischen Enzymverfahren (wie vom Anbieter empfohlen) und resuspendieren Sie schließlich die Endothelzellen in einer Lösung von 3 x 106 Zellen/ml.
- Aussaat von Endothelzellen
- Besiedeln Sie den unteren (vaskulären) Kanal mit 25 μl Endothelzellsuspension (3 x 106 Zellen/ml) und drehen Sie die Chips auf den Kopf, damit sich Endothelzellen an der Oberseite der mikrofluidischen Kammer festsetzen können.
HINWEIS: Fügen Sie 50 μl der Zellsuspension pro Chip hinzu (600 μl pro 12 Chips). - Die Chips in Petrischalen gruppieren. Legen Sie sie bei 37 °C, 5 % CO2 wieder in den Inkubator und lassen Sie die Endothelzellen 1 h lang anhaften.
- Übertragen Sie die Chips nach 1 Stunde aus dem Inkubator in den BSC. Spülen Sie den Gefäßkanal zweimal mit Endothelzellkulturmedium, um Zelltrümmer zu entfernen.
- Wiederholen Sie die Schritte 8.2.1-8.2.2, um den Gefäßkanal erneut mit Endothelzellen zu besiedeln, und legen Sie die Chips flach auf, um die Adhäsion der Endothelzellen an der Unterseite des Gefäßkanals zu erleichtern.
- Besiedeln Sie den unteren (vaskulären) Kanal mit 25 μl Endothelzellsuspension (3 x 106 Zellen/ml) und drehen Sie die Chips auf den Kopf, damit sich Endothelzellen an der Oberseite der mikrofluidischen Kammer festsetzen können.
- Schließen Sie den Chip wieder an den Fluss an
- Füllen Sie den Behälter des Gefäßmediums mit dem entgasten Gefäßzellkulturmedium unter dem BSC.
- Legen Sie die Chips wieder in den/die Chipgehäuseträger(s) und verbinden Sie die Chips wieder mit den Mediumbehältern an einem Ende mit der Peristaltikpumpe am anderen Ende.
Anmerkungen: Es wird empfohlen, die Spülfunktion zu verwenden, um das Medium schnell in das Gefäßkompartiment einzuspeisen und das Risiko von Luftblasen zu verringern. - Überprüfen Sie die mikrofluidischen Verbindungen visuell, um sicherzustellen, dass alle Chips richtig angeschlossen sind und keine sichtbaren Tropfen des Mediums vorhanden sind. Setzen Sie dann den Flüssigkeitsfluss wieder ein, indem Sie die Peristaltikpumpe starten.
9. Gängige Endpunkt-Assays
- Trennen von Chips für Endpunkt-Assays
- Halten Sie die Peristaltikpumpe an, trennen Sie die Späne vorsichtig von der Pumpe und entnehmen Sie den/die Chipgehäuseträger. Übertragen Sie den/die Chipgehäuseträger(s) aus dem Inkubator in den BSC und setzen Sie die Chips frei.
- Waschen Sie die zentrale Kammer des Open-Top-Chips vorsichtig zweimal mit dem Epithelzellkulturmedium und den Gefäßkanal mit dem Endothelkulturmedium, um Zellreste zu entfernen.
- Entfernen Sie den Deckel des Open-Top-Chips, um mit einer Pinzette an das apikale Fach des Chips zu gelangen.
- Immunfärbung für die Fluoreszenzmikroskopie
- Fahren Sie mit der konventionellen Probenfixierung, Permeabilisierung und Blockierung fort.
HINWEIS: In dieser Studie wurden die Proben 1 h lang in 200 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert, gefolgt von einer Spülung mit PBS, einer Permeabilisierung in 0,1 % Triton X-100 für 40 min und einer Blockierung in 1 % Rinderserumalbumin für 1 h. - Inkubieren Sie die Chips mit Primärantikörpern (Materialtabelle) bei 4 °C über Nacht. und waschen Sie dann sowohl die epithelialen als auch die endothelialen Kompartimente der Chips zweimal mit 200 μl PBS. Fahren Sie dann 2 h lang mit den entsprechenden Sekundärantikörpern fort.
HINWEIS: Verdünnen Sie die Primärantikörper und Sekundärantikörper in PBS + 1% BSA in einer Verdünnung von 1:100 (Primärantikörper) und 1:200 (Sekundärantikörper).
- Fahren Sie mit der konventionellen Probenfixierung, Permeabilisierung und Blockierung fort.
- Immunhistochemie
- Extrahieren Sie die stromalen Äquivalente mit einer Pinzette aus der Hauptkammer des Open-Top-Chips, sammeln Sie sie in einem 1,5-ml-Röhrchen, das mit 10 % neutralem, gepuffertem Formalin gefüllt ist, und inkubieren Sie sie mindestens 24 h lang.
- Übertragen Sie das fixierte Stromaäquivalent auf den Gewebeprozessor und befolgen Sie die folgenden Schritte, um eine optimale Probendehydrierung zu erreichen.
- Tauchen Sie das Hydrogel 90 Minuten lang in 70%iges Ethanol.
- Entfernen Sie das 70%ige Ethanol und tauchen Sie das Hydrogel 90 Minuten lang in 80%iges Ethanol.
- Entfernen Sie das 80%ige Ethanol und tauchen Sie das Hydrogel 90 Minuten lang in 95%iges Ethanol.
- Entfernen Sie das 95%ige Ethanol und tauchen Sie das Hydrogel zweimal 90 Minuten lang in 100%iges Ethanol.
- Entfernen Sie das 100%ige Ethanol und tauchen Sie das Hydrogel zweimal für 120 Minuten in eine Xylollösung.
- Entfernen Sie die Xylollösung und infiltrieren Sie die verarbeiteten Stromaäquivalente zweimal für 120 min (~2 h) in Paraffinwachs.
- Betten Sie die infiltrierten Stromaäquivalente in Schnittparaffinblöcke ein.
- An dieser Stelle können die Stromaäquivalente mit Hilfe eines Mikrotoms als Paraffinblöcke geschnitten und nach konventionellen histologischen Techniken verarbeitet werden26.
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Representative Results
Mikrostrukturierung von Oberflächen
Die Mikrostrukturierung der extrazellulären Matrix (EZM) kann verwendet werden, um die räumliche Konfiguration der intestinalen Kryptenschnittstelle zu replizieren. Die Open-Top-Chip-Konfiguration kann modifiziert werden, um mikrostrukturierte Stempel zu integrieren, die speziell entwickelt wurden, um die natürliche Topographie der Dickdarmepithel-Stroma-Grenzfläche (Abbildung 6A, B) und der Darmkrypten im Mikrometermaßstab nachzuahmen (Abbildung 6C-E). Bitte beachten Sie, dass wir für die Haut-, Atemwegs- und Alveolenmodelle eine flache (nicht gemusterte) Oberfläche verwendet haben. Der Stempel wurde in diesem Fall verwendet, um eine gleichmäßige Hydrogeloberfläche für Samenepithelzellen zu erhalten. Wir haben uns für ein Design entschieden, das die natürliche Architektur der menschlichen Darmschleimhaut nachahmen kann, bestehend aus dem Wechsel von positiven und negativen Kuppeln, die die Darmkrypten nachahmen.
Orgel-Modelle
Wir kultivierten und differenzierten vier verschiedene Epithelien (Haut, Alveole, Atemwege und Darm) mit dem Open-Top-Chip-Prototyp, um die Vielseitigkeit dieser biomimetischen Plattform zu beweisen. Histologische Schnitte der Organchips bestätigen das Vorhandensein von Epithelzellen, die phänotypisch unterschiedlich und repräsentativ sind für: ein geschichtetes Epithel im Falle der Haut (Abbildung 7), pseudogeschichtetes Säulenepithel im Fall der Atemwege (Abbildung 8 und ergänzendes Video 1), einfaches Plattenepithel im Fall der Alveole (Abbildung 9), und einfaches säulenförmiges Epithel im Falle des Darms (Abbildung 10). Haut-, Atemwegs- und Alveolarzellen wurden alle von kommerziell erhältlichen Anbietern bezogen (wie in der Materialtabelle angegeben).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Open-Top-Chips und des in dieser Studie verwendeten mikrofluidischen Aufbaus. (A-C) Draufsicht, Schicht-für-Schicht-Projektion und 3D-Rendering, das den Prototyp des Open-Top-Chip-Designs zeigt, bestehend aus dem abnehmbaren oberen Deckel mit ummanteltem mikrofluidischem Kanal (blau), den beiden halbmondförmigen Vakuumkanälen entlang der Kulturkammer (grau) und den unteren spiralförmigen endothelialen mikrofluidischen Kanälen (magenta). (D) Maßgefertigter Chiphalter (auch "Farmsystem" genannt), einschließlich des Chipgehäuseträgers (roter Pfeil), der Peristaltikpumpe und der Reservoirs (gelber Pfeil), die in einer Konfiguration angeordnet sind, die in einen gemeinsamen Zellkultur-Inkubator passt. € Pneumatischer Aktuator, das Instrument, das den Unterdruck steuert, der auf den Vakuumkanal der Chips ausgeübt wird, der zur Erzeugung der zyklischen mechanischen Kraft verwendet wird, die die Zellen während der Atmung oder der Peristaltikbewegung (Dehnung) erfahren. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Varone et al.24 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Technischer Überblick über das Open-Top-Skin-Chip-Protokoll. (A) Schematische Darstellung der Abfolge der Aktionen für die Open-Top-Skin-Chip-Herstellung und (B) Bereitstellung des biologischen Schlüsselschritts der Open-Top-Skin-Chip-Kultur. In der Anfangsphase der Chipherstellung werden mesenchymale Zellen (Fibroblasten) in das Gel eingebettet und in den Open-Top Chip geladen, um die Stromaschicht zu bilden, die für 2-4 h beschichtet und mit Epithelzellen besiedelt wird. Sobald die Epithelzellen eine kompakte Monoschicht gebildet haben, werden sie der Luft (ALI) ausgesetzt. Das biologische System wird unter dem ALI-Regime gehalten, bis es an Tag 14 zur Analyse geopfert wird. Die mechanische Dehnung kann während des Fließens und bei ALI angewendet werden. Die Dehnung wird so lange beibehalten, bis das Gewebe für die Analyse geopfert wird. Weitere Informationen zur Zusammensetzung des Mediums, zu spezifischen Reagenzien und Zelltypen finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Technischer Überblick über das Open-Top-Alveolus-Chip-Protokoll. (A) Schematische Darstellung der Abfolge der Aktionen für die Open-Top-Alveolus-Chip-Herstellung und (B) Bereitstellung des biologischen Schlüsselschritts der Open-Top-Alveolus-Chip-Kultur. In der Anfangsphase der Chip-Präparation werden mesenchymale Zellen (Fibroblasten) in das Gel eingebettet und in den Open-Top-Chip geladen, um die Stromaschicht zu bilden, die für 2-4 h beschichtet und in einem mit KIAD angereicherten Medium mit Atemwegsepithelzellen besiedelt wird (siehe ergänzende Tabelle 2). EGF-supplementiertes Medium wird ~4 Tage lang aufrechterhalten, um das Wachstum der Epithelzellen zu unterstützen. Das Epithel wird dann ~10 Tage lang der Luft (ALI) ausgesetzt, um eine vollständige Gewebereifung zu erreichen. Lungenmikrovaskuläre Endothelzellen werden an Tag 14 ausgesät, und das biologische System wird unter ALI- und Flussregime gehalten, bis es an Tag 21 zur Analyse geopfert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Technischer Überblick über das Open-Top-Airway-Chip-Protokoll. (A) Schematische Darstellung der Abfolge der Aktionen für die Open-Top-Airway-Chip-Präparation und (B) Bereitstellung des biologischen Schlüsselschritts der Open-Top-Airway-Chip-Kultur. In der Anfangsphase der Chip-Präparation werden mesenchymale Zellen (Fibroblasten und/oder glatte Muskelzellen) in das Gel eingebettet und in den Open-Top-Chip geladen, um die Stromaschicht zu bilden, die für 2-4 h beschichtet und mit Epithelzellen in Medium angereichert mit EGF besiedelt wird (siehe ergänzende Tabelle 3). EGF-supplementiertes Medium wird ~4 Tage lang aufrechterhalten, um das Wachstum der Epithelzellen zu unterstützen. Das Epithel wird dann ~10 Tage lang der Luft (ALI) ausgesetzt, um eine vollständige Gewebereifung zu erreichen. Lungenmikrovaskuläre Endothelzellen werden an Tag 14 ausgesät, und das biologische System wird unter ALI- und Flussregime gehalten, bis es an Tag 21 zur Analyse geopfert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Technischer Überblick über das offene Darm-Chip-Protokoll. (A) Schematische Darstellung der Abfolge der Aktionen für die offene Darm-Chip-Präparation und (B) Bereitstellung des biologischen Schlüsselschritts der offenen Darm-Chip-Kultur. In der Anfangsphase der Chip-Präparation werden mesenchymale Zellen (Kolonfibroblasten) in das Gel eingebettet und in den Open-Top-Chip geladen, um die Stromaschicht zu bilden, die für 2-4 h beschichtet und mit Fragmenten von Epithelkolonoiden besiedelt wird, die aus klinischen Resektionen gewonnen wurden. Zellkulturmedium, einschließlich Nahrungsergänzungsmittel (ROCK und CHIR, siehe ergänzende Tabelle 4), ist während des Aussaatschritts erforderlich, um die Lebensfähigkeit und physiologische Morphologie der Kolonoide zu erhalten. Verschiedene Medien werden dann verwendet, um die Expansion (Tag 1 bis 6) und Reifung (Tag 6 bis 9) des Dickdarmepithels voranzutreiben. Kolonische mikrovaskuläre Endothelzellen werden an Tag 6 mit einem Endothelzellkulturmedium (EGM2 MV) ausgesät und dann unter Fließen mit einem epithelialen Expansionsmedium für bis zu 10 weitere Tage kultiviert. Das Epithel wird ab dem 10. Tag ALI ausgesetzt, um die Reifung der Epithelzellen weiter zu fördern. Die mechanische Dehnung kann ab Tag 13 auf das System angewendet und bis zum Tag 16 beibehalten werden, wenn das Organmodell für die Endpunktanalyse geopfert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Mikromuster-Stanzen. (A) Die Seiten- und Draufsicht des Stempels mit mikroskaliger Textur (500 μm Höhe und 250 μm Breite) wird verwendet, um die Gewebeschnittstelle der Dickdarmkrypta sowie die Drauf- und Seitenansicht der Stempel-Chip-Baugruppe nachzubilden, die die Passung der beiden Elemente zeigt, wenn sie zum Gießen der Geloberfläche verwendet werden. (B) Abgewinkelte Seitenansicht mit der Schnittstelle zwischen Stempel und Chip. (C-E) Bilder der mikrostrukturierten Geloberfläche mit und ohne Zellen. Maßstabsbalken: 200 μm. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Varone et al.24 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Repräsentative Daten, die mit dem offenen Skin-Chip erhalten wurden. (A) Schematische Darstellung des Wirkungsablaufs für die Open-Top-Skin-Chip-Herstellung und Bereitstellung der wichtigsten biologischen Schritte der Open-Top-Skin-Chip-Kultur. (B) PCNA-Zytokeratin-14-, Cytokeratin-10-, Involucrin- und Fillagrin-Fluoreszenzfärbung und H&E-Färbung mit reifer, mehrschichtiger, geschichteter Epidermis, die auf dem Chip differenziert ist. Maßstabsbalken: 100 μm. (C) Draufsicht des Skin-Chips (Maßstabsbalken: 5 mm) und H&E-Querschnitt (Maßstabsbalken: 100 μm), die das Vorhandensein der Fibroblasten in der Hautschicht zeigt. (D) PECAM-1, VE-Cadherin und Von Willebrand Fluoreszenzfärbung zeigen die Differenzierung von humanen mikrovaskulären Endothelzellen, die im offenen Hautchip kokultiviert wurden. Maßstabsbalken: 20 μm. (E) 3D-Cartoon-Konzept-Rendering des offenen Skin-Chips. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Varone et al.24 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Repräsentative Daten, die mit dem Open-Top-Atemwegschip erhalten wurden. (A) Schematische Darstellung der Wirkungsabfolge für die Open-Top-Atemwegschip-Präparation und Bereitstellung des biologischen Schlüsselschritts der Open-Top-Atemwegschip-Kultur. (B) MUC5AC (Kelch), α und β-Tubulin (Flimmerzellen), Clara-Zellprotein 16 (Keulenzellen), p63 (Basal-/Vorläuferzellen) und ZO-1-Fluoreszenzfärbung mit reifem Atemwegsepithel. Maßstabsbalken: 20 μm. (C) Video/Bild mit Phasenkontrast, das das Vorhandensein von schlagenden Flimmerhärchen zeigt. Maßstabsbalken: 50 μm. (D) H&E-Färbung (Maßstabsbalken: 20 μm) und TEM-Bild (Maßstabsbalken: 5 μm) zeigen reifes, pseudogeschichtetes Epithel, differenziert auf dem Chip. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Repräsentative Daten, die mit dem offenen Alveolen-Chip gewonnen wurden. (A) Schematische Darstellung des Wirkungsablaufs für die Herstellung des offenen Alveolen-Chips und Bereitstellung des biologischen Schlüsselschritts der offenen Alveolen-Chip-Kultur. (B) Fluoreszenzfärbung Typ I (HTI-56, AT1-α), Typ II (HTII-280, LAMP3, ABCA3, Tensid (C) und E-Cadherin, die das Vorhandensein reifer Pneumozyten auf dem Chip zeigt. Maßstabsbalken: 20 μm. (C) REM- und TEM-Bild, das das Vorhandensein von Mikrovilli und lysosomalen Vesikeln zeigt, die auf einen reifen alveolären Phänotyp hinweisen. Maßstabsbalken: 5 μm. (D) H&E-Querschnitt (Maßstabsbalken: 5 μm), der das Vorhandensein von flachen, plattenepithelartigen Zellen bestätigt, die mit dem Typ-I-Phänotyp übereinstimmen, und quaderförmigen, kopfsteinpflasterartigen Zellen, die mit dem Typ-II-Phänotyp kohärent sind, und (E) zeigt das Vorhandensein der Fibroblasten innerhalb der Hautschicht (Maßstabsbalken: 10 μm). (F) 3D-Cartoon-Konzept-Rendering des offenen Alveolen-Chips. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Varone et al.24 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 10: Repräsentative Daten, die mit dem offenen Darm-Chip gewonnen wurden. (A) Schematische Darstellung des Wirkungsablaufs für die Open-Top-Darm-Chip-Präparation und Bereitstellung des biologischen Schlüsselschritts der Open-Top-Darm-Chip-Kultur. (B) Schräge Seitenansicht, die die Stempel- und Chip-Baugruppe während der Gelgussphase, das Cartoon-Konzept des mikrogemusterten Gels und Phasenkontrastbilder einer kryptenartigen Struktur zeigt, die auf der Geloberfläche mikrogemustert und mit Kolonoide in zwei verschiedenen Höhen besiedelt ist. Maßstabsbalken: 200 μm. (C) Mucin 2- und E-Cadherin-Fluoreszenzfärbung, die das Vorhandensein von Enterozyten und reifen Becherzellen auf dem Chip zeigt. Maßstabsbalken: 200 μm. (D) H&E-Querschnitt einer kryptenartigen Struktur, der das Vorhandensein der Fibroblasten innerhalb der Hautschicht zeigt und das Vorhandensein eines einfachen säulenförmigen Epithels bestätigt. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzungsvideo 1: Phasenkontrast-Video, das schlagende Flimmerhärchen zeigt. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 1: Offene Chipbaugruppe. (A) Schematische Darstellung der dreidimensionalen Darstellung der Open-Top-Chip-Baugruppe und der Cartoon-Darstellung des Open-Top-Skin-Chips, wobei die verschiedenen biologischen Kompartimente hervorgehoben sind, einschließlich Epithel (blau), dermal (gelb) und vaskulär (rot). (B) Die zusammengebaute mikrofluidische Plattform hat ein Format von 35 mm x 17 mm, eine Gewebekulturfläche von 0,32cm2, einen mikrofluidischen Kanal mit Bodenspirale und einen Kammerdeckel mit einem mikrofluidischen Kanal. (C) Die Plattform umfasst eine Kammer mit einer um 5 Grad abgewinkelten Wand, die einen Durchmesser von 6 mm auf Höhe der Membran und 5,7 mm an der Oberseite der PDMS-Kammerwand und eine Höhe von 4 mm und Breite hat. Die poröse Membran ist 50 μm dick und die Poren haben einen Durchmesser von 7 μm. (D) Der untere spiralförmige mikrofluidische Kanal hat Querschnittsabmessungen von 400 μm (Höhe) x 600 μm (Breite). (E) Ein Überblick über den Zeitplan des Experiments und die Schritte, die für die Herstellung des Open-Top-Organ-Chips erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Haut. Die Tabelle bietet eine Zusammenfassung der wichtigsten täglichen Schritte und der Dehnungs- und Flow-Parameter, die während der drei Phasen der Open-Top-Skin-Chip-Kultur (Wachstum, Proliferation und Differenzierung) verwendet werden. Die Tabelle enthält auch die Liste der Materialien, die Formulierungen des Mediums und Anweisungen zur Vorbereitung der für dieses Protokoll erforderlichen Medien. Die Zusammensetzung der drei Medien ist für die verschiedenen Phasen des Protokolls optimiert. Insbesondere ist Medium I für die Aussaat und die frühe Keratinozytenkulturphase optimiert. Medium II ist für Proliferation und frühe Differenzierung (Bildung eines geschichteten Epithels) optimiert. Das ALI-Medium ist für die Aufrechterhaltung von Keratinozyten an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche optimiert, bis eine vollständig differenzierte Epidermis entsteht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: Alveole. Die Tabelle bietet eine Zusammenfassung der wichtigsten täglichen Schritte und der Streckungs- und Flussparameter, die während der drei Phasen der offenen Alveolen-Chip-Kultur (Wachstum, Proliferation und Differenzierung) verwendet werden. Die Tabelle enthält auch die Liste der Materialien, die Formulierungen des Mediums und Anweisungen zur Vorbereitung der für dieses Protokoll erforderlichen Medien. Die Zusammensetzung der beiden Medien ist für die verschiedenen Phasen des Protokolls optimiert. Bitte beachten Sie, dass die Zugabe von Nahrungsergänzungsmitteln (KIAD) zum Zellkulturmedium entscheidend ist, um eine optimale Differenzierung der Pneumozyten zu erreichen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 3: Atemwege. Die Tabelle bietet eine Zusammenfassung der wichtigsten täglichen Schritte und der Dehnungs- und Flussparameter, die während der drei Phasen der offenen Atemwegschipkultur (Wachstum, Proliferation und Differenzierung) verwendet werden. Die Tabelle enthält auch die Liste der Materialien, die Formulierung des Mediums und Anweisungen zur Herstellung des für dieses Protokoll erforderlichen Mediums. Die Zusammensetzung des Mediums ist optimiert, um Atemwegszellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu halten, was wiederum die terminale Differenzierung induziert und die Schleimproduktion stimuliert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 4: Darm. Die Tabelle bietet eine Zusammenfassung der wichtigsten täglichen Schritte und der Dehnungs- und Flussparameter, die während der drei Phasen der offenen Darm-Chip-Kultur (Wachstum, Proliferation und Differenzierung) verwendet werden. Die Tabelle enthält auch die Liste der Materialien, die Formulierungen des Mediums und Anweisungen zur Vorbereitung der für dieses Protokoll erforderlichen Medien. Die Zusammensetzung beider Medien ist für die verschiedenen Phasen des Protokolls optimiert. Konkret ist das mit den CHIR- und ROCK-Inhibitoren ergänzte Expansionsmedium für die Aussaat und die frühe Phase der Kultur optimiert, da es das Überleben und Wachstum des Organoidfragments des Dickdarms als Monoschicht fördert. Das Expansionsmedium ist für die Proliferation und frühe Differenzierung von Epithel-Monolagen optimiert. Das Differenzierungsmedium ist für die terminale Differenzierung der Epithel-Monoschicht vor der Exposition gegenüber der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche optimiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Der Open-Top-Chip stellt eine Plattform dar, um das komplexe zelluläre Zusammenspiel zwischen Endothel, Stroma und Epithel in einer kontrollierten Mikroumgebung in Echtzeit zu untersuchen. Diese Technologie bietet entscheidende Vorteile gegenüber herkömmlichen organotypischen und organoiden Kulturen, wie z. B. die Integration physikalischer und biochemischer Signale, die für die Rekonstruktion der Mikroumgebung des menschlichen Gewebes relevant sind, einschließlich fluidischer Scherung (Strömung), zyklischer Dehnung und Rekonstruktion der epithelialen Oberflächentopographie, die durch Mikrostrukturierung erreicht wird. Menschliche Zellen, die innerhalb dieser Plattform wachsen, wirken synergetisch, um gewebespezifische Funktionen zu rekapitulieren, die mit herkömmlichen Techniken analysiert werden können, einschließlich Immunhistochemie und biochemischer Assays unter Verwendung der Ausflussflüssigkeiten (oder Abwässer) aus den oberen und/oder unteren Kompartimenten. Das aktuelle Design ermöglicht einen einfachen Zugang zur Epithelschicht, in der Zellen in direktem Kontakt mit gewebespezifischen Fibroblasten und anderen Stromazellen wachsen und die multizelluläre Architektur von Epithelgewebe nachahmen. Insbesondere bietet der Open-Top-Chip-Prototyp eine praktikable Lösung für häufige Herausforderungen, die mit der Verwendung anderer Organ-on-Chip-Plattformen verbunden sind. Es ermöglicht nicht nur den Einbau mehrerer verschiedener Zelltypen in ein Stromakompartiment, was zur Erzeugung sehr komplexer 3D-Gewebe führt, sondern ermöglicht auch die einfache Extraktion der etablierten Gewebekonstrukte aus dem Chipgerät für die nachgeschaltete Analyse, einschließlich der konventionellen H&E-Färbung.
Das aktuelle Design weist einige Einschränkungen auf. So ist beispielsweise die elastische Membran, die zwischen dem vaskulären Mikrokanal und dem Stromakompartiment (Hydrogel) des Prototyps des Open-Top-Chips angeordnet ist, erheblich dicker (≈ 50 μm gegenüber ≈ 1 μm) als der Zwischenraum, der das Endothelgewebe vom Stroma in den nativen menschlichen Organen trennt. Obwohl die elastische Membran keine physikalische Barriere für die Diffusion großer Moleküle wie Hormone und anderer parakriner Faktoren darstellt, die die interzelluläre Wechselwirkung zwischen Geweben vermitteln, kann sie die direkten Zell-Zell-Interaktionen und die Migration von Zellen vom vaskulären zum stromalen Kompartiment einschränken. Schließlich besteht der Prototyp des Open-Top-Chips aus PDMS, von dem bekannt ist, dass es eine Vielzahl von hydrophoben Verbindungen absorbiert. Diese Einschränkung wird von vielen PDMS-basierten Plattformen geteilt, die bei Anwendungen, die zur Prüfung der Pharmakodynamik und Pharmakokinetik kleiner therapeutischer Verbindungen bestimmt sind, ein ernsthaftes Hindernis darstellen können27.
Eine der größten Herausforderungen bei der Integration von 3D-Hydrogelen in ein mikrofluidisches Gerät wie den Open-Top-Chip besteht darin, dass das PDMS kein optimales Substrat für die Bindung menschlicher Proteine oder Zellen bietet. Die chemische Funktionalisierung der PDMS-Oberfläche ist daher ein kritischer Schritt in diesem Protokoll, der erforderlich ist, um eine ordnungsgemäße ECM-Beschichtung und Hydrogelhaftung an der Gelkammer des Open-Top-Chip-Modells zu gewährleisten. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, muss der Vernetzer in der ER1-Lösung immer vor direkter Lichteinwirkung geschützt werden. Ein wichtiger Indikator für den Reaktionszustand des Vernetzers ist seine Farbe. Der Vernetzer im ER1 erfährt bei der Oxidation einen Farbübergang von leuchtendem Orange zu Dunkelbraun. Der Farbübergang kann als Indikator nach dem UV-Aktivierungsschritt verwendet werden, um zu überprüfen, ob die Lösung effektiv mit der PDMS-Oberfläche reagiert hat. Bei der Herstellung der Vernetzerlösung sollte der Farbübergang überwacht werden, um sicherzustellen, dass eine versehentliche Einwirkung von direktem Licht die chemische Verbindung in der Lösung nicht photobleichen lässt. Um die Vernetzerlösung zu schützen und unerwünschtes Ausbleichen zu vermeiden, empfehlen wir, Aluminiumfolie, ca. 15 cm x 15 cm, um ein konisches 15-ml-Röhrchen zu wickeln oder ein auf dem Markt erhältliches Braunröhrchen zu verwenden. Der Einsatz des ER1 ermöglicht eine einfache und effektive Methode, um eine schnelle Funktionalisierung der PDMS-Oberflächen zu erreichen; Es gibt jedoch andere Moleküle, die anstelle von ER1 verwendet werden können. Zum Beispiel ist der chemische Vernetzer 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APTMES) nicht so lichtempfindlich wie das ER1 und kann verwendet werden, um mit wenigen zusätzlichen Schritten ähnliche Ergebnisse zu erzielen, wie wir zuvor an anderer Stelle beschrieben haben28,29. Unabhängig vom gewählten Molekül ist eine der Haupteinschränkungen bei der Arbeit mit einem chemischen Vernetzer das Vorhandensein von Reststoffen, die eine Zytotoxizität induzieren können. Nach der Aktivierungsreaktion ist es wichtig, die mikrofluidischen Oberflächen mit reichlich Waschlösung zu spülen.
Da Luftblasen dazu neigen, sich in den hydrophoben Grenzflächen der Chips, Schläuche und Steckverbinder zu bilden und zu wachsen, ist es wichtig zu beurteilen, ob der mikrofluidische Pfad frei von Luftblasen ist, bevor der Flüssigkeitsfluss gestartet wird. Blasen können in der Tat den Fluss stören und sogar die Zellen töten, wenn Chips mit dem Fluss verbunden sind. Das Ansaugen der mikrofluidischen Komponenten vor dem Start des Flüssigkeitsflusses verringert das Risiko der Bildung von Luftblasen und trägt dazu bei, optimale und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Wenn der in diesem Protokoll beschriebene Priming-Zyklus nicht ausreicht, wird durch Spülen der mikrofluidischen Röhrchen mit Ethanol (5 min) und dann mit HBSS (20 min) das Risiko der Bildung von Luftblasen in den fluidischen Anschlüssen weiter verringert.
Trotz seiner Einschränkungen besitzt PDMS eine seltene Kombination chemischer Eigenschaften, die die Herstellung hochgradig biokompatibler, transparenter und elastischer mikrofluidischer Bauelemente ermöglicht hat. All diese Eigenschaften haben PDMS in den letzten zehn Jahren zum am weitesten verbreiteten Material für den Bau von Organ-on-Chip-Modellen gemacht. Jüngste Fortschritte in den Bereichen Materialwissenschaft und Chemieingenieurwesen30,31 deuten darauf hin, dass die PDMS-Komponente dieser Plattform in naher Zukunft durch neue synthetische Polymere oder Biomaterialien ersetzt werden könnte. Wenn dies gelingt, könnte es die Rekapitulation gewebespezifischer Eigenschaften ermöglichen, einschließlich Porosität, EZM-Zusammensetzung des interstitiellen Raums, die eine engere Mimikry zu menschlichem nativem Gewebe bietet, und fortschrittlichere Modelle für pharmakologische Studien. Wir gehen davon aus, dass die zukünftige Entwicklung des Open-Top-Chip-Designs die Modellierung menschlicher Gewebe und Organe mit einem noch nie dagewesenen Detaillierungsgrad ermöglichen wird.
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Disclosures
Die Autoren geben die folgenden finanziellen Interessen/persönlichen Beziehungen an, die als potenzielle Interessenkonflikte angesehen werden können: Varone Antonio ist ein ehemaliger Mitarbeiter von Emulate Inc. und kann eine Kapitalbeteiligung an Emulate halten.
Acknowledgments
Nichts
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
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