Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Определение тепловых пределов для зоопланктона с помощью теплового блока

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64762
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology Department, Swarthmore College

Summary

Настоящий протокол иллюстрирует использование коммерчески доступных компонентов для генерации стабильного и линейного теплового градиента. Такой градиент затем может быть использован для определения верхнего теплового предела планктонных организмов, особенно личинок беспозвоночных.

Abstract

Тепловые пределы и широта широко используются для прогнозирования распространения видов. Поскольку глобальная температура продолжает расти, понимание того, как тепловой предел изменяется с акклиматизацией и как он варьируется между этапами жизни и популяциями, имеет жизненно важное значение для определения уязвимости видов к будущему потеплению. Большинство морских организмов имеют сложные жизненные циклы, которые включают ранние планктонные стадии. Хотя количественная оценка теплового предела этих небольших ранних стадий развития (от десятков до сотен микрон) помогает выявить узкие места в развитии, этот процесс может быть сложным из-за небольшого размера целевых организмов, больших требований к пространству на скамейке и высокой начальной стоимости изготовления. Здесь представлена установка, ориентированная на небольшие объемы (от мл до десятков мл). Эта установка сочетает в себе коммерчески доступные компоненты для создания стабильного и линейного теплового градиента. Также представлены производственные спецификации установки, а также процедуры введения и перечисления живых и мертвых людей и расчета летальной температуры.

Introduction

Термическая толерантность является ключом к выживанию и функции организмов 1,2. Поскольку планета продолжает нагреваться из-за антропогенных выбросов углерода, все большее внимание уделяется определению и применению тепловых пределов3. Различные конечные точки, такие как смертность, неспособность развиваться и потеря подвижности, использовались для определения как верхних, так и нижних температурных пределов4. Эти тепловые пределы часто считаются прокси для тепловой ниши организма. Эта информация, в свою очередь, используется для выявления видов, которые более уязвимы к глобальному потеплению, а также для прогнозирования будущего распространения видов и результирующих видовых взаимодействий 3,5,6,7. Однако определение тепловых пределов, особенно для небольших планктонных организмов, может быть сложной задачей.

Для планктонных организмов, особенно личиночных стадий морских беспозвоночных, тепловой предел может быть определен путем хронического воздействия. Хроническое воздействие достигается путем выращивания личинок при нескольких температурах в течение дней до недель и определения температуры, при которой выживаемость личинок и/или скорость развития снижаются на 8,9,10. Однако этот подход является довольно трудоемким и требует больших инкубаторов и опыта в личиночном животноводстве (см. ссылку11 для хорошего введения в культивирование личинок морских беспозвоночных).

В качестве альтернативы, острое воздействие теплового стресса может быть использовано для определения тепловых пределов. Часто этот подход к определению включает в себя помещение небольших флаконов с личинками в сухие ванны с контролируемой температурой 12,13,14, использование функций теплового градиента в тепловых циклерах ПЦР 15,16 или помещение стеклянных флаконов / микроцентрифужных трубок вдоль теплового градиента, генерируемого примененным нагревом и охлаждением на концах больших алюминиевых блоков с отверстиями, в которые флаконы плотно помещаются17, 18,19. Типичные сухие ванны генерируют единичную температуру; следовательно, несколько блоков должны эксплуатироваться одновременно для оценки производительности в диапазоне температур. Термоциклеры генерируют градиент, но вмещают только небольшой объем образца (120 мкл) и требуют тщательных манипуляций. Подобно тепловым циклерам, большие алюминиевые блоки создают линейные и стабильные температурные градиенты. Оба подхода могут быть объединены с логистической или пробитовой регрессией для вычисления летальной температуры для 50% процентов населения (LT50)12,20,21. Тем не менее, используемые алюминиевые блоки были ~ 100 см в длину; этот размер требует большого лабораторного пространства и доступа к специализированным компьютерным фрезерным станкам с числовым программным управлением для сверления отверстий. Вместе с использованием двух гидромассажных водяных бань для поддержания целевой температуры финансовые затраты на сборку установки высоки.

Поэтому эта работа направлена на разработку альтернативных средств для генерации стабильного линейного градиента температуры с коммерчески доступными деталями. Такой продукт должен иметь небольшую площадь и должен быть легко использован для экспериментов по воздействию острого теплового стресса для планктонных организмов. Этот протокол разработан с использованием зоопланктона размером <1 мм в качестве целевых организмов, и, таким образом, он был оптимизирован для использования микроцентрифужной трубки объемом 1,5 или 2 мл. Более крупным исследуемым организмам потребуются контейнеры больше, чем используемые микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл, и увеличенные отверстия в алюминиевых блоках.

Помимо того, чтобы сделать экспериментальный аппарат более доступным, эта работа направлена на упрощение конвейера обработки данных. В то время как коммерческое статистическое программное обеспечение предоставляет процедуры для вычисления LT50 с использованием логистической или пробитной регрессии, стоимость лицензирования нетривиальна. Поэтому простой в использовании скрипт, основанный на статистической программе R22 с открытым исходным кодом, сделает анализ данных более доступным.

Этот протокол показывает, как компактный тепловой блок может быть изготовлен из коммерчески доступных деталей и применен к воздействию зоопланктона (личинок песочного доллара Dendraster excentricus) на острый тепловой стресс для определения их верхнего теплового предела.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Изготовление теплового блока

  1. Подключите полосовой нагреватель напряжением 120 В, 100 Вт к реостату (см. Таблицу материалов).
  2. Подготовьте алюминиевый блок размером 20,3 см x 15,2 см x 5 см (8 дюймов x 5 дюймов x 2 дюйма), просверлив 60 отверстий в сетке 6 x 10 (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что отверстия расположены на расстоянии 2 см от центра до центра в обоих направлениях. Каждый из них должен быть 1,1 см в диаметре и 4,2 см в глубину (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните сверление на фрезерном станке или сверлильном прессе с высокоскоростными стальными сверлами. Нагревательный элемент и охлаждающий элемент были выбраны таким образом, чтобы покрыть как можно большую часть контактной поверхности поверхностей размером 15,2 см х 5 см.
  3. Просверлите два дополнительных отверстия на одной из поверхностей размером 20,3 см х 5 см между1-й и2-й колоннами и9-й и 10-й колоннами, соответствующие размеру датчиков регулятора температуры (см. Таблицу материалов).
  4. Сконструируйте корпус из прозрачных акриловых листов размером 1,2 см (0,5 дюйма) (см. Таблицу материалов), чтобы удерживать элементы на месте и изолировать готовый тепловой блок. Используйте два слоя акрила для изоляции задней стороны нагревательного элемента (рисунок 1).
  5. При окончательной сборке нанесите термопасту (см. Таблицу материалов) для максимизации теплопроводности от нагревательного элемента в блок и от блока к охлаждающему элементу.

2. Определение параметров теплового градиента

  1. Соедините водяную баню/аквариумный чиллер с трубкой Tygon (см. Таблицу материалов). При необходимости изолируйте трубы изоляцией из пенопласта.
  2. Вставьте датчик термостата в отверстия на боковой стороне алюминиевого блока. Убедитесь, что зонд 1 расположен рядом с нагревательным элементом.
  3. Поместите микроцентрифужные трубки, заполненные до краев (1,5 мл) водопроводной водой, во все фрезерованные отверстия (всего 60 трубок).
  4. Включите регулятор температуры и установите температуру стоп-нагрева зонда 1 на 35-37 °C и зонда 2 на 21,5-22,5 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемый термостат имеет два выхода, которые работают независимо; только зонд 1 используется для регулирования температуры тепла в данном конкретном случае использования. Поэтому установите температуру зонда 2 на температуру низкого уровня.
  5. Поверните реостат, чтобы включить нагревательный элемент и установить его на средний.
  6. Включите водяную баню/аквариумный чиллер и установите температуру чиллера на 15 °C.
  7. Убедитесь, что блок теплый на одном конце и холодный на другом через 10 минут.
    ВНИМАНИЕ: Открытые концы нагревательного элемента могут быть горячими; не трогайте их.
  8. Проверяйте температуру внутри каждой микроцентрифужной трубки с помощью термопары с электродом К-типа (см. Таблицу материалов) каждые 10 минут после этого. Температура стабилизируется через ~60 мин и будет казаться линейной (рисунок 2).
  9. Отрегулируйте значения конечных точек, изменив настройки регулятора температуры и водяной бани по мере необходимости.

3. Тепловое воздействие и перечисление живых:мертвых

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2 может быть опущен после определения желаемых настроек градиента температуры.

  1. Включите циркуляционную водяную баню и нагреватель и установите их на 15 °C и 37 °C соответственно, чтобы создать градиент температуры от 19,5 °C до 37 °C.
  2. Чтобы убедиться, что тепловой градиент является линейным, поместите микроцентрифужные трубки, заполненные до краев (1,5 мл) водопроводной водой, во все фрезерованные отверстия (всего 60 трубок).
  3. Дайте тепловому блоку достичь заданной температуры, подождав 45-60 мин. Проверьте температуру внутри каждой микроцентрифужной трубки с помощью термопары с электродом K-типа, чтобы увидеть, достигла ли она ожидаемой температуры. Обратите внимание на эти температуры.
  4. Если исследуемые организмы имеют размер >500 мкм и могут быть легко перенесены из одного контейнера в другой (например, копепод), заполните микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл 750 мкл 0,45 мкм фильтрованной морской воды. В качестве альтернативы, если исследуемые организмы небольшие, заполните микроцентрифужную трубку 1,5 мл 250 мкл 0,45 мкм фильтрованной морской воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для репрезентативных данных использовались личинки песчаных эксцентриков Dendraster, которым 2, 4 и 6 дней после оплодотворения (см. Таблицу материалов). Средний (± S.D., n = 15 для каждого возраста) размер этих особей составлял 152 ± 7 мкм, 260 ± 17 мкм и 292 ± 14 мкм соответственно. Учитывая, что эти личинки могут быть легко сконцентрированы (стадия 3.5), микроцентрифужные трубки были заполнены 750 мкл фильтрованной морской воды.
  5. Сконцентрируйте культуру исследуемых организмов с помощью обратной фильтрации (т.е. поместите сетку в емкость, содержащую исследуемые организмы, и удалите воду через верхнюю часть сетки), чтобы исследуемые организмы оставались в нижней части стакана11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для изученных личиночных песочных долларов использовалась нейлоновая сетка размером 30 мкм (см. Таблицу материалов).
  6. Промыть концентрированный образец животного фильтрованной морской водой (например, при культивировании с водорослями или другими химическими веществами). Повторите обратную фильтрацию еще раз, чтобы сконцентрировать образец животного.
  7. Поместите известное количество отдельных организмов в наполовину заполненные микроцентрифужные трубки. Подсчитайте мелкие планктонные организмы под рассекающим микроскопом (см. Таблицу материалов) и переложите их стеклянными пипетками Пастера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество организмов, подлежащих размещению, зависит от размера; для личиночных песочных долларов размером ~200 мкм было уместно 20 особей на микроцентрифужную трубку.
    ВНИМАНИЕ: Стеклянные пипетки более желательны, чем пластиковые, так как некоторые планктонные организмы являются гидрофобными и будут прилипать к пластиковым поверхностям.
  8. Добавьте 0,45 мкм отфильтрованной морской воды в микроцентрифужные трубки, содержащие животных, пока конечный объем не составит 1 мл.
  9. Чтобы позволить организмам постепенно прогреться до желаемой экспериментальной температуры, поместите микроцентрифужные трубки с животными, подготовленные на этапе 3.7, в тепловой блок, начиная с холодного конца. Разместите пары микроцентрифужных трубок на каждом ряду (всего 12 трубок).
  10. Подождите 10 минут.
  11. Переместите пары микроцентрифужных трубок, вставленных на шаге 3.9, в соседние просверленные отверстия с более высокими температурами. Поместите дополнительные пары микроцентрифужных трубок в каждый ряд на холодном конце. Каждый ряд теперь будет иметь четыре трубки. Подождите еще 10 минут.
  12. Продолжайте добавлять микроцентрифужные трубки с животными, смещая их положения с более холодного конца на более теплый конец парами. Подождите 10 минут между каждой сменой, пока тепловой блок не будет полностью заполнен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 3.9-3.12 рассматриваются как фаза наращивания для постепенного повышения температуры, испытываемой исследуемыми организмами.
  13. Дайте животным высиживаться при заданной температуре в течение 2 ч. Этот этап является фазой постоянного температурного воздействия эксперимента.
    1. Проверяйте температуру микроцентрифужных трубок термопарой каждый час, если инкубационный период превышает 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время инкубации в зависимости от экспериментальных потребностей. Если инкубация длится более 2 ч, проверьте температуру трубок через равные промежутки времени с помощью термопары в случае непредвиденного отказа оборудования. Чтобы свести к минимуму помехи исследуемым организмам, случайным образом поместите шесть или более микроцентрифужных трубок, заполненных только отфильтрованной морской водой, в блок для мониторинга температуры.
  14. В конце инкубационного периода измеряют температуру внутри каждой микроцентрифужной трубки с помощью термопары с электродом К-типа. Обратите внимание на эти температуры.
  15. Удалите все 60 микроцентрифужных трубок с животными и поместите их в предварительно маркированные держатели.
  16. Инкубировать трубы (стадия 3.14) при заданной температуре, такой как температура выращивания, в течение 1 ч, что является периодом восстановления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Период восстановления может быть видоспецифичным. Для личиночного песочного доллара температура выращивания составляла 18 °C, и поэтому образец помещали в экологическую камеру. Обратитесь к соответствующей литературе и / или проведите пробный эксперимент, чтобы убедиться, что количество живых: мертвых не было затронуто продолжительностью периода восстановления. В репрезентативных данных количество животных, живших через 1 ч, было таким же, как и после 12 или 24 ч выздоровления.
  17. Чтобы перечислить долю исследуемого организма, который жив после теплового воздействия, перенесите содержимое отдельной микроцентрифужной трубки на чашку Петри толщиной 35 мм с помощью стеклянной пипетки.
  18. Понаблюдайте и обратите внимание на относительное количество особей, которые еще активны (живы) и тех, кто захватил плавание или растворился (умер) под рассекающим микроскопом. Убедитесь, что общее число наблюдаемых особей равно числу особей, помещенных в трубки на этапе 3.7. Проверьте боковые стороны микроцентрифужных трубок и чашки Петри для отдельных лиц, если цифры не совпадают.

4. Вычисление LT50

  1. Сгенерируйте таблицу данных в формате CSV с по крайней мере следующими заголовками: группирующая переменная, представляющая интерес, температура трубки в °C, количество живых особей и количество погибших особей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для репрезентативных данных интересующая группирующая переменная заменяется возрастом, поскольку цель состоит в сравнении между возрастными группами.
  2. Чтобы сопоставить данные с логистической регрессией, используйте обобщенную линейную модель с биномиальным распределением. Дополнительный файл кодирования 1 показывает пример сценария с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом R22.
  3. Чтобы определить медианный верхний тепловой предел (LT50), вычислите предикторное значение (т.е. температуру), при котором выжило 50% особей. Файл дополнительного кодирования 2 показывает пример скрипта, использующего функцию dose.p из MASS23 в R22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Целью данного протокола является определение верхнего теплового предела зоопланктона. Для этого необходим стабильный и линейный тепловой градиент. Предложенная установка была способна генерировать тепловой градиент в диапазоне от 14 °C до 40 °C путем установки температуры водяной бани на 8 °C и нагревателя на 39 °C (рисунок 2A). Градиент температуры можно сузить и сместить, изменив значения конечных точек. Тепловой градиент с более узким диапазоном (от 19 °C до 37 °C) также создавался путем установки нагревателя на 37 °C и водяной бани на 15 °C. Температура в блоке стабилизируется в течение от 45 мин до 1 ч после установки (рисунок 2В).

Чтобы проиллюстрировать применение этого протокола к зоопланктону, было исследовано изменение верхнего теплового предела, обозначенного LT50, через онтогенез в личинках песчаных долларов (Dendraster excentricus). Гравидные песочные доллары были получены коммерческим путем (см. Таблицу материалов). Высвобождение гамет индуцировалось введением 0,5-1 мл 0,35 М хлористого калия. Собранные яйца промывали через 63 мкм нейлоновой сетки с 0,45 мкм фильтрованной морской водой. Сперму собирали сухой и держали на льду. Яйцеклетки были оплодотворены при ~104 сперматозоидах на мл. Общие садовые культуры были созданы с гаметами от трех самцов и трех самок по пять особей на мл. Эти личиночные культуры содержались в фильтрованной морской воде с соленостью 32 psu при 18 ° C в цикле 12: 12 свет: темнота с полной сменой воды через день.

По мере развития личиночных песочных долларов верхний тепловой предел увеличивался с 28,6 ° C (± 0,02 ° C S.E) через 2 дня после удобрения до 28,8 ° C (± 0,02 ° C S.E) через 4 дня после удобрения и 29,3 ° C (± 0,02 ° C S.E) через 6 дней после удобрения (рисунок 3). Эти верхние тепловые пределы предполагают, что песчаные доллары живут в пределах своего теплового предела в течение средней летней температуры поверхности моря ~ 20 ° C или ниже вдоль побережья Тихого океана. Однако с увеличением частоты и интенсивности морских тепловых волн максимальная температура продолжает повышаться. Пиковая температура в 26,4 ° C была зафиксирована в бухте Южной Калифорнии в августе 2018 года (Fumo et al.24). Учитывая, что эти виды размножаются весной и летом, выживаемость их ранней стадии жизни, вероятно, уменьшится во время этих экстремальных событий. Прогнозируемая выживаемость снизится на 10%, когда температура достигнет 26,5 ° C.

Парные сравнения с использованием теста соотношения, разработанного Wheeler et al.25 , показывают, что медиана летальной температуры значительно отличалась между тремя возрастными группами (p < 0,001). Более ранние стадии (гаструла и ранние призмы, которым было 2 дня) были более чувствительны к тепловому стрессу, чем более старые личинки. Это наблюдение предполагает, что тепловой предел, выведенный из одной временной точки развития, не является репрезентативным для этого вида на протяжении всей его жизненной истории.

Figure 1
Рисунок 1: Маркированная диаграмма теплового блока. (A) Вид сверху установки со всеми подключенными компонентами. (Б,Г) Размещение и соединения для клемм нагревателя. (С,Э) Размещение теплообменника (охлаждающего элеменета) и связанных с ним трубок к водяной бане. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Изменения температуры в тепловом блоке в течение 1 ч с конечными точками, установленными на 15 и 37 °C. (A) Линейный градиент был достигнут в течение 1 ч. Изменение настроек конечных точек изменяет температурный диапазон, и наибольший диапазон составлял от 14 °C до 40 °C. (B) Разница температур между реплицированными рядами была незначительной (<0,8 °C); данные из двух реплицированных строк были построены для каждого параметра в (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Выживаемость личиночных песочных долларов (Dendraster excentricus) в диапазоне температур от 19 до 37 °C через онтогенез (2, 4 и 6 дней после оплодотворения [dpf]). Каждое данное представляет собой долю личинок, которые пережили 2-часовую инкубацию при определенной температуре с последующим периодом восстановления в 1 час. Логистическая регрессия была выполнена с использованием обобщенной линейной модели с биномиальным распределением в статистическом программном обеспечении R. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный кодовый файл 1: Скрипт R для создания логистических кривых для набора данных с пошаговым примером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодовый файл 2: Скрипт R для генерации оценок LT50 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол обеспечивает доступный и настраиваемый подход к определению тепловых пределов малых планктонных организмов при остром тепловом воздействии. Конструкция с 10 отверстиями и гибкие конечные точки температуры, контролируемые водяной баней на нижнем конце и нагревателем на верхнем конце, позволяют точно определить LT50. Используя этот подход, можно обнаружить разницу в тепловом пределе, который составляет <1 °C (рисунок 3). Этот подход обеспечивает быстрое определение тепловых пределов (в часах) для различных видов, и полученные значения были применены к нескольким моделям распределения видов 2,21. Однако важно отметить, что острое воздействие, вероятно, обеспечивает иную оценку термической толерантности по сравнению с хроническим воздействием 8,26.

Одним из основных преимуществ нынешней конструкции является то, что 10 температурных обработок и шесть реплик включены в небольшую площадь (20,3 см х 15,2 см х 5 см). В предыдущих публикациях, использующих аналогичный подход к тепловому градиенту для определения тепловых пределов, использовались алюминиевые стержни, которые были больше (180 см х 10 см х 6 см в27, 91 см × 25 см × 15 см в10 и 60 см х 20 см в17). В то время как сухие ванны, которые поддерживают одну температуру, меньше (например, 18,5 см х 18,5 см х 2,5 см) и предлагают несколько реплик, несколько единиц (более четырех) необходимы для создания кривой производительности, которая включает в себя несколько температур, или эксперименты должны повторяться с течением времени, что может привести к смешанным факторам. Конструкция теплового блока снижает как стоимость изготовления, так и требования к пространству. Изготовление может быть завершено с помощью сверлильного пресса, или исследователи, не имеющие немедленного доступа к фрезерному станку, могут выбрать коммерческие услуги по обработке с ЧПУ. Использование коммерчески доступных деталей дополнительно контролирует стоимость изготовления. Если можно использовать существующую ванну с подогревом / охлаждением воды или аквариумные чиллеры, оставшаяся стоимость деталей составляет менее 350 долларов. В противном случае аквариумные чиллеры для аквариума объемом 10 галлонов (~ 35 л) можно приобрести за < 150 долларов.

Текущий дизайн может быть изменен в соответствии с потребностями исследователя. Если целевые организмы больше по размеру, сцинтилляционные флаконы являются хорошими альтернативными контейнерами, и потребуются большие отверстия. Тем не менее, алюминиевый блок является съемным в текущем дизайне, поэтому несколько блоков могут быть изготовлены и заменены в соответствии с экспериментальными потребностями. Если целью эксперимента является определение нижнего теплового предела или сосредоточение внимания на полярных организмах, размещение блоков охлаждающей воды на обоих концах основного алюминиевого блока более целесообразно.

Подобно другим исследованиям зоопланктона, текущий протокол не включает фазу постепенного охлаждения20,27. Исследователи могут рассмотреть возможность удаления микроцентрифужных трубок парами и смещения их вниз по градиенту температуры (т. Е. Реверсивные шаги 3.9-3.12) для достижения постепенного охлаждения, если их исследуемые организмы чувствительны к внезапному снижению температуры.

Полезность этой установки может быть уменьшена несколькими факторами, а именно выбором (1) настроек температуры конечной точки, (2) продолжительностью воздействия и восстановления и 3) метрикой, используемой для определения биномиального состояния (живое против мертвого; развитое или неразвитое). Для устранения этих потенциальных ограничений настоятельно рекомендуется предварительное тестирование.

Поскольку логистическая регрессия предполагает биномиальное распределение, предпочтительными являются конечные точки со 100% выживаемостью и смертностью. Для морских организмов разумным начальным диапазоном будет средняя годовая температура поверхности моря места сбора плюс 10-15°C. Затем можно сузить температурный диапазон, исследованный после такого первоначального испытания, так как чем меньше разница температур между отверстиями, тем более точно настроена оценка LT50 .

Продолжительность воздействия и восстановления зависит от вида. Например, Kuo et al.27 позволили молодым волкам (Nucella canaliculata) восстановиться в течение 24 ч, в то время как Hammond et al.28 разрешили личинкам фиолетовых ежей (Stronglylocentrotus purprtaus) 1 ч для восстановления. Можно провести короткий эксперимент, чтобы определить, отличается ли количество live:dead между периодами восстановления. В зависимости от выбранного определения биномиального состояния (например, живое или мертвое), время восстановления может не потребоваться. Если цель эксперимента состоит в том, чтобы проверить, происходят ли процессы развития, такие как расщепление и гаструляция, в диапазоне температур. Другими словами, биномиальное состояние, используемое в модели, будет разработано по сравнению с неразвитым 8,19,21. Фиксаторы, такие как 4% параформальдегид, должны быть добавлены в образцы в период теплового воздействия без какого-либо времени восстановления.

Чтобы обеспечить точный подсчет и определение биномиального состояния (живое против мертвого; развитое или неразвитое), целесообразно подсчитывать образцы после времени восстановления в случайном порядке, чтобы избежать потенциальных смещений наблюдателя. При наличии достаточного количества персонала разные исследователи могут подсчитывать реплицированные строки и сравнивать их результаты. В качестве альтернативы, люди могут неоднократно подсчитывать небольшое подмножество образцов и проверять, являются ли цифры последовательными.

Другим потенциальным ограничением является отсутствие оценки погрешности LT50 из независимых образцов29. Текущий метод анализа данных обеспечивает 95% доверительный интервал вдоль установленной логистической кривой (файл дополнительного кодирования 1) и стандартную ошибку LT50 (файл дополнительного кодирования 2). Эти границы погрешности генерируются в процессе подгонки кривой, а не путем множественных измерений особей из выборочной популяции. Учитывая, что текущая конструкция теплового блока имеет шесть строк, можно сопоставить данные из каждой строки для получения шести оценок LT50 и получения оценок ошибок на основе наблюдений.

Таким образом, представлен доступный подход к определению острых тепловых пределов, который может быть применен к широкому спектру зоопланктона. Эта установка может быть использована для определения тепловых пределов различных организмов и для точного определения стадий развития, которые являются уязвимыми. Эта информация может помочь улучшить прогнозирование производительности организмов и потенциальных взаимодействий сообществ в условиях глобального изменения климата.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается Исследовательским фондом факультета колледжа Суортмор [KC] и Летней исследовательской стипендией Роберта Рейнольдса и Люсинды Льюис '70 для BJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm membrane filter VWR 74300-042
½” Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266 Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe VWR 76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger Omega Engineering HH506A Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette  Ranin 
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater
with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W		 McMaster-Carr 3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix Pentair CM2B Use to make aritifical seawater 
Denraster excentricus M-Rep  Sand dollars from California 
Dissecting microscope  Nikon  SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) Amazon Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"  McMaster-Carr 86825K953 Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation McMaster-Carr 4530K121 Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature 
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller Amazon Can be used in place of the lab-grade water bath 
Example with larval sand dollar 
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling Amazon Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) Amazon Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators VWR 89202-386 Can be replaced with an aquarium chiller 
Microcentrifuge Tubes VWR 76019-014 If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative 
Nitex mesh filter  Self made Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing 
Pasteur pipette VWR 14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)  Millpore-Sigma P3911-500G
R statistical software.  The R Project for Statistical Computing
Syringe needle VWR 89219-346 Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing  McMaster-Carr 5233K65 Adjust to match the chiller and block used 
Zoo Med Repti Temp Rheostat Chewy.com Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
  3. Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
  4. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  5. Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
  6. Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
  7. Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
  8. Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
  9. Wang, W., Ding, M. -w, Li, X. -x, Wang, J., Dong, Y. -w Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
  10. Mak, K. K. -Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
  11. Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , Humana Press. Totowa, NJ. 1-25 (2014).
  12. Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
  13. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
  14. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
  15. Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
  16. Rivera, H. E., Chen, C. -Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
  17. Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
  18. Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
  19. Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
  20. Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
  21. Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
  22. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2021).
  23. Venables, W. N., Ripley, B. D. Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , Springer. (2002).
  24. Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
  25. Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
  26. Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
  27. Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
  28. Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
  29. Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).

Tags

Биология выпуск 189 смертельная температура критический тепловой максимум верхние тепловые пределы глобальное потепление тепловой стресс личинки морских беспозвоночных
Определение тепловых пределов для зоопланктона с помощью теплового блока
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K.,… More

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K., Scoma, S. Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block. J. Vis. Exp. (189), e64762, doi:10.3791/64762 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter