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Biology

Determinación de los límites térmicos para el zooplancton utilizando un bloque de calor

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64762
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology Department, Swarthmore College

Summary

El presente protocolo ilustra el uso de componentes disponibles comercialmente para generar un gradiente térmico estable y lineal. Dicho gradiente se puede utilizar para determinar el límite térmico superior de organismos planctónicos, particularmente larvas de invertebrados.

Abstract

Los límites térmicos y la amplitud se han utilizado ampliamente para predecir la distribución de las especies. A medida que la temperatura global continúa aumentando, comprender cómo cambia el límite térmico con la aclimatación y cómo varía entre las etapas de la vida y las poblaciones es vital para determinar la vulnerabilidad de las especies al calentamiento futuro. La mayoría de los organismos marinos tienen ciclos de vida complejos que incluyen etapas planctónicas tempranas. Si bien cuantificar el límite térmico de estas pequeñas etapas tempranas del desarrollo (decenas a cientos de micras) ayuda a identificar los cuellos de botella del desarrollo, este proceso puede ser un desafío debido al pequeño tamaño de los organismos objetivo, el gran requisito de espacio de banco y el alto costo de fabricación inicial. Aquí, se presenta una configuración que está orientada a volúmenes pequeños (ml a decenas de ml). Esta configuración combina componentes disponibles comercialmente para generar un gradiente térmico estable y lineal. También se presentan las especificaciones de producción de la configuración, así como los procedimientos para introducir y enumerar individuos vivos versus muertos y calcular la temperatura letal.

Introduction

La tolerancia térmica es clave para la supervivencia y función de los organismos 1,2. A medida que el planeta continúa calentándose debido a las emisiones antropogénicas de carbono, se está prestando cada vez más atención a la determinación y aplicación de límites térmicos3. Se han utilizado varios criterios de valoración, como la mortalidad, la falta de desarrollo y la pérdida de movilidad, para determinar los límites térmicos superior e inferior4. Estos límites térmicos a menudo se consideran un proxy para el nicho térmico de un organismo. Esta información se utiliza a su vez para identificar especies que son más vulnerables al calentamiento global, así como para predecir la distribución futura de las especies y las interacciones resultantesentre especies 3,5,6,7. Sin embargo, determinar los límites térmicos, especialmente para pequeños organismos planctónicos, puede ser un desafío.

Para los organismos planctónicos, particularmente las etapas larvales de los invertebrados marinos, el límite térmico puede determinarse a través de la exposición crónica. La exposición crónica se logra criando larvas a varias temperaturas durante días o semanas y determinando la temperatura a la que la supervivencia larvaria y / o la tasa dedesarrollo reduce 8,9,10. Sin embargo, este enfoque requiere bastante tiempo y requiere grandes incubadoras y experiencia en la cría de larvas (consulte la referencia11 para una buena introducción al cultivo de larvas de invertebrados marinos).

Alternativamente, la exposición aguda al estrés térmico se puede utilizar para determinar los límites térmicos. A menudo, este enfoque de determinación implica colocar viales pequeños con larvas en baños secos con temperatura controlada 12,13,14, aprovechar las funciones de gradiente térmico en termocicladores de PCR 15,16, o colocar viales de vidrio / tubos de microcentrífuga a lo largo de un gradiente térmico generado por calentamiento y enfriamiento aplicados en los extremos de grandes bloques de aluminio con orificios en los que los viales encajan cómodamente 17, 18,19. Los baños secos típicos generan una sola temperatura; Por lo tanto, se deben operar varias unidades simultáneamente para evaluar el rendimiento en un rango de temperaturas. Los termocicladores generan un gradiente, pero solo acomodan un pequeño volumen de muestra (120 μL) y requieren manipulaciones cuidadosas. Al igual que los termocicladores, los grandes bloques de aluminio crean gradientes de temperatura lineales y estables. Ambos enfoques pueden combinarse con regresión logística o probit para calcular la temperatura letal para el 50% por ciento de la población (LT50)12,20,21. Sin embargo, los bloques de aluminio utilizados tenían ~ 100 cm de largo; Este tamaño exige un gran espacio de laboratorio y acceso a fresadoras especializadas de control numérico por computadora para perforar los agujeros. Junto con el uso de dos baños de agua de grado de investigación para mantener la temperatura objetivo, el costo financiero de ensamblar la configuración es alto.

Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo desarrollar un medio alternativo para generar un gradiente de temperatura estable y lineal con piezas disponibles comercialmente. Dicho producto debe tener una huella pequeña y debe poder usarse fácilmente para experimentos de exposición al estrés térmico agudo para organismos planctónicos. Este protocolo se desarrolla con zooplancton que tiene un tamaño de <1 mm como organismos objetivo, y por lo tanto, se optimizó para el uso de un tubo de microcentrífuga de 1,5 o 2 ml. Los organismos de estudio más grandes requerirán contenedores más grandes que los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml utilizados y orificios agrandados en los bloques de aluminio.

Además de hacer que el aparato experimental sea más accesible, este trabajo tiene como objetivo simplificar la tubería de procesamiento de datos. Si bien el software estadístico comercial proporciona rutinas para calcular LT50 utilizando regresión logística o probit, el costo de la licencia no es trivial. Por lo tanto, un script fácil de usar que se basa en el programa estadístico de código abierto R22 haría que el análisis de datos fuera más accesible.

Este protocolo muestra cómo se puede fabricar un bloque térmico compacto con piezas disponibles comercialmente y aplicarse para exponer el zooplancton (larvas del dólar de arena Dendraster excentricus) a un estrés térmico agudo para determinar su límite térmico superior.

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Protocol

1. Fabricación del bloque térmico

  1. Conecte el calentador de tiras de 120 V y 100 W al reóstato (consulte la Tabla de materiales).
  2. Prepare el bloque de aluminio de 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 pulgadas x 5 pulgadas x 2 pulgadas) perforando 60 agujeros en una cuadrícula de 6 x 10 (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que los orificios estén espaciados 2 cm de centro a centro en ambas direcciones. Cada uno debe tener 1,1 cm de diámetro y 4,2 cm de profundidad (Figura 1).
    NOTA: Realice la perforación en una fresadora o prensa de perforación con brocas de acero de alta velocidad. El elemento calefactor y el elemento refrigerante se eligieron para cubrir la mayor superficie de contacto posible de las superficies de 15,2 cm x 5 cm.
  3. Perfore dos orificios adicionales en una de las superficies de 20,3 cm x 5 cm entre la 1ª y 2ª columna y la9ª y10ª columna, coincidiendo con el tamaño de las sondas del controlador de temperatura (consulte la Tabla de materiales).
  4. Construya una caja a partir de láminas de acrílico transparente de 1,2 cm (0,5 pulgadas) (consulte la Tabla de materiales) para mantener los elementos en su lugar y aislar el bloque térmico completo. Utilice dos capas de acrílico para aislar la parte posterior del elemento calefactor (Figura 1).
  5. En el ensamblaje final, aplique pasta térmica (consulte la Tabla de materiales) para maximizar la conductancia térmica del elemento calefactor al bloque y del bloque al elemento refrigerante.

2. Determinación de los ajustes del gradiente térmico

  1. Conecte el baño de agua/enfriador de acuario con el tubo Tygon (consulte la Tabla de materiales). Aísle el tubo con aislamiento de tubería de espuma según sea necesario.
  2. Inserte la sonda del termostato en los orificios del costado del bloque de aluminio. Asegúrese de que la sonda 1 esté colocada cerca del elemento calefactor.
  3. Coloque los tubos de microcentrífuga llenos hasta el borde (1,5 ml) con agua del grifo en todos los orificios fresados (60 tubos en total).
  4. Encienda el controlador de temperatura y ajuste la temperatura de calentamiento de parada de la sonda de 1 a 35-37 °C y la sonda de 2 a 21,5-22,5 °C.
    NOTA: El termostato propuesto tiene dos salidas que funcionan de forma independiente; Solo la sonda 1 se utiliza para regular la temperatura cálida en este caso de uso particular. Por lo tanto, ajuste la temperatura de la sonda 2 a la de la temperatura de gama baja.
  5. Gire el reóstato para encender el elemento calefactor y configúrelo en medio.
  6. Encienda el baño de agua/enfriador de acuario y ajuste la temperatura del enfriador a 15 ° C.
  7. Compruebe que el bloque esté caliente en un extremo y frío en el otro después de 10 minutos.
    PRECAUCIÓN: Los extremos expuestos del elemento calefactor pueden estar calientes; No los toques.
  8. Verifique la temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga usando un termopar con un electrodo tipo K (consulte la Tabla de materiales) cada 10 minutos después. La temperatura se estabilizará después de ~ 60 min y aparecerá lineal (Figura 2).
  9. Ajuste los valores de los puntos finales cambiando la configuración del controlador de temperatura y el baño de agua según sea necesario.

3. Exposición térmica y enumeración live:dead

NOTA: El paso 2 se puede omitir una vez que se determinan los ajustes deseados para el gradiente de temperatura.

  1. Encienda el baño de agua de recirculación y el calentador y configúrelos a 15 °C y 37 °C, respectivamente, para generar un gradiente de temperatura de 19,5 °C a 37 °C.
  2. Para asegurarse de que el gradiente térmico sea lineal, coloque tubos de microcentrífuga llenos hasta el borde (1,5 ml) con agua del grifo en todos los orificios fresados (60 tubos en total).
  3. Deje que el bloque de calor alcance la temperatura establecida esperando 45-60 min. Verifique la temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga usando un termopar con un electrodo tipo K para ver si ha alcanzado la temperatura esperada. Tenga en cuenta estas temperaturas.
  4. Si los organismos del estudio tienen un tamaño de >500 μm y pueden transferirse fácilmente de un recipiente a otro (por ejemplo, un copépodo), llene un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 750 μL de agua de mar filtrada de 0,45 μm. Alternativamente, si los organismos del estudio son pequeños, llene un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 250 μL de agua de mar filtrada de 0,45 μm.
    NOTA: Para los datos representativos, se utilizaron larvas del dólar de arena Dendraster excentrics , que son 2, 4 y 6 días después de la fertilización, (ver Tabla de materiales). El tamaño promedio (± S.D., n = 15 para cada edad) de estos individuos fue de 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm y 292 ± 14 μm, respectivamente. Dado que estas larvas se pueden concentrar fácilmente (paso 3.5), los tubos de microcentrífuga se llenaron con 750 μL de agua de mar filtrada.
  5. Concentrar el cultivo de los organismos del estudio con filtrado inverso (es decir, colocar la malla en el recipiente que contiene los organismos del estudio y eliminar el agua a través de la parte superior de la malla), de modo que los organismos del estudio permanezcan en el fondo del vaso de precipitados11.
    NOTA: Se utilizó una malla de nylon de 30 μm para los dólares de arena larval estudiados (ver Tabla de Materiales).
  6. Enjuague la muestra concentrada de animales con agua de mar filtrada (por ejemplo, cuando se cultive con alimentos de algas u otros productos químicos). Repita el filtrado inverso una vez más para concentrar la muestra de animal.
  7. Coloque un número conocido de organismos individuales en los tubos de microcentrífuga medio llenos. Contar los pequeños organismos planctónicos bajo un microscopio de disección (ver Tabla de materiales) y transferirlos con pipetas Pasteur de vidrio.
    NOTA: El número de organismos a colocar depende del tamaño; Para los dólares de arena larvaria que tenían un tamaño de ~ 200 μm, 20 individuos por tubo de microcentrífuga fueron apropiados.
    PRECAUCIÓN: Las pipetas de vidrio son más deseables que las pipetas de plástico, ya que algunos organismos planctónicos son hidrófobos y se adhieren a las superficies de plástico.
  8. Agregue agua de mar filtrada de 0,45 μm a los tubos de microcentrífuga que contienen animales hasta que el volumen final sea de 1 ml.
  9. Para permitir que los organismos se calienten gradualmente hasta la temperatura experimental deseada, colocar los tubos de microcentrífuga con animales, preparados en el paso 3.7, en el bloque de calor a partir del extremo frío. Coloque pares de tubos de microcentrífuga en cada fila (12 tubos en total).
  10. Espera 10 min.
  11. Mover los pares de tubos de microcentrífuga insertados en el paso 3.9 a los orificios perforados adyacentes con temperaturas más cálidas. Coloque pares adicionales de tubos de microcentrífuga en cada fila en el extremo frío. Cada fila ahora tendrá cuatro tubos. Espere otros 10 minutos.
  12. Continúe agregando tubos de microcentrífuga con animales cambiando sus posiciones del extremo más frío al extremo más cálido en pares. Espere 10 minutos entre cada turno hasta que el bloque de calor esté completamente lleno.
    NOTA: Los pasos 3.9-3.12 se consideran una fase de aumento gradual para aumentar gradualmente la temperatura experimentada por los organismos del estudio.
  13. Deje que los animales incuben a la temperatura designada durante 2 h. Este paso es la fase de exposición a temperatura constante del experimento.
    1. Compruebe la temperatura de los tubos de microcentrífuga con un termopar cada hora si el período de incubación supera las 2 h.
      NOTA: Ajuste el tiempo de incubación en función de las necesidades experimentales. Si la incubación es superior a 2 h, compruebe la temperatura de los tubos a intervalos de tiempo regulares con un termopar en caso de fallo imprevisto del equipo. Para minimizar la perturbación de los organismos del estudio, coloque al azar seis o más tubos de microcentrífuga llenos solo con agua de mar filtrada en el bloque para el monitoreo de la temperatura.
  14. Al final del período de incubación, mida la temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga utilizando un termopar con un electrodo tipo K. Tenga en cuenta estas temperaturas.
  15. Retire los 60 tubos de microcentrífuga con animales y colóquelos en soportes preetiquetados.
  16. Incubar los tubos (paso 3.14) a la temperatura predeterminada, como la temperatura de cría, durante 1 h, que es el período de recuperación.
    NOTA: El período de recuperación puede ser específico de cada especie. Para el dólar de arena larval, la temperatura de cría fue de 18 ° C, y por lo tanto la muestra se colocó en una cámara ambiental. Consulte la literatura relevante y / o realice un experimento de prueba para asegurarse de que el recuento de muertos vivos no se haya visto afectado por la duración del período de recuperación. En los datos representativos, el número de animales vivos después de 1 h fue el mismo que después de 12 o 24 h de recuperación.
  17. Para enumerar la proporción de organismos del estudio que están vivos después de la exposición térmica, transfiera el contenido de un tubo de microcentrífuga individual a una placa de Petri de 35 mm utilizando una pipeta de vidrio.
  18. Observe y observe el número relativo de individuos que todavía están activos (vivos) y aquellos que se han apoderado de la natación o se han disuelto (muerto) bajo un microscopio de disección. Asegúrese de que el número total de individuos observados sea igual al número de individuos colocados en los tubos en el paso 3.7. Verifique el lado de los tubos de microcentrífuga y la placa de Petri para las personas si los números no coinciden.

4. Cálculo de LT50

  1. Genere una tabla de datos en formato CSV con al menos los siguientes encabezados: agrupación variable de interés, temperatura del tubo en °C, número de individuos vivos y número de individuos muertos.
    NOTA: Para los datos representativos, la variable de interés de agrupación se sustituye por edad, ya que el objetivo es comparar entre grupos de edad.
  2. Para ajustar los datos con regresión logística, utilice un modelo lineal generalizado con una distribución binomial. El archivo de codificación suplementario 1 muestra un ejemplo de script de ejemplo utilizando el software de código abierto R22.
  3. Para determinar el límite térmico superior medio (LT 50), calcule el valor predictor (es decir, la temperatura) en el que sobrevivió el50% de los individuos. El archivo de codificación suplementario 2 muestra un script de ejemplo utilizando la función dose.p del MASS23 en R22.

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Representative Results

El objetivo de este protocolo es determinar el límite térmico superior del zooplancton. Para ello, se necesita un gradiente térmico estable y lineal. La configuración propuesta fue capaz de generar un gradiente térmico que oscilaba entre 14 °C y 40 °C ajustando la temperatura del baño de agua a 8 °C y la del calentador a 39 °C (Figura 2A). El gradiente de temperatura se puede reducir y cambiar cambiando los valores del punto final. También se generó un gradiente térmico con un rango más estrecho (19 °C a 37 °C) ajustando el calentador a 37 °C y el baño maría a 15 °C. La temperatura en el bloque se estabiliza dentro de 45 min a 1 h de configuración (Figura 2B).

Para ilustrar la aplicación de este protocolo al zooplancton, se examinó el cambio en el límite térmico superior, indicado por LT50, a través de la ontogenia en las larvas de los dólares de arena (Dendraster excentricus). Los dólares de arena grávida se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de materiales). La liberación de gametos se indujo mediante la inyección de 0,5-1 mL de cloruro de potasio 0,35 M. Los huevos recolectados se enjuagaron a través de una malla de nylon de 63 μm con agua de mar filtrada de 0,45 μm. El esperma se recogió seco y se mantuvo en hielo. Los óvulos fueron fertilizados a ~104 espermatozoides por ml. Se crearon cultivos de jardín comunes con gametos de tres machos y tres hembras a cinco individuos por ml. Estos cultivos larvales se mantuvieron en agua de mar filtrada con una salinidad de 32 psu a 18 ° C bajo un ciclo de luz: oscuridad de 12:12 con un cambio completo de agua cada dos días.

A medida que se desarrollaron los dólares de arena larval, el límite térmico superior aumentó de 28.6 ° C (± 0.02 ° C S.E) a los 2 días después de la fertilización a 28.8 ° C (± 0.02 ° C S.E) a los 4 días después de la fertilización y 29.3 ° C (± 0.02 ° C S.E) a los 6 días después de la fertilización (Figura 3). Estos límites térmicos superiores sugieren que los dólares de arena viven dentro de su límite térmico durante la temperatura promedio de la superficie del mar en verano de ~ 20 ° C o menos a lo largo de la costa del Pacífico. Sin embargo, con el aumento de la frecuencia e intensidad de las olas de calor marinas, la temperatura máxima continúa aumentando. Se registró una temperatura máxima de 26.4 ° C en Southern California Bight en agosto de 2018 (Fumo et al.24). Dado que esta especie se reproduce en primavera y verano, es probable que la supervivencia de su etapa temprana de vida disminuya durante estos eventos extremos. La supervivencia prevista disminuiría en un 10% cuando la temperatura alcance los 26,5 °C.

Las comparaciones por pares utilizando la prueba de razón desarrollada por Wheeler et al.25 sugieren que la mediana de la temperatura letal fue significativamente diferente entre los tres grupos de edad (p < 0,001). Las etapas más tempranas (gástrula y prismas tempranos que tenían 2 días de edad) fueron más sensibles al estrés térmico que las larvas más viejas. Esta observación sugiere que el límite térmico deducido de un solo punto de tiempo de desarrollo no es representativo de esa especie a lo largo de su historia de vida.

Figure 1
Figura 1: Diagrama etiquetado del bloque de calor. (A) Vista superior de la configuración con todos los componentes conectados. (B,D) Colocación y conexiones para los terminales del calefactor. (C,E) Colocación del intercambiador de calor (elemenet de enfriamiento) y los tubos asociados al baño maría. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cambios de temperatura en el bloque de calor durante 1 h con puntos finales ajustados a 15 y 37 °C . (A) Se logró un gradiente lineal en 1 h. El cambio en la configuración del punto final varía el rango de temperatura, y el rango más grande fue de 14 ° C a 40 ° C. (B) La diferencia de temperatura entre las filas replicadas fue insignificante (<0.8 ° C); se trazaron los datos de dos filas replicadas para cada configuración en (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Supervivencia de dólares de arena larval (Dendraster excentricus) en un rango de temperatura de 19 a 37 °C a través de la ontogenia (2, 4 y 6 días después de la fertilización [dpf]). Cada dato representa la proporción de larvas que sobrevivieron a una incubación de 2 h a la temperatura específica seguida de un período de recuperación de 1 h. Se realizó una regresión logística utilizando el modelo lineal generalizado con distribución binomial en el software estadístico R. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo de codificación suplementario 1: Un script de R para generar curvas logísticas para el conjunto de datos con un ejemplo paso a paso. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación complementario 2: Un script de R para generar estimaciones LT50 . Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este protocolo proporciona un enfoque accesible y personalizable para determinar los límites térmicos de pequeños organismos de plancton a través de la exposición térmica aguda. El diseño de 10 orificios y los puntos finales de temperatura flexibles, controlados por el baño de agua en el extremo inferior y el calentador en el extremo superior, permiten determinar LT50 con precisión. Usando este enfoque, se podría detectar una diferencia en el límite térmico que es <1 ° C (Figura 3). Este enfoque proporciona una determinación rápida de los límites térmicos (en horas) para una variedad de especies, y los valores resultantes se han aplicado a múltiples modelos de distribución de especies 2,21. Sin embargo, es importante señalar que la exposición aguda probablemente proporciona una estimación de tolerancia térmica diferente en comparación con la exposición crónica 8,26.

Una ventaja importante del diseño actual es que se incluyen 10 tratamientos de temperatura y seis réplicas dentro de un espacio pequeño (20.3 cm x 15.2 cm x 5 cm). Publicaciones anteriores que utilizaron un enfoque de gradiente térmico similar para determinar los límites térmicos utilizaron barras de aluminio que eran más grandes (180 cm x 10 cm x 6 cm en 27, 91 cm × 25 cm × 15 cm en 10 y 60 cm x20 cm en 17). Mientras que los baños secos que contienen una sola temperatura son más pequeños (por ejemplo, 18.5 cm x 18.5 cm x 2.5 cm) y ofrecen múltiples réplicas, se requieren varias unidades (más de cuatro) para generar una curva de rendimiento que incluya múltiples temperaturas, o los experimentos deben repetirse con el tiempo, lo que podría introducir factores de confusión. El diseño del bloque térmico reduce tanto el costo de fabricación como los requisitos de espacio. La fabricación se puede completar con una prensa de perforación, o los investigadores sin acceso inmediato a una fresadora podrían optar por servicios comerciales de mecanizado CNC. El uso de piezas disponibles comercialmente controla aún más el costo de fabricación. Si uno puede usar un baño de agua de calefacción / enfriamiento existente o enfriadores de acuario, el costo restante de las piezas asciende a menos de $ 350. De lo contrario, los enfriadores de acuario para un tanque de peces de 10 galones (~ 35 L) se pueden comprar por < $ 150.

El diseño actual puede modificarse para adaptarse a las necesidades del investigador. Si los organismos objetivo son más grandes en tamaño, los viales de centelleo son buenos recipientes alternativos, y se requerirían agujeros más grandes. Dicho esto, el bloque de aluminio es extraíble en el diseño actual, por lo que se pueden hacer e intercambiar múltiples bloques para adaptarse a las necesidades experimentales. Si el objetivo del experimento es determinar un límite térmico más bajo o centrarse en organismos polares, es más apropiado colocar bloques de agua fría en ambos extremos del bloque principal de aluminio.

Al igual que otros estudios sobre zooplancton, el protocolo actual no incluye una fase de enfriamiento gradual20,27. Los investigadores pueden considerar retirar los tubos de microcentrífuga en pares y desplazarlos hacia abajo en el gradiente de temperatura (es decir, invertir los pasos 3.9-3.12) para lograr un enfriamiento gradual si sus organismos de estudio son sensibles a una disminución repentina de la temperatura.

La utilidad de esta configuración puede verse disminuida por varios factores, a saber, la elección de (1) los ajustes de temperatura del punto final, (2) la duración de la exposición y recuperación, y 3) la métrica utilizada para determinar el estado binomial (vivo vs. muerto; desarrollado vs. no desarrollado). Para abordar estas limitaciones potenciales, se recomienda encarecidamente realizar pruebas preliminares.

Dado que la regresión logística asume una distribución binomial, se prefieren los criterios de valoración con 100% de supervivencia y mortalidad. En el caso de los organismos marinos, un intervalo de partida razonable sería la temperatura media anual de la superficie del mar del lugar de recogida más 10-15 °C. Uno puede entonces reducir el rango de temperatura investigado después de tal prueba inicial, ya que cuanto menor sea la diferencia de temperatura entre los agujeros, más ajustada será la estimación LT50 .

La duración de la exposición y la recuperación son específicas de cada especie. Por ejemplo, Kuo et al.27 permitieron que los juveniles (Nucella canaliculata) se recuperaran durante 24 h, mientras que Hammond et al.28 permitieron larvas de erizos púrpuras (Stronglylocentrotus purprtaus) 1 h para la recuperación. Se podría realizar un breve experimento para determinar si el recuento de muertos difiere entre los períodos de recuperación. Dependiendo de la definición del estado binomial elegido (por ejemplo, vivo vs. muerto), el tiempo de recuperación puede no ser necesario. Si el objetivo del experimento es probar si los procesos de desarrollo, como la escisión y la gastrulación, ocurren en un rango de temperaturas. En otras palabras, el estado binomial utilizado en el modelo sería desarrollado versus no desarrollado 8,19,21. Se deben agregar fijadores como paraformaldehído al 4% a las muestras en el período de exposición térmica sin ningún tiempo de recuperación.

Para garantizar un recuento y determinación precisos del estado binomial (vivo vs. muerto; desarrollado vs. no desarrollado), es aconsejable contar las muestras después del tiempo de recuperación en orden aleatorio para evitar posibles sesgos del observador. Si hay suficiente personal, diferentes investigadores podrían contar filas replicadas y comparar sus resultados. Alternativamente, los individuos pueden contar repetidamente un pequeño subconjunto de las muestras y verificar si los números son consistentes.

Otra limitación potencial es la falta de estimación de errores del LT50 a partir de muestras independientes29. El método de análisis de datos actual proporciona un intervalo de confianza del 95% a lo largo de la curva logística ajustada (Archivo de codificación suplementario 1) y un error estándar del LT50 (Archivo de codificación complementario 2). Estos límites de error se generan a partir del proceso de ajuste de curvas, no a través de múltiples mediciones de individuos de la población de la muestra. Dado que el diseño actual del bloque térmico tiene seis filas, se pueden ajustar los datos de cada fila para generar seis estimaciones LT50 y obtener las estimaciones de error basadas en la observación.

En resumen, se presenta un enfoque accesible para determinar los límites térmicos agudos que se pueden aplicar a una amplia variedad de zooplancton. Esta configuración se puede utilizar para determinar los límites térmicos de varios organismos y para identificar las etapas de desarrollo que son vulnerables. Esta información puede ayudar a mejorar la predicción del rendimiento de los organismos y las posibles interacciones de la comunidad frente al cambio climático global.

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Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Acknowledgments

Este trabajo es apoyado por el Fondo de Investigación de la Facultad del Swarthmore College [KC] y la beca de investigación de verano Robert Reynolds y Lucinda Lewis '70 para BJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm membrane filter VWR 74300-042
½” Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266 Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe VWR 76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger Omega Engineering HH506A Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette  Ranin 
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater
with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W		 McMaster-Carr 3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix Pentair CM2B Use to make aritifical seawater 
Denraster excentricus M-Rep  Sand dollars from California 
Dissecting microscope  Nikon  SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) Amazon Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"  McMaster-Carr 86825K953 Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation McMaster-Carr 4530K121 Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature 
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller Amazon Can be used in place of the lab-grade water bath 
Example with larval sand dollar 
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling Amazon Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) Amazon Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators VWR 89202-386 Can be replaced with an aquarium chiller 
Microcentrifuge Tubes VWR 76019-014 If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative 
Nitex mesh filter  Self made Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing 
Pasteur pipette VWR 14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)  Millpore-Sigma P3911-500G
R statistical software.  The R Project for Statistical Computing
Syringe needle VWR 89219-346 Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing  McMaster-Carr 5233K65 Adjust to match the chiller and block used 
Zoo Med Repti Temp Rheostat Chewy.com Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output

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References

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Biología Número 189 temperatura letal máximo térmico crítico límites térmicos superiores calentamiento global estrés por calor larvas de invertebrados marinos
Determinación de los límites térmicos para el zooplancton utilizando un bloque de calor
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Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K.,… More

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K., Scoma, S. Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block. J. Vis. Exp. (189), e64762, doi:10.3791/64762 (2022).

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