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Bioengineering

मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के विद्युत व्यवहार को चिह्नित करने के लिए प्रकाश-प्रेरित डायफोरफोरेसिस

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/64909
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,2,3,4, 1,2,4
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 3Department of Chemistry, School of Physical Sciences, University of California, Irvine, 4Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine

Summary

यहां, हम विषम सेल लाइनों, विशेष रूप से मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एचएमएससी) को चिह्नित करने के लिए एक लेबल-मुक्त दृष्टिकोण के रूप में प्रकाश-प्रेरित डाइइलेक्ट्रोफोरेसिस प्रस्तुत करते हैं। यह पेपर अपने मूल राज्य को बदले बिना एचएमएससी के विद्युत व्यवहार को चिह्नित करने के लिए एक फोटोकंडक्टिव परत के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग और अनुकूलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Abstract

मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एचएमएससी) रोगों के यांत्रिक अध्ययन या कई चिकित्सीय अनुप्रयोगों के संचालन के लिए एक रोगी-व्युत्पन्न सेल स्रोत प्रदान करते हैं। एचएमएससी गुणों को समझना, जैसे कि विभिन्न परिपक्वता चरणों में उनका विद्युत व्यवहार, हाल के वर्षों में अधिक महत्वपूर्ण हो गया है। डाइइलेक्ट्रोफोरेसिस (डीईपी) एक ऐसी विधि है जो एक गैर-समान विद्युत क्षेत्र में कोशिकाओं में हेरफेर कर सकती है, जिसके माध्यम से कोशिकाओं के विद्युत गुणों के बारे में जानकारी प्राप्त की जा सकती है, जैसे कि कोशिका झिल्ली धारिता और पारगम्यता। डीईपी के पारंपरिक मोड धातु इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हैं, जैसे कि त्रि-आयामी इलेक्ट्रोड, डीईपी के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के लिए। इस पेपर में, हम एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस प्रस्तुत करते हैं जो प्रकाश अनुमानों के माध्यम से कोशिकाओं में हेरफेर करने में सक्षम एक फोटोकंडक्टिव परत के साथ बनाया गया है जो आसानी से अनुरूप ज्यामिति के साथ सीटू वर्चुअल इलेक्ट्रोड के रूप में कार्य करता है। यहां एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है जो इस घटना को प्रदर्शित करता है, जिसे एचएमएससी को चिह्नित करने के लिए प्रकाश-प्रेरित डीईपी (एलआईडीईपी) कहा जाता है। हम दिखाते हैं कि एलआईडीईपी-प्रेरित सेल प्रतिक्रियाओं, जिसे सेल वेग के रूप में मापा जाता है, को इनपुट वोल्टेज, प्रकाश अनुमानों की तरंग दैर्ध्य सीमा और प्रकाश स्रोत की तीव्रता जैसे अलग-अलग मापदंडों द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है। भविष्य में, हम कल्पना करते हैं कि यह मंच उन प्रौद्योगिकियों के लिए मार्ग प्रशस्त कर सकता है जो लेबल-मुक्त हैं और एचएमएससी या अन्य स्टेम सेल लाइनों की विषम आबादी के वास्तविक समय के लक्षण वर्णन करते हैं।

Introduction

मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (एचएमएससी) को उनके इम्यूनोसप्रेसिव गुणों1 के लिए मान्यता प्राप्त है, जिसके कारण विभिन्न प्रकार की बीमारियों के उपचार के लिए चिकित्सीय में उनका उपयोग हुआ है, जैसे कि टाइप II मधुमेह2, ग्राफ्ट बनाम मेजबान रोग3, और यकृत रोग4। एचएमएससी विषम हैं, जिनमें कोशिकाओं की उप-आबादी होती है जो एडिपोसाइट्स, चोंड्रोसाइट्स और ओस्टियोब्लास्ट में अंतर करती हैं। एचएमएससी वसा ऊतक, गर्भनाल ऊतक और अस्थि मज्जा से प्राप्त होते हैं, और उनकी विभेदन क्षमता मूल के ऊतक और उपयोग की जाने वाली कोशिका संस्कृति प्रक्रिया पर निर्भर करतीहै। उदाहरण के लिए, साकागुची एट अल के एक अध्ययन के अनुसार, वसा ऊतक से प्राप्त एचएमएससी एडिपोसाइट्स में अंतर करने की अधिक संभावना रखते हैं, जबकि अस्थि मज्जा से प्राप्त एचएमएससी ओस्टियोसाइट्स6 में अंतर करने की अधिक संभावना रखते हैं। हालांकि, उनकी विभेदन क्षमता पर एचएमएससी के ऊतक उत्पत्ति का प्रभाव एक ऐसी घटना है जिसे अभी भी और समझने की आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, एचएमएससी की विभिन्न विभेदन क्षमता उनकी अंतर्निहित विषमता में योगदान करती है और चिकित्सीय के लिए एचएमएससी को लागू करने में चुनौतियां पैदा करती है। जैसे, विषम स्टेम सेल लाइनों के लक्षण वर्णन, साथ ही छंटाई, इन कोशिकाओं के इन विट्रो और नैदानिक अनुप्रयोग को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है। फ्लो साइटोमेट्री, सेलुलर फेनोटाइप्स में अंतर की जांच के लिए स्वर्ण मानक तकनीक, लक्ष्य कोशिकाओं को लेबल करने के लिए सेल-सतह एंटीजन और फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करती है और प्रकाश प्रकीर्णन या सेल-विशिष्ट प्रतिदीप्ति विशेषताओं 6,7,8 के आधार पर उन्हें चिह्नित करती है। इस पद्धति के नुकसान में सेल-सतह एंटीजन बायोमाकर्स की सीमित उपलब्धता, उपकरण और संचालन की उच्च लागत और यह तथ्य शामिल है कि सेल की सतह धुंधला होने से कोशिका झिल्ली को संभावित रूप से नुकसान हो सकता है और चिकित्सीयअनुप्रयोगों को प्रभावित कर सकता है 9,10,11. इसलिए, सेलुलर झिल्ली की मूल स्थिति से समझौता किए बिना सेल लक्षण वर्णन के लिए नई तकनीकों की खोज स्टेम सेल चिकित्सीय के नैदानिक प्रदर्शन को लाभ पहुंचा सकती है।

डाइइलेक्ट्रोफोरेसिस (डीईपी), सेल लक्षण वर्णन की एक विधि जो सतह लेबल का उपयोग नहीं करती है, इस वर्तमान काम का फोकस है। डीईपी एक लेबल-मुक्त या गैर-धुंधला विधि है जिसे माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों पर लागू किया जाता है ताकि उनके विद्युत गुणों के आधार पर कोशिकाओं की विषम आबादी को चिह्नित किया जा सके। डीईपी प्रतिदीप्ति धुंधला (यानी, एक लेबल-आधारित विधि) 7 के प्रतिस्थापन में एक वैकल्पिक धारा (एसी) विद्युत क्षेत्र का उपयोग करता है। सेल लक्षण वर्णन के लिए डीईपी-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करने के अन्य फायदों में छोटे वॉल्यूम (माइक्रोलिटर्स), त्वरित विश्लेषण समय, न्यूनतम सेल नमूना तैयारी आवश्यकताओं, नमूना संदूषण का न्यूनतम जोखिम, न्यूनतम अपशिष्ट उत्पादन और कम लागत12,13 शामिल हैं। डीईपी का एक और लाभ कोशिकाओं 14,15,16 की वास्तविक समय की निगरानी है। डीईपी के लिए, निलंबन में कोशिकाओं को इलेक्ट्रोड के साथ बनाए गए एक गैर-समान एसी विद्युत क्षेत्र के संपर्क में लाया जाता है, और वे ध्रुवीकृतहो जाते हैं। यह ध्रुवीकरण सेल आंदोलन का कारण बनता है और लागू एसी विद्युत क्षेत्र की आवृत्ति और वोल्टेज के आधार पर सेल हेरफेर की अनुमति देता है। आवृत्ति को समायोजित करके, आमतौर पर 5 kHz से 20 MHz के बीच, कोशिकाओं को क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक DEP व्यवहार के अनुरूप इलेक्ट्रोड से आकर्षित या पीछे हटाया जासकता है।

डीईपी लक्षण वर्णन के कई तरीके हैं, अर्थात्, पारंपरिक, क्षेत्र प्रवाह विभाजन, और प्रकाश-प्रेरित, जैसा कि उनके इलेक्ट्रोड कॉन्फ़िगरेशन और / या परिचालन रणनीति17 द्वारा वर्गीकृत किया गया है। 3डीईपी विश्लेषक, डीईपी का एक पारंपरिक मोड, भौतिक धातु इलेक्ट्रोड को शामिल करता है और एसी विद्युत क्षेत्र के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया की निगरानी करता है। यह प्रणाली कई त्रि-आयामी परिपत्र इलेक्ट्रोड के साथ माइक्रोवेल से युक्त एक चिप का उपयोग करती है और सेल डीईपी व्यवहार18,19,20,21 को चिह्नित करने के लिए प्रकाश तीव्रता में परिवर्तन का पता लगाती है। सकारात्मक डीईपी को माइक्रोवेल की दीवारों के साथ गोलाकार इलेक्ट्रोड के किनारों की ओर बढ़ने वाली कोशिकाओं के रूप में देखा जाता है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोवेल के केंद्र में प्रकाश की तीव्रता बढ़ जाती है। नकारात्मक डीईपी को गोलाकार इलेक्ट्रोड से दूर माइक्रोवेल के केंद्र में कोशिकाओं के क्लस्टरिंग के रूप में देखा जाता है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोवेल के केंद्र में प्रकाश की तीव्रता कम हो जाती है। इन दो घटनाओं को चित्र 1 में दर्शाया गया है। पारंपरिक डीईपी विधियों में विषम सेल आबादी 18,20,21 के विद्युत गुणों को चिह्नित करने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, मुलहॉल एट अल ने 3 डीईपी विश्लेषक का उपयोग करके झिल्ली धारिता21 में अंतर के आधार पर सामान्य मौखिक केराटिनोसाइट्स (एचओके) और घातक मौखिक केराटिनोसाइट्स (एच 357) सेल लाइनों के बीच अंतर करने की क्षमता का प्रदर्शन किया। हालांकि, डीईपी के पारंपरिक तरीकों की एक सीमा निश्चित इलेक्ट्रोड ज्यामिति है। चूंकि एचएमएससी विषम हैं, इसलिए डीईपी आकलन के दौरान इलेक्ट्रोड ज्यामिति को आसानी से संशोधित करने की क्षमता होना फायदेमंद है। उदाहरण के लिए, एकल-सेल ट्रैपिंग के लिए वास्तविक समय में इलेक्ट्रोड या इलेक्ट्रोड सरणियों को संशोधित करने में सक्षम होने से कोशिकाओं को वेग और डीईपी व्यवहार के आधार पर विशेषता दी जा सकती है। एचएमएससी के डीईपी आकलन में वास्तविक समय इलेक्ट्रोड संशोधन का अनुप्रयोग नमूना आबादी की विविधता को चिह्नित करने के लिए नमूना ऊतक से सोर्सिंग के ठीक बाद एचएमएससी के एकल-सेल विश्लेषण की अनुमति देता है।

डीईपी के पारंपरिक तरीकों (यानी, निश्चित भौतिक इलेक्ट्रोड) की सीमा को दूर करने और डीईपी घटना का उपयोग करके वास्तविक समय इलेक्ट्रोड कॉन्फ़िगरेशन संशोधनों के लिए नए अवसरों का पता लगाने के लिए, प्रकाश-प्रेरित डीईपी (एलआईडीईपी) का पता लगाया गया है। एलआईडीईपी डीईपी का एक गैर-पारंपरिक मोड है जो प्रकाश अनुमानों के माध्यम से फोटोकंडक्टिव माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस22,23 का उपयोग करके कोशिकाओं में हेरफेर करता है, स्थानीयकृत इलेक्ट्रोड पारंपरिक डीईपी विधि के समान एक गैर-समान विद्युत क्षेत्र बनाते हैं। यह दृष्टिकोण इलेक्ट्रोड ज्यामिति में लचीलेपन और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर इलेक्ट्रोड को स्थानांतरित करने की भी अनुमति देता है। यह निश्चित इलेक्ट्रोड के साथ देखी गई सीमा को कम करता है और सेलुलर विषमता के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करने का अवसर प्रदान करता है। LiDEP का उपयोग कोशिकाओं 22,23,24 की सजातीय और विषम आबादी में विभिन्न सेल प्रकारों का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए किया गया है। उदाहरण के लिए, लियाओ एट अल ने कैंसर मेटास्टेसिस22 में उनके महत्व का पता लगाने के लिए लाल रक्त कोशिकाओं से उपकला कोशिका आसंजन मॉड्यूल (ईपीकैमनेग) को व्यक्त करने वाले परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) को अलग करने के लिए एलआईडीईपी का उपयोग किया। एलआईडीईपी के साथ एकल-कोशिका विश्लेषण का उपयोग सफलतापूर्वक अग्नाशयी ट्यूमरजेनिसिटी23 के स्तरीकरण और पूर्व और बाद के मेटास्टेसिस24 नमूनों में सीटीसी के विश्लेषण के साथ कैंसर कोशिकाओं को चिह्नित करने और हेरफेर करने के लिए किया गया है।

यहां, हम वर्णन करते हैं कि विभिन्न इलेक्ट्रोड ज्यामिति (सर्कल, डायमंड, स्टार और समानांतर लाइनों) और सिस्टम सेटिंग्स (लागू वोल्टेज, प्रकाश तीव्रता और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस सामग्री) के साथ एचएमएससी में हेरफेर करने के लिए एलआईडीईपी का उपयोग कैसे किया जा सकता है, इस प्रकार आभासी इलेक्ट्रोड के साथ मानव-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के व्यवहार को चिह्नित करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Protocol

1. LiDEP माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस निर्माण

नोट: निर्माण प्रक्रिया में तीन स्तरित घटकों का संयोजन होता है: (i) अनाकार सिलिकॉन (ए: एसआई) और मोलिब्डेनम के साथ एक फोटोकंडक्टिव परत एक इंडियम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) ग्लास सब्सट्रेट पर जमा होती है; (ii) दो तरफा टेप से काटी गई एक माइक्रोचैनल परत; और (iii) सेल निलंबन के इनलेट और आउटलेट के लिए ड्रिल किए गए छेद के साथ एक शीर्ष आईटीओ ग्लास सब्सट्रेट।

  1. फोटोकंडक्टिव इंडियम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) की ग्लास कोटिंग
    1. आईटीओ-लेपित ग्लास सब्सट्रेट (15-20 Ω प्रतिरोध) को सतह पर नाइट्रोजन (एन2) गैस प्रवाह दर पर प्रवाहित करके साफ करें जो दृश्यमान धूल कणों को स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त है। इस चरण के बाद, एसीटोन के साथ सब्सट्रेट को कुल्ला करें।
    2. एसीटोन अवशेषों को धोने के लिए आईटीओ-लेपित ग्लास स्लाइड को आइसोप्रोपिल अल्कोहल स्नान में स्थानांतरित करें, डीआई पानी से कुल्ला करें, और सब्सट्रेट के पूरी तरह से सूखने तक एन2 गैस को फिर से प्रवाहित करें।
    3. आईटीओ-लेपित साइड के साथ ग्लास स्लाइड को वैक्यूम स्पटरिंग सिस्टम में रखें।
    4. आईटीओ-लेपित ग्लास सब्सट्रेट (मोलिब्डेनम लक्ष्य) पर मोलिब्डेनम की 10 एनएम मोटी परत को 0.7 ए / एस की जमाव दर और 140 सेकंड के जमाव समय के साथ स्पटर करें।
    5. बिजली के कनेक्शन के लिए ग्लास सब्सट्रेट के किनारे से 2 मिमी छोड़ने के लिए ग्लास सब्सट्रेट के एक तरफ एक छाया मास्क जोड़ें। अपरिवर्तनीय रूप से युग्मित प्लाज्मा-प्लाज्मा संवर्धित रासायनिक वाष्प जमाव (आईसीपी-पीईसीवीडी) का उपयोग करके ए: एसआई का 1 μ m जमा करें, जैसा कि मेडजडौब एट अल.25 में वर्णित है।
    6. धूल और अन्य अशुद्धियों को दूर करने के लिए एन2 गैस के साथ स्लाइड को साफ करें। छाया मास्क के नीचे जमा किसी भी ए: एसआई के लिए, ए: सी को चप करने के लिए 25% डब्ल्यू / वी पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड समाधान में 2 मिमी के निशान तक किनारे को डुबोएं।
  2. LiDEP चिप डिवाइस निर्माण
    1. माइक्रोचैनल बनाने के लिए, डबल-साइडेड टेप (52 मिमी x 25 मिमी), और पंच छेद (व्यास = 4 मिमी) छोटे आयाम के किनारे से 5-6 मिमी दूर और टेप के लंबे किनारों के बीच केंद्रित प्राप्त करें। छेद ों में दो सीधी रेखाओं (3 मिमी अलग) को काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि पूरे माइक्रोचैनल काटने के चरण के दौरान डबल-साइडेड टेप के दोनों चेहरों पर सुरक्षात्मक चादरें चालू हैं।
    2. शीर्ष आईटीओ ग्लास स्लाइड में दो 3 मिमी व्यास के छेद ड्रिल करें। टेप को आईटीओ-लेपित ग्लास के शीर्ष पर संरेखित किया जा सकता है, जिसमें टेप का लंबा किनारा ग्लास के लंबे किनारे के साथ संरेखित होता है। धोने योग्य मार्कर के साथ छेद स्थान को चिह्नित करें। सुनिश्चित करें कि ड्रिल किए गए छेद डबल-साइडेड टेप में छिद्रित छेद के साथ संरेखित होते हैं। ये दो छेद माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के इनलेट और आउटलेट छेद के रूप में कार्य करेंगे।
    3. डबल-साइडेड टेप पर सुरक्षात्मक फिल्म के एक तरफा हटा दें, टेप और शीर्ष आईटीओ ग्लास स्लाइड में छेद को संरेखित करें, और उन्हें एक साथ दबाएं। हवा की जेब को हटाने के लिए धीरे से दबाएं, खासकर माइक्रोचैनल के पास। एयर पॉकेट मध्यम या अन्य समाधानों को टेप के नीचे रिसने की अनुमति दे सकते हैं, जो माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में मोल्ड को नुकसान पहुंचा सकता है या पैदा कर सकता है।
    4. डबल-साइडेड टेप से अन्य सुरक्षात्मक फिल्म को हटा दें, और मोलिब्डेनम और ए: सी-लेपित आईटीओ ग्लास साइड पर दबाएं। फोटोकंडक्टिव स्लाइड के किनारे का मिलान करें जो 2 मिमी निकासी पक्ष के विपरीत है, डबल-साइडेड टेप के किनारे पर जो शीर्ष आईटीओ ग्लास स्लाइड के केंद्र की ओर है। टॉप आईटीओ ग्लास स्लाइड और फोटोकंडक्टिव मटेरियल-लेपित आईटीओ ग्लास स्लाइड से हैंगओवर होगा।
    5. अच्छा आसंजन सुनिश्चित करने के लिए एक सपाट सतह पर दबाएं। ग्लास सब्सट्रेट और डबल-साइडेड टेप परतों का एक योजनाबद्ध चित्र 1 ए में चित्रित किया गया है। साइड में अतिरिक्त टेप काट लें।
    6. फ़ंक्शन जनरेटर को जोड़ने के लिए परत ए और परत सी के किनारों पर कॉपर टेप लागू करें। आईटीओ या फोटोकंडक्टिव सामग्री के किनारे पर टेप लपेटकर ऐसा करें, यह इस बात पर निर्भर करता है कि क्या यह परत ए या परत सी है, डबल-साइडेड टेप के किनारे से ग्लास सब्सट्रेट के अनकोटेड साइड पर लगभग 3 सेमी तक।
    7. सफल डिवाइस निर्माण सुनिश्चित करने के लिए, ग्लास सब्सट्रेट्स और ग्लास से जुड़े कॉपर टेप दोनों के लेपित स्लाइड्स के बीच प्रतिरोध पढ़ने के लिए परीक्षण करने के लिए एक मल्टीमीटर का उपयोग करें।
  3. डीईपी बफर तैयारी
    1. 4.25 ग्राम सुक्रोज को मापें, और इसे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें। फिर, ग्लूकोज के 0.15 ग्राम को मापें, और इसे उसी 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
    2. शंक्वाकार ट्यूब को 25 एमएल अल्ट्राप्योर पानी से भरें, ढक्कन बंद करें, और मिलाएं। एक बार सुक्रोज और ग्लूकोज का लगभग आधा हिस्सा घुल जाने के बाद, शंक्वाकार ट्यूब को 50 एमएल लाइन तक अल्ट्राप्योर पानी से भरें। सभी सुक्रोज और ग्लूकोज के घुलने तक जोर से मिलाएं। डीईपी बफर समाधान में 8.5% (डब्ल्यू / वी) सुक्रोज और 0.3% (डब्ल्यू / वी) ग्लूकोज होता है।
    3. तैयार सुक्रोज और ग्लूकोज समाधान के 20 एमएल प्राप्त करें, और इसे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें। फिर, गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 0.1 ग्राम को मापें, और इसे सुक्रोज और ग्लूकोज समाधान युक्त 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें। भंवर जब तक बीएसए भंग नहीं हो जाता। अंतिम डीईपी बफर समाधान में 0.5% (डब्ल्यू / वी) बीएसए होता है।
  4. सेल की तैयारी
    1. पिछले अध्ययनों26,27 में वर्णित सेल कल्चर प्रोटोकॉल का उपयोग करके 1 एमएल विकास माध्यम में निलंबित कम से कम 1 x 10 6 कोशिकाओं (एचएमएससी या एचईके293) को प्राप्त करें। सेल निलंबन को 10 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
    2. एचईके 293 कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 201 x g पर और HMSCs को 10 मिनट के लिए 290 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें, और 0.5% बीएसए के साथ डीईपी बफर समाधान के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सुनिश्चित करें कि बफर समाधान को बहुत तेजी से न जोड़ें क्योंकि बुलबुले बन सकते हैं।
    3. सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया को दो बार दोहराएं, और फिर एलआईडीईपी लक्षण वर्णन के लिए 0.5% बीएसए के साथ डीईपी बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सूचीबद्ध सेल तैयारी प्रोटोकॉल 10 रन के लिए पर्याप्त है। उदाहरण के लिए, एक आवृत्ति परीक्षण के लिए कम से कम 15 रन की आवश्यकता होती है, और, इस प्रकार, 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर 2 एमएल कोशिकाओं को बनाने की आवश्यकता होती है।

2. LiDEP लक्षण वर्णन

  1. प्रायोगिक सेटअप
    1. LiDEP के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं को निर्धारित करने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप के लिए निम्नलिखित उपकरणों को इकट्ठा करें: एक लैपटॉप, एक प्रोजेक्टर, एक उद्देश्य लेंस, एक डिजिटल माइक्रोस्कोप और एक फ़ंक्शन जनरेटर। लाइट प्रोजेक्शन (स्टार, डायमंड, तीन लाइनें और अंडाकार) डिजाइन करने के लिए लैपटॉप का उपयोग करें, और इसे प्रोजेक्टर से कनेक्ट करें।
    2. LiDEP चिप की फोटोकंडक्टिव सतह (परत सी) पर प्रकाश अनुमानों को प्रदर्शित करने के लिए प्रकाश स्रोत के रूप में प्रोजेक्टर का उपयोग करें। इसे सेट करें ताकि प्रकाश स्रोत (प्रोजेक्टर) से प्रकाश एलआईडीईपी चिप के माइक्रोचैनल क्षेत्र पर 10x उद्देश्य लेंस के माध्यम से यात्रा करे। 10x उद्देश्य लेंस प्रोजेक्टर लेंस के शीर्ष पर बैठता है। पूरक चित्र 1 एलआईडीईपी प्रणाली में प्रोजेक्टर के एकीकरण को दर्शाता है।
    3. एसी इलेक्ट्रिक फ़ील्ड को लागू करने के लिए लिडईपी चिप को फ़ंक्शन जनरेटर से कनेक्ट करें। इमेजिंग और वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एलआईडीईपी बल का अनुभव करने वाली कोशिकाओं का निरीक्षण करें। चित्रा 1 बी प्रयोगात्मक उपकरण का एक योजनाबद्ध दिखाता है। परीक्षण किए गए सभी कोशिकाओं के लिए मानक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल 26,27 का पालन करें।
  2. प्रायोगिक प्रक्रियाएं
    1. माइक्रोचैनल को 70% इथेनॉल के साथ फ्लश करें, इसके बाद 0.5% बीएसए समाधान। माइक्रोचैनल को फिर से 0.5% बीएसए समाधान के साथ दो बार फ्लश करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि इथेनॉल और पिछली कोशिकाएं पूरी तरह से बह गई हैं। जो कोशिकाएं पहले से ही डीईपी क्षेत्र के संपर्क में आ चुकी हैं, वे ताजा कोशिकाओं की तुलना में अलग तरह से प्रतिक्रिया देंगी और डेटा संग्रह को बाधित कर सकती हैं।
    2. पिपेट के साथ 0.5% बीएसए समाधान को हटा दें, और डिवाइस धारक में माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस फिट करें।
    3. डिवाइस पर प्रत्येक कॉपर टेप कनेक्शन के लिए मगरमच्छ क्लिप संलग्न करें। फ़ंक्शन जनरेटर को वांछित वोल्टेज (वोल्टेज पीक-टू-पीक, वीपीपी) और आवृत्ति (हर्ट्ज) पर सेट करें। यहां परीक्षण की गई आवृत्ति सीमा 30 kHz से 20 MHz थी।
    4. डिवाइस माइक्रोचैनल में 70 μL सेल सस्पेंशन (0.5% बीएसए के साथ सेल + डीईपी बफर समाधान) जोड़ें। माइक्रोचैनल (~ 0.05 मिमी) की पतलीता के कारण, इनलेट और आउटलेट छेद से बाहर फैल सकता है। स्पिलेज की मात्रा को कम करने में मदद करने के लिए, एक छोटे पिपेट टिप का उपयोग करें, और छेद में नोक को माइक्रोचैनल की ओर थोड़ा झुकाएं। किसी भी एक्सेस समाधान (समाधान में 0.5% बीएसए या कोशिकाओं) को एकल-उपयोग पेपर वाइप्स के साथ मिटाया जा सकता है और बायोहाजार्ड कचरे में फेंक दिया जा सकता है।
    5. एलआईडीईपी चिप पर वांछित आभासी इलेक्ट्रोड ज्यामिति (यहां, सर्कल, हीरे, सितारे और / या समानांतर रेखाएं) प्रोजेक्ट करें।
    6. डिजिटल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में, वीडियो की लंबाई 3 मिनट पर सेट करें। 2 मिनट 30 सेकंड के लिए एक प्रयोगशाला टाइमर सेट करें। एक बार जब कोशिकाएं LiDEP चिप के माइक्रोचैनल में स्थिर हो जाती हैं, तो वीडियो रिकॉर्डिंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए डिजिटल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में स्टार्ट दबाएं ।
    7. 10 सेकंड प्रतीक्षा करें, फिर एसी इलेक्ट्रिक फ़ील्ड लागू करने के लिए फ़ंक्शन जनरेटर चैनल आउटपुट के ऑन बटन दबाएं , और टाइमर के लिए स्टार्ट दबाएं। डिजिटल माइक्रोस्कोप के माध्यम से सेल डीईपी व्यवहार की निगरानी करें, और सेटअप के चारों ओर झटकों या आंदोलन को रोकें।
    8. एक बार टाइमर बंद हो जाने के बाद, फ़ंक्शन जनरेटर चैनल आउटपुट के ऑन बटन को दबाएं। यह फ़ंक्शन जनरेटर चैनल आउटपुट को बंद कर देता है, और एसी इलेक्ट्रिक फील्ड अब इलेक्ट्रोड के माध्यम से आपूर्ति नहीं की जाती है। 3 मिनट पर वीडियो रिकॉर्डिंग बंद करें, और भविष्य के विश्लेषण के लिए डिजिटल माइक्रोस्कोप में सहेजें।
    9. एलआईडीईपी चिप के आउटलेट छोर से कोशिकाओं को धीरे-धीरे माइक्रोचैनल में 0.5% बीएसए के साथ 60 μL DEP बफर को धकेलकर और एक साथ आउटलेट पर इकट्ठा करके। तब तक जारी रखें जब तक कि माइक्रोचैनल में बहुत कम या कोई कोशिका न हो।
    10. चरण 2.2.3-2.2.9 को तब तक दोहराएँ जब तक कि सभी आवृत्तियों का परीक्षण न किया गया हो।

Representative Results

वोल्टेज और इलेक्ट्रोड रंग परीक्षण चरण 2.2.3 और चरण 2.2.10 में मामूली भिन्नता के साथ ऊपर की प्रक्रिया का उपयोग करके पूरा किया गया था। वोल्टेज परीक्षण के लिए, इलेक्ट्रोड रंग और आवृत्ति स्थिर रही, और 5 वीपीपी, 10 वीपीपी और 20 वीपीपी लागू किए गए। इलेक्ट्रोड रंग परीक्षण के लिए, लागू वोल्टेज और आवृत्ति को 30 kHz और 20 Vpp पर स्थिर रखा गया था, और नीले, लाल, सफेद और पीले (एचईएक्स रंग कोड #4472C4, #FF0000, #FFFFFF और #FFFF00, क्रमशः) द्वारा संदर्भित) अनुमानित इलेक्ट्रोड की जांच की गई थी। कोशिका व्यवहार्यता की जांच ट्राइपैन ब्लू के साथ कोशिकाओं को धुंधला करके और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके जीवित और मृत कोशिकाओं की संख्या की गणना करके की गई थी।

एलआईडीईपी सेटअप के साथ, हम एचएमएससी में हेरफेर करने और इनपुट आवृत्ति के जवाब में डीईपी प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करने में सक्षम थे, जो कोशिकाओं के विद्युत व्यवहार को चिह्नित करने का एक तरीका है। वर्चुअल इलेक्ट्रोड के साथ उत्पन्न गैर-समान एसी विद्युत क्षेत्र के लिए सुसंगत सेल व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए लागू वोल्टेज और अनुमानित इलेक्ट्रोड रंग (यानी, ग्राफिक एडिटर सॉफ्टवेयर के साथ बनाए गए अलग-अलग रंगों के साथ आकार) जैसे मापदंडों में हेरफेर करके इष्टतम ऑपरेटिंग स्थितियों को खोजने के लिए प्रयोगों की एक श्रृंखला आयोजित की गई थी। एलआईडीईपी, गैर-पारंपरिक डीईपी का उपयोग करके सेल प्रतिक्रियाओं के लिए एकत्र किए गए डेटा की तुलना 3 डीईपी विश्लेषक, पारंपरिक डीईपी के परिणामों से की गई थी।

पहला अनुकूलन परीक्षण एलआईडीईपी चिप में एचएमएससी (यानी, आभासी इलेक्ट्रोड की ओर बढ़ने वाली कोशिकाओं) की सकारात्मक डीईपी प्रतिक्रिया पर केंद्रित था। सकारात्मक डीईपी प्रतिक्रिया का प्रदर्शन नहीं करने वाली कोशिकाओं ने या तो आभासी इलेक्ट्रोड से दूर जाकर नकारात्मक डीईपी प्रतिक्रिया प्रदर्शित की, स्थिर और घूम रहे थे, या विद्युत क्षेत्र के प्रति अनुत्तरदायी थे। कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को 2 मिनट 30 सेकंड की अवधि के दौरान इमेजजे में उनके वेगों (μm / s) को ट्रैक करके निर्धारित किया गया था। वर्चुअल इलेक्ट्रोड के लिए एक पीले अंडाकार प्रक्षेपण का उपयोग किया गया था, और 5 वीपीपी, 10 वीपीपी और 20 वीपीपी के लागू वोल्टेज की जांच 30 किलोहर्ट्ज की एक निर्धारित आवृत्ति पर की गई थी। हमने उन कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया जो वर्चुअल इलेक्ट्रोड के 50 μm के भीतर थे, जबकि एसी इलेक्ट्रिक फील्ड स्थिरता के लिए और आउटलायर्स को कम करने के लिए था। 20 वीपीपी के परिणामस्वरूप एचईके 293 कोशिकाओं की सबसे तेज सेल गति हुई, जिसका औसत वेग 0.035 μm / s था, और इसके बाद 10 Vpp पर 0.032 μm / s और 5 Vpp पर 0.020 μm / s था, जिसका अर्थ है कि ये कोशिकाएं अपेक्षाकृत सजातीय नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करती हैं। इसी तरह की प्रवृत्ति एचएमएससी के लिए देखी गई, जिनका औसत वेग 20 वी पीपी पर 0.051 μm/s, 10 Vpp पर 0.036 μm/s और 5 Vpp पर 0.025 μm/s था, जैसा कि चित्र 2A में है (यहां, * p < 0.05 को इंगित करता है)। 20 वीपीपी पर, यह देखा गया कि एचएमएससी ने सकारात्मक और नकारात्मक डीईपी का एक साथ अनुभव किया। डीईपी बल का अनुभव करने के बाद एचएमएससी के व्यवहार्यता निष्कर्षों से पता चला है कि उच्च वोल्टेज के परिणामस्वरूप आम तौर पर कम सेल व्यवहार्यता होती है, जिसमें 66% कोशिकाएं 5 वीपीपी पर व्यवहार्य होती हैं, 58% कोशिकाएं 10 वी पीपी पर व्यवहार्य होतीहैं, और 57% कोशिकाएं 20 वी पीपी पर व्यवहार्य होती हैं। जैसा कि चित्र 2 बी में है (यहां, ** पी < 0.01 को इंगित करता है)।

LiDEP एक ऑप्टिकल-आधारित प्रणाली होने के कारण, प्रकाश तीव्रता और इलेक्ट्रोड रंग पैरामीटर हैं जिन्हें LiDEP चिप के प्रदर्शन को नियंत्रित करने के लिए आसानी से ट्यून किया जा सकता है। यहां, अनुमानित आकार के आधार पर उत्पन्न विभिन्न इलेक्ट्रोड रंगों (सफेद, पीले, लाल और नीले) का मूल्यांकन कोशिकाओं की डीईपी प्रतिक्रियाओं पर प्रभाव निर्धारित करने के लिए किया गया था। एचईके 293 कोशिकाओं और एचएमएससी का मूल्यांकन 20 वीपीपी और 30 किलोहर्ट्ज पर किया गया था। सफेद, पीले, लाल और नीले रंग के इलेक्ट्रोड चुने गए थे, लेकिन एलआईडीईपी चिप के माध्यम से रोशनी फोटोकंडक्टिव परत से प्रभावित थी, जिसमें लाल-नारंगी रंग था। इस प्रकार, अनुमानित सफेद इलेक्ट्रोड एक सफेद इंटीरियर के साथ पीला दिखाई दिया, लाल इलेक्ट्रोड लाल रूपरेखा के साथ नारंगी दिखाई दिया, और नीला इलेक्ट्रोड हल्का हरा दिखाई दिया (चित्रा 3 ए-डी)। इन चार रंगों के लिए पावर आउटपुट निम्नानुसार थे: सफेद, पीले, लाल और नीले रंग के लिए क्रमशः 77.7 μW ± 0.7 `W, 92.7 μW ± 1.3 μW, 21.9 μW ± 0.2 μW, और 56.7 μW ± 0.9 `W। यह दृढ़ता से बताता है कि पीले और सफेद में सबसे मजबूत डीईपी क्षेत्र था, जबकि नीला और लाल कमजोर थे, जैसा कि चित्र 3 ई में है (यहां, *** एचईके 293 कोशिकाओं के लिए पी < 0.001 को इंगित करता है और ** एचएमएससी के लिए पी < 0.01 को इंगित करता है)। डीईपी बल के आवेदन के दौरान पीले और सफेद आभासी इलेक्ट्रोड के किनारों पर कोशिकाओं का स्थिर रोटेशन भी देखा गया था। सभी इलेक्ट्रोड रंग भिन्नताओं के लिए, एक साथ नकारात्मक और सकारात्मक डीईपी प्रतिक्रियाएं हुईं, जो वोल्टेज परीक्षण के लिए 20 वीपीपी पर दिखाए गए थे। इसके अतिरिक्त, जबकि इलेक्ट्रोड रंग के आधार पर कोशिकाओं का वेग भिन्न होता है, 50 μm सीमा के भीतर लगभग सभी कोशिकाओं ने LiDEP का जवाब दिया। एचएमएससी का आकार 19.2 μm ± 5.8 μm के रूप में मापा गया था।

पारंपरिक इलेक्ट्रोड के साथ डीईपी की तुलना में एलआईडीईपी की क्षमता का आकलन करने के लिए, हमने एलआईडीईपी का उपयोग करने वाली कोशिकाओं के डीईपी व्यवहार के बीच अंतर का आकलन किया। एचएमएससी की डीईपी प्रतिक्रिया को 0.5% बीएसए (~ 100 μS / cm) के साथ कम चालकता डीईपी बफर समाधान में मापा गया था। 3 डीईपी विश्लेषक की नकल करने के लिए, 10 वी पीपी पर एक एकल अंडाकार पीले आभासी इलेक्ट्रोड का अनुमानलगाया गया था। एचएमएससी के डीईपी व्यवहार को 30 kHz से 20 MHz तक की विशेषता थी। 25 kHz से कम आवृत्तियों पर, हमने इलेक्ट्रोलिसिस देखा, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर धातु परत की सतह पर बुलबुला उत्पन्न हुआ। एलआईडीईपी के लिए, कम आवृत्तियों पर, एचएमएससी ने सकारात्मक डीईपी बल का अनुभव किया, जैसा कि चित्रा 4 ए में है, जिसे वर्चुअल इलेक्ट्रोड से आकर्षित कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में दर्शाया गया है। कोशिकाओं ने एक मजबूत सकारात्मक डीईपी बल के साथ शुरुआत की, जो आवृत्ति बढ़ने के साथ कमजोर हो गई। कोशिकाओं ने 30 kHz से 97 kHz तक सबसे मजबूत सकारात्मक DEP बल का अनुभव किया। इन आवृत्तियों पर एसी विद्युत क्षेत्र को लागू करने के बाद, कुछ कोशिकाएं अनुत्तरदायी हो गईं, जबकि अन्य कोशिकाओं ने नकारात्मक डीईपी व्यवहार दिखाया। यह प्रवृत्ति 3 डीईपी विश्लेषक का उपयोग करके देखी गई प्रतिक्रिया से विचलित होती है; कोशिकाओं में सकारात्मक डीईपी में 37 kHz से 255 kHz तक वृद्धि हुई और सकारात्मक DEP में 1,772 kHz से 20 MHz तक की कमी आई, जैसा कि चित्र 4B में है।

Figure 1
चित्रा 1: एचएमएससी के लिए यहां वर्णित एलआईडीईपी प्रोटोकॉल के लिए प्रायोगिक सेटअप। (ए) फोटोकंडक्टिव परत और प्रयोगात्मक सेट-अप के साथ एलआईडीईपी चिप की योजनाबद्ध और वास्तविक छवि। (बी) 3 डीईपी विश्लेषक (पारंपरिक डीईपी इलेक्ट्रोड, शीर्ष का उपयोग करके) में कोशिकाओं की सकारात्मक और नकारात्मक डीईपी प्रतिक्रियाओं की प्रतिनिधि छवियां और एलआईडीईपी का उपयोग करके कोशिकाओं की सकारात्मक और नकारात्मक डीईपी प्रतिक्रियाओं का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (आभासी इलेक्ट्रोड, नीचे के रूप में प्रकाश अनुमानों का उपयोग करना)। (सी) विभिन्न आकृतियों के उदाहरण जिन्हें वर्चुअल इलेक्ट्रोड के रूप में डिवाइस पर प्रक्षेपित किया जा सकता है। चित्र BioRender.com के साथ बनाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: एचएमएससी की डीईपी प्रतिक्रियाओं (वेग) का लक्षण वर्णन और दी गई शर्तों के तहत उनकी व्यवहार्यता। (ए) एचएमएससी के सकारात्मक डीईपी प्रतिक्रियाओं के मापा वेग 5 वीपीपी, 10 वीपीपी और 20 वीपीपी। HMSCs 20 V pp पर 0.051 μm/s, 10 Vpp पर 0.036 μm/s और 5 Vpp पर 0.025 μm/s पर चलेगए। (बी) वर्चुअल इलेक्ट्रोड के साथ उत्पन्न सकारात्मक डीईपी बल का अनुभव करने के बाद एचएमएससी की व्यवहार्यता। व्यवहार्यता क्रमशः 20 वी पीपी, 10 वी पीपी और 5 वीपीपी के लिए 57%, 58%, और 66% थी। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं. टी-परीक्षणों (* पी < 0.05 और ** पी < 0.01) का उपयोग करके पूल किए गए डेटा सेट पर पूरा सांख्यिकीय विश्लेषण पूरा किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: समरूप (एचईके 293) और हेटरोजेनस (एचएमएससी) सेल लाइनों के बीच डीईपी प्रतिक्रियाओं की तुलना करना। 20 वीपीपी और 30 किलोहर्ट्ज पर (ए) सफेद, (बी) पीला, (सी) लाल, और (डी) नीले इलेक्ट्रोड के लिए एचएमएससी कोशिकाओं की सकारात्मक डीईपी प्रतिक्रिया। (ई) विभिन्न रंगीन इलेक्ट्रोड के लिए एचईके 293 कोशिकाओं और एचएमएससी की वेग प्रतिक्रियाएं। एचईके 293 कोशिकाओं ने क्रमशः 0.035 μm / s और 0.033 μm / s पर पीले और लाल इलेक्ट्रोड के साथ उच्चतम वेग प्रदर्शित किए। एचईके 293 कोशिकाओं ने नीले इलेक्ट्रोड के साथ 0.027 μm / s पर सबसे कम वेग प्रदर्शित किया। एचएमएससी ने पीले और सफेद इलेक्ट्रोड के साथ क्रमशः 0.068 μm/s और 0.049 μm/s पर उच्चतम वेग प्रदर्शित किए। एचएमएससी ने लाल इलेक्ट्रोड के साथ 0.039 μm / s पर सबसे कम वेग का अनुभव किया। टी-टेस्ट (*p < 0.05, **p < 0.01, और **p < 0.001) का उपयोग करके पूल किए गए डेटा सेटों पर पूरा किया गया सांख्यिकीय विश्लेषण. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एलआईडीईपी और 3 डीईपी का उपयोग करके एचएमएससी की डीईपी प्रतिक्रियाओं की तुलना करना। एचएमएससी की डीईपी प्रतिक्रियाओं को (ए) एलआईडीईपी और (बी) 10 वी पीपी पर 3 डीईपी विश्लेषक के साथ मापाजाता है। एलआईडीईपी के साथ, 30 kHz से 20 MHz तक HMSCs की सकारात्मक DEP प्रतिक्रिया में क्षय था। 3DEP विश्लेषक से, कोशिकाएं सकारात्मक DEP में 37 kHz से 255 kHz तक बढ़ीं और सकारात्मक DEP में 1,772 kHz से 20 MHz तक घट गईं। त्रुटि पट्टियाँ SD का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: इस प्रोटोकॉल में प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले LiDEP सेटअप की प्रतिनिधि छवियां। प्रोजेक्टर के एकीकरण को दिखाते हुए LiDEP प्रणाली की ज़ूम-इन तस्वीर। प्रकाश एलआईडीईपी चिप के माइक्रोचैनल पर 10x उद्देश्य लेंस के माध्यम से स्रोत (प्रोजेक्टर) से यात्रा करता है। 10x उद्देश्य प्रोजेक्टर लेंस के शीर्ष पर बैठता है। प्रत्येक घटक चित्रों में क्रमांकित है और साइड में सूचीबद्ध है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 1: सफेद, पीले, लाल और नीले आभासी इलेक्ट्रोड का जवाब देने वाले एचएमएससी का प्रतिनिधि वीडियो। कोशिकाओं को सकारात्मक डीईपी (आभासी इलेक्ट्रोड की ओर बढ़ना), नकारात्मक डीईपी (आभासी इलेक्ट्रोड से दूर जाना), स्थिर और घूर्णन, या विद्युत क्षेत्र के प्रति अनुत्तरदायी का अनुभव करने के रूप में देखा जाता है। HMSCs का परीक्षण 37 kHz और 20 Vpp पर किया गया था, और वीडियो को 20x तक बढ़ाया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एचएमएससी की विविधता की जांच करना चिकित्सीय में उनकी प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है। यह काम एचएमएससी के मूल्यांकन के लिए एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में LiDEP का उपयोग करने के लिए पहला कदम प्रदान करता है। हमने वेग को निर्धारित करके एलआईडीईपी में कोशिकाओं की सकारात्मक डीईपी प्रतिक्रिया की वोल्टेज निर्भरता की जांच की। यह उम्मीद की जाती है कि उच्च वोल्टेज को मजबूत सकारात्मक डीईपी बल का उत्पादन करना चाहिए, और हमने मापे गए वेगों के साथ इस पैटर्न को देखा। 10 वीपीपी और 20 वीपीपी वोल्टेज एलआईडीईपी का उपयोग करके एचएमएससी के हेरफेर के लिए पर्याप्त थे। कम वोल्टेज (यानी, 5 वीपीपी) के परिणामस्वरूप धीमी सेल प्रतिक्रियाएं हुईं; जबकि एचएमएससी के लिए इष्टतम नहीं है, यह अन्य सेल प्रकारों के लिए फायदेमंद हो सकता है। एचएमएससी की व्यवहार्यता में लगभग 9% की वोल्टेज-निर्भर कमी आई थी। यह पिछले साहित्य 6,12,28,29 से थोड़ा अलग है, जिसमें जैविक कोशिकाओं की परीक्षा में पारंपरिक डीईपी और एलआईडीईपी के उपयोग ने सेल व्यवहार्यता को कम नहीं किया। हालांकि, प्रत्येक अध्ययन में प्रयोगात्मक उद्देश्य भिन्न था। ग्लासर और फ्यूहर ने सेल कल्चर माध्यम28 में धातु इलेक्ट्रोड पर अनुयायी एल 9 2 9 माउस फाइब्रोब्लास्ट के विकास की निगरानी की। इसके विपरीत, लू एट अल नेविभिन्न अवधियों के लिए एसी विद्युत क्षेत्रों के संपर्क में आने वाले तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की व्यवहार्यता की जांच की। एडम्स एट अल ने धातु इलेक्ट्रोड12 के साथ एचएमएससी के ढांकता हुआ गुणों की विशेषता बताई, और ली एट अल ने एलआईडीईपी29 के साथ ल्यूकेमिया कोशिकाओं में हेरफेर किया। इन अध्ययनों और हमारे बीच का अंतर बीएसए का उपयोग था, जो हमारे द्वारा देखी गई व्यवहार्यता में कमी का कारण हो सकता है। हालांकि, कम समग्र व्यवहार्यता यहां स्थापित प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एक्सपोजर समय (2 मिनट 30 एस) के कारण भी हो सकती है। इस समय को गैर-समान एसी विद्युत क्षेत्र के संपर्क के दौरान सेल हेरफेर की कल्पना करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करने के लिए चुना गया था।

प्रोटोकॉल में वर्णित हमारे एलआईडीईपी सिस्टम की क्षमताओं और सीमाओं को निर्धारित करने के लिए इलेक्ट्रोड रंग के माध्यम से सेल लक्षण वर्णन के तरीकों का परीक्षण किया गया था। इस विशिष्ट प्रोटोकॉल में, ग्राफिक संपादक फ़ाइल के माध्यम से प्रक्षेपित किए जा रहे आकार के रंग के आधार पर इलेक्ट्रोड रंग को नियंत्रित किया जा सकता है। हमने चार रंगों का इस्तेमाल किया: सफेद, पीला, लाल और नीला। प्रत्येक रंग के लिए पावर आउटपुट रीडिंग से, अनुमानित पीले (#FFFF00) और सफेद (#FFFFFF) इलेक्ट्रोड को उच्च तीव्रता के लिए मापा गया था, जो इस बात का आधार था कि ये रंग बाद के प्रयोगों में उपयोग करने के लिए अधिक अनुकूल क्यों थे। इसके अतिरिक्त, फोटोकंडक्टिव सामग्री30,31 की स्थापित प्रकाश तीव्रता निर्भरता के कारण, परिणाम बताते हैं कि एलआईडीईपी उपकरणों का प्रदर्शन फोटोकंडक्टिव ए: एसआई पर निर्भर करता है और अनुमानित इलेक्ट्रोड रंग की पसंद से ट्यून किया जा सकता है। एचएमएससी की सकारात्मक और नकारात्मक डीईपी प्रतिक्रियाओं का एक संयोजन भी एलआईडीईपी का उपयोग करके देखा गया था, जो पारंपरिक डीईपी विधियों में देखी गई घटना की तरह है। प्रत्येक इलेक्ट्रोड रंग के साथ, एचएमएससी ने नकारात्मक डीईपी बल, सकारात्मक डीईपी बल और सेल रोटेशन का अनुभव किया, यह दर्शाता है कि सेल नमूना एक ही आवृत्ति (पूरक वीडियो 1) पर विषम था। यह एडम्स एट अल.6 के निष्कर्षों से सहमत है कि एचएमएससी एक ही आवृत्ति पर नकारात्मक और सकारात्मक डीईपी व्यवहार दोनों प्रदर्शित करते हैं। ये स्थितियां (इलेक्ट्रोड रंग, इलेक्ट्रोड आकार और फोटोकंडक्टिव सामग्री) एचएमएससी नमूनों में विषमता के स्तर का पता लगाने के लिए अतिरिक्त पैरामीटर प्रदान कर सकती हैं।

अंत में, एलआईडीईपी मूल्यांकन के परिणामों की तुलना एचएमएससी डीईपी व्यवहार के बेंचमार्क के रूप में 3 डीईपी विश्लेषक के परिणामों से की गई थी। एचएमएससी की सकारात्मक डीईपी प्रतिक्रिया की आवृत्ति सीमा में अंतर देखा गया था, लेकिन एलआईडीईपी और 3 डीईपी विश्लेषक के माध्यम से एकत्र किए गए डेटा में रुझान समग्र रूप से समान थे (यानी, सकारात्मक डीईपी प्रतिक्रिया बढ़ी हुई आवृत्ति के साथ कम हो गई)। जब एसी इलेक्ट्रिक क्षेत्र को एलआईडीईपी चिप को आपूर्ति की गई थी और उस पर प्रकाश प्रक्षेपित किया गया था, तो प्रकाश प्रक्षेपण के भीतर क्षेत्र में चालकता गिर गई, जिससे एक गैर-समान विद्युत क्षेत्र बन गया। इसलिए, प्रकाश स्रोत (यानी, तीव्रता और तरंग दैर्ध्य) की विशेषताएं एलआईडीईपी चिप के भीतर कोशिकाओं की अपेक्षित प्रतिक्रिया को प्रभावित करती हैं, जैसा कि वोल्टेज और इलेक्ट्रोड रंग भिन्नता परीक्षणों के परिणामों से देखा गया है। अन्य पैरामीटर जिन्हें संशोधित किया जा सकता है, वे फोटोकंडक्टिव परत की सामग्री और डीईपी बफर समाधान की चालकता हैं। जैसे, कोशिकाओं के डीईपी व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग की जाने वाली स्थितियों का मूल्यांकन एलआईडीईपी प्रणाली के सेटअप के आधार पर किया जाना चाहिए। इसके विपरीत, 3 डीईपी विश्लेषक, या अन्य तरीकों के लिए जो डीईपी बल को लागू करने के लिए धातु इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हैं, इलेक्ट्रोड विशेषताएं स्थिर होती हैं और जांच के तहत कोशिकाओं के लिए आवश्यक चीजों के अनुकूल होने के लिए तुरंत भिन्न नहीं हो सकती हैं। सकारात्मक डीईपी व्यवहार की यह भिन्नता एचएमएससी नमूनों, एकल-सेल विश्लेषण, या सेल सॉर्टिंग के भीतर विभिन्न सेल प्रकारों के लक्षण वर्णन में भविष्य के शोध के लिए फायदेमंद हो सकती है। इसके अलावा, जैसे-जैसे कोशिकाएं वर्चुअल इलेक्ट्रोड से दूर जाती हैं, एसी विद्युत क्षेत्र कमजोर हो जाता है। हालांकि, 3 डीईपी विश्लेषक, या धातु इलेक्ट्रोड का उपयोग करने वाले अन्य पारंपरिक डीईपी मोड के साथ, एक बड़ा विद्युत क्षेत्र क्षेत्र लागू किया जा सकता है, जो अधिक कोशिकाओं को हेरफेर करने की अनुमति देता है। इसलिए, एलआईडीईपी प्रयोग में कम कोशिकाओं ने एलआईडीईपी चिप के माइक्रोचैनल के भीतर एसी इलेक्ट्रिक क्षेत्र के प्रभावों का अनुभव किया। समय के साथ डिवाइस के प्रदर्शन में परिवर्तन (यानी, 2 घंटे या 3 घंटे) के कारण आगे की विसंगतियां हो सकती हैं, जिसकी अभी भी जांच की जा रही है। पानी, इथेनॉल और डीईपी बफर समाधान का निरंतर प्रवाह माइक्रोचैनल परत (यानी, फोटोकंडक्टिव सामग्री) की सतह को तोड़ सकता है और इस पर विचार करने की आवश्यकता है। सेल लक्षण वर्णन के लिए समय के साथ डिवाइस के प्रदर्शन को एक LiDEP चिप के विस्तारित उपयोग के लिए भी विचार करने की आवश्यकता है। वास्तविक समय में प्रयोगात्मक मापदंडों में संशोधन में केवल कुछ सेकंड से मिनट लगते हैं। ग्राफिक संपादक सॉफ्टवेयर के भीतर सेटिंग्स का उपयोग करके इलेक्ट्रोड रंग और ज्यामिति को तुरंत समायोजित किया गया था।

सारांश में, यह पेपर एचएमएससी जैसे विषम सेल आबादी के साथ सेल लाइन में हेरफेर करने और चिह्नित करने के लिए एलआईडीईपी की क्षमताओं को प्रदर्शित करता है। इस सेटअप और वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम 20 वीपीपी और अनुमानित वर्चुअल पीले इलेक्ट्रोड की शर्तों के तहत एचएमएससी के सफल लक्षण वर्णन को प्राप्त करने में सक्षम थे। भविष्य के अध्ययनों को एलआईडीईपी के माध्यम से बनाए गए एसी इलेक्ट्रिक क्षेत्र में एचएमएससी के एक्सपोजर समय को समायोजित करने, आभासी इलेक्ट्रोड की प्रकाश तीव्रता बढ़ाने और विषम स्टेम सेल आबादी के विद्युत हस्ताक्षरों की एलआईडीईपी सूची विकसित करने के लिए एचएमएससी (या अन्य स्टेम सेल आबादी) के विभिन्न स्रोतों का आकलन करने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को सीबीईटी के माध्यम से नेशनल साइंस फाउंडेशन करियर अवार्ड (2048221) द्वारा समर्थित किया गया था। हम यूसीआई के एकीकृत नैनोसिस्टम्स रिसर्च फैसिलिटी (आईएनआरएफ) से मो केबेली को स्वीकार करना चाहते हैं। इसके अतिरिक्त, हम एलआईडीईपी प्रणाली के विकास में सहायता के लिए डॉ डेविन केक को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300054
10x objective AmScope ---
Amorphous silicon (A:Si) Millipore Sigma S5130
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240-062
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9706-100
Copper Tape Zehhe BF4964
Dextrose (glucose) Fisher D16-1
Digital microscope Keyence VHX-7000
Double Sided Tape Insulectro FLX000484
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-144
Fetel Bovine Serum (FBS) Corning 35-011-CV
Function Generator Tektronix AFG 31102
Graphic editor software Microsoft Office Powerpoint ---
Indium tin oxidec coated glass slides MSE Supplied GL0333
L-Alanyl-L-Glutamine ATCC PCS-999-034
Laptop Dell Inspiron 14, 2-in-1
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium ATCC PCS-500-030
Mesenchymal Stem Cell Growth Kit for Umbilical and Adipose Cord-Derived MSCs ATCC PCS-500-040
Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X) Giblo A10490-01
Molybdenum, 99.95% Kurt J. Lesker EJTMOXX352A4 Sputtering target
Phenol Red Sigma P5530
Power Meter Thor Labs S130VC/PM400
Projector Vecupoi ---
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Media Gibco 11875-093 This media has L-Glutamine and Phenol Red.
Sucrose Fisher BP220-1
Trypan Blue Stain Gibco 15250-061 0.40%
Trypsin Neutralizer Gibco R002100
Vacuum Sputtering System Denton DV-502M

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References

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Lacy, K. L., Salib, S., Tran, M.,… More

Lacy, K. L., Salib, S., Tran, M., Tsai, T., Valentine, R., Ardoña, H. A. M., Adams, T. N. G. Light-Induced Dielectrophoresis for Characterizing the Electrical Behavior of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (196), e64909, doi:10.3791/64909 (2023).

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