Summary
Här presenterar vi ljusinducerad dielektrofores som en etikettfri metod för att karakterisera heterogena cellinjer, specifikt humana mesenkymala stamceller (hMSC). Detta dokument beskriver ett protokoll för att använda och optimera en mikrofluidisk enhet med ett fotoledande skikt för att karakterisera det elektriska beteendet hos hMSC utan att ändra deras ursprungliga tillstånd.
Abstract
Humana mesenkymala stamceller (hMSC) erbjuder en patient-härledd cellkälla för att genomföra mekanistiska studier av sjukdomar eller för flera terapeutiska tillämpningar. Att förstå hMSC-egenskaper, såsom deras elektriska beteende vid olika mognadsstadier, har blivit viktigare de senaste åren. Dielektrofores (DEP) är en metod som kan manipulera celler i ett ojämnt elektriskt fält, genom vilket information kan erhållas om cellernas elektriska egenskaper, såsom cellmembrankapacitans och permittivitet. Traditionella metoder för DEP använder metallelektroder, såsom tredimensionella elektroder, för att karakterisera cellernas respons på DEP. I denna artikel presenterar vi en mikrofluidisk enhet byggd med ett fotoledande skikt som kan manipulera celler genom ljusprojektioner som fungerar som in situ virtuella elektroder med lätt formbara geometrier. Ett protokoll presenteras här som demonstrerar detta fenomen, kallat ljusinducerad DEP (LiDEP), för att karakterisera hMSC. Vi visar att LiDEP-inducerade cellsvar, mätt som cellhastigheter, kan optimeras genom olika parametrar såsom ingångsspänning, ljusprojektionernas våglängdsområden och ljuskällans intensitet. I framtiden ser vi framför oss att denna plattform kan bana väg för teknologier som är etikettfria och utför realtidskarakterisering av heterogena populationer av hMSC eller andra stamcellslinjer.
Introduction
Mänskliga mesenkymala stamceller (hMSC) är kända för sina immunsuppressiva egenskaper1, vilket har lett till deras användning i terapeutiska medel för behandling av en mängd olika sjukdomar, såsom typ II-diabetes2, transplantat mot värdsjukdom3 och leversjukdom4. HMSC är heterogena och innehåller subpopulationer av celler som differentieras till adipocyter, kondrocyter och osteoblaster. HMSC härrör från fettvävnad, navelsträngsvävnad och benmärg, och deras differentieringspotential beror på ursprungsvävnaden och cellodlingsprocessen som används5. Till exempel, enligt en studie av Sakaguchi et al., är hMSC härrörande från fettvävnad mer benägna att differentiera till adipocyter, medan hMSC härrörande från benmärg är mer benägna att differentiera till osteocyter6. Effekten av vävnadens ursprung hos hMSC på deras differentieringspotential är dock ett fenomen som fortfarande behöver förstås ytterligare. Dessutom bidrar de olika differentieringspotentialerna hos hMSC till deras inneboende heterogenitet och skapar utmaningar vid tillämpning av hMSC för terapi. Som sådan är karakterisering, såväl som sortering, av heterogena stamcellslinjer avgörande för att utveckla in vitro och klinisk tillämpning av dessa celler. Flödescytometri, guldstandardtekniken för att undersöka skillnader i cellulära fenotyper, använder cellytantigener och fluorescerande färgämnen för att märka målceller och karakterisera dem baserat på ljusspridning eller cellspecifika fluorescensegenskaper 6,7,8. Nackdelarna med denna metod inkluderar den begränsade tillgängligheten av cellytantigenbiomarkörer, den höga kostnaden för utrustning och drift och det faktum att cellytfärgningen potentiellt kan skada cellmembranet och påverka terapeutiska tillämpningar 9,10,11. Att utforska nya tekniker för cellkarakterisering utan att äventyra cellmembranets ursprungliga tillstånd kan därför gynna den kliniska prestandan hos stamcellsterapier.
Dielektrofores (DEP), en metod för cellkarakterisering som inte använder ytetiketter, är fokus för detta nuvarande arbete. DEP är en etikettfri eller icke-färgningsmetod implementerad på mikrofluidiska plattformar för att karakterisera heterogena populationer av celler baserat på deras elektriska egenskaper. DEP använder ett elektriskt växelströmsfält som ersättning för fluorescensfärgning (dvs. en etikettbaserad metod)7. De andra fördelarna med att använda DEP-baserade mikrofluidiska anordningar för cellkarakterisering inkluderar användning av små volymer (mikroliter), snabb analystid, minimala krav på cellprovberedning, minimal risk för provkontaminering, minimal avfallsproduktion och låg kostnad12,13. En annan fördel med DEP är realtidsövervakning av celler14,15,16. För DEP utsätts celler i suspension för ett ojämnt växelströmsfält skapat med elektroder, och de blir polariserade6. Denna polarisering orsakar cellrörelse och möjliggör cellmanipulation baserat på frekvensen och spänningen hos det applicerade växelströmsfältet. Genom att justera frekvensen, vanligtvis mellan 5 kHz och 20 MHz, kan celler lockas till eller stötas bort från elektroderna, vilket motsvarar positivt respektive negativt DEP-beteende6.
Det finns flera lägen för DEP-karakterisering, nämligen traditionell, fältflödesfraktionering och ljusinducerad, som klassificeras av deras elektrodkonfiguration och / eller driftsstrategi17. 3DEP-analysatorn, ett traditionellt läge för DEP, innehåller fysiska metallelektroder och övervakar det cellulära svaret på ett elektriskt växelströmsfält. Detta system använder ett chip bestående av mikrobrunnar med flera tredimensionella cirkulära elektroder och detekterar förändringar i ljusintensiteter för att karakterisera cell DEP-beteende 18,19,20,21. Positiv dataexekveringsskydd observeras när cellerna rör sig mot kanterna på de cirkulära elektroderna längs mikrobrunnens väggar, vilket resulterar i ökad ljusintensitet i mitten av mikrobrunnen. Negativ DEP observeras när celler kluster i mitten av mikrobrunnen bort från de cirkulära elektroderna, vilket resulterar i minskad ljusintensitet i mitten av mikrobrunnen. Dessa två fenomen representeras i figur 1. Traditionella DEP-metoder har förmågan att karakterisera de elektriska egenskaperna hos heterogena cellpopulationer 18,20,21. Till exempel visade Mulhall et al. potentialen att skilja mellan normala orala keratinocyter (HOK) och maligna orala keratinocyter (H357) cellinjer baserat på skillnader i membrankapacitans21 med hjälp av 3DEP-analysatorn. En begränsning av traditionella sätt att exekvera genom dataexekveringsskydd är emellertid den fasta elektrodgeometrin. Eftersom hMSC är heterogena är det fördelaktigt att ha förmågan att enkelt modifiera elektrodgeometrierna under DEP-bedömningar. Att till exempel kunna modifiera elektroderna eller elektrodmatriserna i realtid för encellsfångst gör att cellerna kan karakteriseras baserat på hastighet och DEP-beteende. Tillämpningen av elektrodmodifiering i realtid i DEP-bedömningar av hMSC möjliggör encellsanalys av hMSC direkt efter att de hämtats från provvävnaden för att karakterisera heterogeniteten hos provpopulationen.
För att övervinna begränsningen av traditionella sätt för DEP (dvs. fasta fysiska elektroder) och utforska nya möjligheter för elektrodkonfigurationsändringar i realtid med hjälp av DEP-fenomenet har ljusinducerad DEP (LiDEP) undersökts. LiDEP är ett icke-traditionellt sätt för DEP som manipulerar celler med hjälp av en fotoledande mikrofluidisk enhet22,23 via ljusprojektioner, lokaliserade elektroder skapar ett ojämnt elektriskt fält, liknande den traditionella DEP-metoden. Detta tillvägagångssätt möjliggör också flexibilitet i elektrodgeometrin och för att flytta elektroderna inom den mikrofluidiska anordningen. Detta mildrar begränsningen som ses med fasta elektroder och ger möjlighet att få mer information om cellulär heterogenitet. LiDEP har använts för att detektera och analysera olika celltyper i homogena och heterogena populationer av celler22,23,24. Till exempel använde Liao et al. LiDEP för att separera cirkulerande tumörceller (CTC) som uttrycker epitelcelladhesionsmodulen (EpCAMneg) från röda blodkroppar för att utforska deras betydelse vid cancermetastaser22. Encellsanalys med LiDEP har framgångsrikt använts för att karakterisera och manipulera cancerceller med stratifiering av tumörigenicitet23 i bukspottskörteln och analys av CTC i prover före och efter metastasering24.
Här beskriver vi hur LiDEP kan användas för att manipulera hMSC med en mängd olika elektrodgeometrier (cirkel-, diamant-, stjärn- och parallella linjer) och systeminställningar (applicerad spänning, ljusintensitet och mikrofluidiskt enhetsmaterial), vilket ger ett tillvägagångssätt för att karakterisera beteendet hos mänskliga stamceller med virtuella elektroder.
Protocol
1. Tillverkning av LiDEP-mikrofluidiska enheter
OBS: Tillverkningsprocessen består av att kombinera tre skiktade komponenter: (i) ett fotoledande skikt med amorft kisel (A: Si) och molybden avsatt på ett indiumtennoxid (ITO) glassubstrat; ii) Ett mikrokanalskikt som skurits ut ur dubbelhäftande tejp. och (iii) ett övre ITO-glassubstrat med borrade hål för cellsuspensionens inlopp och utlopp.
- Glasbeläggning av fotoledande indiumtennoxid (ITO)
- Rengör det ITO-belagda glassubstratet (15–20 Ω motstånd) genom att flöda kvävgas (N2) vid ytan med en flödeshastighet som är tillräcklig för att flytta synliga dammpartiklar. Skölj substratet med aceton efter detta steg.
- Överför den ITO-belagda glasskivan till ett isopropylalkoholbad för att tvätta bort acetonresten, skölj med DI-vatten och flödaN2-gas igen tills substratet är helt torrt.
- Placera glasskivan med den ITO-belagda sidan uppåt i vakuumförstoftningssystemet.
- Sputtera ett 10 nm tjockt lager molybden på det ITO-belagda glassubstratet (molybdenmålet) med en deponeringshastighet på 0,7 Å/s och en deponeringstid på 140 s.
- Lägg till en skuggmask på ena sidan av glassubstratet för att lämna 2 mm från kanten av glassubstratet avtäckt för elektriska anslutningar. Deponering av 1 μm A:Si med användning av induktivt kopplad plasmaplasmaförstärkt kemisk ångavsättning (ICP-PECVD), såsom beskrivs i Medjdoub et al.25.
- Rengör glaset medN2-gas för att avlägsna damm och andra föroreningar. För alla A: Si som deponeras under skuggmasken, sänk ner kanten upp till 2 mm-märket i en 25% w / v kaliumhydroxidlösning för att etsa A: Si.
- Tillverkning av LiDEP-chipenheter
- För att bilda mikrokanalen, skaffa dubbelhäftande tejp (52 mm x 25 mm) och stanshål (diameter = 4 mm) 5-6 mm från kanten av den kortare dimensionen och centrerad mellan bandets längre sidor. Använd en skalpell för att skära två raka linjer (3 mm från varandra) över hålen. Se till att skyddsarken på båda sidor av den dubbelhäftande tejpen är på under hela mikrokanalskärningssteget.
- Borra två hål med 3 mm diameter i den övre ITO-glasskivan. Tejpen kan justeras ovanpå det ITO-belagda glaset, med tejpens långkant i linje med glasets långkant. Markera hålplatsen med en tvättbar markör. Se till att de borrade hålen ligger i linje med hålen i den dubbelhäftande tejpen. Dessa två hål kommer att fungera som inlopps- och utloppshålen i den mikrofluidiska anordningen.
- Ta bort ena sidan av skyddsfilmen på den dubbelhäftande tejpen, rikta in hålen i tejpen och den övre ITO-glasskivan och tryck ihop dem. Tryck försiktigt för att ta bort luftfickorna, särskilt nära mikrokanalen. Luftfickor kan tillåta mediet eller andra lösningar att sippra under tejpen, vilket kan skada eller orsaka mögel i mikrofluidanordningen.
- Ta bort den andra skyddsfilmen från den dubbelhäftande tejpen och tryck på molybden och A: Si-belagd ITO-glassida. Matcha kanten på den fotoledande bilden som är motsatt 2 mm spelrumssidan till kanten på den dubbelhäftande tejpen som är mot mitten av den övre ITO-glasskivan. Det kommer att finnas baksmälla från den övre ITO-glasskivan och den fotoledande materialbelagda ITO-glasskivan.
- Tryck på en plan yta för att säkerställa god vidhäftning. En schematisk bild av glassubstratet och de dubbelhäftande tejpskikten illustreras i figur 1A. Klipp av överflödig tejp på sidan.
- Applicera koppartejp på kanterna på lager A och lager C för att ansluta funktionsgeneratorn. Gör detta genom att linda tejpen på sidan av ITO eller det fotoledande materialet, beroende på om det är lager A eller lager C, från kanten på den dubbelhäftande tejpen till cirka 3 cm på den obelagda sidan av glassubstratet.
- För att säkerställa framgångsrik enhetstillverkning, använd en multimeter för att testa för en motståndsavläsning mellan de belagda bilderna på båda glassubstraten och koppartejpen som fästes på glaset.
- Förberedelse av DEP-buffert
- Mät upp 4,25 g sackaros och placera den i ett 50 ml koniskt rör. Mät sedan upp 0,15 g glukos och placera den i samma 50 ml koniska rör.
- Fyll det koniska röret med 25 ml ultrarent vatten, stäng locket och blanda. När ungefär hälften av sackaros och glukos har lösts upp, fyll det koniska röret med ultrarent vatten upp till 50 ml linjen. Blanda kraftigt tills all sackaros och glukos är upplösta. DEP-buffertlösningen innehåller 8,5 % (vikt/volym) sackaros och 0,3 % (vikt/volym) glukos.
- Ersätt 20 ml av den beredda sackaros- och glukoslösningen och placera den i ett 50 ml koniskt rör. Mät sedan upp 0,1 g bovint serumalbumin (BSA) och placera det i det 50 ml koniska röret som innehåller sackaros- och glukoslösningen. Virvel tills BSA är upplöst. Den slutliga buffertlösningen för dataexekveringsskydd innehåller 0,5 % (w/v) BSA.
- Förberedelse av celler
- Erhåll minst 1 x 106 celler (hMSC eller HEK 293) suspenderade i 1 ml tillväxtmedium med hjälp av cellodlingsprotokollet som beskrivits i tidigare studier26,27. Placera cellsuspensionen i ett 10 ml centrifugrör.
- Centrifugera HEK 293-cellerna vid 201 x g i 5 minuter och hMSC vid 290 x g i 10 minuter. Efter centrifugering aspirerar supernatanten och suspenderar cellerna i 1 ml av DEP-buffertlösningen med 0,5 % BSA. Var noga med att inte lägga till buffertlösningen för snabbt eftersom bubblor kan bildas.
- Upprepa centrifugeringsprocessen ytterligare två gånger och suspendera sedan cellerna i DEP-bufferten med 0,5 % BSA för LiDEP-karakterisering. Det angivna cellberedningsprotokollet räcker för 10 körningar. Till exempel kräver ett frekvenstest minst 15 körningar, och därmed måste 2 ml celler i en koncentration av 1 x 106 celler / ml göras.
2. Karakterisering av LiDEP
- Experimentell installation
- Montera följande utrustning för experimentell installation för kvantifiering av cellulära svar på LiDEP: en bärbar dator, en projektor, en objektivlins, ett digitalt mikroskop och en funktionsgenerator. Använd den bärbara datorn för att designa ljusprojektionerna (stjärna, diamant, tre linjer och oval) och anslut den till projektorn.
- Använd projektorn som ljuskälla för att visa ljusprojektionerna på den fotoledande ytan (lager C) på LiDEP-chipet. Ställ in den så att ljuset från ljuskällan (projektorn) färdas genom en 10x objektivlins till LiDEP-chipets mikrokanalområde. 10x objektivlinsen sitter ovanpå projektorlinsen. Kompletterande figur 1 visar integreringen av projektorn i LiDEP-systemet.
- Anslut LiDEP-chipet till funktionsgeneratorn för att applicera det elektriska växelströmsfältet. Observera cellerna som upplever LiDEP-kraften genom att använda det digitala mikroskopet för bildbehandling och videoinspelning. Figur 1B visar en schematisk bild av experimentapparaturen. Följ standardcellodlingsprotokoll26,27 för alla testade celler.
- Experimentella förfaranden
- Spola mikrokanalen med 70% etanol, följt av 0,5% BSA-lösning. Spola mikrokanalen igen med 0,5% BSA-lösning ytterligare två gånger för att säkerställa att etanolen och tidigare celler tvättas bort helt. Celler som redan har exponerats för dataexekveringsskyddet svarar annorlunda än färska celler och kan störa datainsamlingen.
- Ta bort 0,5% BSA-lösningen med en pipett och montera den mikrofluidiska enheten i enhetshållaren.
- Fäst alligatorklämmor på var och en av kopparbandanslutningarna på enheten. Ställ in funktionsgeneratorn på önskad spänning (spänning peak-to-peak, Vpp) och frekvens (Hz). Frekvensområdet som testades här var 30 kHz till 20 MHz.
- Tillsätt 70 μL cellsuspension (celler + DEP-buffertlösning med 0,5% BSA) i enhetens mikrokanal. På grund av mikrokanalens tunnhet (~ 0,05 mm) kan spill ut ur inlopps- och utloppshålen uppstå. För att minska mängden spill, använd en mindre pipettspets och luta spetsen något i hålet mot mikrokanalen. Alla åtkomstlösningar (0,5 % BSA eller celler i lösning) kan torkas bort med pappersservetter för engångsbruk och kastas i biologiskt farligt avfall.
- Projicera önskad virtuell elektrodgeometri (här, cirklar, diamanter, stjärnor och/eller parallella linjer) på LiDEP-chipet.
- I det digitala mikroskopprogrammet ställer du in videolängden till 3 minuter. Ställ in en labbtimer på 2 min 30 s. När cellerna är stationära i LiDEP-chipets mikrokanal trycker du på Start i det digitala mikroskopprogrammet för att starta videoinspelningsprocessen.
- Vänta 10 s, tryck sedan på ON-knappen på funktionsgeneratorns kanalutgång för att applicera det elektriska fältet och tryck på Start för timern. Övervaka cellens DEP-beteende genom det digitala mikroskopet och förhindra skakningar eller rörelser runt installationen.
- När timern släcks, tryck på ON-knappen på funktionsgeneratorns kanalutgång. Detta stänger av funktionsgeneratorns kanalutgång och det elektriska växelströmsfältet matas inte längre genom elektroderna. Stoppa videoinspelningen vid 3 minuter och spara i det digitala mikroskopet för framtida analys.
- Pipettera ut cellerna ur LiDEP-chipets utloppsände genom att långsamt trycka in 60 μL DEP-buffert med 0,5 % BSA i mikrokanalen och samtidigt samlas vid utloppet. Fortsätt tills det finns få eller inga celler i mikrokanalen.
- Upprepa steg 2.2.3-2.2.9 tills alla frekvenser har testats.
Representative Results
Spännings- och elektrodfärgtester slutfördes med hjälp av proceduren ovan med en liten variation i steg 2.2.3 och steg 2.2.10. För spänningstestet förblev elektrodfärgen och frekvensen konstant och 5 V pp, 10 V pp och 20 Vpp applicerades. För elektrodfärgtestet hölls den applicerade spänningen och frekvensen konstant vid 30 kHz och 20 Vpp, och blå, röd, vit och gul (refererad av HEX-färgkoder #4472C4, #FF0000, #FFFFFF respektive #FFFF00) projicerade elektroder undersöktes. Cellviabiliteten undersöktes genom färgning av cellerna med trypanblått och räkning av antalet levande och döda celler med hjälp av en hemocytometer.
Med LiDEP-installationen kunde vi manipulera hMSC: erna och generera DEP-svarskurvor som svar på ingångsfrekvensen, vilket är ett sätt att karakterisera cellernas elektriska beteende. En serie experiment genomfördes för att hitta de optimala driftsförhållandena genom att manipulera parametrar som den applicerade spänningen och den projicerade elektrodfärgen (dvs. former med distinkta färger skapade med en grafisk redigeringsprogramvara) för att observera konsekvent cellbeteende till det ojämna växelströmsfältet som genereras med de virtuella elektroderna. De data som samlats in för cellsvar med LiDEP, icke-traditionell DEP, jämfördes med resultat från 3DEP-analysatorn, traditionell DEP.
Det första optimeringstestet fokuserade på det positiva DEP-svaret hos hMSC (dvs. cellerna som rör sig mot den virtuella elektroden) i LiDEP-chipet. De celler som inte uppvisade ett positivt DEP-svar visade antingen ett negativt DEP-svar genom att flytta sig bort från den virtuella elektroden, var stationära och roterande eller svarade inte på det elektriska fältet. Cellernas respons kvantifierades genom att spåra deras hastigheter (μm/s) i ImageJ under en period på 2 min 30 s. En gul oval projektion användes för den virtuella elektroden, och de applicerade spänningarna på 5 V pp, 10 V pp och 20 Vpp undersöktes vid en inställd frekvens på 30 kHz. Vi fokuserade på celler som var inom 50 μm från den virtuella elektroden medan AC-elektriskt fält var på för konsistens och för att minimera avvikande värden. 20 V pp resulterade i den snabbaste cellrörelsen av HEK 293-cellerna, med en genomsnittlig hastighet på 0,035 μm / s, och detta följdes av 0,032 μm / s vid 10 V pp och 0,020 μm / s vid 5 Vpp, vilket innebär att dessa celler representerar en relativt homogen kontroll. En liknande trend observerades för hMSC, som hade en genomsnittlig hastighet på 0,051 μm/s vid 20 V pp, 0,036 μm/s vid 10 V pp och 0,025 μm/s vid 5 V pp, som i figur 2A (här indikerar * p < 0,05). Vid 20 Vpp observerades att hMSC upplevde positiv och negativ DEP samtidigt. Detta observerades inte vid 10 V pp och 5 V pp. Livsduglighetsresultaten för hMSC efter att ha upplevt DEP-kraften visade att högre spänningar i allmänhet resulterade i lägre cellviabilitet, med 66% av cellerna livskraftiga vid 5 V pp, 58% av cellerna livskraftiga vid 10 V pp och 57% av cellerna livskraftiga vid 20 V pp. som i figur 2B (här indikerar ** p < 0,01).
På grund av att LiDEP är ett optiskt baserat system är ljusintensiteten och elektrodfärgen parametrar som enkelt kan ställas in för att styra LiDEP-chipets prestanda. Här utvärderades olika elektrodfärger (vit, gul, röd och blå) genererad baserat på formen som projicerades för att bestämma effekten på cellernas DEP-svar. HEK 293-celler och hMSC utvärderades vid 20 Vpp och 30 kHz. Vita, gul-, röd- och blåfärgade elektroder valdes, men belysningen genom LiDEP-chipet påverkades av det fotoledande skiktet, som hade en röd-orange färg. Således verkade den projicerade vita elektroden gul med en vit inredning, den röda elektroden verkade orange med en röd kontur och den blå elektroden verkade ljusgrön (figur 3A-D). Uteffekten för dessa fyra färger var följande: 77,7 μW ± 0,7 μW, 92,7 μW ± 1,3 μW, 21,9 μW ± 0,2 μW och 56,7 μW ± 0,9 μW för vitt, gult, rött respektive blått. Detta tyder starkt på att gult och vitt hade det starkaste DEP-fältet, medan blått och rött var svagare, som i figur 3E (här indikerar *** p < 0,001 för HEK 293-celler och ** indikerar p < 0,01 för hMSC). Stationär rotation av cellerna på kanterna av de gula och vita virtuella elektroderna under appliceringen av DEP-kraften observerades också. För alla elektrodfärgvariationer inträffade samtidiga negativa och positiva DEP-svar, vilket korrelerade med vad som visades vid 20 Vpp för spänningstestet. Dessutom, medan cellernas hastighet varierade baserat på elektrodfärgen, svarade nästan alla celler inom gränsen på 50 μm på LiDEP. Storleken på hMSC uppmättes som 19,2 μm ± 5,8 μm.
För att bedöma LiDEP-förmågan jämfört med DEP med konventionella elektroder bedömde vi skillnaderna mellan DEP-beteendet hos celler som använde LiDEP och det hos celler som analyserades av 3DEP-analysatorn. Svaret från dataexekveringsskyddet för hMSC mättes i en DEP-buffertlösning med låg ledningsförmåga med 0,5 % BSA (~100 μS/cm). För att efterlikna 3DEP-analysatorn projicerades en enda oval gul virtuell elektrod vid 10 Vpp. HMSC: s DEP-beteende karakteriserades från 30 kHz till 20 MHz. Vid frekvenser lägre än 25 kHz observerade vi elektrolys, vilket resulterade i bubbelbildning vid ytan av metallskiktet i den mikrofluidiska anordningen. För LiDEP, vid lägre frekvenser, upplevde hMSC positiv DEP-kraft, som i figur 4A, representerad som procentandelen celler som lockades till den virtuella elektroden. Cellerna började med en stark positiv DEP-kraft, som försvagades när frekvensen ökade. Cellerna upplevde den starkaste positiva DEP-kraften från 30 kHz till 97 kHz. Efter applicering av det elektriska växelströmsfältet vid dessa frekvenser svarade vissa celler inte, medan andra celler visade negativt DEP-beteende. Denna trend avviker från det observerade svaret kvantifierat med hjälp av 3DEP-analysatorn. cellerna ökade i positiv DEP från 37 kHz till 255 kHz och minskade i positiv DEP från 1 772 kHz till 20 MHz, som i figur 4B.
Bild 1: Experimentell konfiguration för LiDEP-protokollet som beskrivs här för hMSC. (A) Schematisk och verklig bild av LiDEP-chipet med det fotoledande skiktet och experimentuppställningen. (B) Representativa bilder av positiva och negativa DEP-svar hos celler i 3DEP-analysatorn (med konventionella DEP-elektroder, överst) och schematisk representation av positiva och negativa DEP-svar hos celler med LiDEP (med ljusprojektioner som virtuella elektroder, botten). (C) Exempel på olika former som kan projiceras på enheten som virtuella elektroder. Figur skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Karakterisering av hMSC:s respons (hastighet) vid DEP och deras viabilitet under givna betingelser. a) De uppmätta hastigheterna för hMSC:s positiva respons på 5 V pp, 10 V pp och 20 V pp. hMSC rörde sig vid 0,051 μm/s vid 20 V pp, 0,036 μm/s vid 10 V pp och 0,025 μm/s vid 5 Vpp. b) HMSC:ernas viabilitet efter att ha upplevt den positiva DEP-kraft som alstras med virtuella elektroder. Viabiliteten var 57 %, 58 % och 66 % för 20 V pp, 10 V pp respektive 5 Vpp. Felstaplar representerar standardavvikelsen (SD). Statistisk analys slutförd på poolade dataset med t-test (*p < 0,05 och **p < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Jämförelse av DEP-svar mellan homogena (HEK 293) och heterogena (hMSC) cellinjer. Positivt DEP-svar från hMSC-celler på (A) vita, (B) gula, (C) röda och (D) blå elektroder vid 20 Vpp och 30 kHz. (E) Hastighetssvar hos HEK 293-celler och hMSC på de olikfärgade elektroderna. HEK 293-cellerna uppvisade de högsta hastigheterna med de gula och röda elektroderna vid 0,035 μm / s respektive 0,033 μm / s. HEK 293-cellerna uppvisade den lägsta hastigheten med de blå elektroderna vid 0,027 μm / s. hMSC:erna uppvisade de högsta hastigheterna med de gula och vita elektroderna vid 0,068 μm/s respektive 0,049 μm/s. hMSC:erna upplevde den lägsta hastigheten med de röda elektroderna vid 0,039 μm/s. Felstaplarna representerar SD. Statistisk analys slutförd på poolade datauppsättningar med t-test (*p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Jämförelse av svaren från dataexekveringsskyddet för hMSC med LiDEP och 3DEP. Svaren från dataexekveringsskyddet för hMSC uppmätta med (A) LiDEP och (B) 3DEP-analysatorn vid 10 Vpp. Med LiDEP skedde ett sönderfall i hMSC:ernas positiva DEP-respons från 30 kHz till 20 MHz. Från 3DEP-analysatorn ökade cellerna i positiv DEP från 37 kHz till 255 kHz och minskade i positiv DEP från 1 772 kHz till 20 MHz. Felstaplar representerar SD. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande bild 1: Representativa bilder av LiDEP-installationen som används för experimenten i detta protokoll. Inzoomad bild av LiDEP-systemet som visar projektorns integration. Ljus färdas från källan (projektorn) genom en 10x objektivlins till LiDEP-chipets mikrokanal. 10x-målet sitter ovanpå projektorlinsen. Varje komponent är numrerad i bilderna och listad på sidan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video 1: Representativ video av hMSC som svarar på de vita, gula, röda och blå virtuella elektroderna. Cellerna visualiseras som att de upplever positiv DEP (rör sig mot den virtuella elektroden), upplever negativ DEP (rör sig bort från den virtuella elektroden), stationär och roterande eller inte svarar på det elektriska fältet. hMSC: erna testades vid 37 kHz och 20 Vpp, och videon påskyndades 20x. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Att undersöka heterogeniteten hos hMSC är viktigt för deras framsteg inom terapi. Detta arbete utgör ett första steg för att använda LiDEP som ett analytiskt verktyg för bedömning av hMSC. Vi undersökte spänningsberoendet av det positiva DEP-svaret hos celler i LiDEP genom att kvantifiera hastigheten. Det förväntas att högre spänningar bör ge starkare positiv DEP-kraft, och vi observerade detta mönster med de uppmätta hastigheterna. Spänningarna 10 V pp och 20 Vpp var tillräckliga för manipulering av hMSC med LiDEP. Lägre spänningar (dvs. 5 Vpp) resulterade i långsammare cellsvar; även om det inte är optimalt för hMSC, kan detta vara fördelaktigt för andra celltyper. Det fanns en spänningsberoende minskning av hMSC: s livskraft på cirka 9%. Detta skiljer sig något från den tidigare litteraturen 6,12,28,29, där användningen av traditionell DEP och LiDEP vid undersökning av biologiska celler inte minskade cellviabiliteten. Det experimentella målet i varje studie varierade dock. Glasser och Fuhr övervakade tillväxten av vidhäftande L929-musfibroblaster på metallelektroder i cellodlingsmedium28. Omvänt undersökte Lu et al. livskraften hos neurala stamceller som exponerades för växelströmselektriska fält under olika tidsperioder12. karakteriserade de dielektriska egenskaperna hos hMSC med metallelektroder12 och Li et al. manipulerade leukemiceller med LiDEP29. Skillnaden mellan dessa studier och vår var användningen av BSA, vilket kan vara orsaken till den minskade lönsamheten vi observerade. Den lägre totala livskraften kan dock också bero på exponeringstiden (2 min 30 s) som används i protokollet som fastställs här. Denna tid valdes för att ge tillräckligt med tid för att visualisera cellmanipulation under exponering för det ojämna växelströmsfältet.
Metoderna för cellkarakterisering testades via elektrodfärgen för att bestämma kapaciteten och begränsningarna hos vårt LiDEP-system byggt enligt beskrivningen i protokollet. I detta specifika protokoll kan elektrodfärgen styras baserat på färgen på formen som projiceras genom en grafisk redigeringsfil. Vi använde fyra färger: vit, gul, röd och blå. Från effektavläsningarna för varje färg mättes de projicerade gula (#FFFF00) och vita (#FFFFFF) elektroderna för att ha högre intensiteter, vilket var grunden för varför dessa färger var mer gynnsamma att använda i de efterföljande experimenten. Dessutom, på grund av det etablerade ljusintensitetsberoendet av fotoledande material30,31, tyder resultaten på att LiDEP-enheternas prestanda bygger på fotoledande A: Si och kan ställas in genom valet av den projicerade elektrodfärgen. En kombination av positiva och negativa DEP-svar från hMSC observerades också med användning av LiDEP, vilket är som fenomenet som ses i traditionella DEP-metoder. Med varje elektrodfärg upplevde hMSC: erna negativ DEP-kraft, positiv DEP-kraft och cellrotation, vilket indikerar att cellprovet var heterogent vid en enda frekvens (kompletterande video 1). Detta överensstämmer med resultaten från Adams et al.6 att hMSC uppvisar både negativt och positivt DEP-beteende vid en enda frekvens. Dessa förhållanden (elektrodfärg, elektrodform och fotoledande material) kan ge ytterligare parametrar för att detektera heterogenitetsnivån i hMSC-prover.
Slutligen jämfördes resultaten av LiDEP-bedömningen med resultaten från 3DEP-analysatorn som ett riktmärke för hMSC DEP-beteende. En skillnad i frekvensområdet för hMSC:s positiva DEP-respons observerades, men trenderna i de data som samlats in via LiDEP och 3DEP-analysatorn var totalt sett likartade (dvs. det positiva DEP-svaret minskade med ökad frekvens). När växelströmsfältet tillfördes LiDEP-chipet och ljus projicerades på det, sjönk konduktansen i området inom ljusprojektionen, vilket skapade ett ojämnt elektriskt fält. Därför påverkar ljuskällans egenskaper (dvs. intensitet och våglängd) det förväntade svaret hos cellerna i LiDEP-chipet, vilket framgår av resultaten av spännings- och elektrodfärgvariationstesterna. Andra parametrar som kan modifieras är materialet i det fotoledande skiktet och konduktiviteten hos DEP-buffertlösningen. Som sådan måste de förhållanden som används för att utvärdera cellernas DEP-beteende utvärderas baserat på installationen av LiDEP-systemet. Omvänt, för 3DEP-analysatorn eller andra metoder som använder metallelektroder för att applicera DEP-kraften, är elektrodegenskaperna konstanta och kan inte varieras omedelbart för att anpassa sig till vad som behövs för cellerna som undersöks. Denna variation av det positiva DEP-beteendet kan vara till nytta för framtida forskning om karakterisering av olika celltyper inom hMSC-prover, encellsanalys eller cellsortering. Dessutom, när cellerna rör sig längre bort från de virtuella elektroderna, blir växelströmsfältet svagare. Men med 3DEP-analysatorn eller andra traditionella DEP-lägen som använder metallelektroder kan ett större elektriskt fältområde appliceras, vilket gör att fler celler kan manipuleras. Därför upplevde färre celler per LiDEP-experiment effekterna av det elektriska växelströmsfältet i LiDEP-chipets mikrokanal. Ytterligare avvikelser kan orsakas av förändringar i enhetens prestanda över tid (dvs. 2 timmar eller 3 timmar), vilket fortfarande undersöks. Det konstanta flödet av vatten, etanol och DEP-buffertlösning kan bryta ner ytan på mikrokanalskiktet (dvs. det fotoledande materialet) och måste beaktas. Enhetens prestanda över tid för cellkarakterisering måste också beaktas för utökad användning av ett LiDEP-chip. Modifieringar av experimentparametrarna i realtid tog bara några sekunder till minuter. Elektrodfärgen och geometrierna justerades omedelbart med hjälp av inställningar i grafikredigeringsprogrammet.
Sammanfattningsvis visar denna artikel LiDEP: s förmåga att manipulera och karakterisera en cellinje med heterogena cellpopulationer såsom hMSC. Med hjälp av denna inställning och det beskrivna protokollet kunde vi uppnå en framgångsrik karakterisering av hMSC under förhållandena 20 Vpp och projicerade virtuella gula elektroder. Framtida studier bör fokusera på att justera exponeringstiden för hMSC till det elektriska växelströmsfältet som skapas via LiDEP, öka ljusintensiteten hos de virtuella elektroderna och bedöma olika källor till hMSC (eller andra stamcellspopulationer) för att utveckla en LiDEP-katalog över de elektriska signaturerna hos heterogena stamcellspopulationer.
Disclosures
Författarna rapporterar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation CAREER award (2048221) via CBET. Vi vill tacka Mo Kebaili från UCI:s Integrated Nanosystems Research Facility (INRF). Dessutom vill vi tacka Dr. Devin Keck för att ha hjälpt till med utvecklingen av LiDEP-systemet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 10x objective | AmScope | --- | |
| Amorphous silicon (A:Si) | Millipore Sigma | S5130 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9706-100 | |
| Copper Tape | Zehhe | BF4964 | |
| Dextrose (glucose) | Fisher | D16-1 | |
| Digital microscope | Keyence | VHX-7000 | |
| Double Sided Tape | Insulectro | FLX000484 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Fetel Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Function Generator | Tektronix | AFG 31102 | |
| Graphic editor software | Microsoft Office Powerpoint | --- | |
| Indium tin oxidec coated glass slides | MSE Supplied | GL0333 | |
| L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | PCS-999-034 | |
| Laptop | Dell | Inspiron 14, 2-in-1 | |
| Mesenchymal Stem Cell Basal Medium | ATCC | PCS-500-030 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Kit for Umbilical and Adipose Cord-Derived MSCs | ATCC | PCS-500-040 | |
| Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X) | Giblo | A10490-01 | |
| Molybdenum, 99.95% | Kurt J. Lesker | EJTMOXX352A4 | Sputtering target |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Power Meter | Thor Labs | S130VC/PM400 | |
| Projector | Vecupoi | --- | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Media | Gibco | 11875-093 | This media has L-Glutamine and Phenol Red. |
| Sucrose | Fisher | BP220-1 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | 0.40% |
| Trypsin Neutralizer | Gibco | R002100 | |
| Vacuum Sputtering System | Denton | DV-502M |
References
- Mahla, S. R. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, (2016).
- Bhansali, A. Efficacy of autologous bone marrow-derived stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus. Stem Cells and Development. 18 (10), 1407-1416 (2009).
- Bouchlaka, M. N. Human mesenchymal stem cell-educated macrophages are a distinct high IL-6-producing subset that confer protection in graft-versus-host-disease and radiation injury models. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 23 (6), 897-905 (2017).
- Alfaifi, M., Eom, Y. W., Newsome, P. N., Baik, S. K. Mesenchymal stromal cell therapy for liver diseases. Journal of Hepatology. 68 (6), 1272-1285 (2018).
- Oswald, J. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells. 22 (3), 377-384 (2004).
- Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. Arthritis and rheumatism. 52 (8), 2521-2529 (2005).
- Poirier, J. T. Chapter 5 - Genetic profiling of tumors in PDX models. In Patient Derived Tumor Xenograft Models: Promise, Potential and Practice. Uthamanthil, R., Tinkey, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 149-159 (2017).
- Sino Biological. Fluorescence-activated cell sorting (FACS). , Available from: https://www.sinobiological.com/category/fcm-facs-facs (2023).
- González-González, M., Vázquez-Villegas, P., García-Salinas, C., Rito-Palomares, M. Current strategies and challenges for the purification of Stem Cells. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 87 (1), 2-10 (2011).
- Flanagan, A. L. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 23 (3), 656-665 (2007).
- Vykoukal, J., Vykoukal, D. M., Freyberg, S., Alt, E. U., Gascoyne, P. R. C. Enrichment of putative stem cells from adipose tissue using dielectrophoretic field-flow fractionation. Lab on a Chip. 8 (8), 1386-1393 (2008).
- Adams, T. N. G., Turner, P. A., Janorkar, A. V., Zhao, F., Minerick, A. R. Characterizing the dielectric properties of human mesenchymal stem cells and the effects of charged elastin-like polypeptide copolymer treatment. Biomicrofluidics. 8 (5), (2014).
- Wu, H. W., Lin, C. C., Lee, G. B.
- Adams, T. N. G. Label-free enrichment of fate-biased human neural stem and progenitor cells. Biosensors and Bioelectronics. 152, 111982 (2020).
- Zhao, K., Larasati,, Duncker, B. P., Li, D. Continuous cell characterization and separation by microfluidic alternating current dielectrophoresis. Analytical Chemistry. 91 (9), 6304-6314 (2019).
- Song, H. Continuous-flow sorting o stem cells and differentiation products based on dielectrophoresis. Lab on a Chip. 15, 1320-1328 (2015).
- Khoshmanesh, K., Nahavandi, S., Baratchi, S., Mitchell, A., Kalantar-Zadeh, K. Dielectrophoretic platforms for bio-microfluidic systems. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 1800-1814 (2010).
- Hoettges, K. F. Ten-second electrophysiology: Evaluation of the 3DEP platform for high-speed, high-accuracy cell analysis. Scientific Reports. 9, 19153 (2019).
- Hubner, Y., Hoettges, K. F., Kass, G. E. N., Ogin, S. L., Hughes, M. P. Parallel measurements of drug actions on Erythrocytes by dielectrophoresis, using a three-dimensional electrode design. IEE Proceedings - Nanobiotechnology. 152 (4), 150-154 (2005).
- Hoettges, K. F. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Analytical Chemistry. 80 (9), 2063-2068 (2008).
- Mulhall, H. J. Cancer, pre-cancer and normal oral cells distinguished by dielectrophoresis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (8), 2455-2463 (2011).
- Liao, C. -J. An optically induced dielectrophoresis (ODEP)-based microfluidic system for the isolation of high-purity CD45neg/EPCAMNEG cells from the blood samples of cancer patients-Demonstration and initial exploration of the clinical significance of these cells. Micromachines. 9 (11), 563 (2018).
- McGrath, J. S. Electrophysiology-based stratification of pancreatic tumorigenicity by label-free single-cell impedance cytometry. Analytica Chimica Acta. 1101, 90-98 (2019).
- Chiu, T. K. Optically-induced-dielectrophoresis (ODEP)-based cell manipulation in a microfluidic system for high-purity isolation of integral circulating tumor cell (CTC) clusters based on their size characteristics. Sensors and Actuators, B: Chemical. 258, 1161-1173 (2018).
- Medjdoub, M., Courant, J. L., Maher, H., Post, G. Inductively coupled plasma - plasma enhanced chemical vapor deposition silicon nitride for passivation of InP based high electron mobility transistors (HEMTs). Material Science and Engineering: B. 80 (1-3), 252-256 (2001).
- Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; Normal, human. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/pcs-500-010 (2023).
- 293 [HEK-293]. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/crl-1573 (2023).
- Glasser, H., Fuhr, G. Cultivation of cells under strong ac-electric field-differentiation between heating and trans-membrane potential effects. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 47 (2), 301-310 (1998).
- Li, B. Implementation of flexible virtual microchannels based on optically induced dielectrophoresis. Nanotechnology. 33, 295102 (2022).
- Schellenberg, J. J., Kao, K. C. On the relationship between photoconductivity and light intensity in solids. Journal of Physics D: Applied Physics. 21, 1764-1768 (1988).
- Aoyagi, Y., Masuda, K., Namba, S. Explaination of light-intensity dependence of photoconductivity in zinc phthalocyanine. Journal of Applied Physics. 43, 249-251 (1972).
