Summary
여기에서 우리는 이질적인 세포주, 특히 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)를 특성화하기 위한 무표지 접근 방식으로 광 유도 이전기영동을 제시합니다. 이 논문은 hMSC의 본래 상태를 변경하지 않고 전기적 거동을 특성화하기 위해 광도전층이 있는 미세유체 장치를 사용하고 최적화하기 위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)는 질병에 대한 기계론적 연구를 수행하거나 여러 치료 응용 분야를 위한 환자 유래 세포 공급원을 제공합니다. 다양한 성숙 단계에서의 전기적 거동과 같은 hMSC 특성을 이해하는 것이 최근 몇 년 동안 더욱 중요해졌습니다. 이전기영동(DEP)은 불균일한 전기장에서 세포를 조작할 수 있는 방법으로, 이를 통해 세포막 정전용량 및 유전율과 같은 세포의 전기적 특성에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. DEP의 기존 모드는 DEP에 대한 셀의 반응을 특성화하기 위해 3차원 전극과 같은 금속 전극을 사용합니다. 이 논문에서 우리는 쉽게 순응할 수 있는 기하학적 구조를 가진 현장 가상 전극 역할을 하는 광 투영을 통해 세포를 조작할 수 있는 광전도층으로 구축된 미세 유체 장치를 제시합니다. hMSC를 특성화하기 위해 LiDEP(Light-induced DEP)라고 하는 이 현상을 입증하는 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 우리는 세포 속도로 측정되는 LiDEP 유도 세포 반응이 입력 전압, 광 투영의 파장 범위 및 광원의 강도와 같은 다양한 매개변수에 의해 최적화될 수 있음을 보여줍니다. 앞으로 우리는 이 플랫폼이 라벨이 없고 hMSC 또는 기타 줄기 세포주의 이질적인 집단의 실시간 특성화를 수행하는 기술을 위한 길을 열 수 있을 것으로 예상합니다.
Introduction
인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)는 면역억제 특성1으로 인정받고 있으며, 이로 인해 제2형당뇨병2, 이식편대숙주질환3, 간 질환4과 같은다양한 질환을 치료하기 위한 치료제로 사용되고 있다. HMSC는 이질적이며 지방 세포, 연골 세포 및 조골 세포로 분화하는 세포의 하위 집단을 포함합니다. HMSC는 지방조직, 탯줄 조직 및 골수에서 유래하며, 이들의 분화 가능성은 기원 조직과 사용된 세포 배양 공정에 따라 다르다5. 예를 들어, Sakaguchi et al.의 연구에 따르면, 지방 조직에서 유래한 hMSC는 지방 세포로 분화할 가능성이 더 높은 반면, 골수에서 유래한 hMSC는 골세포로 분화할 가능성이 더 높다고 한다 6. 그러나 hMSC의 조직 기원이 분화 가능성에 미치는 영향은 여전히 더 이해해야 하는 현상입니다. 또한, hMSC의 다양한 차별화 잠재력은 고유한 이질성에 기여하고 hMSC를 치료제에 적용하는 데 어려움을 야기합니다. 따라서 이종 줄기 세포주의 특성화 및 분류는 이러한 세포의 시험관 내 및 임상 적용을 개발하는 데 중요합니다. 세포 표현형의 차이를 검사하기 위한 황금 표준 기술인 유세포 분석은 세포 표면 항원과 형광 염료를 사용하여 표적 세포를 표지하고 광 산란 또는 세포 특이적 형광 특성을 기반으로 특성화합니다 6,7,8. 이 방법의 단점은 세포 표면 항원 바이오마커의 제한된 가용성, 높은 장비 및 운영 비용, 세포 표면 염색이 잠재적으로 세포막을 손상시키고 치료 적용에 영향을 미칠 수 있다는 사실을 포함합니다 9,10,11. 따라서 세포막의 본래 상태를 손상시키지 않으면서 세포 특성화를 위한 새로운 기술을 탐색하면 줄기 세포 치료제의 임상 성능에 도움이 될 수 있습니다.
표면 라벨을 사용하지 않는 세포 특성화 방법인 디전기영동(DEP)이 현재 작업의 초점입니다. DEP는 전기적 특성에 따라 이질적인 세포 집단을 특성화하기 위해 미세유체 플랫폼에 구현된 무표지 또는 비염색 방법입니다. DEP는 형광 염색(즉, 라벨 기반 방법)을 대체하기 위해 교류(AC) 전기장을 사용합니다7. 세포 특성화를 위해 DEP 기반 미세유체 장치를 사용할 때의 다른 이점으로는 소량(마이크로리터)의 사용, 빠른 분석 시간, 최소 세포 샘플 준비 요구 사항, 최소 샘플 오염 위험, 최소 폐기물 생산 및 저렴한 비용이 있습니다12,13. DEP의 또 다른 이점은 셀(14, 15, 16)의 실시간 모니터링이다. DEP의 경우, 현탁액의 세포는 전극으로 생성된 불균일한 AC 전기장에 노출되어 분극화된다6. 이 분극은 세포 이동을 유발하고 인가된 AC 전기장의 주파수와 전압에 따라 세포 조작을 허용합니다. 일반적으로 5 kHz 내지 20 MHz 사이의 주파수를 조절함으로써, 전지는 전극에 끌리거나 전극으로부터 멀어지게 될 수 있으며, 이는 각각 포지티브 및 네거티브 DEP 거동에 해당한다6.
DEP 특성화에는 전극 구성 및/또는 작동 전략(17)에 의해 분류되는 전통적, 필드 유동 분별(field flow fractionation) 및 광유도(light-induced )의 여러 모드가 있다. 기존 DEP 모드인 3DEP 분석기는 물리적 금속 전극을 통합하고 AC 전기장에 대한 셀룰러 반응을 모니터링합니다. 이 시스템은 다중 3차원 원형 전극을 갖는 마이크로웰로 구성된 칩을 사용하며, 셀 DEP 거동을 특성화하기 위해 광도의 변화를 검출한다(18,19,20,21). 양성 DEP는 세포가 마이크로웰의 벽을 따라 원형 전극의 가장자리를 향해 이동함에 따라 관찰되며, 그 결과 마이크로웰의 중심에서 광도가 증가합니다. 음의 DEP는 원형 전극으로부터 멀리 떨어진 마이크로웰의 중심에 군집하는 세포로 관찰되며, 그 결과 마이크로웰의 중심에서 광도가 감소합니다. 이 두 가지 현상은 그림 1에 나와 있습니다. 전통적인 DEP 방법은 이질적인 세포 집단 18,20,21의 전기적 특성을 특성화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 예를 들어, Mulhall et al. 3DEP 분석기를 사용하여 막 정전 용량21의 차이를 기반으로 정상 구강 각질 세포(HOK)와 악성 구강 각질 세포(H357) 세포주를 구별할 수 있는 가능성을 입증했습니다. 그러나 기존 DEP 모드의 한 가지 한계는 고정 전극 형상입니다. hMSC는 이질적이기 때문에 DEP 평가 중에 전극 형상을 쉽게 수정할 수 있는 능력이 있는 것이 유리합니다. 예를 들어, 단일 셀 트래핑을 위해 전극 또는 전극 어레이를 실시간으로 수정할 수 있으므로 속도 및 DEP 동작에 따라 셀을 특성화할 수 있습니다. hMSC의 DEP 평가에 실시간 전극 변형을 적용하면 샘플 조직에서 hMSC를 소싱한 직후 hMSC의 단일 세포 분석을 통해 샘플 집단의 이질성을 특성화할 수 있습니다.
기존 DEP 모드(즉, 고정된 물리적 전극)의 한계를 극복하고 DEP 현상을 사용하여 실시간 전극 구성 수정을 위한 새로운 기회를 모색하기 위해 광 유도 DEP(LiDEP)가 탐색되었습니다. LiDEP는 광 투영을 통해 광전도성 미세유체 소자(22,23)를 사용하여 세포를 조작하는 DEP의 비전통적인 모드이며, 국부적 전극은 전통적인 DEP 방법과 유사하게 불균일한 전기장을 생성합니다. 이 접근법은 또한 전극 기하학의 유연성 및 미세유체 장치 내에서 전극을 이동시키는 것을 허용한다. 이는 고정 전극에서 볼 수 있는 한계를 완화하고 세포 이질성에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있는 기회를 제공합니다. LiDEP는 균질 및 이질적인 세포 집단에서 다양한 세포 유형을 검출하고 분석하는 데 사용되었습니다22,23,24. 예를 들어, Liao et al. LiDEP를 사용하여 적혈구에서 상피 세포 접착 모듈(EpCAMneg)을 발현하는 순환 종양 세포(CTC)를 분리하여 암 전이에서 이들의 중요성을 탐색했습니다22. LiDEP를 이용한 단세포 분석은 췌장 종양 형성성의 층화와 전이 전후 샘플의 CTC 분석을 통해 암세포를 특성화하고 조작하는 데 성공적으로 사용되었습니다24.
여기에서는 다양한 전극 형상(원, 다이아몬드, 별 및 평행선) 및 시스템 설정(인가 전압, 광도 및 미세 유체 장치 재료)으로 hMSC를 조작하는 데 LiDEP를 활용하여 가상 전극을 사용하여 인간 유래 줄기 세포의 거동을 특성화하는 접근 방식을 제공합니다.
Protocol
1. LiDEP 미세유체소자 제작
참고 : 제조 공정은 3 개의 적층 구성 요소를 결합하는 것으로 구성됩니다 : (i) 비정질 실리콘 (A : Si)과 몰리브덴이 인듐 주석 산화물 (ITO) 유리 기판에 증착 된 광전도층; (ii) 양면 테이프로부터 절취된 마이크로채널 층; 및 (iii) 세포 현탁액의 입구 및 출구를 위해 뚫린 구멍이 있는 상부 ITO 유리 기판.
- 광전도성 인듐 주석 산화물(ITO)의 유리 코팅
- ITO 코팅된 유리 기판(15-20 Ω 저항)을 표면에 질소(N2) 가스를 가시광선 먼지 입자가 이동하기에 충분한 유속으로 흘려주어 청소한다. 이 단계가 끝나면 기판을 아세톤으로 헹굽니다.
- ITO 코팅된 유리 슬라이드를 이소프로필 알코올 수조로 옮겨 아세톤 잔류물을 씻어내고 DI 물로 헹구고 기판이 완전히 건조될 때까지N2 가스를 다시 흘려보냅니다.
- ITO 코팅면이 위로 향하도록 유리 슬라이드를 진공 스퍼터링 시스템에 놓습니다.
- 10nm 두께의 몰리브덴 층을 ITO 코팅 유리 기판(몰리브덴 타겟)에 0.7Å/s의 증착 속도와 140초의 증착 시간으로 스퍼터링합니다.
- 유리 기판의 한쪽 면에 섀도우 마스크를 추가하여 전기 연결을 위해 유리 기판 가장자리에서 2mm 떨어진 곳에 둡니다. Medjdoub et al.25에 설명된 바와 같이 유도 결합 플라즈마-플라즈마 강화 화학 기상 증착(ICP-PECVD)을 사용하여 1μm의 A:Si를 증착합니다.
- N2 가스로 슬라이드를 청소하여 먼지 및 기타 불순물을 제거합니다. 섀도우 마스크 아래에 증착된 A:Si의 경우 가장자리를 2% w/v 수산화칼륨 용액에 최대 25mm 표시까지 담그고 A:Si를 에칭합니다.
- LiDEP 칩 소자 제작
- 마이크로 채널을 형성하려면 양면 테이프 (52mm x 25mm)와 짧은 치수의 가장자리에서 5-6mm 떨어진 곳에 테이프의 긴면 사이의 중앙에 펀치 구멍 (직경 = 4mm)을 구하십시오. 메스를 사용하여 구멍을 가로질러 두 개의 직선(3mm 간격)을 자릅니다. 전체 마이크로채널 절단 단계 동안 양면 테이프의 양면에 있는 보호 시트가 붙어 있는지 확인합니다.
- 상단 ITO 유리 슬라이드에 직경 3mm의 구멍 2개를 뚫습니다. 테이프는 ITO 코팅 유리 위에 정렬할 수 있으며 테이프의 긴 가장자리는 유리의 긴 가장자리에 정렬됩니다. 빨 수 있는 마커로 구멍 위치를 표시하십시오. 뚫린 구멍이 양면 테이프에 뚫린 구멍과 일치하는지 확인하십시오. 이 두 구멍은 미세유체 장치의 입구 및 출구 구멍 역할을 합니다.
- 양면 테이프의 보호 필름 한쪽을 제거하고 테이프의 구멍과 상단 ITO 유리 슬라이드를 정렬한 다음 함께 누릅니다. 특히 마이크로채널 근처의 공기 주머니를 제거하려면 부드럽게 누릅니다. 공기 주머니는 매체 또는 다른 용액이 테이프 아래로 스며들게 하여 미세유체 장치를 손상시키거나 곰팡이를 유발할 수 있습니다.
- 양면 테이프에서 다른 보호 필름을 제거하고 몰리브덴과 A:Si 코팅 ITO 유리 면을 누릅니다. 2mm 간격 면과 반대쪽에 있는 광전도성 슬라이드의 가장자리를 상단 ITO 유리 슬라이드의 중앙을 향하는 양면 테이프의 가장자리에 맞춥니다. 상단 ITO 유리 슬라이드와 광전도성 재료 코팅 ITO 유리 슬라이드에서 숙취가 발생합니다.
- 좋은 접착력을 보장하기 위해 평평한 표면을 누르십시오. 유리 기판 및 양면 테이프 층의 개략도가 그림 1A에 나와 있습니다. 측면의 여분의 테이프를 잘라냅니다.
- 레이어 A와 레이어 C의 가장자리에 구리 테이프를 붙여 함수 생성기를 연결합니다. ITO 또는 광도전성 물질의 측면에 테이프를 감아 양면 테이프의 가장자리에서 유리 기판의 코팅되지 않은면까지 약 3cm까지 감습니다.
- 성공적인 장치 제작을 위해 멀티미터를 사용하여 유리 기판의 코팅된 슬라이드와 유리에 부착된 구리 테이프 사이의 저항 판독값을 테스트합니다.
- DEP 버퍼 준비
- 자당 4.25g을 측정하여 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 그런 다음 0.15g의 포도당을 측정하고 동일한 50mL 원추형 튜브에 넣습니다.
- 원뿔형 튜브에 초순수 25mL를 채우고 뚜껑을 닫고 섞습니다. 자당과 포도당의 약 절반이 용해되면 원뿔형 튜브에 최대 50mL 라인의 초순수를 채웁니다. 모든 자당과 포도당이 녹을 때까지 격렬하게 섞는다. DEP 완충액은 8.5%(w/v) 자당과 0.3%(w/v) 포도당을 함유하고 있습니다.
- 제조된 자당 및 포도당 용액 20 mL를 얻고, 이를 50 mL 원뿔형 튜브에 넣는다. 그런 다음 0.1g의 소 혈청 알부민(BSA)을 측정하고 자당과 포도당 용액이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. BSA가 용해될 때까지 소용돌이. 최종 DEP 버퍼 용액에는 0.5%(w/v) BSA가 포함되어 있습니다.
- 세포 준비
- 이전 연구 26,27에 기술된 세포 배양 프로토콜을 사용하여 1mL의 성장 배지에 현탁된 최소 1 x10 6 세포(hMSC 또는 HEK293)를 얻습니다. 세포 현탁액을 10mL 원심분리기 튜브에 넣습니다.
- HEK 293 세포를 201 x g에서 5분 동안 원심분리 하고 hMSC를 290 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 흡인하고, 0.5% BSA가 함유된 DEP 완충용액 1 mL에 세포를 재현탁시킨다. 기포가 형성될 수 있으므로 완충액을 너무 빨리 첨가하지 마십시오.
- 원심분리 과정을 두 번 더 반복한 다음 LiDEP 특성화를 위해 0.5% BSA로 DEP 버퍼에 세포를 다시 일시 중단합니다. 나열된 세포 준비 프로토콜은 10회 실행에 충분합니다. 예를 들어, 한 번의 빈도 테스트에는 최소 15번의 실행이 필요하므로 1 x 106 cells/mL 농도의 세포 2mL를 만들어야 합니다.
2. LiDEP 특성화
- 실험 설정
- LiDEP에 대한 세포 반응을 정량화하기 위한 실험 설정을 위해 노트북, 프로젝터, 대물 렌즈, 디지털 현미경 및 함수 발생기와 같은 장비를 조립합니다. 노트북을 사용하여 조명 프로젝션(별, 다이아몬드, 세 줄, 타원형)을 디자인하고 프로젝터에 연결합니다.
- 프로젝터를 광원으로 사용하여 LiDEP 칩의 광전도성 표면(층 C)에 투영된 빛을 표시합니다. 광원(프로젝터)의 빛이 10x 대물 렌즈를 통해 LiDEP 칩의 마이크로채널 영역으로 이동하도록 설정합니다. 10x 대물 렌즈는 프로젝터 렌즈 위에 있습니다. 보충 그림 1 은 프로젝터를 LiDEP 시스템에 통합한 것을 보여줍니다.
- LiDEP 칩을 함수 발생기에 연결하여 AC 전기장을 적용합니다. 이미징 및 비디오 녹화를 위해 디지털 현미경을 사용하여 LiDEP 힘을 경험하는 세포를 관찰합니다. 도 1B는 실험 장치의 개략도를 나타낸다. 테스트된 모든 세포에 대해 표준 세포 배양 프로토콜26,27을 따르십시오.
- 실험 절차
- 마이크로채널을 70% 에탄올로 세척한 다음, 0.5% BSA 용액으로 세척한다. 0.5% BSA 용액으로 마이크로채널을 다시 두 번 더 플러시하여 에탄올과 이전 세포가 완전히 씻겨 나가도록 합니다. 이미 DEP 필드에 노출된 세포는 신선한 세포와 다르게 반응하여 데이터 수집을 방해할 수 있습니다.
- 피펫으로 0.5% BSA 용액을 제거하고 미세유체 장치를 장치 홀더에 끼웁니다.
- 장치의 각 구리 테이프 연결부에 악어 클립을 부착합니다. 함수 발생기를 원하는 전압(전압 피크 대 피크,Vpp) 및 주파수(Hz)로 설정합니다. 여기서 테스트한 주파수 범위는 30kHz에서 20MHz였습니다.
- 70μL의 세포 현탁액(세포 + 0.5% BSA가 포함된 DEP 완충액)을 장치 마이크로채널에 추가합니다. 마이크로 채널(~0.05mm)이 얇기 때문에 입구 및 출구 구멍에서 유출이 발생할 수 있습니다. 유출 횟수를 줄이려면 더 작은 피펫 팁을 사용하고 구멍의 팁을 마이크로 채널 쪽으로 약간 기울이십시오. 모든 접근 용액(0.5% BSA 또는 용액 내 세포)은 일회용 종이 물티슈로 닦아내고 생물학적 위험 폐기물로 버릴 수 있습니다.
- 원하는 가상 전극 형상(여기서는 원, 다이아몬드, 별 및/또는 평행선)을 LiDEP 칩에 투영합니다.
- 디지털 현미경 소프트웨어에서 비디오 길이를 3분으로 설정합니다. 실험실 타이머를 2분 30초로 설정합니다. 세포가 LiDEP 칩의 마이크로채널에 고정되면 디지털 현미경 소프트웨어에서 시작을 눌러 비디오 녹화 프로세스를 시작합니다.
- 10초 동안 기다린 다음 함수 발생기 채널 출력의 ON 버튼을 눌러 AC 전기장을 적용하고 타이머에 대해 시작을 누릅니다. 디지털 현미경을 통해 셀 DEP 동작을 모니터링하고 설정 주변의 흔들림이나 움직임을 방지합니다.
- 타이머가 꺼지면 함수 발생기 채널 출력의 ON 버튼을 누릅니다. 이렇게 하면 함수 발생기 채널 출력이 꺼지고 AC 전기장이 더 이상 전극을 통해 공급되지 않습니다. 3분에서 비디오 녹화를 중지하고 향후 분석을 위해 디지털 현미경에 저장합니다.
- 0.5% BSA가 함유된 60μL의 DEP 버퍼를 마이크로채널로 천천히 밀어 넣고 동시에 출구에서 수집하여 LiDEP 칩의 출구 끝에서 세포를 피펫팅합니다. 마이크로채널에 세포가 거의 또는 전혀 없을 때까지 계속하십시오.
- 모든 주파수가 테스트될 때까지 2.2.3-2.2.9단계를 반복합니다.
Representative Results
전압 및 전극 색상 테스트는 2.2.3 단계와 2.2.10 단계에서 약간의 변형을 제외하고 위의 절차를 사용하여 완료되었습니다. 전압 테스트를 위해 전극 색상과 주파수를 일정하게 유지하고 5V pp, 10V pp 및 20V pp를 적용했습니다. 전극 색상 테스트를 위해 인가된 전압과 주파수를 30kHz 및 20Vpp에서 일정하게 유지하고 파란색, 빨간색, 흰색 및 노란색(각각 HEX 색상 코드 #4472C4, #FF0000, #FFFFFF 및 #FFFF00 참조) 투영 전극을 검사했습니다. 트립판 블루로 세포를 염색하고 혈구계를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 계수하여 세포 생존율을 조사했습니다.
LiDEP 설정을 통해 hMSC를 조작하고 입력 주파수에 대한 응답으로 DEP 응답 곡선을 생성할 수 있었으며, 이는 셀의 전기적 거동을 특성화하는 한 가지 방법입니다. 가상 전극에서 생성된 불균일한 AC 전기장에 대한 일관된 셀 거동을 관찰하기 위해 인가 전압 및 투영된 전극 색상(즉, 그래픽 편집기 소프트웨어로 생성된 고유한 색상의 모양)과 같은 매개변수를 조작하여 최적의 작동 조건을 찾기 위해 일련의 실험이 수행되었습니다. LiDEP(비전통적 DEP)를 사용하여 세포 반응에 대해 수집된 데이터를 3DEP 분석기인 기존 DEP의 결과와 비교했습니다.
첫 번째 최적화 테스트는 LiDEP 칩에서 hMSC(즉, 가상 전극을 향해 이동하는 셀)의 양성 DEP 반응에 초점을 맞췄습니다. 양성 DEP 반응을 나타내지 않은 셀은 가상 전극에서 멀어짐으로써 음성 DEP 반응을 나타내거나, 정지 및 회전하거나, 전기장에 반응하지 않았습니다. 세포의 반응은 2분 30초 동안 ImageJ에서 속도(μm/s)를 추적하여 정량화되었습니다. 가상 전극에 노란색 타원형 돌기를 사용하였고, 30kHz의 설정 주파수에서 5 V pp, 10 V pp 및 20 Vpp의 인가 전압을 조사하였다. 우리는 일관성과 이상치를 최소화하기 위해 AC 전기장이 켜져 있는 동안 가상 전극의 50μm 이내에 있는 셀에 초점을 맞췄습니다. 20 V pp는 평균 속도가 0.035 μm/s인 HEK 293 셀의 가장 빠른 셀 이동을 초래했으며, 그 뒤를 이어 10 Vpp에서 0.032 μm/s, 5 Vpp에서 0.020 μm/s가 뒤따랐으며, 이는 이들 셀이 비교적 균질한 제어를 나타낸다는 것을 의미합니다. 그림 2A에서와 같이 평균 속도가 20 V pp에서 0.051 μm/s, 10 V pp에서 0.036 μm/s 및 5 Vpp에서 0.025 μm/s인 hMSC에 대해서도 유사한 경향이 관찰되었다(여기서, *는 p < 0.05를 나타냄). 20 Vpp에서, hMSC는 양성 및 음성 DEP를 동시에 경험하는 것으로 관찰되었다. 이것은 10 V pp 및 5 V pp에서는 관찰되지 않았다. DEP 힘을 경험한 후 hMSC의 생존력 발견은 더 높은 전압이 일반적으로 더 낮은 세포 생존율을 초래한다는 것을 보여주었고, 세포의 66%는 5 V pp에서 생존 가능하고, 세포의 58%는 10 Vpp에서 생존 가능하고, 세포의 57%는 20 V pp에서 생존 가능하고, 도 2B에서와 같이(여기서, **는 p < 0.01을 나타낸다).
LiDEP는 광학 기반 시스템이기 때문에 광도와 전극 색상은 LiDEP 칩의 성능을 제어하기 위해 쉽게 조정할 수 있는 매개변수입니다. 여기서는 투사되는 모양에 따라 생성된 다양한 전극 색상(흰색, 노란색, 빨간색 및 파란색)을 평가하여 세포의 DEP 반응에 미치는 영향을 확인했습니다. HEK 293 세포 및 hMSC를 20 Vpp 및 30 kHz에서 평가하였다. 흰색, 노란색, 빨간색 및 파란색 전극이 선택되었지만 LiDEP 칩을 통한 조명은 빨간색-주황색을 띤 광도전층의 영향을 받았습니다. 따라서, 투영된 백색 전극은 내부가 백색인 황색으로 나타났고, 적색 전극은 적색 윤곽선이 있는 주황색으로 나타났으며, 청색 전극은 연한 녹색으로 나타났다(도 3A-D). 이 네 가지 색상의 전력 출력은 각각 77.7μW ± 0.7μW, 92.7μW ± 1.3μW, 21.9μW ± 0.2μW, 56.7μW ± 0.9μW였습니다. 이는 그림 3E에서와 같이 노란색과 흰색이 가장 강한 DEP 필드를 갖는 반면 파란색과 빨간색은 더 약하다는 것을 강력하게 시사합니다(여기서, ***는 HEK 293 세포에 대해 p < 0.001을 나타내고 **는 hMSC에 대해 p < 0.01을 나타냄). DEP 힘의 인가 동안 노란색 및 흰색 가상 전극의 가장자리 상의 셀의 정지 회전이 또한 관찰되었다. 모든 전극 색상 변화에 대해 동시 음성 및 양성 DEP 응답이 발생했으며, 이는 전압 테스트를 위해 20Vpp에서 표시된 것과 관련이 있습니다. 또한 셀의 속도는 전극 색상에 따라 다르지만 50μm 경계 내의 거의 모든 셀이 LiDEP에 반응했습니다. hMSCs의 크기는 19.2 μm ± 5.8 μm로 측정되었다.
기존 전극을 사용한 DEP와 비교하여 LiDEP의 기능을 평가하기 위해 LiDEP를 사용하는 셀의 DEP 거동과 3DEP 분석기로 분석한 셀의 DEP 거동 간의 차이를 평가했습니다. hMSC의 DEP 반응은 0.5% BSA(~100μS/cm)를 갖는 저전도성 DEP 완충용액에서 측정되었습니다. 3DEP 분석기를 모방하기 위해 단일 타원형 노란색 가상 전극이 10Vpp에서 투영되었습니다. hMSC의 DEP 거동은 30kHz 내지 20MHz로 특성화되었다. 25kHz보다 낮은 주파수에서 전기 분해를 관찰하여 미세 유체 장치 내의 금속층 표면에서 기포가 생성되었습니다. LiDEP의 경우, 더 낮은 주파수에서 hMSC는 그림 4A에서와 같이 양의 DEP 힘을 경험했으며, 이는 가상 전극에 끌리는 셀의 백분율로 표시됩니다. 세포는 강한 양의 DEP 힘으로 시작했으며 주파수가 증가함에 따라 약화되었습니다. 세포는 30kHz에서 97kHz까지 가장 강한 양의 DEP 힘을 경험했습니다. 이 주파수에서 AC 전기장을 가한 후 일부 셀은 반응하지 않는 반면 다른 셀은 음성 DEP 동작을 보였습니다. 이러한 경향은 3DEP 분석기를 사용하여 정량화된 관찰된 반응에서 벗어납니다. 그림 4B에서와 같이 셀은 양성 DEP가 37kHz에서 255kHz로 증가하고 양성 DEP가 1,772kHz에서 20MHz로 감소했습니다.
그림 1: hMSC에 대해 여기에 설명된 LiDEP 프로토콜에 대한 실험적 설정. (A) 광도전층과 실험 설정이 있는 LiDEP 칩의 개략도 및 실제 이미지. (B) 3DEP 분석기에서 세포의 양성 및 음성 DEP 반응의 대표 이미지(기존 DEP 전극 사용, 위) 및 LiDEP를 사용한 세포의 양성 및 음성 DEP 반응의 개략도 표현(광 투영을 가상 전극으로 사용, 아래). (C) 가상 전극으로서 장치에 투영될 수 있는 상이한 형상의 예. BioRender.com 로 만든 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: hMSC의 DEP 반응(속도) 및 주어진 조건에서의 생존력의 특성화. (A) 5 V pp, 10 Vpp 및 20 Vpp에 대한 hMSC의 양의 DEP 반응의 측정된 속도. hMSC는 20V pp에서 0.051μm/s, 10Vpp에서 0.036μm/s, 5Vpp에서 0.025μm/s로 이동했습니다. (B) 가상 전극으로 생성된 양의 DEP 힘을 경험한 후 hMSC의 생존 가능성. 생존율은 20 Vpp, 10 V pp 및 5 Vpp에 대해 각각 57%, 58% 및 66%였다. 오차 막대는 표준 편차(SD)를 나타냅니다. t-검정을 사용하여 풀링된 데이터 세트에 대한 통계 분석이 완료되었습니다(*p < 0.05 및 **p < 0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 동종(HEK 293) 세포주와 이종(hMSC) 세포주 간의 DEP 반응 비교. 20Vpp 및 30kHz에서 (A) 흰색, (B) 노란색, (C) 빨간색 및 (D) 파란색 전극에 대한 hMSC 세포의 양성 DEP 반응. (E) 상이한 색상의 전극에 대한 HEK 293 셀 및 hMSC의 속도 응답. HEK 293 셀은 각각 0.035 μm/s 및 0.033 μm/s에서 노란색 및 빨간색 전극에서 가장 높은 속도를 나타냈습니다. HEK 293 셀은 0.027 μm/s에서 청색 전극으로 가장 낮은 속도를 나타냈다. hMSC는 각각 0.068 μm/s 및 0.049 μm/s에서 노란색 및 흰색 전극에서 가장 높은 속도를 나타냈습니다. hMSC는 0.039μm/s에서 빨간색 전극으로 가장 낮은 속도를 경험했습니다. 오차 막대는 SD를 나타냅니다. t-검정을 사용하여 풀링된 데이터 세트에 대해 통계 분석을 완료했습니다(*p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: LiDEP와 3DEP를 사용한 hMSC의 DEP 응답 비교. hMSC의 DEP 응답은 10Vpp에서 (A) LiDEP 및 (B) 3DEP 분석기로 측정되었습니다. LiDEP를 사용하면 hMSC의 양의 DEP 응답이 30kHz에서 20MHz로 감소했습니다. 3DEP 분석기에서 셀은 양성 DEP가 37kHz에서 255kHz로 증가했고 양성 DEP가 1,772kHz에서 20MHz로 감소했습니다. 오차 막대는 SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 이 프로토콜의 실험에 사용된 LiDEP 설정의 대표 이미지. 프로젝터의 통합을 보여주는 LiDEP 시스템의 확대 사진. 빛은 광원(프로젝터)에서 10x 대물 렌즈를 통해 LiDEP 칩의 마이크로채널로 이동합니다. 10x 대물렌즈는 프로젝터 렌즈 위에 있습니다. 각 구성 요소는 그림에 번호가 매겨져 있으며 측면에 나열되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1: 흰색, 노란색, 빨간색 및 파란색 가상 전극에 반응하는 hMSC의 대표 비디오. 셀은 양의 DEP(가상 전극을 향해 이동), 음의 DEP(가상 전극에서 멀어짐)를 경험하고, 정지 및 회전하거나, 전기장에 반응하지 않는 것으로 시각화됩니다. hMSC는 37kHz 및 20Vpp에서 테스트되었으며 비디오 속도는 20배 빨라졌습니다 . 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
hMSC의 이질성을 조사하는 것은 치료제의 발전에 중요합니다. 이 작업은 hMSC 평가를 위한 분석 도구로 LiDEP를 사용하기 위한 첫 번째 단계를 제공합니다. 우리는 속도를 정량화하여 LiDEP에서 세포의 양의 DEP 응답의 전압 의존성을 조사했습니다. 더 높은 전압은 더 강한 양의 DEP 힘을 생성해야 할 것으로 예상되며, 측정된 속도로 이 패턴을 관찰했습니다. 10 V pp 및 20 Vpp 전압은 LiDEP를 사용하여 hMSC를 조작하기에 충분했습니다. 더 낮은 전압(즉, 5Vpp)은 셀 응답이 느려졌습니다. hMSC에는 최적이 아니지만 다른 세포 유형에는 유리할 수 있습니다. hMSCs의 생존력에서 전압에 따라 약 9%의 감소가 있었다. 이는 종래의 문헌 6,12,28,29와 약간 상이한데, 여기서 생물학적 세포의 검사에서 전통적인 DEP 및 LiDEP의 사용은 세포 생존율을 감소시키지 않았다. 그러나 각 연구의 실험 목적은 다양했다. Glasser와 Fuhr는 세포 배양 배지28에서 금속 전극 상에서 부착성 L929 마우스 섬유아세포의 성장을 모니터링하였다. 반대로, Lu et al. 서로 다른 기간 동안 AC 전기장에 노출된 신경 줄기 세포의 생존 가능성을 조사했습니다12. Adams et al. 금속 전극12를 갖는 hMSCs의 유전 특성을 특성화하고, Li et al. LiDEP29로 백혈병 세포를 조작하였다. 이 연구와 우리의 연구의 차이점은 BSA의 사용이었는데, 이는 우리가 관찰한 생존력 감소의 원인일 수 있습니다. 그러나, 더 낮은 전체 생존율은 또한 여기에 확립된 프로토콜에 사용된 노출 시간(2분 30초) 때문일 수 있다. 이 시간은 불균일한 AC 전기장에 노출되는 동안 세포 조작을 시각화하기에 충분한 시간을 제공하기 위해 선택되었습니다.
셀 특성화 방법은 프로토콜에 설명된 대로 구축된 LiDEP 시스템의 기능과 한계를 결정하기 위해 전극 색상을 통해 테스트되었습니다. 이 특정 프로토콜에서, 전극 색상은 그래픽 편집기 파일을 통해 투사되는 형상의 색상에 기초하여 제어될 수 있다. 흰색, 노란색, 빨간색, 파란색의 네 가지 색상을 사용했습니다. 각 색상에 대한 전력 출력 판독 값으로부터, 투영 된 황색 (#FFFF00) 및 백색 (#FFFFFF) 전극이 더 높은 강도를 갖는 것으로 측정되었으며, 이는 이들 색상이 후속 실험에서 사용하기에 더 유리한 이유의 기초였다. 또한, 광전도성 재료30,31의 확립된 광도 의존성으로 인해, 결과는 LiDEP 장치의 성능이 광전도성 A:Si에 의존하고 투영된 전극 색상의 선택에 의해 조정될 수 있음을 시사한다. hMSC의 양성 및 음성 DEP 반응의 조합도 LiDEP를 사용하여 관찰되었으며, 이는 기존 DEP 방법에서 볼 수 있는 현상과 유사합니다. 각 전극 색상에 따라 hMSC는 음의 DEP 힘, 양의 DEP 힘 및 세포 회전을 경험했으며, 이는 세포 샘플이 단일 주파수에서 이질적임을 나타냅니다(보충 비디오 1). 이는 hMSC가 단일 주파수에서 음성 및 양성 DEP 거동을 모두 나타낸다는 Adams et al.6의 발견과 일치합니다. 이러한 조건(전극 색상, 전극 형상 및 광전도성 물질)은 hMSC 샘플에서 이질성의 레벨을 검출하기 위한 추가의 파라미터를 제공할 수 있다.
마지막으로, LiDEP 평가 결과를 hMSC DEP 동작의 벤치마크로 3DEP 분석기의 결과와 비교했습니다. hMSC의 양성 DEP 반응의 주파수 범위의 차이가 관찰되었지만 LiDEP와 3DEP 분석기를 통해 수집된 데이터의 경향은 전반적으로 유사했습니다(즉, 양성 DEP 응답은 빈도가 증가함에 따라 감소함). LiDEP 칩에 AC 전기장이 공급되고 빛이 투사되면 광 투영 내 영역의 컨덕턴스가 떨어져 불균일한 전기장이 생성됩니다. 따라서 광원의 특성(즉, 강도 및 파장)은 전압 및 전극 색상 변화 테스트 결과에서 볼 수 있듯이 LiDEP 칩 내 셀의 예상 응답에 영향을 미칩니다. 수정할 수 있는 다른 매개변수는 광도전층의 재료와 DEP 버퍼 용액의 전도도입니다. 따라서 셀의 DEP 동작을 평가하는 데 사용되는 조건은 LiDEP 시스템의 설정을 기반으로 평가되어야 합니다. 반대로, 3DEP 분석기 또는 금속 전극을 사용하여 DEP 힘을 적용하는 다른 방법의 경우 전극 특성이 일정하며 조사 중인 셀에 필요한 것에 적응하기 위해 즉시 변경할 수 없습니다. 양성 DEP 거동의 이러한 변화는 hMSC 샘플 내 다양한 세포 유형의 특성화, 단일 세포 분석 또는 세포 분류에 대한 향후 연구에 도움이 될 수 있습니다. 또한 셀이 가상 전극에서 멀어질수록 AC 전기장이 약해집니다. 그러나 3DEP 분석기 또는 금속 전극을 사용하는 다른 기존 DEP 모드를 사용하면 더 큰 전기장 영역을 적용할 수 있으므로 더 많은 셀을 조작할 수 있습니다. 따라서 LiDEP 실험당 더 적은 수의 셀이 LiDEP 칩의 마이크로채널 내에서 교류 전기장의 영향을 경험했습니다. 시간 경과에 따른 장치 성능의 변화(즉, 2시간 또는 3시간)로 인해 추가 불일치가 발생할 수 있으며, 이는 아직 조사 중입니다. 물, 에탄올 및 DEP 버퍼 용액의 일정한 흐름은 마이크로 채널 층 (즉, 광전도성 물질)의 표면을 분해 할 수 있으므로 고려해야합니다. 셀 특성화를 위한 시간 경과에 따른 장치 성능도 하나의 LiDEP 칩의 확장된 사용을 위해 고려해야 합니다. 실험 파라미터를 실시간으로 수정하는 데는 몇 초에서 몇 분밖에 걸리지 않았습니다. 전극 색상과 형상은 그래픽 편집기 소프트웨어 내의 설정을 사용하여 즉시 조정되었습니다.
요약하면, 이 논문은 hMSC와 같은 이질적인 세포 집단을 가진 세포주를 조작하고 특성화하는 LiDEP의 능력을 보여줍니다. 이 설정과 설명된 프로토콜을 사용하여 20Vpp 및 투영된 가상 노란색 전극 조건에서 hMSC의 성공적인 특성화를 달성할 수 있었습니다. 향후 연구는 LiDEP를 통해 생성된 AC 전기장에 대한 hMSC의 노출 시간을 조정하고, 가상 전극의 광도를 증가시키고, hMSC(또는 다른 줄기 세포 집단)의 다양한 소스를 평가하여 이종 줄기 세포 집단의 전기적 서명에 대한 LiDEP 카탈로그를 개발하는 데 초점을 맞춰야 합니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.
Acknowledgments
이 연구는 CBET를 통해 국립 과학 재단 CAREER 상 (2048221)의 지원을 받았습니다. UCI의 통합 나노 시스템 연구 시설 (INRF)의 Mo Kebaili에게 감사드립니다. 또한 LiDEP 시스템 개발을 지원해 주신 Devin Keck 박사님께 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 10x objective | AmScope | --- | |
| Amorphous silicon (A:Si) | Millipore Sigma | S5130 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9706-100 | |
| Copper Tape | Zehhe | BF4964 | |
| Dextrose (glucose) | Fisher | D16-1 | |
| Digital microscope | Keyence | VHX-7000 | |
| Double Sided Tape | Insulectro | FLX000484 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Fetel Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Function Generator | Tektronix | AFG 31102 | |
| Graphic editor software | Microsoft Office Powerpoint | --- | |
| Indium tin oxidec coated glass slides | MSE Supplied | GL0333 | |
| L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | PCS-999-034 | |
| Laptop | Dell | Inspiron 14, 2-in-1 | |
| Mesenchymal Stem Cell Basal Medium | ATCC | PCS-500-030 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Kit for Umbilical and Adipose Cord-Derived MSCs | ATCC | PCS-500-040 | |
| Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X) | Giblo | A10490-01 | |
| Molybdenum, 99.95% | Kurt J. Lesker | EJTMOXX352A4 | Sputtering target |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Power Meter | Thor Labs | S130VC/PM400 | |
| Projector | Vecupoi | --- | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Media | Gibco | 11875-093 | This media has L-Glutamine and Phenol Red. |
| Sucrose | Fisher | BP220-1 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | 0.40% |
| Trypsin Neutralizer | Gibco | R002100 | |
| Vacuum Sputtering System | Denton | DV-502M |
References
- Mahla, S. R. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, (2016).
- Bhansali, A. Efficacy of autologous bone marrow-derived stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus. Stem Cells and Development. 18 (10), 1407-1416 (2009).
- Bouchlaka, M. N. Human mesenchymal stem cell-educated macrophages are a distinct high IL-6-producing subset that confer protection in graft-versus-host-disease and radiation injury models. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 23 (6), 897-905 (2017).
- Alfaifi, M., Eom, Y. W., Newsome, P. N., Baik, S. K. Mesenchymal stromal cell therapy for liver diseases. Journal of Hepatology. 68 (6), 1272-1285 (2018).
- Oswald, J. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells. 22 (3), 377-384 (2004).
- Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. Arthritis and rheumatism. 52 (8), 2521-2529 (2005).
- Poirier, J. T. Chapter 5 - Genetic profiling of tumors in PDX models. In Patient Derived Tumor Xenograft Models: Promise, Potential and Practice. Uthamanthil, R., Tinkey, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 149-159 (2017).
- Sino Biological. Fluorescence-activated cell sorting (FACS). , Available from: https://www.sinobiological.com/category/fcm-facs-facs (2023).
- González-González, M., Vázquez-Villegas, P., García-Salinas, C., Rito-Palomares, M. Current strategies and challenges for the purification of Stem Cells. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 87 (1), 2-10 (2011).
- Flanagan, A. L. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 23 (3), 656-665 (2007).
- Vykoukal, J., Vykoukal, D. M., Freyberg, S., Alt, E. U., Gascoyne, P. R. C. Enrichment of putative stem cells from adipose tissue using dielectrophoretic field-flow fractionation. Lab on a Chip. 8 (8), 1386-1393 (2008).
- Adams, T. N. G., Turner, P. A., Janorkar, A. V., Zhao, F., Minerick, A. R. Characterizing the dielectric properties of human mesenchymal stem cells and the effects of charged elastin-like polypeptide copolymer treatment. Biomicrofluidics. 8 (5), (2014).
- Wu, H. W., Lin, C. C., Lee, G. B.
- Adams, T. N. G. Label-free enrichment of fate-biased human neural stem and progenitor cells. Biosensors and Bioelectronics. 152, 111982 (2020).
- Zhao, K., Larasati,, Duncker, B. P., Li, D. Continuous cell characterization and separation by microfluidic alternating current dielectrophoresis. Analytical Chemistry. 91 (9), 6304-6314 (2019).
- Song, H. Continuous-flow sorting o stem cells and differentiation products based on dielectrophoresis. Lab on a Chip. 15, 1320-1328 (2015).
- Khoshmanesh, K., Nahavandi, S., Baratchi, S., Mitchell, A., Kalantar-Zadeh, K. Dielectrophoretic platforms for bio-microfluidic systems. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 1800-1814 (2010).
- Hoettges, K. F. Ten-second electrophysiology: Evaluation of the 3DEP platform for high-speed, high-accuracy cell analysis. Scientific Reports. 9, 19153 (2019).
- Hubner, Y., Hoettges, K. F., Kass, G. E. N., Ogin, S. L., Hughes, M. P. Parallel measurements of drug actions on Erythrocytes by dielectrophoresis, using a three-dimensional electrode design. IEE Proceedings - Nanobiotechnology. 152 (4), 150-154 (2005).
- Hoettges, K. F. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Analytical Chemistry. 80 (9), 2063-2068 (2008).
- Mulhall, H. J. Cancer, pre-cancer and normal oral cells distinguished by dielectrophoresis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (8), 2455-2463 (2011).
- Liao, C. -J. An optically induced dielectrophoresis (ODEP)-based microfluidic system for the isolation of high-purity CD45neg/EPCAMNEG cells from the blood samples of cancer patients-Demonstration and initial exploration of the clinical significance of these cells. Micromachines. 9 (11), 563 (2018).
- McGrath, J. S. Electrophysiology-based stratification of pancreatic tumorigenicity by label-free single-cell impedance cytometry. Analytica Chimica Acta. 1101, 90-98 (2019).
- Chiu, T. K. Optically-induced-dielectrophoresis (ODEP)-based cell manipulation in a microfluidic system for high-purity isolation of integral circulating tumor cell (CTC) clusters based on their size characteristics. Sensors and Actuators, B: Chemical. 258, 1161-1173 (2018).
- Medjdoub, M., Courant, J. L., Maher, H., Post, G. Inductively coupled plasma - plasma enhanced chemical vapor deposition silicon nitride for passivation of InP based high electron mobility transistors (HEMTs). Material Science and Engineering: B. 80 (1-3), 252-256 (2001).
- Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; Normal, human. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/pcs-500-010 (2023).
- 293 [HEK-293]. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/crl-1573 (2023).
- Glasser, H., Fuhr, G. Cultivation of cells under strong ac-electric field-differentiation between heating and trans-membrane potential effects. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 47 (2), 301-310 (1998).
- Li, B. Implementation of flexible virtual microchannels based on optically induced dielectrophoresis. Nanotechnology. 33, 295102 (2022).
- Schellenberg, J. J., Kao, K. C. On the relationship between photoconductivity and light intensity in solids. Journal of Physics D: Applied Physics. 21, 1764-1768 (1988).
- Aoyagi, Y., Masuda, K., Namba, S. Explaination of light-intensity dependence of photoconductivity in zinc phthalocyanine. Journal of Applied Physics. 43, 249-251 (1972).
