Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Lysinduceret dielektroforese til karakterisering af den elektriske opførsel af humane mesenkymale stamceller

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/64909
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,2,3,4, 1,2,4
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 3Department of Chemistry, School of Physical Sciences, University of California, Irvine, 4Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine

Summary

Her præsenterer vi lysinduceret dielektroforese som en etiketfri tilgang til karakterisering af heterogene cellelinjer, specifikt humane mesenkymale stamceller (hMSC'er). Dette papir beskriver en protokol til brug og optimering af en mikrofluidisk enhed med et fotoledende lag til at karakterisere hMSC'ers elektriske opførsel uden at ændre deres oprindelige tilstand.

Abstract

Humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) tilbyder en patientafledt cellekilde til gennemførelse af mekanistiske undersøgelser af sygdomme eller til flere terapeutiske anvendelser. Forståelse af hMSC-egenskaber, såsom deres elektriske adfærd på forskellige modningsstadier, er blevet vigtigere i de senere år. Dielektroforese (DEP) er en metode, der kan manipulere celler i et uensartet elektrisk felt, hvorigennem der kan opnås information om cellernes elektriske egenskaber, såsom cellemembranens kapacitans og permittivitet. Traditionelle former for DEP bruger metalelektroder, såsom tredimensionelle elektroder, til at karakterisere cellernes respons på DEP. I dette papir præsenterer vi en mikrofluidisk enhed bygget med et fotoledende lag, der er i stand til at manipulere celler gennem lysprojektioner, der fungerer som in situ virtuelle elektroder med let overensstemmende geometrier. En protokol præsenteres her, der demonstrerer dette fænomen, kaldet lysinduceret DEP (LiDEP), til karakterisering af hMSC'er. Vi viser, at LiDEP-inducerede celleresponser, målt som cellehastigheder, kan optimeres ved hjælp af forskellige parametre såsom indgangsspændingen, bølgelængdeområderne for lysprojektionerne og lyskildens intensitet. I fremtiden forestiller vi os, at denne platform kan bane vejen for teknologier, der er etiketfri og udfører karakterisering i realtid af heterogene populationer af hMSC'er eller andre stamcellelinjer.

Introduction

Humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) er anerkendt for deres immunsuppressive egenskaber1, hvilket har ført til deres anvendelse i terapi til behandling af en række sygdomme, såsom type II-diabetes2, graft versus værtssygdom3 og leversygdom4. HMSC'er er heterogene og indeholder underpopulationer af celler, der differentierer sig til adipocytter, chondrocytter og osteoblaster. HMSC'er er afledt af fedtvæv, navlesnorsvæv og knoglemarv, og deres differentieringspotentiale afhænger af oprindelsesvævet og den anvendte cellekulturproces5. For eksempel, ifølge en undersøgelse af Sakaguchi et al., hMSC'er afledt af fedtvæv er mere tilbøjelige til at differentiere sig til adipocytter, mens hMSC'er afledt af knoglemarv er mere tilbøjelige til at differentiere sig til osteocytter6. Virkningen af hMSC'ers vævsoprindelse på deres differentieringspotentiale er imidlertid et fænomen, der stadig mangler at blive forstået yderligere. Derudover bidrager hMSC'ernes varierede differentieringspotentialer til deres iboende heterogenitet og skaber udfordringer ved anvendelse af hMSC'er til terapi. Som sådan er karakterisering såvel som sortering af heterogene stamcellelinjer afgørende for udviklingen af in vitro og klinisk anvendelse af disse celler. Flowcytometri, guldstandardteknikken til undersøgelse af forskelle i cellulære fænotyper, bruger celleoverfladeantigener og fluorescerende farvestoffer til at mærke målceller og karakterisere dem baseret på lysspredning eller cellespecifikke fluorescensegenskaber 6,7,8. Ulemperne ved denne metode inkluderer den begrænsede tilgængelighed af antigenbiomarkører på celleoverfladen, de høje omkostninger ved udstyr og drift og det faktum, at celleoverfladefarvning potentielt kan beskadige cellemembranen og påvirke terapeutiske anvendelser 9,10,11. Derfor kan udforskning af nye teknikker til cellekarakterisering uden at gå på kompromis med cellemembranens oprindelige tilstand gavne den kliniske ydeevne af stamcelleterapi.

Dielektroforese (DEP), en metode til cellekarakterisering, der ikke bruger overfladeetiketter, er fokus for dette nuværende arbejde. DEP er en etiketfri eller ikke-farvningsmetode implementeret på mikrofluidiske platforme for at karakterisere heterogene populationer af celler baseret på deres elektriske egenskaber. DEP bruger et vekselstrømsfelt (AC) til erstatning for fluorescensfarvning (dvs. en etiketbaseret metode)7. De andre fordele ved at bruge DEP-baserede mikrofluidiske enheder til cellekarakterisering inkluderer brugen af små mængder (mikroliter), hurtig analysetid, minimale krav til forberedelse af celleprøver, minimal risiko for prøvekontaminering, minimal affaldsproduktion og lave omkostninger12,13. En anden fordel ved DEP er realtidsovervågning af celler14,15,16. For DEP udsættes celler i suspension for et uensartet vekselstrømsfelt skabt med elektroder, og de bliver polariserede6. Denne polarisering forårsager cellebevægelse og tillader cellemanipulation baseret på frekvensen og spændingen af det påførte vekselstrømsfelt. Ved at justere frekvensen, typisk mellem 5 kHz og 20 MHz, kan celler tiltrækkes eller frastødes væk fra elektroderne, svarende til henholdsvis positiv og negativ DEP-adfærd6.

Der er flere tilstande af DEP-karakterisering, nemlig traditionel, feltstrømfraktionering og lysinduceret, som klassificeret efter deres elektrodekonfiguration og / eller driftsstrategi17. 3DEP-analysatoren, en traditionel tilstand af DEP, inkorporerer fysiske metalelektroder og overvåger det cellulære respons på et vekselstrømsfelt. Dette system bruger en chip bestående af mikrobrønde med flere tredimensionelle cirkulære elektroder og registrerer ændringer i lysintensiteter for at karakterisere celle DEP-adfærd 18,19,20,21. Positiv DEP observeres som cellerne, der bevæger sig mod kanterne af de cirkulære elektroder langs mikrobrøndens vægge, hvilket resulterer i øget lysintensitet i midten af mikrobrønden. Negativ DEP observeres som celler, der klynger sig i midten af mikrobrønden væk fra de cirkulære elektroder, hvilket resulterer i nedsat lysintensitet i midten af mikrobrønden. Disse to fænomener er repræsenteret i figur 1. Traditionelle DEP-metoder har evnen til at karakterisere de elektriske egenskaber af heterogene cellepopulationer 18,20,21. For eksempel demonstrerede Mulhall et al. potentialet til at skelne mellem normale orale keratinocytter (HOK) og maligne orale keratinocyt (H357) cellelinjer baseret på forskelle i membrankapacitans21 ved anvendelse af 3DEP-analysatoren. En begrænsning af traditionelle tilstande af DEP er imidlertid den faste elektrodegeometri. Da hMSC'er er heterogene, er det en fordel at have mulighed for let at ændre elektrodegeometrierne under DEP-vurderinger. For eksempel gør det muligt at kunne ændre elektroderne eller elektrodearrayerne i realtid til enkeltcellefangst, at cellerne kan karakteriseres baseret på hastighed og DEP-adfærd. Anvendelsen af elektrodemodifikation i realtid i DEP-vurderinger af hMSC'er muliggør enkeltcelleanalyse af hMSC'er lige efter indkøb af dem fra prøvevævet for at karakterisere heterogeniteten af prøvepopulationen.

For at overvinde begrænsningen af traditionelle tilstande af DEP (dvs. faste fysiske elektroder) og udforske nye muligheder for realtidselektrodekonfigurationsændringer ved hjælp af DEP-fænomenet er lysinduceret DEP (LiDEP) blevet undersøgt. LiDEP er en ikke-traditionel tilstand af DEP, der manipulerer celler ved hjælp af en fotoledende mikrofluidisk enhed22,23 via lysfremskrivninger, lokaliserede elektroder skaber et uensartet elektrisk felt, svarende til den traditionelle DEP-metode. Denne tilgang giver også mulighed for fleksibilitet i elektrodegeometrien og for at flytte elektroderne i den mikrofluidiske enhed. Dette mindsker begrænsningen set med faste elektroder og giver mulighed for at få mere information om cellulær heterogenitet. LiDEP er blevet brugt til at detektere og analysere forskellige celletyper i homogene og heterogene populationer af celler22,23,24. For eksempel brugte Liao et al. LiDEP til at adskille cirkulerende tumorceller (CTC'er), der udtrykker epitelcelleadhæsionsmodulet (EpCAMneg) fra røde blodlegemer for at undersøge deres betydning i kræftmetastase22. Enkeltcelleanalyse med LiDEP er med succes blevet brugt til at karakterisere og manipulere kræftceller med stratificering af bugspytkirteltumorigenicitet23 og analyse af CTC'er i prøver før og efter metastase24.

Her beskriver vi, hvordan LiDEP kan bruges til at manipulere hMSC'er med en række elektrodegeometrier (cirkel-, diamant-, stjerne- og parallelle linjer) og systemindstillinger (anvendt spænding, lysintensitet og mikrofluidisk enhedsmateriale) og dermed tilbyde en tilgang til at karakterisere opførsel af menneskeafledte stamceller med virtuelle elektroder.

Protocol

1. Fremstilling af LiDEP mikrofluidisk enhed

BEMÆRK: Fremstillingsprocessen består i at kombinere tre lagdelte komponenter: (i) et fotoledende lag med amorft silicium (A: Si) og molybdæn deponeret på et indiumtinoxid (ITO) glassubstrat; ii) et mikrokanallag, der er udskåret af dobbeltklæbende tape og iii) et top-ITO-glassubstrat med huller boret til cellesuspensionens indløb og udløb.

  1. Glasbelægning af fotoledende indiumtinoxid (ITO)
    1. Det ITO-belagte glassubstrat (15-20 Ω modstand) rengøres ved at strømme nitrogengas (N2) på overfladen med en strømningshastighed, der er tilstrækkelig til at flytte synlige støvpartikler. Efter dette trin skylles substratet med acetone.
    2. Overfør det ITO-belagte glasglas til et isopropylalkoholbad for at vaske acetoneresterne af, skyl med DI-vand og flydN2-gas igen, indtil substratet er helt tørt.
    3. Placer glasobjektglasset med den ITO-belagte side opad i vakuumforstøvningssystemet.
    4. Sputter et 10 nm tykt lag molybdæn på det ITO-belagte glassubstrat (molybdænmål) med en aflejringshastighed på 0,7 Å/s og en aflejringstid på 140 s.
    5. Tilføj en skyggemaske til den ene side af glasunderlaget for at efterlade 2 mm fra kanten af glasunderlaget udækket til elektriske forbindelser. Der aflejres 1 μm A:Si ved hjælp af induktivt koblet plasma-plasmaforstærket kemisk dampaflejring (ICP-PECVD), som beskrevet i Medjdoub et al.25.
    6. Rengør objektglasset medN2-gas for at fjerne støv og andre urenheder. For enhver A:Si, der aflejres under skyggemasken, nedsænkes kanten op til 2 mm-mærket i en 25 % w/v kaliumhydroxidopløsning for at ætse A:Si.
  2. Fremstilling af LiDEP-chipenhed
    1. For at danne mikrokanalen opnås dobbeltsidet tape (52 mm x 25 mm) og stansehuller (diameter = 4 mm) 5-6 mm væk fra kanten af den kortere dimension og centreret mellem båndets længere sider. Brug en skalpel til at skære to lige linjer (3 mm fra hinanden) på tværs af hullerne. Sørg for, at beskyttelsespladerne på begge sider af den dobbeltklæbende tape er på under hele mikrokanalskæretrinnet.
    2. Bor to huller med en diameter på 3 mm i det øverste ITO-glasglas. Tapen kan justeres oven på det ITO-belagte glas, hvor tapens lange kant flugter med glassets lange kant. Marker hullets placering med en vaskbar markør. Sørg for, at de borede huller flugter med hullerne i den dobbeltklæbende tape. Disse to huller fungerer som indløbs- og udløbshullerne i den mikrofluidiske enhed.
    3. Fjern den ene side af beskyttelsesfilmen på den dobbeltsidede tape, juster hullerne i tapen og det øverste ITO-glasglas, og tryk dem sammen. Tryk forsigtigt for at fjerne luftlommer, især i nærheden af mikrokanalen. Luftlommer kan tillade mediet eller andre opløsninger at sive under båndet, hvilket kan beskadige eller forårsage skimmelsvamp i den mikrofluidiske enhed.
    4. Fjern den anden beskyttelsesfilm fra den dobbeltklæbende tape, og tryk på molybdæn og A:Si-belagt ITO-glasside. Match kanten af det fotoledende objektglas, der er modsat den 2 mm frigangsside, til kanten af den dobbeltsidede tape, der er mod midten af det øverste ITO-glasglas. Der vil være tømmermænd fra den øverste ITO-glasrutsjebane og den fotoledende materialebelagte ITO-glasrutsjebane.
    5. Tryk på en plan overflade for at sikre god vedhæftning. Et skema over glassubstratet og de dobbeltsidede båndlag er illustreret i figur 1A. Skær overskydende tape af på siden.
    6. Påfør kobbertape på kanterne af lag A og lag C for at forbinde funktionsgeneratoren. Gør dette ved at vikle tapen på siden af ITO eller fotoledende materiale, afhængigt af om det er lag A eller lag C, fra kanten af den dobbeltsidede tape til ca. 3 cm på den ubelagte side af glassubstratet.
    7. For at sikre en vellykket enhedsfremstilling skal du bruge et multimeter til at teste for en modstandsaflæsning mellem de belagte dias af begge glasunderlag og kobberbåndet, der var fastgjort til glasset.
  3. Forberedelse af DEP-buffer
    1. Mål 4,25 g saccharose, og læg det i et 50 ml konisk rør. Mål derefter 0,15 g glukose, og læg den i det samme 50 ml koniske rør.
    2. Fyld det koniske rør med 25 ml ultrarent vand, luk låget og bland. Når ca. halvdelen af saccharose og glukose er opløst, fyldes det koniske rør med ultrarent vand op til 50 ml linjen. Bland kraftigt, indtil al saccharose og glucose er opløst. DEP-bufferopløsning indeholder 8,5 % (w/v) saccharose og 0,3 % (w/v) glucose.
    3. Der opnås 20 ml af den tilberedte saccharose- og glucoseopløsning, og den anbringes i et 50 ml konisk rør. Derefter afmåles 0,1 g bovin serumalbumin (BSA), og det anbringes i det 50 ml koniske rør indeholdende saccharose og glucoseopløsning. Vortex, indtil BSA er opløst. Den endelige DEP-bufferopløsning indeholder 0,5 % (w/v) BSA.
  4. Celle forberedelse
    1. Der opnås mindst 1 x 106 celler (hMSC'er eller HEK 293) suspenderet i 1 ml vækstmedium ved hjælp af cellekulturprotokollen beskrevet i tidligere undersøgelser26,27. Cellesuspensionen anbringes i et 10 ml centrifugeglas.
    2. HEK 293-cellerne centrifugeres ved 201 x g i 5 minutter og hMSC'erne ved 290 x g i 10 minutter. Efter centrifugering aspireres supernatanten, og cellerne resuspenderes i 1 ml DEP-bufferopløsning med 0,5 % BSA. Sørg for ikke at tilføje bufferopløsningen for hurtigt, da der kan dannes bobler.
    3. Gentag centrifugeringsprocessen to gange mere, og resuspender derefter cellerne i DEP-bufferen med 0,5% BSA til LiDEP-karakterisering. Den angivne celleforberedelsesprotokol er nok til 10 kørsler. For eksempel kræver en frekvenstest mindst 15 kørsler, og derfor skal der laves 2 ml celler i en koncentration på 1 x 106 celler / ml.

2. LiDEP-karakterisering

  1. Eksperimentel opsætning
    1. Saml følgende udstyr til den eksperimentelle opsætning til kvantificering af de cellulære reaktioner på LiDEP: en bærbar computer, en projektor, en objektiv linse, et digitalt mikroskop og en funktionsgenerator. Brug den bærbare computer til at designe lysprojektionerne (stjerne, diamant, tre linjer og oval), og tilslut den til projektoren.
    2. Brug projektoren som lyskilde til at vise lysprojektionerne på den fotoledende overflade (lag C) på LiDEP-chippen. Indstil det, så lyset fra lyskilden (projektoren) bevæger sig gennem en 10x objektivlinse på LiDEP-chippens mikrokanalområde. 10x objektivobjektivet sidder oven på projektorlinsen. Supplerende figur 1 viser projektorens integration i LiDEP-systemet.
    3. Tilslut LiDEP-chippen til funktionsgeneratoren for at anvende det elektriske vekselstrømsfelt. Overhold cellerne, der oplever LiDEP-kraften ved hjælp af det digitale mikroskop til billeddannelse og videooptagelse. Figur 1B viser et skema over forsøgsapparatet. Følg standard cellekulturprotokoller26,27 for alle testede celler.
  2. Eksperimentelle procedurer
    1. Skyl mikrokanalen med 70% ethanol efterfulgt af 0,5% BSA-opløsning. Skyl mikrokanalen igen med 0,5% BSA-opløsning to gange mere for at sikre, at ethanolen og de tidligere celler vaskes helt væk. Celler, der allerede har været eksponeret for DEP-feltet, reagerer anderledes end nye celler og kan forstyrre dataindsamlingen.
    2. Fjern 0,5 % BSA-opløsningen med en pipette, og sæt den mikrofluidiske enhed i enhedsholderen.
    3. Fastgør alligatorklemmer til hver af kobberbåndforbindelserne på enheden. Indstil funktionsgeneratoren til den ønskede spænding (spænding peak-to-peak, Vpp) og frekvens (Hz). Frekvensområdet, der blev testet her, var 30 kHz til 20 MHz.
    4. Tilsæt 70 μL cellesuspension (celler + DEP-bufferopløsning med 0,5% BSA) i enhedens mikrokanal. På grund af mikrokanalens tyndhed (~0,05 mm) kan der forekomme spild ud af indløbs- og udløbshullerne. For at reducere mængden af spild skal du bruge en mindre pipettespids og vippe spidsen lidt i hullet mod mikrokanalen. Enhver adgangsløsning (0,5% BSA eller celler i opløsning) kan tørres væk med papirservietter til engangsbrug og kasseres i biofarligt affald.
    5. Projicer den ønskede virtuelle elektrodegeometri (her cirkler, diamanter, stjerner og/eller parallelle linjer) på LiDEP-chippen.
    6. I softwaren til digitalt mikroskop skal du indstille videolængden til 3 min. Indstil en laboratorietimer til 2 min 30 sek. Når cellerne er stationære i LiDEP-chippens mikrokanal, skal du trykke på Start i den digitale mikroskopsoftware for at starte videooptagelsesprocessen.
    7. Vent 10 sek., tryk derefter på ON-knappen på funktionsgeneratorkanaludgangen for at anvende det elektriske vekselstrømsfelt, og tryk på Start for timeren. Overvåg cellens DEP-adfærd gennem det digitale mikroskop, og undgå rystelser eller bevægelse omkring opsætningen.
    8. Når timeren slukker, skal du trykke på ON-knappen på funktionsgeneratorkanaludgangen. Dette slukker funktionsgeneratorkanaludgangen, og det elektriske vekselstrømsfelt leveres ikke længere gennem elektroderne. Stop videooptagelsen på 3 min, og gem i det digitale mikroskop til fremtidig analyse.
    9. Pipette cellerne ud af udløbsenden af LiDEP-chippen ved langsomt at skubbe 60 μL DEP-buffer med 0,5% BSA ind i mikrokanalen og samtidig opsamle ved udløbet. Fortsæt, indtil der er få eller ingen celler i mikrokanalen.
    10. Trin 2.2.3-2.2.9 gentages, indtil alle frekvenser er blevet testet.

Representative Results

Spændings- og elektrodefarvetest blev afsluttet ved hjælp af ovenstående procedure med en lille variation i trin 2.2.3 og trin 2.2.10. Til spændingstesten forblev elektrodefarven og frekvensen konstant, og 5 V pp, 10 V pp og 20 Vpp blev påført. Til elektrodefarvetesten blev den anvendte spænding og frekvens holdt konstant ved 30 kHz og 20 Vpp, og blå, rød, hvid og gul (refereret af HEX-farvekoder #4472C4, #FF0000, #FFFFFF og #FFFF00, henholdsvis) projicerede elektroder blev undersøgt. Cellelevedygtigheden blev undersøgt ved at farve cellerne med trypanblå og tælle antallet af levende og døde celler ved hjælp af et hæmocytometer.

Med LiDEP-opsætningen var vi i stand til at manipulere hMSC'erne og generere DEP-responskurver som reaktion på inputfrekvensen, hvilket er en måde at karakterisere cellernes elektriske opførsel på. En række eksperimenter blev udført for at finde de optimale driftsforhold ved at manipulere parametre som den påførte spænding og den projicerede elektrodefarve (dvs. former med forskellige farver oprettet med en grafisk editor-software) for at observere konsekvent celleadfærd til det uensartede vekselstrømselektriske felt genereret med de virtuelle elektroder. De data, der blev indsamlet for celleresponser ved hjælp af LiDEP, ikke-traditionel DEP, blev sammenlignet med resultater fra 3DEP-analysatoren, traditionel DEP.

Den første optimeringstest fokuserede på den positive DEP-respons fra hMSC'er (dvs. cellerne, der bevæger sig mod den virtuelle elektrode) i LiDEP-chippen. Cellerne, der ikke udviste et positivt DEP-respons, viste enten et negativt DEP-respons ved at bevæge sig væk fra den virtuelle elektrode, var stationære og roterende eller reagerede ikke på det elektriske felt. Cellernes respons blev kvantificeret ved at spore deres hastigheder (μm/s) i ImageJ i løbet af en periode på 2 min og 30 s. En gul oval projektion blev brugt til den virtuelle elektrode, og de påførte spændinger på 5 V pp, 10 V pp og 20 Vpp blev undersøgt ved en indstillet frekvens på 30 kHz. Vi fokuserede på celler, der var inden for 50 μm fra den virtuelle elektrode, mens det elektriske AC-felt var tændt for konsistens og for at minimere outliers. 20 V pp resulterede i den hurtigste cellebevægelse af HEK 293-cellerne med en gennemsnitshastighed på 0,035 μm / s, og dette blev efterfulgt af 0,032 μm / s ved 10 V pp og 0,020 μm / s ved 5 Vpp, hvilket betyder, at disse celler repræsenterer en relativt homogen kontrol. En lignende tendens blev observeret for hMSC'er, som havde en gennemsnitshastighed på 0,051 μm/s ved 20 V pp, 0,036 μm/s ved 10 V pp og 0,025 μm/s ved 5 Vpp, som i figur 2A (her angiver * p < 0,05). Ved 20 Vpp blev det observeret, at hMSC'erne oplevede positiv og negativ DEP samtidigt. Dette blev ikke observeret ved 10 V pp og 5 V pp. Levedygtighedsresultaterne af hMSC'erne efter at have oplevet DEP-kraften viste, at højere spændinger generelt resulterede i lavere cellelevedygtighed, hvor 66% af cellerne var levedygtige ved 5 V pp, 58% af cellerne levedygtige ved 10 V pp og 57% af cellerne levedygtige ved 20 V pp, som i figur 2B (her angiver ** p < 0,01).

På grund af at LiDEP er et optisk baseret system, er lysintensiteten og elektrodefarven parametre, der let kan indstilles til at kontrollere LiDEP-chipens ydeevne. Her blev forskellige elektrodefarver (hvid, gul, rød og blå) genereret baseret på den form, der blev projiceret, evalueret for at bestemme effekten på cellernes DEP-responser. HEK 293 celler og hMSC'er blev evalueret ved 20 Vpp og 30 kHz. Hvid-, gul-, rød- og blåfarvede elektroder blev valgt, men belysningen gennem LiDEP-chippen blev påvirket af det fotoledende lag, som havde en rød-orange farve. Således syntes den projicerede hvide elektrode gul med et hvidt interiør, den røde elektrode syntes orange med en rød kontur, og den blå elektrode syntes lysegrøn (figur 3A-D). Effektudgangene for disse fire farver var som følger: 77,7 μW ± 0,7 μW, 92,7 μW ± 1,3 μW, 21,9 μW ± 0,2 μW og 56,7 μW ± 0,9 μW for henholdsvis hvid, gul, rød og blå. Dette tyder stærkt på, at gul og hvid havde det stærkeste DEP-felt, mens blå og rød var svagere, som i figur 3E (her angiver *** p < 0,001 for HEK 293-celler og ** angiver p < 0,01 for hMSC'er). Stationær rotation af cellerne på kanterne af de gule og hvide virtuelle elektroder under påføring af DEP-kraften blev også observeret. For alle elektrodefarvevariationer forekom samtidige negative og positive DEP-responser, der korrelerede med det, der blev vist ved 20 Vpp for spændingstesten. Derudover, mens cellernes hastighed varierede baseret på elektrodefarven, reagerede næsten alle cellerne inden for 50 μm-grænsen på LiDEP. Størrelsen af hMSC'erne blev målt til 19,2 μm ± 5,8 μm.

For at vurdere LiDEP's evne sammenlignet med DEP med konventionelle elektroder vurderede vi forskellene mellem DEP-adfærden for celler, der bruger LiDEP, og for celler, der analyseres af 3DEP-analysatoren. DEP-responsen for hMSC'er blev målt i en DEP-bufferopløsning med lav ledningsevne med 0,5 % BSA (~100 μS/cm). For at efterligne 3DEP-analysatoren blev en enkelt oval gul virtuel elektrode projiceret ved 10 Vpp. Databehandlingsadfærden for hMSC'erne blev karakteriseret fra 30 kHz til 20 MHz. Ved frekvenser lavere end 25 kHz observerede vi elektrolyse, hvilket resulterede i boblegenerering på overfladen af metallaget i den mikrofluidiske enhed. For LiDEP oplevede hMSC'erne ved lavere frekvenser positiv DEP-kraft, som i figur 4A, repræsenteret som procentdelen af celler, der tiltrækkes af den virtuelle elektrode. Cellerne startede med en stærk positiv DEP-kraft, som svækkedes, da frekvensen steg. Cellerne oplevede den stærkeste positive DEP-kraft fra 30 kHz til 97 kHz. Efter påføring af vekselstrømsfeltet ved disse frekvenser reagerede nogle celler ikke, mens andre celler viste negativ DEP-adfærd. Denne tendens afviger fra det observerede respons kvantificeret ved hjælp af 3DEP-analysatoren; cellerne steg i positiv DEP fra 37 kHz til 255 kHz og faldt i positiv DEP fra 1,772 kHz til 20 MHz, som i figur 4B.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel opsætning for LiDEP-protokollen, der er beskrevet her for hMSC'er. (A) Skematisk og reelt billede af LiDEP-chippen med det fotoledende lag og forsøgsopstillingen. (B) Repræsentative billeder af positive og negative DEP-responser af celler i 3DEP-analysatoren (ved hjælp af konventionelle DEP-elektroder, øverst) og skematisk repræsentation af positive og negative DEP-responser fra celler ved hjælp af LiDEP (ved hjælp af lysprojektioner som virtuelle elektroder, nederst). (C) Eksempler på forskellige former, der kan projiceres på enheden som virtuelle elektroder. Figur oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Karakterisering af DEP-responserne (hastigheden) af hMSC'er og deres levedygtighed under de givne betingelser. (A) De målte hastigheder af hMSC'ers positive DEP-respons til 5 V pp, 10 V pp og 20 V pp. hMSC'erne bevægede sig ved 0,051 μm/s ved 20 V pp, 0,036 μm/s ved 10 V pp og 0,025 μm/s ved 5 Vpp. (B) HMSC'ernes levedygtighed efter at have oplevet den positive DEP-kraft, der genereres med virtuelle elektroder. Levedygtigheden var henholdsvis 57%, 58% og 66% for 20 V pp, 10 V pp og 5 Vpp. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelsen (SD). Statistisk analyse udført på puljede datasæt ved hjælp af t-tests (*p < 0,05 og **p < 0,01). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning af DEP-responserne mellem homogene (HEK 293) og heterogene (hMSC'er) cellelinjer. Positiv DEP-respons fra hMSC-celler til (A) hvide, (B) gule, (C) røde og (D) blå elektroder ved 20 Vpp og 30 kHz. (E) Hastighedsrespons af HEK 293-celler og hMSC'er til de forskellige farvede elektroder. HEK 293-cellerne udviste de højeste hastigheder med de gule og røde elektroder ved henholdsvis 0,035 μm / s og 0,033 μm / s. HEK 293-cellerne udviste den laveste hastighed med de blå elektroder ved 0,027 μm / s. hMSC'erne udviste de højeste hastigheder med de gule og hvide elektroder på henholdsvis 0,068 μm / s og 0,049 μm / s. hMSC'erne oplevede den laveste hastighed med de røde elektroder på 0,039 μm/s. Fejlbjælkerne repræsenterer SD. Statistisk analyse udført på poolede datasæt ved hjælp af t-tests (*p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Sammenligning af DEP-svarene fra hMSC'er ved hjælp af LiDEP og 3DEP. DEP-responserne for hMSC'er målt med (A) LiDEP og (B) 3DEP-analysatoren ved 10 Vpp. Med LiDEP var der et henfald i hMSC'ernes positive DEP-respons fra 30 kHz til 20 MHz. Fra 3DEP-analysatoren steg cellerne i positiv DEP fra 37 kHz til 255 kHz og faldt i positiv DEP fra 1,772 kHz til 20 MHz. Fejlbjælker repræsenterer SD. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Repræsentative billeder af LiDEP-opsætningen, der er brugt til eksperimenterne i denne protokol. Zoomet billede af LiDEP-systemet, der viser integrationen af projektoren. Lys bevæger sig fra kilden (projektoren) gennem en 10x objektivlinse på LiDEP-chipens mikrokanal. 10x-målet sidder oven på projektorlinsen. Hver komponent er nummereret på billederne og angivet på siden. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 1: Repræsentativ video af hMSC'er, der reagerer på de hvide, gule, røde og blå virtuelle elektroder. Cellerne visualiseres som oplever positiv DEP (bevæger sig mod den virtuelle elektrode), oplever negativ DEP (bevæger sig væk fra den virtuelle elektrode), stationær og roterende eller reagerer ikke på det elektriske felt. hMSC'erne blev testet ved 37 kHz og 20 Vpp, og videoen blev fremskyndet 20x. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Undersøgelse af heterogeniteten af hMSC'er er vigtig for deres fremskridt inden for terapi. Dette arbejde giver et første skridt til at bruge LiDEP som et analytisk værktøj til vurdering af hMSC'er. Vi undersøgte spændingsafhængigheden af cellernes positive DEP-respons i LiDEP ved at kvantificere hastigheden. Det forventes, at højere spændinger skulle producere stærkere positiv DEP-kraft, og vi observerede dette mønster med de målte hastigheder. 10 V pp og 20 Vpp spændingerne var tilstrækkelige til manipulation af hMSC'er ved hjælp af LiDEP. Lavere spændinger (dvs. 5 Vpp) resulterede i langsommere celleresponser; Selvom det ikke er optimalt for hMSC'er, kan dette være fordelagtigt for andre celletyper. Der var et spændingsafhængigt fald i hMSC'ernes levedygtighed på ca. 9%. Dette adskiller sig lidt fra den tidligere litteratur 6,12,28,29, hvor brugen af traditionel DEP og LiDEP i undersøgelsen af biologiske celler ikke nedsatte cellens levedygtighed. Det eksperimentelle mål i hver undersøgelse varierede imidlertid. Glasser og Fuhr overvågede væksten af klæbende L929-musefibroblaster på metalelektroder i cellekulturmedium28. Omvendt undersøgte Lu et al. levedygtigheden af neurale stamceller udsat for vekselstrømselektriske felter i forskellige perioder12. Adams et al. karakteriserede de dielektriske egenskaber af hMSC'er med metalelektroder12, og Li et al. manipulerede leukæmiceller med LiDEP29. Forskellen mellem disse undersøgelser og vores var brugen af BSA, som kan være årsagen til det fald i levedygtighed, vi observerede. Den lavere samlede levedygtighed kan dog også skyldes den eksponeringstid (2 min 30 s), der anvendes i den protokol, der er fastlagt her. Denne gang blev valgt for at give tilstrækkelig tid til at visualisere cellemanipulation under eksponering for det uensartede vekselstrømsfelt.

Metoderne til cellekarakterisering blev testet via elektrodefarven for at bestemme mulighederne og begrænsningerne i vores LiDEP-system bygget som beskrevet i protokollen. I denne specifikke protokol kan elektrodefarven styres baseret på farven på den form, der projiceres gennem en grafisk editorfil. Vi brugte fire farver: hvid, gul, rød og blå. Fra effektudgangsaflæsningerne for hver farve blev de projicerede gule (#FFFF00) og hvide (#FFFFFF) elektroder målt til at have højere intensiteter, hvilket var grundlaget for, hvorfor disse farver var mere gunstige at bruge i de efterfølgende eksperimenter. På grund af den etablerede lysintensitetsafhængighed af fotoledende materialer30,31 tyder resultaterne desuden på, at ydeevnen for LiDEP-enheder er afhængig af fotoledende A: Si og kan indstilles ved valget af den projicerede elektrodefarve. En kombination af positive og negative DEP-responser fra hMSC'er blev også observeret ved anvendelse af LiDEP, hvilket er ligesom det fænomen, der ses i traditionelle DEP-metoder. Med hver elektrodefarve oplevede hMSC'erne negativ DEP-kraft, positiv DEP-kraft og cellerotation, hvilket indikerer, at celleprøven var heterogen ved en enkelt frekvens (supplerende video 1). Dette stemmer overens med resultaterne af Adams et al.6, at hMSC'er udviser både negativ og positiv DEP-adfærd ved en enkelt frekvens. Disse betingelser (elektrodefarve, elektrodeform og fotoledende materiale) kan tilvejebringe yderligere parametre til påvisning af heterogenitetsniveauet i hMSC-prøver.

Endelig blev resultaterne af LiDEP-vurderingen sammenlignet med resultaterne fra 3DEP-analysatoren som benchmark for hMSC DEP-adfærd. Der blev observeret en forskel i frekvensområdet for hMSC'ernes positive DEP-respons, men tendenserne i de data, der blev indsamlet via LiDEP og 3DEP-analysatoren, var generelt ens (dvs. det positive DEP-respons faldt med øget frekvens). Når det elektriske vekselstrømsfelt blev leveret til LiDEP-chippen, og lyset blev projiceret på det, faldt ledningsevnen i området inden for lysprojektionen, hvilket skabte et uensartet elektrisk felt. Derfor påvirker lyskildens egenskaber (dvs. intensitet og bølgelængde) den forventede respons af cellerne i LiDEP-chippen, set fra resultaterne af spændings- og elektrodefarvevariationstestene. Andre parametre, der kan ændres, er materialet i det fotokonduktive lag og ledningsevnen af DEP-bufferopløsningen. Som sådan skal de betingelser, der bruges til at evaluere cellernes DEP-adfærd, evalueres baseret på opsætningen af LiDEP-systemet. Omvendt er elektrodeegenskaberne konstante for 3DEP-analysatoren eller andre metoder, der bruger metalelektroder til at anvende DEP-kraften, og kan ikke varieres øjeblikkeligt for at tilpasse sig det, der er nødvendigt for de celler, der undersøges. Denne variation af den positive DEP-adfærd kan være gavnlig for fremtidig forskning i karakterisering af forskellige celletyper inden for hMSC-prøver, enkeltcelleanalyse eller cellesortering. Derudover, når cellerne bevæger sig længere væk fra de virtuelle elektroder, bliver AC-elektriske felt svagere. Men med 3DEP-analysatoren eller andre traditionelle DEP-tilstande, der bruger metalelektroder, kan der anvendes et større elektrisk feltområde, hvilket gør det muligt at manipulere flere celler. Derfor oplevede færre celler pr. LiDEP-eksperiment virkningerne af det vekselstrømselektriske felt inden for LiDEP-chippens mikrokanal. Yderligere uoverensstemmelser kan skyldes ændringer i enhedens ydeevne over tid (dvs. 2 timer eller 3 timer), som stadig undersøges. Den konstante strøm af vand, ethanol og DEP-bufferopløsning kan nedbryde overfladen af mikrokanallaget (dvs. det fotoledende materiale) og skal overvejes. Enhedens ydeevne over tid til cellekarakterisering skal også overvejes til udvidet brug af en LiDEP-chip. Ændringer af de eksperimentelle parametre i realtid tog kun et par sekunder til minutter. Elektrodefarven og geometrierne blev justeret øjeblikkeligt ved hjælp af indstillinger i grafikeditorsoftwaren.

Sammenfattende demonstrerer dette papir LiDEP's evner til at manipulere og karakterisere en cellelinje med heterogene cellepopulationer såsom hMSC'er. Ved hjælp af denne opsætning og den beskrevne protokol var vi i stand til at opnå en vellykket karakterisering af hMSC'er under betingelserne for 20 Vpp og projicerede virtuelle gule elektroder. Fremtidige undersøgelser bør fokusere på at justere eksponeringstiden for hMSC'erne til det vekselstrømselektriske felt, der skabes via LiDEP, øge lysintensiteten af de virtuelle elektroder og vurdere forskellige kilder til hMSC'er (eller andre stamcellepopulationer) for at udvikle et LiDEP-katalog over de elektriske signaturer af heterogene stamcellepopulationer.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation CAREER award (2048221) via CBET. Vi vil gerne takke Mo Kebaili fra UCI's Integrated Nanosystems Research Facility (INRF). Derudover vil vi gerne takke Dr. Devin Keck for at hjælpe med udviklingen af LiDEP-systemet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300054
10x objective AmScope ---
Amorphous silicon (A:Si) Millipore Sigma S5130
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240-062
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9706-100
Copper Tape Zehhe BF4964
Dextrose (glucose) Fisher D16-1
Digital microscope Keyence VHX-7000
Double Sided Tape Insulectro FLX000484
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-144
Fetel Bovine Serum (FBS) Corning 35-011-CV
Function Generator Tektronix AFG 31102
Graphic editor software Microsoft Office Powerpoint ---
Indium tin oxidec coated glass slides MSE Supplied GL0333
L-Alanyl-L-Glutamine ATCC PCS-999-034
Laptop Dell Inspiron 14, 2-in-1
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium ATCC PCS-500-030
Mesenchymal Stem Cell Growth Kit for Umbilical and Adipose Cord-Derived MSCs ATCC PCS-500-040
Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X) Giblo A10490-01
Molybdenum, 99.95% Kurt J. Lesker EJTMOXX352A4 Sputtering target
Phenol Red Sigma P5530
Power Meter Thor Labs S130VC/PM400
Projector Vecupoi ---
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Media Gibco 11875-093 This media has L-Glutamine and Phenol Red.
Sucrose Fisher BP220-1
Trypan Blue Stain Gibco 15250-061 0.40%
Trypsin Neutralizer Gibco R002100
Vacuum Sputtering System Denton DV-502M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mahla, S. R. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, (2016).
  2. Bhansali, A. Efficacy of autologous bone marrow-derived stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus. Stem Cells and Development. 18 (10), 1407-1416 (2009).
  3. Bouchlaka, M. N. Human mesenchymal stem cell-educated macrophages are a distinct high IL-6-producing subset that confer protection in graft-versus-host-disease and radiation injury models. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 23 (6), 897-905 (2017).
  4. Alfaifi, M., Eom, Y. W., Newsome, P. N., Baik, S. K. Mesenchymal stromal cell therapy for liver diseases. Journal of Hepatology. 68 (6), 1272-1285 (2018).
  5. Oswald, J. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells. 22 (3), 377-384 (2004).
  6. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. Arthritis and rheumatism. 52 (8), 2521-2529 (2005).
  7. Poirier, J. T. Chapter 5 - Genetic profiling of tumors in PDX models. In Patient Derived Tumor Xenograft Models: Promise, Potential and Practice. Uthamanthil, R., Tinkey, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 149-159 (2017).
  8. Sino Biological. Fluorescence-activated cell sorting (FACS). , Available from: https://www.sinobiological.com/category/fcm-facs-facs (2023).
  9. González-González, M., Vázquez-Villegas, P., García-Salinas, C., Rito-Palomares, M. Current strategies and challenges for the purification of Stem Cells. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 87 (1), 2-10 (2011).
  10. Flanagan, A. L. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 23 (3), 656-665 (2007).
  11. Vykoukal, J., Vykoukal, D. M., Freyberg, S., Alt, E. U., Gascoyne, P. R. C. Enrichment of putative stem cells from adipose tissue using dielectrophoretic field-flow fractionation. Lab on a Chip. 8 (8), 1386-1393 (2008).
  12. Adams, T. N. G., Turner, P. A., Janorkar, A. V., Zhao, F., Minerick, A. R. Characterizing the dielectric properties of human mesenchymal stem cells and the effects of charged elastin-like polypeptide copolymer treatment. Biomicrofluidics. 8 (5), (2014).
  13. Wu, H. W., Lin, C. C., Lee, G. B. Stem cells in microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (1), (2011).
  14. Adams, T. N. G. Label-free enrichment of fate-biased human neural stem and progenitor cells. Biosensors and Bioelectronics. 152, 111982 (2020).
  15. Zhao, K., Larasati,, Duncker, B. P., Li, D. Continuous cell characterization and separation by microfluidic alternating current dielectrophoresis. Analytical Chemistry. 91 (9), 6304-6314 (2019).
  16. Song, H. Continuous-flow sorting o stem cells and differentiation products based on dielectrophoresis. Lab on a Chip. 15, 1320-1328 (2015).
  17. Khoshmanesh, K., Nahavandi, S., Baratchi, S., Mitchell, A., Kalantar-Zadeh, K. Dielectrophoretic platforms for bio-microfluidic systems. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 1800-1814 (2010).
  18. Hoettges, K. F. Ten-second electrophysiology: Evaluation of the 3DEP platform for high-speed, high-accuracy cell analysis. Scientific Reports. 9, 19153 (2019).
  19. Hubner, Y., Hoettges, K. F., Kass, G. E. N., Ogin, S. L., Hughes, M. P. Parallel measurements of drug actions on Erythrocytes by dielectrophoresis, using a three-dimensional electrode design. IEE Proceedings - Nanobiotechnology. 152 (4), 150-154 (2005).
  20. Hoettges, K. F. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Analytical Chemistry. 80 (9), 2063-2068 (2008).
  21. Mulhall, H. J. Cancer, pre-cancer and normal oral cells distinguished by dielectrophoresis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (8), 2455-2463 (2011).
  22. Liao, C. -J. An optically induced dielectrophoresis (ODEP)-based microfluidic system for the isolation of high-purity CD45neg/EPCAMNEG cells from the blood samples of cancer patients-Demonstration and initial exploration of the clinical significance of these cells. Micromachines. 9 (11), 563 (2018).
  23. McGrath, J. S. Electrophysiology-based stratification of pancreatic tumorigenicity by label-free single-cell impedance cytometry. Analytica Chimica Acta. 1101, 90-98 (2019).
  24. Chiu, T. K. Optically-induced-dielectrophoresis (ODEP)-based cell manipulation in a microfluidic system for high-purity isolation of integral circulating tumor cell (CTC) clusters based on their size characteristics. Sensors and Actuators, B: Chemical. 258, 1161-1173 (2018).
  25. Medjdoub, M., Courant, J. L., Maher, H., Post, G. Inductively coupled plasma - plasma enhanced chemical vapor deposition silicon nitride for passivation of InP based high electron mobility transistors (HEMTs). Material Science and Engineering: B. 80 (1-3), 252-256 (2001).
  26. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; Normal, human. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/pcs-500-010 (2023).
  27. 293 [HEK-293]. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/crl-1573 (2023).
  28. Glasser, H., Fuhr, G. Cultivation of cells under strong ac-electric field-differentiation between heating and trans-membrane potential effects. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 47 (2), 301-310 (1998).
  29. Li, B. Implementation of flexible virtual microchannels based on optically induced dielectrophoresis. Nanotechnology. 33, 295102 (2022).
  30. Schellenberg, J. J., Kao, K. C. On the relationship between photoconductivity and light intensity in solids. Journal of Physics D: Applied Physics. 21, 1764-1768 (1988).
  31. Aoyagi, Y., Masuda, K., Namba, S. Explaination of light-intensity dependence of photoconductivity in zinc phthalocyanine. Journal of Applied Physics. 43, 249-251 (1972).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 196 Elektrokinetik mikrofluidik stamceller virtuelle elektroder cellekarakterisering
Lysinduceret dielektroforese til karakterisering af den elektriske opførsel af humane mesenkymale stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lacy, K. L., Salib, S., Tran, M.,… More

Lacy, K. L., Salib, S., Tran, M., Tsai, T., Valentine, R., Ardoña, H. A. M., Adams, T. N. G. Light-Induced Dielectrophoresis for Characterizing the Electrical Behavior of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (196), e64909, doi:10.3791/64909 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter