Summary
Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde strategie voor het verkennen van de belangrijkste doelen en mechanismen van Fructus Phyllanthi tegen hyperlipidemie op basis van netwerkfarmacologievoorspelling en metabolomics-verificatie.
Abstract
Hyperlipidemie is wereldwijd een belangrijke risicofactor geworden voor hart- en vaatziekten en leverbeschadiging. Fructus Phyllanthi (FP) is een effectief medicijn tegen hyperlipidemie in de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) en de Indiase geneeskunde theorieën, maar het potentiële mechanisme vereist verder onderzoek. Het huidige onderzoek heeft tot doel het mechanisme van FP tegen hyperlipidemie te onthullen op basis van een geïntegreerde strategie die netwerkfarmacologievoorspelling combineert met metabolomics-validatie. Een vetrijk dieet (HFD) -geïnduceerd muizenmodel werd vastgesteld door de plasmalipideniveaus te evalueren, waaronder totaal cholesterol (TC), triglyceride (TG), lipoproteïnecholesterol met lage dichtheid (LDL-C) en lipoproteïnecholesterol met hoge dichtheid (HDL-C). Netwerkfarmacologie werd toegepast om de actieve ingrediënten van FP en potentiële doelwitten tegen hyperlipidemie te achterhalen. Metabolomica van plasma en lever werden uitgevoerd om differentiële metabolieten en hun overeenkomstige routes te identificeren tussen de normale groep, modelgroep en interventiegroep. De relatie tussen netwerkfarmacologie en metabolomica werd verder geconstrueerd om een uitgebreid beeld te krijgen van het proces van FP tegen hyperlipidemie. De verkregen belangrijkste doeleiwitten werden geverifieerd door moleculaire docking. Deze resultaten weerspiegelden dat FP de plasmalipidespiegels en leverbeschadiging van hyperlipidemie geïnduceerd door een HFD verbeterde. Galluszuur, quercetine en bèta-sitosterol in FP werden aangetoond als de belangrijkste actieve verbindingen. Een totaal van 16 en zes potentiële differentiële metabolieten in respectievelijk plasma en lever bleken betrokken te zijn bij de therapeutische effecten van FP tegen hyperlipidemie door metabolomica. Verder gaf integratieanalyse aan dat de interventie-effecten geassocieerd waren met CYP1A1, AChE en MGAM, evenals de aanpassing van L-kynurenine, corticosteron, acetylcholine en raffinose, voornamelijk met betrekking tot tryptofaanmetabolismeroute. Moleculaire docking zorgde ervoor dat de bovenstaande ingrediënten die inwerken op hyperlipidemie-gerelateerde eiwitdoelen een sleutelrol speelden bij het verlagen van lipiden. Samenvattend bood dit onderzoek een nieuwe mogelijkheid voor het voorkomen en behandelen van hyperlipidemie.
Introduction
Hyperlipidemie is een veel voorkomende stofwisselingsziekte met ernstige gevolgen voor de menselijke gezondheid en is ook de primaire risicofactor voor hart- en vaatziekten1. Onlangs is er een neerwaartse leeftijdsgerelateerde trend voor deze ziekte en jongere mensen zijn vatbaarder geworden vanwege langdurige onregelmatige levensstijlen en ongezonde eetgewoonten2. In de kliniek zijn verschillende medicijnen gebruikt om hyperlipidemie te behandelen. Een van de meest gebruikte geneesmiddelen voor patiënten met hyperlipidemie en gerelateerde atherosclerotische aandoeningen is bijvoorbeeld statines. Langdurig gebruik van statines heeft echter bijwerkingen die niet kunnen worden verwaarloosd, wat leidt tot een slechte prognose, zoals intolerantie, behandelingsresistentie en bijwerkingen 3,4. Deze tekortkomingen zijn extra pijnen geworden voor hyperlipidemiepatiënten. Daarom moeten nieuwe behandelingen voor stabiele lipidenverlagende werkzaamheid en minder bijwerkingen worden voorgesteld.
Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) is op grote schaal gebruikt om ziekten te behandelen vanwege de goede werkzaamheid en weinig bijwerkingen5. Fructus Phyllanthi (FP), de gedroogde vrucht van Phyllanthus emblica Linn. (in de volksmond bekend als amla-bes of Indiase kruisbes), is een beroemd medicijn en voedsel homoloog materiaal van traditionele Chinese en Indiase medicijnen 6,7. Dit geneesmiddel is gebruikt voor het opruimen van warmte, het koelen van bloed en het bevorderen van de spijsvertering, volgens TCM-theorieën8. Moderne farmacologische studies hebben aangetoond dat FP rijk is aan bioactieve verbindingen zoals galluszuren, ellaginezuren en quercetine9, die verantwoordelijk zijn voor een reeks veelzijdige biologische eigenschappen, door op te treden als een antioxidant, een ontstekingsremmer, leverbescherming, een anti-hypolipidaemische, enzovoort10. Recent onderzoek heeft ook aangetoond dat FP de bloedlipiden van patiënten met hyperlipidemie effectief kan reguleren. Variya et al.11 hebben bijvoorbeeld aangetoond dat FP-vruchtensap en het belangrijkste chemische ingrediënt van galluszuur het plasmacholesterol kunnen verlagen en olie-infiltratie in de lever en aorta kunnen verminderen. De therapeutische werkzaamheid was gerelateerd aan de regulatie van FP bij het verhogen van de expressie van peroxisoom proliferator-geactiveerde receptor-alfa en het verminderen van hepatische lipogene activiteit. Het onderliggende mechanisme van FP bij het verbeteren van hyperlipidemie moet echter verder worden onderzocht, omdat de bioactieve ingrediënten vrij uitgebreid zijn. We probeerden het potentiële mechanisme van de therapeutische werkzaamheid van FP te onderzoeken, wat gunstig kan zijn voor de verdere ontwikkeling en het gebruik van dit geneesmiddel.
Momenteel wordt netwerkfarmacologie beschouwd als een holistische en efficiënte techniek om het therapeutische mechanisme van TCM te bestuderen. In plaats van te zoeken naar enkele ziekteverwekkende genen en geneesmiddelen die alleen een individueel doelwit behandelen, wordt een compleet netwerk van geneesmiddelen-ingrediënten-genen-ziekten geconstrueerd om het multi-doelmechanisme van het geneesmiddel met meerdere ingrediënten te vinden met betrekking tot hun uitgebreide behandeling12. Deze techniek is vooral geschikt voor TCM, omdat hun chemische samenstellingen enorm zijn. Helaas kan netwerkfarmacologie alleen worden gebruikt om doelen te voorspellen die in theorie worden beïnvloed door chemische ingrediënten. De endogene metabolieten in het ziektemodel moeten worden geobserveerd om de effectiviteit van netwerkfarmacologie te valideren. De metabolomics-methode, die ontstaat met de ontwikkeling van systeembiologie, is een belangrijk hulpmiddel voor het monitoren van de veranderingen in endogene metabolieten13. De veranderingen in metabolieten weerspiegelen de steady state veranderingen van de gastheer, wat ook een belangrijke indicator is voor het bestuderen van het interne mechanisme. Sommige onderzoekers hebben met succes netwerkfarmacologie en metabolomica geïntegreerd om het interactiemechanisme tussen geneesmiddelen en ziekten te onderzoeken14,15.
Dit artikel onderzoekt de mechanistische basis van FP tegen hyperlipidemie door netwerkfarmacologie en metabolomics-technieken te integreren. Netwerkfarmacologie werd toegepast om de relatie tussen de belangrijkste actieve ingrediënten in FP en moleculaire doelen voor hyperlipidemie te analyseren. Vervolgens werd metabolomics uitgevoerd om de verandering van endogene metabolieten in het diermodel te observeren, wat de geneesmiddelacties op metabolisch niveau kan verklaren. Vergeleken met de toepassing van netwerkfarmacologie of metabonomica alleen, leverde deze geïntegreerde analyse een specifieker en uitgebreider onderzoeksmechanisme op. Bovendien werd de moleculaire koppelingsstrategie gebruikt om de interactie tussen actieve ingrediënten en belangrijke eiwitten te analyseren. In het algemeen zou deze geïntegreerde benadering het gebrek aan experimenteel bewijs voor netwerkfarmacologie en het ontbreken van een endogene mechanisme voor de metabolomics-methode kunnen compenseren en kan het worden gebruikt voor de therapeutische mechanismeanalyse van natuurlijke geneeskunde. Het belangrijkste schematische stroomdiagram van het protocol is weergegeven in figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot de behandeling van dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door de institutionele ethische commissie van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (protocolnummer 2020-36). Mannelijke C57BL/6 muizen (20 ± 2 g) werden gebruikt voor deze studie. De muizen werden verkregen uit een commerciële bron (zie Tabel van Materialen).
1. Op netwerkfarmacologie gebaseerde voorspelling
OPMERKING: De netwerkfarmacologie wordt gebruikt om de actieve ingrediënten en hun belangrijkste doelen van FP tegen hyperlipidemie te voorspellen.
- Selectie van actieve ingrediënten en belangrijkste doelen
- Zoek op het trefwoord "Phyllanthi Fructus" in de farmacologiedatabase van het traditionele Chinese geneeskundesysteem (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) om de lijst met de kandidaat-actieve ingrediënten en doelen van FP te verkrijgen.
OPMERKING: Normaal gesproken worden alleen ingrediënten met orale biologische beschikbaarheid (OB) ≥30% en geneesmiddelachtige (DL) waarden ≥0,18 in de database opgenomen als actieve ingrediënten. - Zoek op het trefwoord "hyperlipidemie" in de GeneCards-database (https://www.genecards.org/), de Online Mendelian Inheritance in Man-database (OMIM; https://omim.org/) en de therapeutische doeldatabase (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) om de respectieve kandidaat-doelen van hyperlipidemie te verkrijgen. Download de spreadsheets van ziektedoelen. Verwijder de herhaalde doelen om de lijst met hyperlipidemiedoelen te verkrijgen.
- Kopieer deze lijsten uit stap 1.1.1 en 1.1.2 naar een nieuwe spreadsheet. Gebruik de functie "Gegevens - Duplicaten identificeren" in de werkbalk om kruispuntdoelen te krijgen. Importeer de kruispuntdoellijst in UniProtKB (http://www.uniprot.org/) om de gen- en eiwitnamen te standaardiseren.
OPMERKING: Deze doelen zijn gerelateerd aan zowel FP als hyperlipidemie. Voorspel daarom deze kruispuntdoelen als de doelen van FP tegen hyperlipidemie.
- Zoek op het trefwoord "Phyllanthi Fructus" in de farmacologiedatabase van het traditionele Chinese geneeskundesysteem (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) om de lijst met de kandidaat-actieve ingrediënten en doelen van FP te verkrijgen.
- Bouw van een eiwit-eiwit interactienetwerk
- Open de STRING-database (https://string-db.org/) 11.5. Plak de kruispuntdoellijst van FP tegen hyperlipidemie in het dialoogvenster 'Lijst met namen'. Selecteer Homo sapiens in "Organismen" en klik op ZOEKEN > DOORGAAN.
OPMERKING: Mensen en muizen hebben zeer vergelijkbare genen. Daarom wordt verdere experimentele verificatie uitgevoerd met muizen. - Wanneer de resultaten beschikbaar zijn, vinkt u de verberg niet-verbonden knooppunten in het netwerk aan in "Geavanceerde instellingen". Stel het hoogste vertrouwen (0,900) in op "minimaal vereiste interactiescore" en klik vervolgens op de knop UPDATE .
- Klik op Exports in de titelbalk en download de korte tabeltekst van het eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk in PNG- en TSV-indeling.
- Open de STRING-database (https://string-db.org/) 11.5. Plak de kruispuntdoellijst van FP tegen hyperlipidemie in het dialoogvenster 'Lijst met namen'. Selecteer Homo sapiens in "Organismen" en klik op ZOEKEN > DOORGAAN.
- Bouw van een drug-component-disease-target netwerk
- Open Cytoscape 3.9.1 (zie Tabel met materialen). Importeer het TSV-indelingsbestand van stap 1.2.3. Optimaliseer de kleur, het lettertype en de zijkant van de netwerkknooppunten via de stijlbalk in het configuratiescherm.
- Gebruik de functie "Netwerk analyseren" voor netwerktopologieanalyse. Verkrijg hubgenen door CytoHubba in Cytoscape. Opzetten van het drug-ingredient-target-disease netwerk.
- GO- en KEGG-verrijkingsanalyse
- Open DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Klik op Analyse starten en plak de doellijst in het linkerdialoogvenster. Selecteer OFFICIEEL GENSYMBOOL in "Select Identifier". Selecteer Homo sapiens in "Selecteer soort". Selecteer Genenlijst in "Lijsttype". Klik op Lijst verzenden.
- Wanneer de resultaten beschikbaar zijn, klikt u op Bovenstaande genenlijst analyseren met een van de DAVID-tools. Vink GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT GOTERM_MF_DIRECT aan in "Gene Ontology" voor GO-functieverrijkingsanalyse. Vink KEGG_Pathway aan in "Pathways" voor KEGG pathway enrichment analysis.
- Klik op Functionele Annotatiegrafiek om de resultaten weer te geven.
OPMERKING: Stel de statistische significantiedrempel van de verrijkingsanalyse in op p < 0,05.
2. Experimenteel ontwerp
- Het FP-waterige extractpreparaat
OPMERKING: FP wordt verwerkt in het laboratorium van professor Lina Xia aan de Chengdu University of TCM8.- Week het gedroogde pfp-poeder (90 g) in 1 l zuiver water in een schone maatkolf van 2 l. Gebruik ultrasone behandeling (in een waterbad van 4 °C, vermogen: 250 W, frequentie: 35 kHz) om gedurende 30 minuten op te lossen. Filtreer de oplossing om het extract te verkrijgen met een dubbellaags, 1 mm x 1 mm steriel medisch gaas. Herhaal de bovenstaande bewerking drie keer om de volledige oplossing van FP te garanderen.
- Gebruik de roterende verdampingsmethode voor verdere concentratie. Stel het toerental in op 50 rpm met een temperatuur van 60 °C gedurende 4 uur. Concentreer het waterige extract tot 100 ml.
- Verdeel het ruwe extract van FP (0,9 g/ml) gelijkmatig in twee delen (50 ml). Eén deel wordt gebruikt als de hooggedoseerde FP-vloeistof (0,9 g / ml). Voeg 50 ml zuiver water toe aan een ander deel en beschouw het als de lage dosis FP-vloeistof (0,45 g / ml). Gebruik de hoge en lage dosis FP-waterige oplossingen voor toediening. Bewaar de vloeistof bij -20 °C tot gebruik.
- Voorbereiding van dieren
- Huis 50 mannelijke C57BL/6 muizen (20 ± 2 g) in een goed geventileerde ruimte bij kamertemperatuur, met een licht-donker cyclus van 12 uur en vrije toegang tot voedsel en zuiver water.
- Wijs de muizen willekeurig toe aan twee groepen: voer 10 muizen met een normaal dieet en 40 muizen met een vetrijk dieet (zie tabel met materialen) om hyperlipidemie te induceren.
OPMERKING: Na 8 weken te hebben gevoerd, werden de muizen gescreend op verdere medicamenteuze interventie. - Trek in de 8e week ongeveer 200 μL bloed uit elke muisbaan. Centrifugeer het bloed gedurende 10 minuten bij 5,733 x g bij 4 °C om plasmamonsters te verkrijgen. Bepaal de TC- en TG-niveaus met in de handel verkrijgbare testkits (zie materiaaltabel).
- Selecteer zes muizen met de meest normale lipideniveaus als de no-treatment control (NC) groep. Selecteer 24 muizen met een significant hoger lipidenniveau als de vetrijke dieetgroep en verdeel ze willekeurig in vier groepen: vetrijke dieet (HFD) -groep, lage dosis FP (FP_L) -groep, hoge dosis FP (FP_H) -groep en positieve controle (PC) -groep.
- Dien maagirrigatie toe aan de FP_L en FP_H groepen met twee doseringen FP (lage dosis, 4,5 g / kg en hoge dosis, 9 g / kg), respectievelijk; maagirrigatie naar de PC-groep met simvastatinetabletten (5 mg/kg; zie materiaaltabel); en maagirrigatie naar de NC- en HFD-groepen met hetzelfde volume fysiologische zoutoplossing eenmaal daags gedurende 4 weken.
OPMERKING: De huidige studie gebruikte de waterige oplossingen van FP en simvastatine voor de behandeling. - In de 12e week, na anesthesie door 1% pentobarbital natrium (30 mg / kg), offeren de muizen van alle groepen. Verzamel ~ 400 μL bloedmonsters uit de orbitale ader van elke muis.
OPMERKING: Stimuleer de tenen en voetzolen van de muizen met een pincet. Als er geen reactie is, blijkt dit adequate anesthesie. - Centrifugeer het bloed gedurende 10 minuten bij 5.733 x g bij 4 °C om plasmamonsters te verkrijgen en bepaal de TC-, TG-, LDL-C- en HDL-C-niveaus met in de handel verkrijgbare testkits (zie materiaaltabel). Verkrijg leverweefselmonsters16 en onderwerp ze aan histopathologische analyse. Gebruik de resterende plasma- en levermonsters voor metabolomics-analyse (stap 3).
OPMERKING: Alle monsters worden bewaard bij -80 °C tot gebruik.
- Histopathologisch leveronderzoek
- Fixeer verse leverweefsels met 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende meer dan 24 uur. Haal het weefsel uit het fixatief en strijk de doelweefsels glad met een scalpel. Plaats het weefsel en het bijbehorende etiket in de dehydrator.
- Uitdrogen in een ethanolgradiënt: 75% alcohol gedurende 4 uur, 85% alcohol gedurende 2 uur, 90% alcohol gedurende 2 uur, 95% alcohol gedurende 1 uur, absolute ethanol gedurende 1 uur, xyleen gedurende 30 minuten. Plaats de weefselcassette in een weefselvorm in paraffinewas gedurende drie wasbeurten, 30 min elk16.
- Plaats de met was doordrenkte weefsels in de weefselinbedding (zie tabel met materialen). Voordat de was stolt, verwijdert u de weefsels uit de dehydrator, plaatst u ze in de ingesloten doos en bevestigt u het bijbehorende label.
- Koel de wasblokken af in een vriestafel van -20 °C, verwijder ze uit het ingesloten frame en snijd het wasblok bij.
- Snijd de bijgesneden wasblokken in secties van 3 μm dik met behulp van een microtoom (zie materiaaltabel). Laat de secties drijven in water van 40 °C, haal ze van de platen en bak ze in een oven van 60 °C. Na het bakken met water en droge was, haal je het eruit en bewaar je het op kamertemperatuur.
- Plaats de secties achtereenvolgens in xyleen I gedurende 10 minuten, xyleen II gedurende 10 minuten, xyleen III gedurende 10 minuten, absolute ethanol I gedurende 5 minuten, absolute ethanol II gedurende 5 minuten, 75% alcohol gedurende 5 minuten en was in water16.
- Kleur de secties met hematoxyline-kleuringsoplossing gedurende 4 minuten, 1% zoutzuuralcoholoplossing (75% alcohol) voor differentiatie, 1% ammoniakwateroplossing terug blauw en was ze met water.
- Bevlek de secties gedurende 2 minuten met eosinekleuringsoplossing en was ze met water.
- Observeer de secties met een optische microscoop met een vergroting van 200x en 400x.
- Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie )LC-MS) analyse
- Identificatie van ingrediënten van KP
OPMERKING: De analyse wordt uitgevoerd met behulp van ultra-high-performance vloeistofchromatografie in combinatie met hybride quadrupole-orbitrap hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; zie tabel met materialen).- Meet nauwkeurig 1 g gedroogd pp-poeder af en doe het in een schone maatkolf van 50 ml.
- Voeg 25 ml 70% methanol toe aan de maatkolf en weeg nauwkeurig. Gebruik ultrasone behandeling (in een waterbad van 4 °C, vermogen: 250 W, frequentie: 35 kHz) gedurende 30 minuten om het oplossen te helpen. Weeg opnieuw nauwkeurig om het verlies na het oplossen nauwkeurig te bepalen en gebruik 70% methanol om het verlies aan te vullen.
OPMERKING: Meet het volume niet, omdat de schaal van de maatkolf niet nauwkeurig is, vooral na het waterbad van 4 °C. - Schud op om volledig te mengen. Gebruik een microporeus membraan van 0,22 μm om te filteren.
- Voorbereiding van plasmamonsters
- Voeg nauwkeurig 100 μL plasma (stap 2.2.7) toe aan een dubbel volume (200 μL) acetonitril in een centrifugebuis van 1,5 ml en vortex het met een vortexvibrator gedurende ten minste 30 s. Volg deze procedure voor alle voorbeelden.
- Centrifugeer alle monsters bij 17.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng de supernatanten na centrifugatie over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml. Droog de supernatanten onder stikstof. Reconstitueer met 200 μL extractieoplosmiddel (acetonitril:water = 4:1 [v/v]).
- Vortex de gereconstitueerde oplossing gedurende ten minste 30 s en gebruik ultrasone behandeling gedurende 10 minuten (in een waterbad van 4 °C, vermogen: 250 W, frequentie: 35 kHz). Centrifugeer bij 17.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Filtreer de supernatanten met 0,22 μm filtermembranen en houd ze op 4 °C voor analyse.
- Voorbereiding van het levermonster
- Homogeniseer 90 mg leverweefsel (stap 2.2.7) gedurende 1 min in ijskoud methanolwater (1:1, v/v, 1 ml) en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 21.500 x g . Breng het supernatant over in centrifugebuizen van 1,5 ml. Volg deze procedure voor alle voorbeelden.
- Extraheer de neerslag opnieuw volgens dezelfde procedure en voeg de supernatanten samen in nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml. Droog de supernatanten onder stikstof. Reconstitueer met 300 μL van het extractieoplosmiddel (methanol:water = 4:1 [v/v]).
- Vortex de gereconstitueerde oplossing gedurende ten minste 30 s en gebruik ultrasone behandeling gedurende 10 minuten (in een waterbad van 4 °C, vermogen: 250 W, frequentie: 35 kHz). Centrifugeer bij 17.200 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Filtreer de supernatanten met 0,22 μm filtermembranen en houd ze op 4 °C voor analyse.
OPMERKING: De gepoolde kwaliteitscontrolemonsters (QC) werden bereid door 10 μL aliquots uit elk plasma- en levermonster te mengen (één per zes monsters).
- Analyseparameters van LC-MS
OPMERKING: De mobiele fase bestaat uit 0,1% mierenzuur (oplosmiddel A) en acetonitril (oplosmiddel B). Breng deze oplosmiddelen over in een schone glazen fles en sluit ze aan op het LC-MS-systeem.- Stel de gradiëntprogramma's van plasmamonsters in het "inlaatbestand" van het LC-MS-systeem als volgt in: 1% B (0-1,5 min), 1%-60% B (1,5-13,0 min), 60%-99% B (13,0-20,0 min), handhaven op 99% B (20,0-25,0 min), 99%-1% B (25,0-25,1 min) en handhaven op 1% B tot 27 min.
- Stel de autosamplercondities van de plasmamonsters in het "inlaatbestand" van het LC-MS-systeem als volgt in: het injectievolume, 2 μL; en het debiet 0,3 ml/min voor elke analyse.
- Stel het gradiëntprogramma van levermonsters in het "inlaatbestand" van het LC-MS-systeem als volgt in: 1% B (0-1 min), 1%-53% B (1-15 min), 53%-70% B (15-30 min), 70%-90% B (30-32 min), 90%-95% B (32-40 min), 95%-1% B (40-42 min), en handhaaf op 1% B tot 45 min.
- Stel de autosamplercondities van de levermonsters in het "inlaatbestand" van het LC-MS-systeem als volgt in: injectievolume, 5 μL; en het debiet 0,3 ml/min voor elke analyse.
- Stel de MS-detectiecondities van zowel de plasma- als de levermonsters in het "MS-tunebestand" van het LC-MS-systeem in. Voer de MS-acquisitie uit met behulp van zowel positieve als negatieve ionisatiemodi.
OPMERKING: De verwarmde elektrospray ionisatieparameters zijn als volgt: sproeispanning: 3,5 kV voor positieve ionisatie en 3,8 kV voor negatieve ionisatie; Mantelgasstroom: 55 arb; hulpgasstroom: 15 arb; sondeverwarmingstemperatuur: 300 °C; en capillaire temperatuur: 350 °C. - Importeer de verzamelde onbewerkte gegevens in de Compound Discoverer-software en stel de methodesjabloon in volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Identificatie van ingrediënten van KP
3. Metabolomische validatie
OPMERKING: De metabolomische profileringsgegevens van plasma- en levermetabolieten worden geïmporteerd in Compound Discoverer-software om de metabole functie-extractie uit te voeren door een algoritme voor moleculaire functie-extractie aan te nemen. Stel de parameters als volgt in: massaafwijking, 5 x 10-6; massabereik, 100-1.500; signaal-ruisverhouding (SNR) drempel, 3; en afwijking van de retentietijd, 0,05. Evalueer de stabiliteit en herhaalbaarheid van metabolomics aan de hand van de relatieve standaarddeviatie (RSD) van QC-piekgebieden.
- Gebruik SIMCA-P-software (zie materiaaltabel) voor multivariate statistische analyse van de integrale waarden verkregen uit LC-MS-bevindingen. Gebruik orthogonale partiële kleinste kwadratenanalyse (OPLS-DA) voor de gemiddeld-gecentreerde gegevens en de modellering van steekproefklassen.
- Beschouw na de OPLS-DA-test de metabolieten, met integraal met variabel belang in de projectiewaarden (VIP) van >1 en een p-waarde van <0,05 uit de t-test van Student als de potentiële differentiële metabolieten.
- Identificeer de verstoorde metabolieten en metabole routes door open databasebronnen, waaronder Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) en MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
- Visualiseer de resultaatweergaven door MetaboAnalyst5.0 en het 'Wu Kong'-platform (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).
4. Moleculaire koppeling
- Download respectievelijk de 3D-structuur van de geselecteerde FP-ingrediënten uit de TCMSP-database. Zoek de namen van de ingrediënten in het zoekvak 'Chemische naam' en download de bijbehorende 3D-structuurbestanden in mol2-indeling.
- Download de kristalstructuren van de belangrijkste doelen uit de AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Zoek de doelnamen in het zoekvak en download de bijbehorende kristalstructuurbestanden in pdb-formaat.
- Importeer ingrediënten en doelstructuren in AutoDockTools-software. Klik op Bewerken > Water verwijderen om watermoleculen te verwijderen. Klik op Bewerken > Hydrogenen > Toevoegen om waterstof toe te voegen. Stel de ingrediënten in als de 'ligand' en voer blind docking uit door de hele doelen als de 'receptor' te selecteren17.
- Voer een waarde in het vak achter "midden" en "grootte" in om de nieuw ontwikkelde ruimte aan te passen, waardoor het mogelijk wordt om het ligand en de receptor volledig te omvatten. Sla de ligand- en receptorbestanden op in pdbqt-indeling.
- Gebruik AutoDock Vina om moleculaire docking uit te voeren. Stel de balk "Receptor" in op de naam van de 'receptor.pdbqt' en de balk "Ligand" op de naam van de 'ligand.pdbqt'. Verkrijg de optimale locatie voor ligandbinding aan de receptor. Noteer de bindingsenergiewaarde op de optimale positie.
OPMERKING: Het koppelingsproces is berekend door het genetische algoritme14. Alle opties voor het uitvoeren van docking waren standaardwaarden. Dockingframes worden automatisch gerangschikt van de hoogste naar de laagste bindingsenergie. - Importeer de dockingbestanden in PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) om het visuele systeemmodel te krijgen. Download de modelbestanden in pse-formaat en importeer ze in PyMOL-software (zie Materiaaltabel) om verdere visualisatie te construeren.
5. Statistische analyse
OPMERKING: Gebruik spss statistische software (zie tabel met materialen) voor gegevensanalyse. Beschouw de waarde van p < 0,05 als statistisch significant.
- Druk de waarden uit als gemiddelde ± standaardafwijking (SD).
- Voer een eenrichtings-ANOVA uit, gevolgd door post hoc minst significant verschil (LSD), Dunnett (in geval van gelijke variantie) of Dunnett's T3 (in geval van ongelijke variantie) om de statistische significantie tussen groepen te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Netwerk farmacologie
In totaal werden 18 potentiële ingrediënten in KP gescreend op basis van hun farmacokinetische en farmacodynamische eigenschappen uit de database en LC-MS-analyse (de totale ionchromatogrammen zijn weergegeven in aanvullende figuur 1). Door relevante literatuur is het gehalte aan galluszuur veel hoger dan andere ingrediënten en is het effectief in het verlagen van lipiden 9,11. Daarom werd dit ingrediënt ook als een potentieel ingrediënt beschouwd. In totaal zijn 19 ingrediënten en 134 ingrediëntgerelateerde doelstellingen van KP opgericht. Alle 19 ingrediënten zijn weergegeven in tabel 1. Om de meest representatieve ingrediënten voor verdere analyse te selecteren, werden deze ingrediënten geïmporteerd in Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine database (BATMAN-TCM; http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/). Volgens het netwerk voor ingrediënt-target-pathway-disease werden sommige bioactieve ingrediënten, zoals galluszuur, quercetine en bèta-sitosterol, geïdentificeerd als de belangrijkste ingrediënten van FP gerelateerd aan hypercholesterolemie en coronaire atherosclerose (aanvullende figuur 2). Onder deze is galluszuur een van de meest bestudeerde fenolzuren; het is het belangrijkste bioactieve ingrediënt dat in KP18 wordt gepresenteerd. Ondertussen is galluszuur ook het ingrediënt met het hoogste gehalte aan FP; De concentratie is meestal 1% tot 3%. El-Hussainy et al.19 hebben aangetoond dat galluszuur hartletsel kan beperken, het lipidenprofiel kan verbeteren en cardiale ontstekingsmarkers kan downreguleren. Het gehalte aan quercetine en bèta-sitosterol is lager, maar sommige studies hebben hun effect op het verlagen van lipiden bewezen. Quercetine, als een belangrijke flavonoïde die veel voorkomt in planten, heeft verschillende eigenschappen, zoals antioxiderende, ontstekingsremmende en cardiovasculaire beschermingseffecten20. Lu et al.21 hebben onderzocht dat het met quercetine verrijkte sap de TC-, LDL-C- en HDL-C-niveaus kan verzwakken bij gezonde personen met milde hypercholesterolemie. Wat bèta-sitosterol betreft, hebben klinische studies aangetoond dat plantensterol hypercholesterolemie en hart- en vaatziekten aanzienlijk kan voorkomen22,23. Althwab et al.24bewezen dat bèta-sitosterol het lipidenprofiel en de atherogene index bij HFD-ratten kon verbeteren. Het is te zien dat het lipidenverlagende effect van FP gerelateerd kan zijn aan deze drie ingrediënten.
Daarnaast werden 1.552 doelen van hyperlipidemie-gerelateerde uit de Genecards-, OMIM- en TTD-databases verzameld. Na het matchen van de 134 FP-gerelateerde doelen met de hyperlipidemie-gerelateerde doelen, werden 62 doelen geïdentificeerd als potentiële doelen voor FP tegen hyperlipidemie (figuur 2A). Alle doorsneden doelen werden genormaliseerd tot hun officiële symbolen, volgens de UniProt-database. Vervolgens werd het PPI-netwerk geconstrueerd door STRING (Figuur 2B) en Cytoscape (Figuur 2C). Door de scores van computationele methoden te combineren, waren de top 10-doelen ESR1, RELA, FOS, EGFR, HIF1A, AR, CCND1, IL6, MAPK8 en MYC. De details zijn weergegeven in aanvullende figuur 3. Al deze 62 doelen vormen de basis van verdere analyse, die is geïntegreerd met de resultaten van metabonomics.
GO- en KEGG-pathways werden uitgevoerd door verrijkingsanalyse. De top 15 pathways, op basis van het aantal targets, werden geselecteerd voor analyse op basis van de p-waarde. De GO-verrijkingsresultaten suggereerden dat de biologische processen en de moleculaire functie van FP tegen hyperlipidemie voornamelijk gerelateerd waren aan genexpressie en eiwitbinding (figuur 2D). De KEGG-verrijking bewees dat FP kon ingrijpen in het proces van lipidenmetabolisme en atherosclerose (figuur 2E), wat betekent dat FP hyperlipidemie verlicht door het lipidenmetabolisme te beïnvloeden.
Het effect van FP op plasmalipideniveaus en leverindex
Om het verbeterde effect van FP op hyperlipidemie te testen, werden eerst de veranderingen in TC, TG, LDL-C, HDL-C en leverindex (de verhouding tussen levergewicht en lichaamsgewicht) gemeten. Vergeleken met de NC-groep vertoonden muizen in de HFD-groep een significante toename van de plasmaspiegels van TC (p < 0,001), LDL-C (p < 0,001) en TG (p < 0,05), wat aangeeft dat langdurige HFD-interventie de lipideniveaus kan verhogen en hyperlipidemie kan veroorzaken (figuur 3).
Na toediening van FP-waterig extract waren de TC-niveaus in FP_L- en FP_H-groepen significant (p < 0,05) verminderd met respectievelijk 18,8% en 12,4% (figuur 3A). De niveaus van LDL-C in FP_L en FP_H groepen waren significant (p < 0,05) verminderd met respectievelijk 13,7% en 21,8% (figuur 3B). Wat het HDL-C-niveau betreft, was de FP_H groep significant (p < 0,01) toegenomen van 1,81 ± 0,08 mmol/l tot 2,65 ± 0,16 mmol/l, vergeleken met de HFD-groep (figuur 3C). Hoewel het TG-niveau onbeduidend bleef na FP-interventie, was het verlaagd in vergelijking met de HFD-groep (figuur 3D). Recente studies hebben aangetoond dat de index van LDL-C / HDL-C ratio een betere index is dan LDL-C of HDL-C alleen bij het voorspellen van hart- en vaatziekten25,26. Vergeleken met de HFD-groep was de LDL-C/HDL-C-ratio significant (p < 0,01) significant verlaagd met 46,3% in de FP_H-groep (figuur 3E), wat betekent dat FP-interventie het slechte cholesterol verlaagde en het goede cholesterolgehalte verhoogde. Als het belangrijkste vetstofwisselingsorgaan weerspiegelt het levergewicht tot op zekere hoogte de vetopslag bij muizen27. Na 12 weken waren de leverindexen in de FP_L groep en FP_H groep significant (p < 0,01) verminderd in vergelijking met de HFD-groep (figuur 3F). De PC-groep vertoonde ook verschillende gradaties van reductie in deze indicatoren hierboven, wat aantoonde dat FP vergelijkbare effecten had als statines, en het beschermende effect vertoonde een dosis-responsrelatie.
Verschillende klinische studies toonden aan dat, na het nemen van extract of hele FP gedurende een tijdje, TC- en LDL-C-niveaus aanzienlijk waren verlaagd. Ondertussen werd het HDL-C-niveau opmerkelijk verhoogd bij langdurige toediening van KP28,29. Nambiar en Shetty30 ontdekten dat FP-sap geoxideerde lipoproteïnen met lage dichtheid kon verminderen, waardoor het risico op atherosclerose aanzienlijk werd verminderd. Gopa et al.31 evalueerden het hypolipidemische effect van FP bij patiënten met hyperlipidemie en vergeleken het met simvastatine. Behandeling met FP resulteerde in een aanzienlijke vermindering van TC, LDL-C en TG, en een significante toename van HDL-C-niveaus, vergelijkbaar met die van simvastatine. In dit onderzoek hadden FP en simvastatine ook vergelijkbare therapeutische effecten, en het LDL-C-verlagende effect en de leverherstellende werking van FP waren superieur aan simvastatine.
Histopathologische waarneming van de lever
Het effect van FP op leversteatose bij HFD-muizen is weergegeven in figuur 4. De leverpathologische secties in de NC-groep drukten regelmatige hepatocytenmorfologie uit, duidelijk gedefinieerde celgrenzen en geen duidelijke vetvacuolen (figuur 4A,B). Ter vergelijking: de HFD-groep had vetvacuolen van verschillende grootte rond de bloedvaten en vertoonde duidelijke leverschade, zoals gekenmerkt door celzwelling, vetdegeneratie, verlies van cellulaire grenzen, cellulaire contractie en hepatocytennecrose (figuur 4C, D). Zoals te zien is in figuur 4E,F, zou FP-interventie leversteatose kunnen verbeteren, vooral in de FP_L groep. Vergeleken met de HFD-groep hadden de FP_H (figuur 4G,H) en pc-groep (figuur 4I,J) een zekere mate van herstel van de levercelstructuur, vetdegeneratie en vetvacuolereductie. Dit betekent dat FP-interventie leverweefsel kan beschermen tegen HFD-geïnduceerde leverbeschadiging.
Metabolomics profilering
Volgens plasmalipideniveau en leverhistopathologische observatie had hoge dosis FP een beter effect op hyperlipidemie dan lage dosis FP. Daarom werden NC-, HFD- en FP_H-groepen gekozen om hun verandering in het metabolismeniveau te analyseren. De totale ionchromatogrammen van QC-monsters werden weergegeven in aanvullende figuur 4. Om de nauwkeurigheid van de gegevens te garanderen, werden de functies met RSD-waarden >30% uit alle QC-monsters verwijderd. PCA- en ionchromatogrammen gaven aan dat QC-monsters stabiel waren tijdens het proces (aanvullende figuur 5). Een totaal van 626 en 562 kenmerken in het plasma en de lever werden bepaald na de voorbewerking van de gegevens. Onder hen werden respectievelijk 120 en 124 metabolieten in het plasma en de lever geïdentificeerd op basis van de KEGG-database. OPLS-DA-analyse werd gebruikt om de scheiding tussen de NC-, HFD- en FP_H-groepen te onderzoeken. OPLS-DA toonde aan dat dezelfde groepsmonsters bij elkaar werden geclusterd en verschillende groepsmonsters goed onderscheid maakten (figuur 5A,B). Deze resultaten gaven aan dat de HFD- en FP-interventies duidelijke metabole variaties veroorzaakten.
Om de potentiële differentiële metabolieten te identificeren die bijdroegen aan het metabole onderscheid, werden verdere OPLS-DA- en t-testanalyses van respectievelijk NC versus HFD en HFD versus FP_H uitgevoerd. De OPLS-DA-resultaten onderscheidden zich goed en toonden significante verschillen tussen verschillende groepen modellen14 (aanvullende figuur 6). Op basis van VIP (Variabele belangrijk in projectie) >1 en p < 0,05, vertoonden 32 metabolieten in het plasma differentiatie tussen de NC- en HFD-groep en 72 metabolieten vertoonden differentiatie tussen de HFD- en FP_H-groep. In de lever vertoonden 38 metabolieten differentiatie tussen de NC- en HFD-groep en 17 metabolieten vertoonden differentiatie tussen de HFD- en FP_H-groep. Ten slotte werden in totaal 16 en 6 metabolieten geïdentificeerd als differentiële metabolieten in FP-beïnvloedende HFD-muizen in respectievelijk het plasma en de lever (aanvullende figuur 7). De informatie over deze metabolieten is weergegeven in tabel 2.
Om de variatie in metabolieten tussen de drie groepen te visualiseren, werden heatmaps uitgezet door MetaboAnalyst 5.0. Alle differentiële metabolieten in het plasma en de lever waren veranderd in de HFD-groep en de meeste werden omgekeerd in de FP-groep, wat aangeeft dat FP-interventie de metabole stoornis kan verbeteren (figuur 5C, D). Verder werden differentiële metabolieten geïmporteerd in MetaboAnalyst 5.0 om de metabole routes van FP in HFD-muizen te onderzoeken. Op basis van p < 0,05 en een pathway impact >0,10 werd het tryptofaanmetabolisme significant beïnvloed in het plasma, en de metabolieten gerelateerd aan deze route waren D-tryptofaan en L-kynurenine (figuur 5E). Jung et al.32 onderzochten dat langdurige hyperlipidemie de serumspiegels van kynurenine kan verlagen. Het metabolisme van taurine en hypotaurine werd significant beïnvloed in de lever en de gerelateerde metaboliet gerelateerde was taurine (figuur 5F). Taurine is een belangrijk en noodzakelijk aminozuur in het dierlijke lichaam; Dong et al.33 bestudeerden dat taurine de schade aan bloedlipiden mild kon verminderen en het risico op atherosclerose veroorzaakt door HFD kon verlagen. In dit onderzoek verhoogde FP-interventie het gehalte aan L-kynurenine en taurine, wat positief gerelateerd is aan de verlaging van lipideniveaus, ter ondersteuning van de effectiviteit van FP tegen hyperlipidemie.
Geïntegreerde analyse van netwerkfarmacologie en metabolomica
Een geïntegreerde strategie van netwerkfarmacologie in combinatie met metabolomica is steeds onmisbaarder geworden bij het bestuderen van ziektemechanismen en interventiestrategieën. De relevantie tussen netwerkfarmacologie en metabolomica met beperkt bewijs werd vastgesteld. Om een volledig beeld te krijgen van het mechanisme van FP tegen hyperlipidemie, werden de interactienetwerken op basis van netwerkfarmacologie en metabolomica geconstrueerd. Differentiële metabolieten werden geïmporteerd in de MetScape-plug-in in Cytoscape en kwamen overeen met de hubgenen die in de netwerkfarmacologie werden geïdentificeerd om de verbindingen -reactie-enzym-gennetwerken te verzamelen (figuur 6). Zoals weergegeven in tabel 3, waren L-kynurenine en corticosteron in plasmametabolieten gerelateerd aan CYP1A1, dat lipideperoxidatie kan katalyseren en niet-alcoholische leververvetting kan induceren34,35; De getroffen routes waren respectievelijk tryptofaanmetabolisme en steroïde hormoonbiosynthese. Acetylcholine was gerelateerd aan AChE en beïnvloedde het glycerofosfolipidenmetabolisme. In levermetabolieten waren MGAM en raffinose gerelateerd aan het galactosemetabolisme. Verschillende studies hebben aangetoond dat de inname van oligosachariden uit de raffinosefamilie metabole stoornissen bij HFD-muizen zou kunnen verbeteren36.
Verder is het ingrediënten-targets-metabolieten-pathways netwerk geconstrueerd (figuur 7). In de ingrediënten verbond quercetine de meeste randen, wat aangeeft dat quercetine van FP de belangrijkste rol speelt bij het verlagen van lipiden. De hierboven geïntegreerde analyse onthulde de belangrijkste doelen, metabolieten en routes van FP tegen hyperlipidemie, die de basis zouden kunnen vormen voor verdere studie van het therapeutische mechanisme en de klinische toepassing van dit geneesmiddel.
Moleculaire docking
Om de mogelijkheid van interactie tussen de geselecteerde ingrediënten en de belangrijkste doelen verder te onderzoeken, werd moleculaire docking gebruikt om hun ligand-actieve site-interacties te analyseren. AutoDock Vina-software (zie Materiaaltabel) werd gebruikt om moleculaire docking uit te voeren en de eerste dockinghouding werd uitgevoerd volgens de rang van de scorefunctie. De koppelingsresultaten zijn weergegeven in figuur 8.
In de geïntegreerde analyse waren CYP1A1, AChE en MGAM gerelateerd aan differentiële metabolieten; Ze bouwden bruggen tussen doelwitten en metabolieten. Verdere moleculaire docking werd uitgevoerd om de relatie tussen het doelwit en de ingrediënten te verifiëren. De resultaten van ingrediëntkoppeling met CYP1A1 waren als volgt: galluszuur vormde vier waterstofbruggen door de aminozuurresiduen Asn-185, Tyr-187, Asn-219 en His-500 en vormde π-π stapelinteractie door het aminozuurresidu Tyr-187 (figuur 8A); quercetine vormde drie waterstofbruggen via Asn-185, Asn-219 en His-500, hydrofobe interactie en π-π stapelinteractie door Tyr-187 (figuur 8B); bèta-sitosterol vormde vier waterstofbruggen via Arg-362, Ser-363, Leu-365 en Arg-464, en hydrofobe interactie via Glu-369 en Ile-439 (figuur 8C). De bindingsenergieën waren respectievelijk 5,3, 7,0 en 7,3 kcal/-mol. In de interactie met AChE werd galluszuur gestabiliseerd door waterstofbruggen met Arg-237, Arg-238 en Arg-480 (figuur 8D); quercetine werd gestabiliseerd door waterstofbruggen met Arg-237 en Phe-474, door hydrofobe interactie met Phe-157 en door π-π stapelinteractie met Tyr-478 (figuur 8E); bèta-sitosterol werd gestabiliseerd door hydrofobe interactie met Phe-157, Val-244, Ile-248, Phe-474, Ala477 en TYR478 (figuur 8F). De bindingsenergieën waren respectievelijk 5,0, 6,5 en 8,0 kcal/- mol. In de interactie met MGAM werd galluszuur gestabiliseerd door waterstofbruggen met Ile-1716, Gly-1747 en Trp-1749, en door hydrofobe interactie met Tyr-1715 en Trp-1749 (figuur 8G); quercetine werd gestabiliseerd door waterstofbruggen met Arg-1311, Thr-1726, Gln-1731 en Trp-1752, door waterstofbruggen met Arg-1730 en door π-π stapelen met His-1727 (figuur 8H); bèta-sitosterol werd gestabiliseerd door hydrofobe interactie met Pro-1159, Trp-1355, Phe-1427 en Phe-1560, De bindingsenergieën waren respectievelijk 5,9, 8,1 en 6,9 kcal / mol. Gedetailleerde informatie over de interacties en bindingsaffiniteiten is weergegeven in tabel 4. Meerdere bindingsplaatsen en hoge bindingsenergieën verklaren de hoge affiniteiten tussen ingrediënten en eiwitdoelen, waarbij wordt geverifieerd dat deze ingrediënten de rol spelen van het verlagen van lipiden door in te werken op hyperlipidemie-gerelateerde doelen.
Figuur 1: Schematisch stroomschema van de geïntegreerde strategie. Hub-ingrediënten en -genen werden geëxtraheerd door netwerkfarmacologie (deel 1). Differentiële metabolieten van FP tegen hyperlipidemie werden geanalyseerd door plasma- en levermetabolomica (deel 2). Belangrijke doelwitten, metabolieten en routes werden geïdentificeerd en gekoppeld op basis van een geïntegreerde analyse van deel 1 en deel 2 (deel 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Doelscreening, netwerkconstructie en verrijkingsanalyse van het effect van FP tegen hyperlipidemie . (A) Venn-diagram van de FP-hyperlipidemiedoelen. (B) Potentieel actief geneesmiddel-ingrediënten-targets-ziektenetwerk: verschillende kleursymbolen zoals hier vermeld: ziekte (rood), geneesmiddel (blauw), ingrediënten (groen) en doelwitten (geel). (C) PPI-netwerk door STRING. D) analyse van de verrijking van het GO-traject. (E) KEGG-routeverrijkingsanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het effect van FP op plasmalipideniveaus en leverindex bij muizen met HFD-geïnduceerde hyperlipidemie (n = 6). (A) Niveaus van TC. b) LDL-C-niveaus. (C) HDL-C-niveau. (D) TG-niveau. (E) De LDL-C/HDL-C-verhouding. (F) Leverindexen.*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistisch significante verschillen werden geëvalueerd met behulp van een eenrichtings-ANOVA gevolgd door Dunnett's meervoudige vergelijkingstest of post-hocanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het effect van FP op leverweefsel bij muizen met HFD-geïnduceerde hyperlipidemie (H&E-kleuring). (A,B) NC-groep, (C,D) HFD-groep, (E,F) FP_L groep, (G,H) FP_H groep, (I,J) PC-groep (n = 6). Schaalbalk: (A,C,E = 200 μm; B,D,F = 50 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De OPLS-DA score plots, heat maps en metabole routes van differentiële metabolieten. De OPLS-DA score plots van FP op HFD muizen in het plasma (A) en de lever (B). De heatmaps van differentiële metabolieten in het plasma (C) en de lever (D). De metabole routes van differentiële metabolieten in het plasma (E) en de lever (F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: De compound-reaction-enzyme-gen netwerken van de belangrijkste metabolieten en targets. Laaggradenknooppunten zijn verwijderd. De rode zeshoeken, blauwe cirkels, ronde groene rechthoeken en grijze diamanten vertegenwoordigen respectievelijk de actieve verbindingen, genen, eiwitten en reacties. De belangrijkste doelwitten en metabolieten werden uitvergroot. De paden met de witte achtergrond worden aanzienlijk gereguleerd in het plasma. Het pad met de grijze achtergrond is aanzienlijk gereguleerd in de lever. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Het ingrediënten-doelen-metabolieten-pathways netwerk. Hoe donkerder de kleur, hoe meer de verbonden randen, wat betekent dat het knooppunt belangrijker is in dit netwerk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: De interactiediagrammen van KP-ingrediënten en de belangrijkste doelen . (A) Galluszuur dat inwerkt op CYP1A1. B) quercetine die inwerkt op CYP1A1. C) Bèta-sitosterol inwerkend op CYP1A1. (D) Galluszuur dat inwerkt op AChE. E) Quercetine dat inwerkt op AChE. (F) Beta-sitosteroling act op AChE. (G) Galluszuur dat inwerkt op MGAM. H) Quercetine dat inwerkt op MGAM. (I) Bèta-sitosterol inwerkend op MGAM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Overzicht van FP tegen hyperlipidemie resultaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: De geselecteerde ingrediënten van FP-waterig extract. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: De differentiële metabolieten tussen de drie groepen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: De informatie over de belangrijkste doelwitten, metabolieten en routes. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Bindingsplaatsen en werkingskrachten tussen KP-ingrediënten en doeleiwitten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende figuur 1: De positieve en negatieve ionchromatogrammen van FP-waterig extract. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Het FP-netwerk voor ingrediënten-doel-pathway-ziekten door BATMAN-TCM. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: De frequentieanalyse van hubgenen in de netwerkfarmacologie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 4: Ionchromatogrammen van plasma- en lever-QC-monsters. De representatieve positieve (A) en negatieve (B) ionchromatogrammen van plasma QC monsters. De representatieve positieve (C) en negatieve (D) ionchromatogrammen van lever QC monsters. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 5: De PCA-score plots van plasma (A) en lever (B) QC-monsters. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 6: De OPLS-DA score plots van plasma (A en B) en lever (C en D) monsters. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 7: Venn-diagrammen van de differentiële metabolieten in plasma (A) en lever (B) monsters. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de afgelopen jaren is de incidentie van hyperlipidemie toegenomen, voornamelijk als gevolg van langdurige ongezonde eetgewoonten. TCM en zijn chemische ingrediënten hebben verschillende farmacologische activiteiten, die de afgelopen jaren op grote schaal zijn bestudeerd37,38. FP is een soort fruitbron, gebruikt als medicijn en voedsel, en heeft een belangrijk potentieel voor de behandeling van hyperlipidemie. Het potentiële therapeutische mechanisme van FP tegen hyperlipidemie moet echter verder worden bestudeerd.
Netwerkfarmacologie evalueert polyfarmacologische effecten van geneesmiddelen op moleculair niveau en voorspelt de interactie van natuurlijke producten en eiwitten om het belangrijkste mechanisme te bepalen39. De eerste stap is het selecteren van de actieve ingrediënten en de belangrijkste doelen van het medicijn. In dit onderzoek werden negen actieve ingrediënten en 62 hubgenen gevonden. Om het moleculaire mechanisme van FP op hyperlipidemie verder te begrijpen, werden PPI en netwerkdoelen voor ingrediënten vastgesteld op basis van netwerkfarmacologieanalyse. Om het bereik van de belangrijkste ingrediënten en doelen te beperken, zijn drie belangrijke ingrediënten (galluszuur, quercetine en bèta-sitosterol) met betrekking tot hypercholesterolemie en coronaire atherosclerose opgericht door BATMAN-TCM. Al deze ingrediënten kunnen LDL-C-niveaus verlagen of HDL-C-niveaus verhogen, waardoor de specifieke effecten van FP op hyperlipidemie worden gevalideerd. Bovendien is volgens KEGG-verrijkingsanalyse de functie van FP op hyperlipidemie gerelateerd aan de activiteit van de lipide- en atheroscleroseroute. Hoewel deze methode te veel afhankelijk is van de database en experimentele verificatie ontbreekt, heeft het theoretische waarde en biedt het ideeën voor later experimenteel verificatieonderzoek.
Voor verdere experimentele validatie werden muizen gedurende 8 weken gevoed met een vetaangevuld dieet om hyperlipidemie te induceren. De resultaten toonden aan dat plasma TC, LDL-C en TG niveaus significant verhoogd waren. Hoewel het niveau van HDL-C aanzienlijk afnam, nam de verhouding van LDL-C tot HDL-C aanzienlijk toe. De histopathologische waarnemingen toonden aan dat het leverweefsel van HFD-muizen ernstig beschadigd was, maar er was geen significante toename van de leverindex; Het kan zijn dat veranderingen in lichaamsgewicht en visceraal gewicht langer duren. De lipiden en leververanderingen toonden voldoende het interventie-effect van FP op hyperlipidemie. Het interne mechanisme van het interventie-effect moet echter nog verder worden onderzocht.
Metabolomics biedt een lijst van potentiële metabolieten en gerelateerde routes, die gericht zijn op het verkennen van het mechanisme van metabole ziekten en de werking van therapeutische geneesmiddelen40. Het resultaat van metabolomics kan worden beïnvloed door het type monster. Gezien de pathogene kenmerken van hyperlipidemie werden plasma- en levermonsters gekozen voor metabonomische analyse in dit onderzoek. Volgens de resultaten van OPLS-DA werden de metabolieten van de NC-, HFD- en FP_H-groepen goed gediscrimineerd. In totaal werden 16 differentiële metabolieten gevonden in het plasma en 6 differentiële metabolieten werden gevonden in de lever. Er waren meer aangetaste metabolieten in het plasma dan in de lever, wat bewijst dat bloed de belangrijkste plaats is van metabole stoornissen veroorzaakt door hyperlipidemie. FP-interventie kan de verandering van deze metabolieten onder invloed van HFD omkeren. Bovendien werden deze differentiële metabolieten geïmporteerd in de KEGG-database. De significante metabole routes van differentiële metabolieten in het plasma waren tryptofaanmetabolisme en in de lever waren taurine- en hypotaurinemetabolisme. In dit onderzoek verhoogde FP-interventie het gehalte aan L-kynurenine van tryptofaanmetabolisme en taurinegehalte van taurine- en hypotaurinemetabolisme, wat betekent dat FP effectief zou kunnen zijn bij het gunstig aanpassen van metabole stoornissen en hyperlipidemie. De metabolomics-analyse onthulde welke metabolieten gerelateerd waren aan hyperlipidemie of FP-interventie en bepaalde het downstream-mechanisme van het FP-effect.
Door het resultaat van netwerkfarmacologie te combineren met metabolomica, werden drie belangrijke doelen (CYP1A1, AChE en MGAM) geïdentificeerd in de compound-reaction-enzym-gen-netwerken. Volgens moleculaire dockinganalyse vertoonden deze doelen hoge affiniteiten met FP-ingrediënten (galluszuur, quercetine en bèta-sitosterol). Vier metabolieten (L-kynurenine, corticosteron, acetylcholine en raffinose) en vier gerelateerde routes (tryptofaanmetabolisme, steroïde hormoonbiosynthese, glycerofosfolipidenmetabolisme en galactosemetabolisme) werden geïdentificeerd als de belangrijkste metabolieten en metabole routes. Onder deze, quercetine was geassocieerd met de meeste doelen, en tryptofaan metabolisme verscheen in zowel metabonomics en geïntegreerde resultaten. Ze spelen de meest essentiële rol in het therapeutische effect van FP tegen hyperlipidemie. Moleculair koppelingsresultaat toonde aan dat CYP1A1, AChE en MGAM hoge affiniteiten hebben met ingrediënten. De bovenstaande resultaten bewijzen dat deze gescreende doelen nauw verband houden met het therapeutische effect van FP.
In het huidige onderzoek werden galluszuur, quercetine en bèta-sitosterol geïdentificeerd als FP-actieve ingrediënten in de richting van anti-hyperlipidemie, en tryptofaanmetabolisme is de belangrijkste metabole route van FP-therapie bij HFD-muizen. Het overzicht van het resultaat is weergegeven in figuur 9. Dit onderzoek bood gegevens en theoretische ondersteuning voor verdere studies van mechanismen en bood een basis voor de klinische toepassing van FP-geneeskunde. Het bewees ook dat natuurlijke voeding een veelbelovende optie kan zijn met geweldige vooruitzichten in de klinische praktijk. Er zijn echter nog steeds enkele tekortkomingen in dit onderzoek. Het therapeutische effect van het werkzame bestanddeel alleen op hyperlipidemie is niet geverifieerd. Bovendien is het traject van de belangrijkste doelen niet bestudeerd; Het heeft ook verdere systematische moleculaire biologische experimenten nodig om het nauwkeurige mechanisme te verifiëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door het Product Development and Innovation Team van TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) en Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 101-3B Oven | Luyue Instrument and Equipment Factory | \ | |
| 80312/80302 Glass Slide | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| 80340-1630 Cover Slip | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A998 | Version 1.5.6 |
| ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Aethanol | Fisher Chemical | A995 | Version 3.0 |
| Ammonia Solution | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1336-21-6 | Version 3.9.1 |
| AutoDockTools | Scripps Institution of Oceanography | \ | |
| BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | \ | |
| Compound Discoverer | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | \ | |
| DM500 Optical Microscope | Leica | \ | |
| DV215CD Electronic Balance | Ohaus Corporation ., Ltd | T15A63 | |
| Ethyl Alcohol | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 64-17-5 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A118 | |
| HDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A112-1-1 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL700B | |
| High Fat Diet | ENSIWEIER | 202211091031 | |
| Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge | Hitachi., Ltd. | \ | |
| Homogenizer | Oulaibo Technology Co., Ltd | \ | |
| Hydrochloric Acid | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 7647-01-0 | |
| Image-forming System | LIOO | \ | |
| JB-L5 Freezer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JB-L5 Tissue Embedder | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JK-5/6 Microtome | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JT-12S Hydroextractor | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| KQ3200E Ultrasonic Cleaner | Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd | \ | |
| LDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A113-1-1 | |
| Male C57BL/6 Mice | SBF Biotechnology Co., Ltd. | \ | Version 2.3.2 |
| Neutral Balsam | Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd | 10021190865934 | |
| Pure Water | Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd | GB19298 | |
| PyMOL | DeLano Scientific LLC | \ | Version 14.1 |
| RE-3000 Rotary Evaporator | Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd | \ | |
| RM2016 Pathological Microtome | Shanghai Leica Instruments Co., Ltd | \ | Version 26.0 |
| SIMCA-P | Umetrics AB | \ | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme., Ltd | 14202220051 | |
| SPSS | International Business Machines Corporation | \ | |
| TC Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
| TG Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
| UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Vortex Vibrator | Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. | LC-Vortex-P1 | |
| Xylene | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1330-20-7 |
References
- Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
- Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
- Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
- Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
- Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
- Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
- Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
- Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
- Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
- Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
- Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
- Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
- Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
- Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
- Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
- Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
- Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
- Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
- El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
- Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
- Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
- Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
- Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
- Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
- Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
- Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
- Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
- Antony, B., Merina, B., Sheeba, V.
- Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
- Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
- Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
- Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
- Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
- Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
- Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
- Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
- Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).
