Summary
현재 프로토콜은 네트워크 약리학 예측 및 대사체학 검증을 기반으로 고지혈증에 대한 Fructus Phyllanthi의 주요 표적 및 메커니즘을 탐색하기 위한 통합 전략을 설명합니다.
Abstract
고지혈증은 전 세계적으로 심혈관 질환 및 간 손상의 주요 위험 요소가 되었습니다. Fructus Phyllanthi(FP)는 중국 전통 의학(TCM) 및 인도 의학 이론에서 고지혈증에 효과적인 약물이지만 잠재적인 메커니즘은 추가 탐색이 필요합니다. 본 연구는 네트워크 약리학 예측과 대사체학 검증을 결합한 통합 전략을 기반으로 고지혈증에 대한 FP의 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 합니다. 총 콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C) 및 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C)을 포함한 혈장 지질 수준을 평가하여 고지방 식이(HFD) 유도 마우스 모델을 확립했습니다. FP의 유효성분과 고지혈증에 대한 잠재적 표적을 찾기 위해 네트워크 약리학을 적용했습니다. 혈장과 간의 대사체학을 수행하여 정상군, 모델군, 중재군 간의 차등 대사산물과 해당 경로를 확인하였다. 네트워크 약리학과 대사체학 사이의 관계는 고지혈증에 대한 FP의 과정에 대한 포괄적인 관점을 얻기 위해 추가로 구성되었습니다. 얻어진 핵심 표적 단백질은 분자 도킹에 의해 검증되었다. 이러한 결과는 FP가 HFD에 의해 유발된 고지혈증의 혈장 지질 수준 및 간 손상을 개선시킨다는 것을 반영하였다. FP의 갈산, 케르세틴 및 베타-시토스테롤이 주요 활성 화합물로 입증되었습니다. 혈장과 간에서 각각 총 16개 및 6개의 잠재적 차등 대사산물이 대사체학에 의한 고지혈증에 대한 FP의 치료 효과에 관여하는 것으로 밝혀졌습니다. 또한, 통합 분석에 따르면 중재 효과는 CYP1A1, AChE 및 MGAM뿐만 아니라 주로 트립토판 대사 경로를 포함하는 L-키누레닌, 코르티코스테론, 아세틸콜린 및 라피노스의 조정과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 분자 도킹은 고지혈증 관련 단백질 표적에 작용하는 위의 성분이 지질을 낮추는 데 중요한 역할을 하도록 했습니다. 요약하면, 이 연구는 고지혈증을 예방하고 치료할 수 있는 새로운 가능성을 제시했습니다.
Introduction
고지혈증은 인체 건강에 심각한 영향을 미치는 흔한 대사 질환이며 심혈관 질환의 주요 위험 인자이기도합니다 1. 최근 이 질환은 연령과 관련하여 감소하는 추세를 보이고 있으며, 장기간의 불규칙한 생활 습관과 건강에 해로운 식습관으로 인해 젊은 층이 더 취약해지고 있다2. 클리닉에서는 고지혈증 치료에 다양한 약물이 사용되고 있습니다. 예를 들어, 고지혈증 및 관련 죽상동맥경화성 질환 환자에게 가장 일반적으로 사용되는 약물 중 하나는 스타틴입니다. 그러나 스타틴을 장기간 사용하면 무시할 수 없는 부작용이 있어 불내성, 치료 저항성, 부작용 등 예후가 좋지 않다 3,4. 이러한 단점은 고지혈증 환자에게 추가적인 통증이 되었습니다. 따라서 안정적인 지질 저하 효능과 부작용 감소를 위한 새로운 치료법이 제안되어야 합니다.
중국 전통 의학(Traditional Chinese Medicine, TCM)은 효능이 좋고 부작용이 거의 없어 질병 치료에 널리 사용되어 왔다5. Fructus Phyllanthi (FP), Phyllanthus emblica Linn의 말린 과일. (일반적으로 amla 베리 또는 인도 구스베리로 알려짐)는 중국 전통 및 인도 의약품 6,7의 유명한 의약품 및 식품 상동 소재입니다. 이 약은 TCM 이론8에 따라 열을 맑게하고, 혈액을 식히고, 소화를 촉진하는 데 사용되어 왔습니다. 현대의 약리학 연구에 따르면 FP는 갈산, 엘라그산, 케르세틴과 같은 생리활성 화합물이 풍부하여 항산화제, 항염증제, 간 보호제, 항고지혈증 등의 역할을 하여 다양한 생물학적 특성을 담당한다10. 최근 연구에 따르면 FP는 고지혈증 환자의 혈중 지질을 효과적으로 조절할 수 있습니다. 예를 들어, Variya et al.11은 FP 과일 주스와 갈산의 주요 화학 성분이 혈장 콜레스테롤을 감소시키고 간과 대동맥의 기름 침투를 감소시킬 수 있음을 입증했습니다. 치료 효능은 과산화소체 증식제 활성화 수용체-알파의 발현을 증가시키고 간 지방 생성 활성을 감소시키는 FP의 조절과 관련이 있었습니다. 그러나 고지혈증 개선에 대한 FP의 기본 메커니즘은 생리 활성 성분이 상당히 광범위하기 때문에 추가로 조사해야 합니다. 우리는 이 약의 추가 개발 및 활용에 도움이 될 수 있는 FP의 치료 효능의 잠재적 메커니즘을 탐구하고자 했습니다.
현재 네트워크 약리학은 TCM의 치료 메커니즘을 연구하는 전체론적이고 효율적인 기술로 간주됩니다. 개별 표적만을 치료하는 단일 질병 유발 유전자 및 약물을 찾는 대신, 포괄적인 치료와 관련하여 다중 성분 약물의 다중 표적 메커니즘을 찾기 위해 완전한 약물-성분-유전자-질병 네트워크를 구축한다12. 이 기술은 화학 성분이 방대하기 때문에 TCM에 특히 적합합니다. 안타깝게도 네트워크 약리학은 이론적으로 화학 성분의 영향을 받는 표적을 예측하는 데만 사용할 수 있습니다. 네트워크 약리학의 효과를 검증하기 위해 질병 모델의 내인성 대사산물을 관찰해야 합니다. 시스템 생물학의 발전과 함께 등장한 대사체학(metabolomics) 방법은 내인성 대사산물의 변화를 모니터링하는 중요한 도구이다13. 대사 산물의 변화는 숙주의 정상 상태 변화를 반영하며, 이는 내부 메커니즘을 연구하는 데 중요한 지표이기도 합니다. 일부 연구자들은 약물과 질병 사이의 상호 작용 메커니즘을 탐구하기 위해 네트워크 약리학 및 대사체학을 성공적으로 통합했습니다14,15.
이 기사는 네트워크 약리학과 대사체학 기술을 통합하여 고지혈증에 대한 FP의 기계론적 기초를 탐구합니다. FP의 주성분과 고지혈증에 대한 분자 표적 간의 관계를 분석하기 위해 네트워크 약리학을 적용하였다. 이어서, 동물 모델에서 내인성 대사 산물의 변화를 관찰하기 위해 대사체학을 수행하였으며, 이는 대사 수준에서 의약 작용을 설명할 수 있습니다. 네트워크 약리학 또는 대사노학의 단독 적용과 비교할 때, 이 통합 분석은 보다 구체적이고 포괄적인 연구 메커니즘을 제공했습니다. 또한 분자 도킹 전략을 사용하여 활성 성분과 주요 단백질 간의 상호 작용을 분석했습니다. 일반적으로 이러한 통합 접근법은 네트워크 약리학에 대한 실험적 증거의 부족과 대사체학 방법에 대한 내인성 메커니즘의 부족을 보완할 수 있으며 자연 의학의 치료 메커니즘 분석에 사용할 수 있습니다. 프로토콜의 주요 개략도 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 취급과 관련된 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 청두 중국 전통 의학 대학 가이드에 따라 수행되었으며 청두 한의학 대학 기관 윤리 위원회(프로토콜 번호 2020-36)의 승인을 받았습니다. 수컷 C57BL/6 마우스(20 ± 2 g)를 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료 표 참조).
1. 네트워크 약리학 기반 예측
참고: 네트워크 약리학은 고지혈증에 대한 FP의 활성 성분과 주요 표적을 예측하는 데 사용됩니다.
- 활성 성분 및 주요 목표 선택
- 중국 전통 의학 시스템의 약리학 데이터베이스(TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php)에서 키워드 "Phyllanthi Fructus"를 검색하여 FP의 후보 활성 성분 및 표적 목록을 얻습니다.
참고: 일반적으로 경구 생체이용률(OB)이 ≥30%이고 약물 유사(DL) 값이 ≥0.18인 성분만 활성 성분으로 포함됩니다. - GeneCards 데이터베이스(https://www.genecards.org/), Online Mendelian Inheritance in Man 데이터베이스(OMIM; https://omim.org/) 및 치료 대상 데이터베이스(TTD; http://db.idrblab.net/ttd/)에서 키워드 "고지혈증"을 검색하여 고지혈증의 각 후보 표적을 얻습니다. 질병 표적의 스프레드시트를 다운로드하십시오. 반복된 표적을 삭제하여 고지혈증 표적 목록을 얻는다.
- 1.1.1 및 1.1.2 단계에서 이러한 목록을 새 스프레드시트에 복사합니다. 도구 모음의 "Data - Identify Duplicates" 기능을 사용하여 교차 대상을 가져옵니다. 교차 표적 목록을 UniProtKB(http://www.uniprot.org/)로 가져와 유전자 및 단백질 이름을 표준화합니다.
참고: 이러한 표적은 FP 및 고지혈증과 관련이 있습니다. 따라서 이러한 교차 표적을 고지혈증에 대한 FP의 표적으로 예측한다.
- 중국 전통 의학 시스템의 약리학 데이터베이스(TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php)에서 키워드 "Phyllanthi Fructus"를 검색하여 FP의 후보 활성 성분 및 표적 목록을 얻습니다.
- 단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축
- STRING 데이터베이스 열기(https://string-db.org/) 11.5. 고지혈증에 대한 FP의 교집합 표적 목록을 "이름 목록" 대화 상자에 붙여넣습니다. "유기체"에서 호모 사피엔 스를 선택하고 검색을 > 계속을 클릭하십시오.
참고: 인간과 생쥐는 매우 유사한 유전자를 가지고 있습니다. 따라서, 마우스에 대한 추가 실험 검증이 수행된다. - 결과를 사용할 수 있으면 "고급 설정"에서 네트워크에서 연결이 끊긴 노드 숨기기를 선택합니다. "최소 필수 상호 작용 점수"에서 가장 높은 신뢰도(0.900) 를 설정한 다음 업데이트 버튼을 클릭합니다.
- 제목 표시줄에서 내보내기 를 클릭하고 단백질-단백질 상호 작용(PPI) 네트워크의 짧은 표 형식 텍스트를 PNG 및 TSV 형식으로 다운로드합니다.
- STRING 데이터베이스 열기(https://string-db.org/) 11.5. 고지혈증에 대한 FP의 교집합 표적 목록을 "이름 목록" 대화 상자에 붙여넣습니다. "유기체"에서 호모 사피엔 스를 선택하고 검색을 > 계속을 클릭하십시오.
- 약물-성분-질병-표적 네트워크 구축
- Cytoscape 3.9.1을 엽니 다. 1.2.3단계의 TSV 형식 파일을 가져옵니다. 제어판의 스타일 표시줄을 통해 네트워크 노드의 색상, 글꼴 및 측면을 최적화합니다.
- 네트워크 토폴로지 분석을 위해 "네트워크 분석" 기능을 사용합니다. Cytoscape에서 CytoHubba에 의해 허브 유전자를 얻습니다. 약물 성분 표적 질병 네트워크를 구축하십시오.
- GO 및 KEGG 농축 분석
- DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)를 엽니 다. Start Analysis(분석 시작 )를 클릭하고 대상 목록을 왼쪽 대화 상자에 붙여넣습니다. "식별자 선택"에서 OFFICIAL GENE SYMBOL 을 선택합니다. "종 선택"에서 호모 사피엔스를 선택합니다. "목록 유형"에서 유전자 목록을 선택합니다. 목록 제출을 클릭합니다.
- 결과가 나오면 DAVID 도구 중 하나를 사용하여 위의 유전자 목록 분석을 클릭합니다. GO 기능 강화 분석을 위해 "Gene Ontology"에서 GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT GOTERM_MF_DIRECT 선택합니다. KEGG 경로 농축 분석을 위해 "Pathways"에서 KEGG_Pathway 선택하십시오.
- 기능 주석 차트를 클릭하여 결과를 표시합니다.
참고: 농축 분석의 통계적 유의성 임계값을 p < 0.05로 설정합니다.
2. 실험 설계
- FP 수성 추출물 제제
참고: FP는 TCM8의 청두 대학교에 있는 Lina Xia 교수의 실험실에서 처리됩니다.- 깨끗한 2L 용량 플라스크에 1L의 순수한 물에 FP(90g)의 건조 분말을 담그십시오. 초음파 처리 (4 °C 수조, 전력 : 250W, 주파수 : 35kHz)를 사용하여 30 분 동안 용해시킵니다. 용액을 여과하여 이중층, 1 mm x 1 mm 멸균 의료용 거즈로 추출물을 얻었다. FP의 완전한 용해를 보장하기 위해 위의 작업을 세 번 반복하십시오.
- 추가 농축을 위해 회전 증발 방법을 사용하십시오. 4시간 동안 60°C의 온도에서 회전 속도를 50rpm으로 설정합니다. 수성 추출물을 100 mL로 농축한다.
- FP의 조추출물(0.9g/mL)을 두 부분(50mL)으로 고르게 나눕니다. 한 부분은 고용량 FP 액체(0.9g/mL)로 사용됩니다. 순수한 물 50mL를 다른 부분에 넣고 저용량 FP 액체(0.45g/mL)로 간주합니다. 투여를 위해 고용량 및 저용량 FP 수용액을 사용하십시오. 사용할 때까지 액체를 -20 °C에서 보관하십시오.
- 동물 준비
- 50마리의 수컷 C57BL/6마리(20 ± 2g)를 실온에서 환기가 잘 되는 방에 넣고 12시간 명암 주기로 음식과 순수한 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다.
- 마우스를 무작위로 두 그룹으로 나누십시오 : 10 마리의 마우스에게 정상식이 요법을, 40 마리의 마우스에게 고지방식이를 먹이십시오 ( 재료 표 참조).
참고: 8주 동안 먹이를 먹은 후 마우스를 추가 약물 개입을 위해 스크리닝했습니다. - 8주차에 각 마우스 궤도에서 약 200μL의 혈액을 채취합니다. 혈액을 4°C에서 5,733 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 혈장 샘플을 얻었다. 시중에서 판매되는 분석 키트로 TC 및 TG 수준을 측정합니다( 재료 표 참조).
- 지질 수치가 가장 정상인 마우스 6마리를 무처리 대조군(NC)으로 선택합니다. 고지방식이군으로 지질수치가 유의하게 높은 마우스 24마리를 선정하여 고지방식이(HFD)군, 저선량 FP(FP_L)군, 고선량 FP(FP_H)군, 양성대조군(PC)군의 4개 그룹으로 무작위로 나눕니다.
- FP_L 및 FP_H 그룹에 각각 2가지 용량의 FP(저용량, 4.5g/kg 및 고용량, 9g/kg)로 위 세척을 시행합니다. 심바스타틴 정제(5mg/kg, 재료 표 참조)를 사용한 PC 그룹에 대한 위 세척; 4주 동안 하루에 한 번 동일한 양의 생리 식염수로 NC 및 HFD 그룹에 대한 위 세척.
참고: 현재 연구에서는 치료를 위해 FP와 심바스타틴의 수용액을 사용했습니다. - 12주차에 1% 펜토바르비탈 나트륨(30mg/kg)으로 마취한 후 모든 그룹의 마우스를 희생시킵니다. 각 마우스의 안와 정맥에서 ~400 μL 혈액 샘플을 수집합니다.
알림: 핀셋으로 생쥐의 발가락과 발바닥을 자극하십시오. 반응이 없으면 적절한 마취를 증명합니다. - 혈장 샘플을 얻기 위해 4°C에서 5,733 x g 에서 10분 동안 혈액을 원심분리하고, 상업적으로 이용 가능한 분석 키트를 사용하여 TC, TG, LDL-C 및 HDL-C 수준을 측정합니다( 재료 표 참조). 간 조직 샘플(16 )을 채취하여 조직병리학적 분석을 실시한다. 대사체학 분석을 위해 나머지 혈장 및 간 샘플을 사용합니다(3단계).
참고: 모든 샘플은 사용할 때까지 -80°C에서 보관됩니다.
- 간 조직 병리학 적 검사
- 신선한 간 조직을 4 % 파라 포름 알데히드 용액으로 24 시간 이상 고정시킵니다. 고정액에서 조직을 꺼내고 메스로 대상 조직을 부드럽게합니다. 티슈와 해당 라벨을 탈수기에 넣습니다.
- 에탄올 구배에서 탈수 : 4 시간 동안 75 % 알코올, 2 시간 동안 85 % 알코올, 2 시간 동안 90 % 알코올, 1 시간 동안 95 % 알코올, 1 시간 동안 절대 에탄올, 30 분 동안 크실렌. 티슈 카세트를 파라핀 왁스로 티슈 몰드에 넣고 각각 30분씩 3회 세척한다(16).
- 왁스에 적신 티슈를 티슈 임베더에 넣습니다( 재료 표 참조). 왁스가 굳기 전에 탈수기에서 티슈를 꺼내 내장 상자에 넣고 해당 라벨을 부착하십시오.
- -20°C 냉동조조에서 왁스 블록을 식히고 내장된 프레임에서 제거한 다음 왁스 블록을 다듬습니다.
- 마이크로톰을 사용하여 트리밍된 왁스 블록을 3μm 두께의 섹션으로 자릅니다( 재료 표 참조). 섹션을 40°C 물에 띄우고 슬라이드에서 제거하고 60°C 오븐에서 굽습니다. 물과 마른 왁스로 구운 후 꺼내어 실온에 보관한다.
- 섹션을 크실렌 I에 10분, 크실렌 II에 10분, 크실렌 III에 10분, 무수 에탄올 I에 5분, 무수 에탄올 II에 5분, 75% 알코올에 5분 동안 연속적으로 넣고 물16으로 세척합니다.
- 헤마톡실린 염색 용액으로 4분, 분화를 위한 1% 염산 알코올 용액(75% 알코올), 다시 1% 암모니아수 용액으로 절편을 염색하고 물로 씻어냅니다.
- 에오신 염색 용액으로 섹션을 2 분 동안 염색하고 물로 씻으십시오.
- 200x 및 400x 배율의 광학 현미경을 사용하여 단면을 관찰합니다.
- 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS) 분석
- FP의 성분 식별
참고: 분석은 하이브리드 Quadrupole-orbitrap 고분해능 질량 분석법(UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS , 재료 표 참조)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 수행됩니다.- FP의 건조분말 1g을 정밀하게 측정하여 깨끗한 50mL 용량플라스크에 넣는다.
- 70% 메탄올 25mL를 용량 플라스크에 넣고 정확하게 무게를 잰다. 용해를 돕기 위해 30 분 동안 초음파 처리 (4 °C 수조, 전력 : 250W, 주파수 : 35kHz)를 사용하십시오. 용해 후 손실을 정확하게 결정하기 위해 다시 정확하게 무게를 측정하고 70% 메탄올을 사용하여 손실을 보충합니다.
알림: 특히 4°C 수조 후에는 부피 플라스크의 눈금이 정확하지 않으므로 부피를 측정하지 마십시오. - 완전히 섞이도록 흔들어주세요. 0.22μm 미세 다공성 멤브레인을 사용하여 필터링합니다.
- 혈장 시료 전처리
- 1.5mL 원심분리기 튜브에 있는 이중 부피(200μL)의 아세토니트릴에 혈장 100μL(단계 2.2.7)를 정밀하게 추가하고 최소 30초 동안 와류 진동기로 소용돌이칩니다. 모든 샘플에 대해 이 절차를 수행합니다.
- 모든 시료를 17,200 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 새 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 상청액을 질소 하에서 건조시킨다. 200 μL의 추출 용매(아세토니트릴:물 = 4:1 [v/v])로 재구성합니다.
- 재구성 된 용액을 최소 30 초 동안 소용돌이 치고 10 분 동안 초음파 처리를 사용합니다 (4 ° C 수조에서, 전력 : 250W, 주파수 : 35kHz). 4°C에서 10분 동안 17,200 x g 로 원심분리합니다.
- 0.22μm 필터 멤브레인으로 상층액을 여과하고 분석을 위해 4°C로 유지합니다.
- 간 시료 전처리
- 간 조직 90mg(단계 2.2.7)을 얼음처럼 차가운 메탄올-물(1:1, v/v, 1mL)에서 1분 동안 균질화하고 21,500 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 모든 샘플에 대해 이 절차를 수행합니다.
- 동일한 절차에 따라 침전물을 다시 추출하고 상층액을 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브에 함께 모읍니다. 상청액을 질소 하에서 건조시킨다. 300 μL의 추출 용매로 재구성합니다 (메탄올 : 물 = 4 : 1 [v / v]).
- 재구성 된 용액을 최소 30 초 동안 소용돌이 치고 10 분 동안 초음파 처리를 사용합니다 (4 ° C 수조에서, 전력 : 250W, 주파수 : 35kHz). 4°C에서 15분 동안 17,200 x g 로 원심분리합니다.
- 0.22μm 필터 멤브레인으로 상층액을 여과하고 분석을 위해 4°C로 유지합니다.
참고: 풀링된 품질 관리(QC) 샘플은 각 혈장 및 간 샘플(샘플 6개당 1개)에서 10μL 분취량을 혼합하여 준비되었습니다.
- LC-MS의 분석 파라미터
참고: 이동상은 0.1% 포름산(용매 A)과 아세토니트릴(용매 B)로 구성됩니다. 이 용매를 깨끗한 유리병에 옮기고 LC-MS 시스템에 연결합니다.- LC-MS 시스템의 "입구 파일"에서 혈장 샘플의 그래디언트 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 1% B(0-1.5분), 1%-60% B(1.5-13.0분), 60%-99% B(13.0-20.0분), 99% B(20.0-25.0분), 99%-1% B(25.0-25.1분) 및 27분까지 1% B로 유지.
- LC-MS 시스템의 "inlet file"에서 혈장 샘플의 자동 시료 주입기 조건을 다음과 같이 설정합니다: 주입 부피, 2 μL; 각 분석에 대한 유속(0.3mL/min)입니다.
- LC-MS 시스템의 "inlet file"에서 간 샘플의 그래디언트 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 1% B(0-1분), 1%-53% B(1-15분), 53%-70% B(15-30분), 70%-90% B(30-32분), 90%-95% B(32-40분), 95%-1% B(40-42분) 및 1% B에서 45분까지 유지합니다.
- LC-MS 시스템의 "inlet file"에서 간 샘플의 자동 시료 주입기 조건을 다음과 같이 설정합니다: 주입 부피, 5 μL; 각 분석에 대한 유속(0.3mL/min)입니다.
- LC-MS 시스템의 "MS tune file"에서 혈장 및 간 샘플의 MS 검출 조건을 설정합니다. 양이온화 모드와 음이온화 모드를 모두 사용하여 MS 수집을 수행합니다.
참고: 가열된 전기분무 이온화 매개변수는 다음과 같습니다: 분무 전압: 양이온화의 경우 3.5kV, 음이온화의 경우 3.8kV; 피복 가스 유량 : 55 Arb; 보조 가스 유량 : 15 Arb; 프로브 히터 온도: 300°C; 및 모세관 온도: 350°C. - 수집된 원시 데이터를 Compound Discoverer 소프트웨어로 가져오고 제조업체의 지침에 따라 분석법 템플릿을 설정합니다( 재료 표 참조).
- FP의 성분 식별
3. 대사체학 검증
참고: 혈장 및 간 대사 산물의 대사 프로파일링 데이터를 Compound Discoverer 소프트웨어로 가져와 분자 특징 추출 알고리즘을 채택하여 대사 특징 추출을 수행합니다. 매개 변수를 다음과 같이 설정하십시오 : 질량 편차, 5 x 10-6; 질량 범위, 100-1,500; 신호 대 잡음비(SNR) 임계값, 3; 및 머무름 시간 편차, 0.05. QC 피크 면적의 상대 표준 편차(RSD)를 통해 대사체학의 안정성과 반복성을 평가합니다.
- SIMCA-P 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 LC-MS 결과에서 얻은 적분 값의 다변량 통계 분석을 수행할 수 있습니다. 평균 중심 데이터 및 표본 클래스 모델링에 직교 부분 최소 제곱 판별 분석(OPLS-DA)을 사용합니다.
- OPLS-DA 테스트 후, 투영(VIP) 값이 >1이고 스튜던트 t-테스트에서 p-값이 <0.05인 적분을 갖는 대사산물을 잠재적 미분 대사산물로 고려하십시오.
- Human Metabolome(HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG; https://www.kegg.jp/) 및 MetaboAnalyst5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)을 포함한 개방형 데이터베이스 소스를 통해 교란된 대사 산물 및 대사 경로를 식별합니다.
- MetaboAnalyst5.0 및 'Wu Kong' 플랫폼(https://www.omicsolution.com/wkomics/main/)으로 결과 보기를 시각화합니다.
4. 분자 도킹
- TCMSP 데이터베이스에서 선택한 FP 성분의 3D 구조를 각각 다운로드합니다. '화학 이름' 검색 상자에서 성분 이름을 검색하고 해당 3D 구조 파일을 mol2 형식으로 다운로드합니다.
- AlphaFold Protein Structure Database(Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/)에서 주요 표적의 결정 구조를 다운로드하십시오. 검색 상자에서 대상 이름을 검색하고 해당 결정 구조 파일을 pdb 형식으로 다운로드합니다.
- 재료 및 대상 구조 파일을 AutoDockTools 소프트웨어로 가져옵니다. 편집 > 물 삭제 를 클릭하여 물 분자를 삭제합니다. 수소 편집(Edit > Hydrogens) > 추가(Add) 를 클릭하여 수소를 추가합니다. 성분을 '리간드'로 설정하고 전체 타겟을 '수용체'로 선택하여 블라인드 도킹을 수행합니다17.
- "center"와 "size" 뒤에 있는 상자에 값을 입력하여 새로 개발된 공간을 조정하여 리간드와 수용체를 완전히 둘러쌀 수 있도록 합니다. 리간드 및 수용체 파일을 pdbqt 형식으로 저장합니다.
- AutoDock Vina를 사용하여 분자 도킹을 수행합니다. "Receptor" 바를 'receptor.pdbqt'의 이름으로, "Ligand" 바를 'ligand.pdbqt'의 이름으로 설정합니다. 리간드가 수용체에 결합하기 위한 최적의 위치를 얻는다. 최적의 위치에서 결합 에너지 값을 기록합니다.
참고: 도킹 과정은 유전 알고리즘14에 의해 계산되었습니다. 모든 도킹 실행 옵션은 기본값이었습니다. 도킹 프레임은 가장 높은 바인딩 에너지에서 가장 낮은 바인딩 에너지로 자동 순위가 매겨집니다. - 도킹 파일을 PILP(Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index)로 가져와 시각적 시스템 모델을 가져옵니다. 모델 파일을 pse 형식으로 다운로드하고 PyMOL 소프트웨어(재료 표 참조)로 가져와서 추가 시각화를 구성합니다.
5. 통계 분석
참고: 데이터 분석을 위해 SPSS 통계 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하십시오. p < 0.05의 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.
- 값을 표준 편차(SD)± 평균으로 표현합니다.
- 일원 분산 분석(One-way ANOVA)을 수행한 후 사후 최하위 차이(LSD), Dunnett(등분산의 경우) 또는 Dunnett의 T3(동일하지 않은 분산의 경우)을 수행하여 그룹 간의 통계적 유의성을 검정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
네트워크 약리학
FP의 총 18가지 잠재적 성분을 데이터베이스 및 LC-MS 분석에서 약동학 및 약력학적 특성에 따라 스크리닝했습니다(총 이온 크로마토그램은 보충 그림 1에 표시됨). 관련 문헌을 통해 갈산의 함량은 다른 성분보다 훨씬 높으며 지질을 낮추는 데 효과적입니다 9,11. 따라서 이 성분도 잠재적인 성분으로 간주되었습니다. FP의 총 19개 성분과 134개 성분 관련 타겟이 설립되었습니다. 19가지 성분 모두 표 1에 나타내었다. 추가 분석을 위한 가장 대표적인 성분을 선택하기 위해, 이들 성분을 Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine 데이터베이스(BATMAN-TCM; http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)로 가져왔다. 성분-표적-경로-질병 네트워크에 따르면 갈산, 케르세틴, 베타-시토스테롤과 같은 일부 생리 활성 성분이 고콜레스테롤혈증 및 관상동맥 동맥경화증과 관련된 FP의 가장 중요한 성분으로 확인되었습니다(보충 그림 2). 이 중 갈산은 가장 널리 연구된 페놀산 중 하나입니다. FP18에 제시된 주요 생리 활성 성분입니다. 한편, 갈산은 FP에서 가장 높은 함량의 성분이기도 합니다. 그 농도는 보통 1 %에서 3 %입니다. El-Hussainy et al.19는 갈산이 심장 손상을 제한하고 지질 프로필을 개선하며 심장 염증 마커를 하향 조절할 수 있음을 밝혔습니다. 케르세틴과 베타-시토스테롤의 함량은 낮지만 일부 연구에서는 지질 저하에 미치는 영향을 입증했습니다. 퀘르세틴은 식물에 널리 존재하는 중요한 플라보노이드로서 항산화, 항염 및 심혈관 보호 효과 등 다양한 특성을 가지고 있다20. Lu et al.21은 케르세틴이 풍부한 주스가 경미한 고콜레스테롤혈증이 있는 건강한 개인의 TC, LDL-C 및 HDL-C 수치를 약화시킬 수 있다고 연구했습니다. 베타 - 시토스테롤의 경우, 임상 연구에 따르면 식물성 스테롤은 고 콜레스테롤 혈증과 심혈관 질환을 현저하게 예방할 수 있습니다22,23. Althwab et al.24는 베타-시토스테롤이 HFD 쥐의 지질 프로필과 동맥경화 지수를 개선할 수 있음을 증명했습니다. FP의 지질 저하 효과는 이 세 가지 성분과 관련이 있을 수 있음을 알 수 있습니다.
또한 Genecards, OMIM 및 TTD 데이터베이스에서 고지혈증 관련 표적 1,552개를 수집했습니다. 134개의 FP 관련 표적을 고지혈증 관련 표적과 일치시킨 후, 62개의 표적이 고지혈증에 대한 FP의 잠재적 표적으로 확인되었습니다(그림 2A). UniProt 데이터베이스에 따르면 교차 된 모든 표적은 공식 기호로 정규화되었습니다. 그 후, PPI 네트워크는 STRING(그림 2B) 및 Cytoscape(그림 2C)에 의해 구성되었습니다. 계산 방법의 점수를 결합하면 상위 10개 대상은 ESR1, RELA, FOS, EGFR, HIF1A, AR, CCND1, IL6, MAPK8 및 MYC였습니다. 자세한 내용은 보충 그림 3에 나와 있습니다. 이 62 개의 모든 표적은 대사 학의 결과와 통합 된 추가 분석의 기초입니다.
GO 및 KEGG 경로는 농축 분석에 의해 수행되었습니다. 표적 수에 따라 상위 15개 경로를 p-값에 따라 분석을 위해 선택했습니다. GO 농축 결과는 고지혈증에 대한 FP의 생물학적 과정과 분자 기능이 주로 유전자 발현 및 단백질 결합과 관련이 있음을 시사했습니다(그림 2D). KEGG 농축은 FP가 지질 대사 및 죽상동맥경화 과정에 개입할 수 있음을 입증했으며(그림 2E), 이는 FP가 지질 대사에 영향을 주어 고지혈증을 완화한다는 것을 의미합니다.
FP가 혈장 지질 수치와 간 지수에 미치는 영향
고지혈증에 대한 FP의 개선 효과를 테스트하기 위해 먼저 TC, TG, LDL-C, HDL-C 및 간 지수(간 중량 대 체중의 비율)의 변화를 측정했습니다. NC 그룹과 비교하여 HFD 그룹의 마우스는 TC(p < 0.001), LDL-C(p < 0.001) 및 TG(p < 0.05)의 혈장 수준이 유의하게 증가한 것으로 나타났으며, 이는 장기간 HFD 개입이 지질 수준을 증가시키고 고지혈증을 유발할 수 있음을 나타냅니다(그림 3).
FP 수성 추출물을 투여한 후, FP_L 및 FP_H 그룹의 TC 수준은 각각 18.8% 및 12.4% 감소하여 유의하게(p < 0.05) 감소하였다(도 3A). FP_L 및 FP_H 그룹의 LDL-C 수치는 각각 13.7% 및 21.8% 감소하여(p < 0.05) 유의하게 감소했습니다(그림 3B). HDL-C 수준과 관련하여 FP_H 그룹은 HFD 그룹에 비해 1.81 ± 0.08mmol/L에서 2.65± 0.16mmol/L로 유의하게(p < 0.01) 증가했습니다(그림 3C). FP 개입 후에도 TG 수준은 유의하지 않았지만 HFD 그룹에 비해 감소했습니다(그림 3D). 최근 연구에 따르면 LDL-C/HDL-C 비율의 지수는 심혈관 질환을 예측하는 데 LDL-C 또는 HDL-C 단독보다 더 나은 지표입니다25,26. HFD 그룹과 비교하여 LDL-C/HDL-C 비율은 FP_H 그룹에서 46.3% 유의하게(p < 0.01) 감소했으며(그림 3E), 이는 FP 개입이 나쁜 콜레스테롤을 감소시키고 좋은 콜레스테롤 수치를 증가시켰음을 의미합니다. 주요 지방 대사 기관으로서, 간 무게는 생쥐의 지방 저장을 어느 정도 반영한다27. 12주 후, FP_L 그룹 및 FP_H 그룹의 간 지수는 HFD 그룹에 비해 유의하게 감소하였다(p < 0.01). PC 그룹은 또한 위의 지표에서 다른 정도의 감소를 보였으며, FP가 스타틴과 유사한 효과를 가졌으며 보호 효과가 용량-반응 관계를 나타냄을 보여주었습니다.
다양한 임상 연구에 따르면 추출물 또는 전체 FP를 한동안 복용한 후 TC 및 LDL-C 수치가 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다. 한편, HDL-C 수치는 FP28,29의 장기 투여시 현저하게 상승했습니다. Nambiar와 Shetty30은 FP 주스가 산화된 저밀도 지단백질을 감소시켜 죽상동맥경화증의 위험을 크게 줄일 수 있음을 발견했습니다. Gopa et al.31은 고지혈증 환자에서 FP의 고지혈증 효과를 평가하고 심바스타틴과 비교했습니다. FP로 치료하면 TC, LDL-C 및 TG가 크게 감소하고 심바스타틴과 유사한 HDL-C 수치가 크게 증가했습니다. 본 연구에서는 FP와 심바스타틴도 유사한 치료 효과를 보였으며, FP의 LDL-C 저하 효과와 간 복구 작용이 심바스타틴보다 우수했다.
간 조직병리학적 관찰
HFD 마우스에서 간 지방증에 대한 FP의 효과는 그림 4에 나와 있습니다. NC 그룹의 간 병리학적 절편은 규칙적인 간세포 형태, 명확하게 정의된 세포 경계 및 명백한 지방 액포를 나타내지 않았습니다(그림 4A, B). 비교해 보면, HFD 그룹은 혈관 주위에 다양한 크기의 지방 액포를 가지고 있었고 세포 부종, 지방 변성, 세포 경계 상실, 세포 수축 및 간세포 괴사를 특징으로 하는 명백한 간 손상을 보였습니다(그림 4C,D). 그림 4E,F에서 볼 수 있듯이 FP 개입은 특히 FP_L 그룹에서 간 지방증을 개선할 수 있습니다. HFD 그룹과 비교하여 FP_H(그림 4G,H) 및 PC 그룹(그림 4I,J)은 간세포 구조의 어느 정도 회복, 지방 변성 및 지방 액포 감소를 보였습니다. 이것은 FP 개입이 HFD로 인한 간 손상으로부터 간 조직을 보호할 수 있음을 의미합니다.
대사체학 프로파일링
혈장 지질 수준과 간 조직병리학적 관찰에 따르면 고용량 FP는 저용량 FP보다 고지혈증에 더 나은 영향을 미쳤다. 따라서 NC, HFD 및 FP_H 그룹을 선택하여 신진 대사 수준의 변화를 분석했습니다. QC 샘플의 총 이온 크로마토그램을 보충 그림 4에 나타내었다. 데이터의 정확성을 보장하기 위해 RSD 값이 >30%인 기능을 모든 QC 샘플에서 제거했습니다. PCA 및 이온 크로마토그램은 QC 샘플이 공정 중에 안정적임을 반영했습니다(보충 그림 5). 혈장과 간에서 총 626 및 562 개의 특징이 데이터 전처리 후에 결정되었습니다. 이 중 혈장과 간 내 대사산물은 각각 120개와 124개로 KEGG 데이터베이스를 기반으로 확인되었다. OPLS-DA 분석을 사용하여 NC, HFD 및 FP_H 그룹 간의 분리를 탐색했습니다. OPLS-DA는 동일한 그룹 샘플이 함께 클러스터링되고 다른 그룹 샘플이 잘 구별됨을 보여주었습니다(그림 5A, B). 이러한 결과는 HFD 및 FP 개입이 명백한 대사 변화를 일으켰음을 나타냅니다.
대사 구별에 기여한 잠재적인 차등 대사산물을 식별하기 위해 NC 대 HFD 및 HFD 대 FP_H의 추가 OPLS-DA 및 t-테스트 분석을 각각 수행했습니다. OPLS-DA 결과는 잘 구별되었고, 모델14 의 상이한 그룹 간에 유의한 차이를 보였다(보충 그림 6). VIP(Variable important in projection) >1 및 p < 0.05를 기준으로 혈장 내 32개의 대사산물이 NC군과 HFD군 간의 분화를 보였고, 72개의 대사산물이 HFD군과 FP_H군 간의 분화를 보였다. 간에서는 38개의 대사산물이 NC군과 HFD군, 17개의 대사산물이 HFD군과 HFD군FP_H 분화를 보였다. 마지막으로, 총 16개 및 6개의 대사산물이 혈장 및 간에서 각각 FP에 영향을 미치는 HFD 마우스에서 차등 대사산물로 확인되었다(보충 그림 7). 이들 대사산물에 대한 정보는 표 2에 나와 있다.
세 그룹 간의 대사 산물의 변화를 시각화하기 위해 MetaboAnalyst 5.0으로 히트 맵을 그렸습니다. 혈장과 간의 모든 차등 대사 산물은 HFD 그룹에서 변경되었고 대부분은 FP 그룹에서 역전되어 FP 개입이 대사 장애를 개선할 수 있음을 나타냅니다(그림 5C, D). 또한, HFD 마우스에서 FP의 대사 경로를 탐색하기 위해 MetaboAnalyst 5.0으로 차등 대사 산물을 가져왔습니다. p < 0.05와 경로 영향 >0.10을 기준으로 트립토판 대사는 혈장에서 유의한 영향을 받았으며 이 경로와 관련된 대사산물은 D-트립토판 및 L-키누레닌이었습니다(그림 5E). Jung et al.32 는 장기간의 고지혈증이 키누레닌의 혈청 수치를 낮출 수 있다고 연구했습니다. 타우린과 하이포타우린 대사는 간에서 유의하게 영향을 받았으며 관련된 대사산물은 타우린이었습니다(그림 5F). 타우린은 동물의 몸에서 중요하고 필요한 아미노산입니다. Dong et al.33 은 타우린이 혈중 지질의 손상을 약간 줄이고 HFD로 인한 죽상 동맥 경화증 위험을 낮출 수 있다고 연구했습니다. 이 연구에서 FP 개입은 L-키누레닌과 타우린의 함량을 증가시켰는데, 이는 지질 수치 감소와 긍정적인 관련이 있어 고지혈증에 대한 FP의 효과를 뒷받침합니다.
네트워크 약리학 및 대사체학의 통합 분석
대사체학과 결합된 네트워크 약리학의 통합 전략은 질병 메커니즘 및 개입 전략을 연구하는 데 점점 더 필수 불가결해지고 있습니다. 제한된 증거로 네트워크 약리학과 대사체학 사이의 관련성이 확립되었습니다. 고지혈증에 대한 FP의 기전을 종합적으로 보기 위해 네트워크 약리학 및 대사체학을 기반으로 한 상호작용 네트워크를 구축했습니다. 차등 대사 산물을 Cytoscape의 MetScape 플러그인으로 가져오고 네트워크 약리학에서 확인된 허브 유전자를 일치시켜 화합물-반응-효소-유전자 네트워크를 수집했습니다(그림 6). 표 3에 나타낸 바와 같이, 혈장 대사산물에서 L-키누레닌 및 코르티코스테론은 CYP1A1과 관련이 있었으며, 이는 지질 과산화를 촉매하고 비알코올성 지방간 질환을 유발할 수 있습니다34,35; 영향을 받은 경로는 각각 트립토판 대사와 스테로이드 호르몬 생합성이었습니다. 아세틸콜린은 AChE와 관련이 있으며 글리세로인지질 대사에 영향을 미쳤습니다. 간 대사 산물에서 MGAM과 라피노스는 갈락토오스 대사와 관련이 있었습니다. 여러 연구에서 라피노스 계열 올리고당의 섭취가 HFD 마우스의 대사 장애를 개선할 수 있음이 입증되었습니다36.
또한, 성분-표적-대사산물-경로 네트워크가 구축되었습니다(그림 7). 성분에서 케르세틴이 가장 많은 가장자리를 연결했는데, 이는 FP의 퀘르세틴이 지질을 낮추는 데 가장 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 위의 통합 분석을 통해 고지혈증에 대한 FP의 주요 표적, 대사 산물 및 경로가 밝혀졌으며, 이는 이 약의 치료 메커니즘 및 임상 적용에 대한 추가 연구의 기초가 될 수 있습니다.
분자 도킹
선택된 성분과 주요 표적 사이의 상호 작용 가능성을 추가로 조사하기 위해 분자 도킹을 사용하여 리간드-활성 부위 상호 작용을 분석했습니다. AutoDock Vina 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 분자 도킹을 수행하였으며, 스코어링 함수의 순위에 따라 첫 번째 도킹 포즈를 출력하였다. 도킹 결과는 그림 8에 나와 있습니다.
통합 분석에서 CYP1A1, AChE 및 MGAM은 차등 대사 산물과 관련이 있었습니다. 그들은 표적과 대사 산물 사이에 다리를 만들었습니다. 표적과 성분 사이의 관계를 확인하기 위해 추가 분자 도킹이 수행되었습니다. CYP1A1과 성분 도킹의 결과는 다음과 같다: 갈산은 아미노산 잔기 Asn-185, Tyr-187, Asn-219 및 His-500을 통해 4개의 수소 결합을 형성하고, 아미노산 잔기 Tyr-187을 통해 π-π 스태킹 상호작용을 형성하였다(도 8A); 케르세틴은 Asn-185, Asn-219 및 His-500, 소수성 상호 작용 및 Tyr-187을 통한 π-π 스태킹 상호 작용을 통해 3개의 수소 결합을 형성했습니다(그림 8B). 베타-시토스테롤은 Arg-362, Ser-363, Leu-365 및 Arg-464를 통해 4개의 수소 결합을 형성하고 Glu-369 및 Ile-439를 통해 소수성 상호작용을 형성했습니다(그림 8C). 결합 에너지는 각각 5.3, 7.0 및 7.3kcal/-mol이었다. AChE와의 상호 작용에서 갈산은 Arg-237, Arg-238 및 Arg-480과의 수소 결합에 의해 안정화되었습니다(그림 8D). 케르세틴은 Arg-237 및 Phe-474와의 수소 결합, Phe-157과의 소수성 상호 작용 및 Tyr-478과의 π-π 스태킹 상호 작용에 의해 안정화되었습니다 (그림 8E). 베타-시토스테롤은 Phe-157, Val-244, Ile-248, Phe-474, Ala477 및 TYR478과의 소수성 상호작용에 의해 안정화되었다(도 8F). 결합 에너지는 각각 5.0, 6.5 및 8.0kcal/-mol이었다. MGAM과의 상호작용에서 갈산은 Ile-1716, Gly-1747 및 Trp-1749와의 수소 결합과 Tyr-1715 및 Trp-1749와의 소수성 상호작용에 의해 안정화되었습니다(그림 8G). 퀘르세틴은 Arg-1311, Thr-1726, Gln-1731 및 Trp-1752와의 수소 결합, Arg-1730과의 수소 결합, His-1727과의 π-π 스태킹에 의해 안정화되었습니다(그림 8H). 베타-시토스테롤은 Pro-1159, Trp-1355, Phe-1427 및 Phe-1560과의 소수성 상호작용에 의해 안정화되었으며, 결합 에너지는 각각 5.9, 8.1 및 6.9kcal/mol이었습니다. 상호작용 및 결합 친화도에 대한 상세한 정보는 표 4에 나타내었다. 다중 결합 부위와 높은 결합 에너지는 성분과 단백질 표적 사이의 높은 친화도를 설명하며, 이러한 성분이 고지혈증 관련 표적에 작용하여 지질을 낮추는 역할을 한다는 것을 확인합니다.
그림 1: 통합 전략의 개략도 흐름도. 허브 성분과 유전자는 네트워크 약리학(Part 1)에 의해 추출되었습니다. 고지혈증에 대한 FP의 차등 대사산물은 혈장 및 간 대사체학(Part 2)으로 분석되었습니다. 주요 표적, 대사 산물 및 경로는 Part 1 및 Part 2(Part 3)의 통합 분석을 기반으로 식별 및 연결되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 고지혈증에 대한 FP의 효과에 대한 표적 스크리닝, 네트워크 구축 및 농축 분석. (A) FP-고지혈증 표적의 벤 다이어그램. (B) 잠재적 활성 약물-성분-표적-질병 네트워크: 여기에 언급된 다양한 색상 기호: 질병(빨간색), 약물(파란색), 성분(녹색) 및 표적(노란색). (C) STRING에 의한 PPI 네트워크. (D) GO 경로 농축 분석. (E) KEGG 경로 농축 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HFD 유발 고지혈증이 있는 마우스의 혈장 지질 수준 및 간 지수에 대한 FP의 영향(n = 6). (A) TC 수준. (b) LDL-C 수치. (C) HDL-C 수준. (D) TG 수준. (E) LDL-C/HDL-C 비율. (F) 간 지수.*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 통계적으로 유의미한 차이는 일원 분산 분석에 이어 Dunnett의 다중 비교 테스트 또는 사후 분석을 사용하여 평가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: HFD 유발 고지혈증이 있는 마우스의 간 조직에 대한 FP의 효과(H&E 염색). (A,B) NC 그룹, (C,D) HFD 그룹, (E,F) FP_L 그룹, (G,H) FP_H 그룹, (I,J) PC 그룹(n = 6). 스케일 바: (A,C,E = 200 μm; B,D,F = 50μm)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: OPLS-DA 점수 플롯, 히트 맵 및 차등 대사 산물의 대사 경로. 혈장(A) 및 간(B)에서 HFD 마우스에 대한 FP의 OPLS-DA 점수 플롯. 혈장(C)과 간(D)의 차등 대사 산물의 히트 맵. 혈장(E)과 간(F)에서 차등 대사 산물의 대사 경로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 주요 대사산물 및 표적의 화합물-반응-효소-유전자 네트워크. 낮은 수준의 노드가 제거되었습니다. 빨간색 육각형, 파란색 원, 둥근 녹색 직사각형 및 회색 다이아몬드는 각각 활성 화합물, 유전자, 단백질 및 반응을 나타냅니다. 주요 표적과 대사 산물이 확대되었습니다. 흰색 배경의 경로는 혈장에서 크게 조절됩니다. 회색 배경의 경로는 간에서 크게 조절됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 성분-표적-대사산물-경로 네트워크. 색상이 어두울수록 연결된 가장자리가 많을수록 이 네트워크에서 노드가 더 중요하다는 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: FP 성분과 주요 표적의 상호 작용 다이어그램 . (A) CYP1A1에 작용하는 갈산. (B) CYP1A1에 작용하는 케르세틴. (C) CYP1A1에 작용하는 베타-시토스테롤. (D) AChE에 작용하는 갈산. (E) AChE에 작용하는 케르세틴. (F) AChE에 대한 베타-시토스테롤링 작용. (G) MGAM에 작용하는 갈산. (H) MGAM에 작용하는 케르세틴. (I) MGAM에 작용하는 베타-시토스테롤. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 고지혈증에 대한 FP 개요 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: FP 수성 추출물의 선택된 성분. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 세 그룹 간의 차등 대사산물. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 주요 표적, 대사 산물 및 경로에 대한 정보. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: FP 성분과 표적 단백질 사이의 결합 부위 및 작용력. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: FP 수성 추출물의 양이온 및 음이온 크로마토그램. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: BATMAN-TCM에 의한 FP 성분-표적-경로-질병 네트워크. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 네트워크 약리학에서 허브 유전자의 빈도 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: 혈장 및 간 QC 샘플의 이온 크로마토그램. 혈장 QC 샘플의 대표적인 양성(A) 및 음성(B) 이온 크로마토그램. 간 QC 샘플의 대표적인 양성(C) 및 음성(D) 이온 크로마토그램. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 5: 혈장(A) 및 간(B) QC 샘플의 PCA 점수 플롯. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 6: 혈장(A 및 B) 및 간(C 및 D) 샘플의 OPLS-DA 점수 플롯. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 7: 혈장(A) 및 간(B) 샘플의 차등 대사 산물의 벤 다이어그램. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
최근 몇 년 동안 고지혈증의 발병률이 증가하고 있는데, 이는 주로 장기간의 건강에 해로운 식습관으로 인한 것입니다. TCM과 그 화학 성분은 다양한 약리학 적 활성을 가지고 있으며, 최근 몇 년 동안 널리 연구되어왔다37,38. FP는 약과 식품으로 사용되는 과일 자원의 일종으로 고지혈증 치료에 중요한 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 고지혈증에 대한 FP의 잠재적인 치료 기전은 추가 연구가 필요합니다.
네트워크 약리학은 분자 수준에서 약물 다약리학적 효과를 평가하고 천연물과 단백질의 상호작용을 예측하여 주요 메커니즘을 결정합니다39. 첫 번째 단계는 약물의 활성 성분과 주요 표적을 선택하는 것입니다. 이 연구에서는 9 개의 활성 성분과 62 개의 허브 유전자가 발견되었습니다. 고지혈증에 대한 FP의 분자 메커니즘을 더 깊이 이해하기 위해 네트워크 약리학 분석을 기반으로 PPI 및 성분-표적 네트워크를 구축했습니다. 주요 성분과 표적의 범위를 좁히기 위해 고콜레스테롤혈증 및 관상동맥 동맥경화증과 관련된 세 가지 핵심 성분(갈산, 케르세틴, 베타-시토스테롤)이 BATMAN-TCM에 의해 설립되었습니다. 이러한 모든 성분은 LDL-C 수치를 낮추거나 HDL-C 수치를 증가시켜 고지혈증에 대한 FP의 특정 효과를 검증할 수 있습니다. 또한 KEGG 농축 분석에 따르면 고지혈증에 대한 FP의 기능은 지질 및 죽상동맥경화증 경로의 활성과 관련이 있습니다. 이 방법은 데이터베이스에 너무 많이 의존하고 실험적 검증이 부족하지만 이론적 가치가 있으며 후속 실험적 검증 연구에 대한 아이디어를 제공합니다.
추가 실험적 검증을 위해 마우스에 고지혈증을 유도하기 위해 8주 동안 지방 보충 식단을 먹였습니다. 그 결과 혈장 TC, LDL-C 및 TG 수준이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. HDL-C의 수준은 크게 감소했지만 LDL-C와 HDL-C의 비율은 크게 증가했습니다. 조직병리학적 관찰 결과 HFD 마우스의 간 조직이 심하게 손상되었지만 간 지수는 크게 증가하지 않았습니다. 체중과 내장 체중의 변화가 더 오래 걸릴 수 있습니다. 지질과 간 변화는 고지혈증에 대한 FP의 개입 효과를 적절하게 보여주었습니다. 그러나 개입 효과의 내부 메커니즘은 여전히 추가 탐색이 필요합니다.
대사체학(Metabolomics)은 대사 질환의 메커니즘과 치료 약물의 작용을 탐구하는 것을 목표로 하는 잠재적인 대사 산물 및 관련 경로의 목록을 제공합니다40. 대사체학의 결과는 샘플 유형에 영향을 받을 수 있습니다. 고지혈증의 병원성 특성을 고려하여 본 연구에서는 대사 분석을 위해 혈장과 간 샘플을 선택하였다. OPLS-DA 결과에 따르면 NC, HFD 및 FP_H 그룹의 대사산물이 잘 구별되었습니다. 혈장에서 총 16개의 차등 대사산물이 발견되었고 간에서 6개의 차등 대사산물이 발견되었습니다. 간보다 혈장에 영향을 받는 대사산물이 더 많았으며, 이는 혈액이 고지혈증에 의해 유발되는 대사 장애의 주요 장소임을 증명합니다. FP 개입은 HFD의 영향 하에서 이러한 대사 산물의 변화를 역전시킬 수 있습니다. 또한 이러한 차등 대사 산물을 KEGG 데이터베이스로 가져 왔습니다. 혈장에서 차등 대사 산물의 중요한 대사 경로는 트립토판 대사였으며 간에서는 타우린과 하이포 타우린 대사였습니다. 이 연구에서 FP 개입은 트립토판 대사의 L-키누레닌 함량과 타우린 및 하이포타우린 대사의 타우린 함량을 증가시켰으며, 이는 FP가 대사 장애 및 고지혈증을 유리하게 조정하는 데 효과적일 수 있음을 의미합니다. 대사체학 분석을 통해 어떤 대사산물이 고지혈증 또는 FP 개입과 관련이 있는지 밝혀냈고 FP 효과의 다운스트림 메커니즘을 결정했습니다.
네트워크 약리학과 대사체학의 결과를 결합하여 화합물-반응-효소-유전자 네트워크에서 세 가지 주요 표적(CYP1A1, AChE 및 MGAM)을 확인했습니다. 분자 도킹 분석에 따르면 이러한 표적은 FP 성분(갈산, 케르세틴 및 베타-시토스테롤)과 높은 친화도를 보였습니다. 4가지 대사산물(L-키누레닌, 코르티코스테론, 아세틸콜린, 라피노스)과 4가지 관련 경로(트립토판 대사, 스테로이드 호르몬 생합성, 글리세로인지질 대사, 갈락토오스 대사)가 주요 대사산물 및 대사 경로로 확인되었습니다. 이 중 케르세틴이 가장 많은 표적과 연관되어 있었고, 트립토판 대사는 대사학과 통합 결과 모두에서 나타났다. 그들은 고지혈증에 대한 FP의 치료 효과에 가장 중요한 역할을 합니다. 분자 도킹 결과 CYP1A1, AChE 및 MGAM은 성분과의 친화도가 높은 것으로 나타났습니다. 상기 결과는 이러한 선별된 표적이 FP의 치료 효과와 밀접한 관련이 있음을 증명합니다.
본 연구에서 갈산, 케르세틴 및 베타-시토스테롤은 항고지혈증에 대한 FP 활성 성분으로 확인되었으며 트립토판 대사는 HFD 마우스에서 FP 요법의 주요 대사 경로입니다. 결과의 개요는 그림 9에 나와 있습니다. 이 연구는 메커니즘에 대한 추가 연구를 위한 데이터와 이론적 지원을 제공하고 FP 의학의 임상 적용을 위한 토대를 제공했습니다. 또한 자연 식품이 임상 실습에서 큰 전망을 가진 유망한 옵션이 될 수 있음을 입증했습니다. 그러나 이 연구에는 여전히 몇 가지 단점이 있습니다. 고지혈증에 대한 활성 성분 단독의 치료 효과는 검증되지 않았습니다. 또한 주요 목표의 경로는 연구되지 않았습니다. 또한 정확한 메커니즘을 검증하기 위해 더 체계적인 분자 생물학 실험이 필요합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 TCM Health Preservation and Rehabilitation(2022C005)의 제품 개발 및 혁신 팀과 "Health Preservation and Rehabilitation+"의 새로운 비즈니스 국경 간 통합에 관한 연구의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 101-3B Oven | Luyue Instrument and Equipment Factory | \ | |
| 80312/80302 Glass Slide | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| 80340-1630 Cover Slip | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A998 | Version 1.5.6 |
| ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Aethanol | Fisher Chemical | A995 | Version 3.0 |
| Ammonia Solution | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1336-21-6 | Version 3.9.1 |
| AutoDockTools | Scripps Institution of Oceanography | \ | |
| BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | \ | |
| Compound Discoverer | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | \ | |
| DM500 Optical Microscope | Leica | \ | |
| DV215CD Electronic Balance | Ohaus Corporation ., Ltd | T15A63 | |
| Ethyl Alcohol | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 64-17-5 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A118 | |
| HDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A112-1-1 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL700B | |
| High Fat Diet | ENSIWEIER | 202211091031 | |
| Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge | Hitachi., Ltd. | \ | |
| Homogenizer | Oulaibo Technology Co., Ltd | \ | |
| Hydrochloric Acid | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 7647-01-0 | |
| Image-forming System | LIOO | \ | |
| JB-L5 Freezer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JB-L5 Tissue Embedder | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JK-5/6 Microtome | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JT-12S Hydroextractor | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| KQ3200E Ultrasonic Cleaner | Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd | \ | |
| LDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A113-1-1 | |
| Male C57BL/6 Mice | SBF Biotechnology Co., Ltd. | \ | Version 2.3.2 |
| Neutral Balsam | Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd | 10021190865934 | |
| Pure Water | Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd | GB19298 | |
| PyMOL | DeLano Scientific LLC | \ | Version 14.1 |
| RE-3000 Rotary Evaporator | Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd | \ | |
| RM2016 Pathological Microtome | Shanghai Leica Instruments Co., Ltd | \ | Version 26.0 |
| SIMCA-P | Umetrics AB | \ | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme., Ltd | 14202220051 | |
| SPSS | International Business Machines Corporation | \ | |
| TC Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
| TG Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
| UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Vortex Vibrator | Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. | LC-Vortex-P1 | |
| Xylene | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1330-20-7 |
References
- Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
- Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
- Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
- Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
- Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
- Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
- Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
- Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
- Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
- Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
- Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
- Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
- Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
- Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
- Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
- Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
- Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
- Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
- El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
- Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
- Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
- Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
- Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
- Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
- Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
- Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
- Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
- Antony, B., Merina, B., Sheeba, V.
- Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
- Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
- Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
- Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
- Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
- Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
- Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
- Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
- Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).
