Summary
Il presente protocollo descrive una strategia integrata per esplorare i bersagli e i meccanismi chiave di Fructus Phyllanthi contro l'iperlipidemia basata sulla previsione della farmacologia di rete e sulla verifica metabolomica.
Abstract
L'iperlipidemia è diventata un fattore di rischio leader per le malattie cardiovascolari e le lesioni epatiche in tutto il mondo. Fructus Phyllanthi (FP) è un farmaco efficace contro l'iperlipidemia nelle teorie della medicina tradizionale cinese (MTC) e della medicina indiana, tuttavia il potenziale meccanismo richiede ulteriori esplorazioni. La presente ricerca si propone di rivelare il meccanismo della FP contro l'iperlipidemia sulla base di una strategia integrata che combina la previsione della farmacologia di rete con la validazione metabolomica. Un modello di topi indotti da una dieta ricca di grassi (HFD) è stato stabilito valutando i livelli plasmatici di lipidi, tra cui colesterolo totale (TC), trigliceridi (TG), colesterolo lipoproteico a bassa densità (LDL-C) e colesterolo lipoproteico ad alta densità (HDL-C). La farmacologia di rete è stata applicata per scoprire i principi attivi della FP e i potenziali bersagli contro l'iperlipidemia. La metabolomica del plasma e del fegato è stata eseguita per identificare i metaboliti differenziali e i loro percorsi corrispondenti tra il gruppo normale, il gruppo modello e il gruppo di intervento. La relazione tra farmacologia di rete e metabolomica è stata ulteriormente costruita per ottenere una visione completa del processo di FP contro l'iperlipidemia. Le proteine bersaglio chiave ottenute sono state verificate mediante docking molecolare. Questi risultati riflettono che la FP ha migliorato i livelli plasmatici di lipidi e il danno epatico dell'iperlipidemia indotta da un HFD. L'acido gallico, la quercetina e il beta-sitosterolo nella FP sono stati dimostrati come composti attivi chiave. Un totale di 16 e sei potenziali metaboliti differenziali nel plasma e nel fegato, rispettivamente, sono risultati coinvolti negli effetti terapeutici della FP contro l'iperlipidemia da parte della metabolomica. Inoltre, l'analisi di integrazione ha indicato che gli effetti dell'intervento erano associati a CYP1A1, AChE e MGAM, così come l'aggiustamento di L-chinurenina, corticosterone, acetilcolina e raffinosio, coinvolgendo principalmente la via del metabolismo del triptofano. Il docking molecolare ha assicurato che gli ingredienti di cui sopra che agiscono sui bersagli proteici correlati all'iperlipidemia hanno svolto un ruolo chiave nell'abbassare i lipidi. In sintesi, questa ricerca ha fornito una nuova possibilità per prevenire e curare l'iperlipidemia.
Introduction
L'iperlipidemia è una malattia metabolica comune con gravi impatti sulla salute umana ed è anche il principale fattore di rischio per le malattie cardiovascolari1. Recentemente, c'è stata una tendenza al ribasso legata all'età per questa malattia e i giovani sono diventati più suscettibili a causa di stili di vita irregolari a lungo termine e abitudini alimentari malsane2. Nella clinica, vari farmaci sono stati usati per trattare l'iperlipidemia. Ad esempio, uno dei farmaci più comunemente usati per i pazienti con iperlipidemia e disturbi aterosclerotici correlati sono le statine. Tuttavia, l'uso a lungo termine di statine ha effetti collaterali che non possono essere trascurati, che portano a una prognosi infausta, come intolleranza, resistenza al trattamento ed eventi avversi 3,4. Queste carenze sono diventate ulteriori dolori per i pazienti con iperlipidemia. Pertanto, dovrebbero essere proposti nuovi trattamenti per un'efficacia ipolipemizzante stabile e un minor numero di effetti collaterali.
La medicina tradizionale cinese (MTC) è stata ampiamente utilizzata per trattare le malattie a causa della sua buona efficacia e pochi effetti collaterali5. Fructus Phyllanthi (FP), il frutto secco di Phyllanthus emblica Linn. (popolarmente conosciuta come bacca di amla o uva spina indiana), è una famosa medicina e materiale omologo alimentare delle medicine tradizionali cinesi e indiane 6,7. Questo medicinale è stato utilizzato per eliminare il calore, raffreddare il sangue e promuovere la digestione, secondo le teorie TCM8. I moderni studi farmacologici hanno dimostrato che la FP è ricca di composti bioattivi come acidi gallici, acidi ellagici e quercetina9, che sono responsabili di una serie di proprietà biologiche sfaccettate, agendo come antiossidante, antinfiammatorio, protettivo del fegato, anti-ipolipidemia e così via10. Recenti ricerche hanno anche dimostrato che la FP potrebbe regolare efficacemente i lipidi nel sangue dei pazienti con iperlipidemia. Ad esempio, Variya et al.11 hanno dimostrato che il succo di frutta FP e il suo principale ingrediente chimico dell'acido gallico possono ridurre il colesterolo plasmatico e ridurre l'infiltrazione di olio nel fegato e nell'aorta. L'efficacia terapeutica era correlata alla regolazione della FP nell'aumentare l'espressione del recettore-alfa attivato dal proliferatore dei perossisomi e nel diminuire l'attività lipogenica epatica. Tuttavia, il meccanismo alla base della FP nel migliorare l'iperlipidemia dovrebbe essere ulteriormente studiato, perché i suoi ingredienti bioattivi sono piuttosto estesi. Abbiamo cercato di esplorare il potenziale meccanismo di efficacia terapeutica della FP, che può essere utile per l'ulteriore sviluppo e utilizzo di questo farmaco.
Attualmente, la farmacologia di rete è considerata una tecnica olistica ed efficiente per studiare il meccanismo terapeutico della MTC. Invece di cercare singoli geni che causano malattie e farmaci che trattano esclusivamente un bersaglio individuale, viene costruita una rete completa di farmaci-ingredienti-geni-malattie per trovare il meccanismo multi-target del farmaco multi-ingrediente per quanto riguarda il loro trattamento completo12. Questa tecnica è particolarmente adatta per la MTC, poiché le loro composizioni chimiche sono massicce. Sfortunatamente, la farmacologia di rete può essere utilizzata solo per prevedere obiettivi influenzati da ingredienti chimici in teoria. I metaboliti endogeni nel modello di malattia devono essere osservati per convalidare l'efficacia della farmacologia di rete. Il metodo della metabolomica, che emerge con lo sviluppo della biologia dei sistemi, è uno strumento importante per monitorare i cambiamenti nei metaboliti endogeni13. I cambiamenti nei metaboliti riflettono i cambiamenti dello stato stazionario dell'ospite, che è anche un indicatore importante per studiare il meccanismo interno. Alcuni ricercatori hanno integrato con successo la farmacologia di rete e la metabolomica per esplorare il meccanismo di interazione tra farmaci e malattie14,15.
Questo articolo esplora le basi meccanicistiche della FP contro l'iperlipidemia integrando tecniche di farmacologia di rete e metabolomica. La farmacologia di rete è stata applicata per analizzare la relazione tra i principali principi attivi nella FP e i bersagli molecolari per l'iperlipidemia. Successivamente, è stata eseguita la metabolomica per osservare il cambiamento dei metaboliti endogeni nel modello animale, che può spiegare le azioni della medicina a livello metabolico. Rispetto all'applicazione della sola farmacologia di rete o della sola metabonomica, questa analisi integrata ha fornito un meccanismo di ricerca più specifico e completo. Inoltre, la strategia di docking molecolare è stata utilizzata per analizzare l'interazione tra principi attivi e proteine chiave. In generale, questo approccio integrato potrebbe compensare la mancanza di prove sperimentali per la farmacologia di rete e la mancanza di un meccanismo endogeno per il metodo metabolomico, e può essere utilizzato per l'analisi del meccanismo terapeutico della medicina naturale. Il diagramma di flusso schematico principale del protocollo è mostrato nella Figura 1.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono la manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con la Guida alla medicina tradizionale cinese dell'Università di Chengdu per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal Comitato etico istituzionale dell'Università di medicina tradizionale cinese di Chengdu (numero di protocollo 2020-36). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6 (20 ± 2 g). I topi sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
1. Predizione basata sulla farmacologia di rete
NOTA: La farmacologia di rete viene utilizzata per prevedere i principi attivi e i loro obiettivi chiave della FP contro l'iperlipidemia.
- Selezione dei principi attivi e obiettivi chiave
- Cerca la parola chiave "Phyllanthi Fructus" nel database farmacologico del sistema di medicina tradizionale cinese (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) per ottenere l'elenco dei principi attivi candidati e dei bersagli della FP.
NOTA: Normalmente, solo gli ingredienti con biodisponibilità orale (OB) ≥30% e valori farmaco-simili (DL) ≥0,18 nel database sono inclusi come principi attivi. - Cerca la parola chiave "iperlipidemia" nel database GeneCards (https://www.genecards.org/), nel database Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM; https://omim.org/) e nel database degli obiettivi terapeutici (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) per ottenere i rispettivi bersagli candidati di iperlipidemia. Scarica i fogli di calcolo degli obiettivi di malattia. Eliminare gli obiettivi ripetuti per ottenere l'elenco degli obiettivi di iperlipidemia.
- Copiare questi elenchi dai passaggi 1.1.1 e 1.1.2 in un nuovo foglio di calcolo. Utilizzare la funzione "Dati - Identifica duplicati" nella barra degli strumenti per ottenere obiettivi di intersezione. Importare l'elenco degli obiettivi di intersezione in UniProtKB (http://www.uniprot.org/) per standardizzare i nomi dei geni e delle proteine.
NOTA: Questi obiettivi sono correlati sia alla FP che all'iperlipidemia. Pertanto, prevedere questi obiettivi di intersezione come bersagli della FP contro l'iperlipidemia.
- Cerca la parola chiave "Phyllanthi Fructus" nel database farmacologico del sistema di medicina tradizionale cinese (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) per ottenere l'elenco dei principi attivi candidati e dei bersagli della FP.
- Costruzione di una rete di interazione proteina-proteina
- Aprire il database STRING (https://string-db.org/) 11.5. Incollare l'elenco degli obiettivi di intersezione di FP contro l'iperlipidemia nella finestra di dialogo "Elenco dei nomi". Seleziona Homo sapiens in "Organismi" e clicca su CERCA > CONTINUA.
NOTA: Gli esseri umani e i topi hanno geni molto simili. Pertanto, un'ulteriore verifica sperimentale viene effettuata con i topi. - Quando i risultati sono disponibili, selezionare il nascondi nodi disconnessi nella rete in "Impostazioni avanzate". Impostare la massima confidenza (0,900) in "punteggio minimo di interazione richiesto", quindi fare clic sul pulsante AGGIORNA .
- Fare clic su Esportazioni nella barra del titolo e scaricare il breve testo tabellare della rete di interazione proteina-proteina (PPI) in formato PNG e TSV.
- Aprire il database STRING (https://string-db.org/) 11.5. Incollare l'elenco degli obiettivi di intersezione di FP contro l'iperlipidemia nella finestra di dialogo "Elenco dei nomi". Seleziona Homo sapiens in "Organismi" e clicca su CERCA > CONTINUA.
- Costruzione di una rete farmaco-componente-malattia-bersaglio
- Aprire Cytoscape 3.9.1 (vedere Tabella dei materiali). Importare il file in formato TSV del passaggio 1.2.3. Ottimizza il colore, il carattere e il lato dei nodi di rete tramite la barra di stile nel pannello di controllo.
- Utilizzare la funzione "Analizza rete" per l'analisi della topologia di rete. Ottenere i geni hub da CytoHubba in Cytoscape. Stabilire la rete farmaco-ingrediente-bersaglio-malattia.
- Analisi dell'arricchimento GO e KEGG
- Apri DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Fare clic su Avvia analisi e incollare l'elenco di destinazione nella finestra di dialogo di sinistra. Selezionare SIMBOLO UFFICIALE DEL GENE in "Seleziona identificatore". Seleziona Homo sapiens in "Seleziona specie". Elenco dei geni di spunta in "Tipo di elenco". Fai clic su Invia elenco.
- Quando i risultati sono disponibili, fare clic su Analizza sopra l'elenco dei geni con uno degli strumenti DAVID. Tick GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT in "Ontologia genica" per l'analisi dell'arricchimento della funzione GO. Spuntare KEGG_Pathway in "Pathways" per l'analisi dell'arricchimento del pathway KEGG.
- Fare clic su Grafico di annotazione funzionale per visualizzare i risultati.
NOTA: impostare la soglia di significatività statistica dell'analisi di arricchimento a p < 0,05.
2. Progettazione sperimentale
- La preparazione dell'estratto acquoso FP
NOTA: FP viene elaborato nel laboratorio della professoressa Lina Xia presso l'Università di Chengdu di TCM8.- Immergere la polvere essiccata di FP (90 g) in 1 L di acqua pura in un matraccio tarato pulito da 2 L. Utilizzare il trattamento ad ultrasuoni (a bagnomaria a 4 °C, potenza: 250 W, frequenza: 35 kHz) per aiutare a dissolvere per 30 minuti. Filtrare la soluzione per ottenere l'estratto con una garza medica sterile a doppio strato, 1 mm x 1 mm. Ripetere l'operazione di cui sopra tre volte per garantire la completa dissoluzione di FP.
- Utilizzare il metodo di evaporazione rotativa per un'ulteriore concentrazione. Impostare la velocità di rotazione a 50 giri/min con una temperatura di 60 °C per 4 ore. Concentrare l'estratto acquoso a 100 ml.
- Dividere uniformemente l'estratto grezzo di FP (0,9 g/ml) in due parti (50 ml). Una parte viene utilizzata come liquido FP ad alte dosi (0,9 g/ml). Aggiungere 50 ml di acqua pura in un'altra parte e considerarlo come il liquido FP a basso dosaggio (0,45 g / ml). Utilizzare le soluzioni acquose FP ad alto e basso dosaggio per la somministrazione. Conservare il liquido a -20 °C fino all'uso.
- Preparazione degli animali
- Ospitare 50 topi maschi C57BL/6 (20 ± 2 g) in una stanza ben ventilata a temperatura ambiente, con un ciclo luce-buio di 12 ore e libero accesso al cibo e all'acqua pura.
- Assegnare in modo casuale i topi a due gruppi: nutrire 10 topi con una dieta normale e 40 topi con una dieta ricca di grassi (vedi Tabella dei materiali) per indurre iperlipidemia.
NOTA: Dopo aver mangiato per 8 settimane, i topi sono stati sottoposti a screening per ulteriori interventi farmacologici. - Nell'8a settimana, prelevare circa 200 μL di sangue da ciascuna orbita del topo. Centrifugare il sangue per 10 minuti a 5.733 x g a 4 °C per ottenere campioni di plasma. Determinare i livelli di TC e TG con kit di analisi disponibili in commercio (vedere la tabella dei materiali).
- Selezionare sei topi con i livelli lipidici più normali come gruppo di controllo senza trattamento (NC). Seleziona 24 topi con un livello lipidico significativamente più alto come gruppo di dieta ad alto contenuto di grassi e dividili casualmente in quattro gruppi: gruppo dieta ricca di grassi (HFD), gruppo FP a basso dosaggio (FP_L), gruppo FP ad alte dosi (FP_H) e gruppo di controllo positivo (PC).
- Somministrare l'irrigazione gastrica ai gruppi FP_L e FP_H con due dosaggi di FP (dose bassa, 4,5 g / kg e dose alta, 9 g / kg), rispettivamente; irrigazione gastrica al gruppo PC con compresse di simvastatina (5 mg/kg; vedere Tabella dei materiali); e irrigazione gastrica ai gruppi NC e HFD con lo stesso volume di soluzione fisiologica una volta al giorno per 4 settimane.
NOTA: Il presente studio ha utilizzato le soluzioni acquose di FP e simvastatina per il trattamento. - Nella 12a settimana, dopo l'anestesia con pentobarbital sodico all'1% (30 mg/kg), sacrificare i topi di tutti i gruppi. Raccogliere ~ 400 μL di campioni di sangue dalla vena orbitale di ciascun topo.
NOTA: Stimolare le dita dei piedi e le piante dei topi con una pinzetta. Se non c'è reazione, dimostra un'anestesia adeguata. - Centrifugare il sangue per 10 minuti a 5.733 x g a 4 °C per ottenere campioni di plasma e determinare i livelli di TC, TG, LDL-C e HDL-C con kit di analisi disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali). Ottenere campioni di tessuto epatico16 e sottoporli ad analisi istopatologica. Utilizzare i restanti campioni di plasma ed epato per l'analisi metabolomica (fase 3).
NOTA: Tutti i campioni vengono conservati a -80 °C fino all'uso.
- Esame istopatologico del fegato
- Fissare i tessuti epatici freschi con una soluzione di paraformaldeide al 4% per più di 24 ore. Estrarre il tessuto dal fissativo e levigare i tessuti bersaglio con un bisturi. Inserire il fazzoletto e l'etichetta corrispondente nell'essiccatore.
- Disidratazione in un gradiente di etanolo: 75% di alcol per 4 ore, 85% di alcol per 2 ore, 90% di alcol per 2 ore, 95% di alcol per 1 ora, etanolo assoluto per 1 ora, xilene per 30 min. Mettere la cassetta di tessuto in uno stampo di tessuto in cera di paraffina per tre lavaggi, 30 min ciascuno16.
- Inserire i tessuti imbevuti di cera nell'incastonatore di tessuto (vedere Tabella dei materiali). Prima che la cera si solidifichi, rimuovere i tessuti dall'essiccatore, inserirli nella scatola incorporata e attaccare l'etichetta corrispondente.
- Raffreddare i blocchi di cera in un tavolo di congelamento a -20 °C, rimuoverli dal telaio incorporato e tagliare il blocco di cera.
- Tagliare i blocchi di cera tagliati in sezioni spesse 3 μm usando un microtomo (vedi Tabella dei materiali). Far galleggiare le sezioni in acqua a 40 °C, toglierle dai vetrini e cuocere in forno a 60 °C. Dopo la cottura con acqua e cera asciutta, estrarlo e tenerlo a temperatura ambiente.
- Successivamente posizionare le sezioni in xilene I per 10 min, xilene II per 10 min, xilene III per 10 min, etanolo assoluto I per 5 min, etanolo assoluto II per 5 min, alcool al 75% per 5 minuti e lavare in acqua16.
- Macchiare le sezioni con una soluzione colorante di ematossilina per 4 minuti, una soluzione di alcol acido cloridrico all'1% (alcol al 75%) per la differenziazione, una soluzione di acqua di ammoniaca all'1% di blu e lavarle con acqua.
- Macchiare le sezioni con una soluzione colorante di eosina per 2 minuti e lavarle con acqua.
- Osservare le sezioni utilizzando un microscopio ottico con un ingrandimento di 200x e 400x.
- Analisi cromatografia-spettrometria di massa liquida LC-MS)
- Identificazione degli ingredienti del FP
NOTA: L'analisi viene eseguita utilizzando cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata con spettrometria di massa ibrida quadrupolo-orbitrap ad alta risoluzione (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; vedere Tabella dei materiali).- Misurare con precisione 1 g di polvere essiccata di FP e metterla in un matraccio tarato pulito da 50 ml.
- Aggiungere 25 ml di metanolo al 70% nel matraccio tarato e pesare accuratamente. Utilizzare il trattamento ad ultrasuoni (a bagnomaria a 4 °C, potenza: 250 W, frequenza: 35 kHz) per 30 minuti per favorire la dissoluzione. Pesare di nuovo con precisione per determinare con precisione la perdita dopo la dissoluzione e utilizzare il 70% di metanolo per compensare la perdita.
NOTA: Non misurare il volume, poiché la scala del matraccio volumetrico non è accurata, specialmente dopo il bagno d'acqua a 4 °C. - Agitare fino a mescolare completamente. Utilizzare una membrana microporosa da 0,22 μm per filtrare.
- Preparazione del campione di plasma
- Aggiungere con precisione 100 μL di plasma (fase 2.2.7) in un doppio volume (200 μL) di acetonitrile in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e farlo vortice con un vibratore a vortice per almeno 30 s. Seguire questa procedura per tutti i campioni.
- Centrifugare tutti i campioni a 17.200 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire i surnatanti dopo centrifugazione in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 ml. Asciugare i surnatanti sotto azoto. Ricostituire con 200 μL di solvente da estrazione (acetonitrile:acqua = 4:1 [v/v]).
- Vortice la soluzione ricostituita per almeno 30 s e utilizzare il trattamento ad ultrasuoni per 10 minuti (a bagnomaria a 4 °C, potenza: 250 W, frequenza: 35 kHz). Centrifugare a 17.200 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Filtrare i surnatanti con membrane filtranti da 0,22 μm e mantenerli a 4 °C per l'analisi.
- Preparazione del campione di fegato
- Omogeneizzare 90 mg di tessuto epatico (fase 2.2.7) per 1 minuto in acqua metanolo ghiacciata (1:1, v/v, 1 mL) e centrifugarli a 21.500 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in provette da centrifuga da 1,5 ml. Seguire questa procedura per tutti i campioni.
- Estrarre nuovamente i precipitati seguendo la stessa procedura e raggruppare i surnatanti in nuove provette da centrifuga da 1,5 ml. Asciugare i surnatanti sotto azoto. Ricostituire con 300 μL del solvente di estrazione (metanolo:acqua = 4:1 [v/v]).
- Vortice la soluzione ricostituita per almeno 30 s e utilizzare il trattamento ad ultrasuoni per 10 minuti (a bagnomaria a 4 °C, potenza: 250 W, frequenza: 35 kHz). Centrifugare a 17.200 x g per 15 minuti a 4 °C.
- Filtrare i surnatanti con membrane filtranti da 0,22 μm e mantenerli a 4 °C per l'analisi.
NOTA: I campioni aggregati di controllo di qualità (QC) sono stati preparati miscelando 10 μL di aliquote da ciascun campione di plasma e fegato (uno su sei campioni).
- Parametri di analisi di LC-MS
NOTA: La fase mobile è costituita da acido formico allo 0,1% (solvente A) e acetonitrile (solvente B). Trasferire questi solventi in una bottiglia di vetro pulita e collegarli al sistema LC-MS.- Impostare i programmi di gradiente dei campioni di plasma nel "file di ingresso" del sistema LC-MS come segue: 1% B (0-1,5 min), 1%-60% B (1,5-13,0 min), 60%-99% B (13,0-20,0 min), mantenere al 99% B (20,0-25,0 min), 99%-1% B (25,0-25,1 min) e mantenere all'1% B fino a 27 min.
- Impostare le condizioni dell'autocampionatore dei campioni di plasma nel "file di ingresso" del sistema LC-MS come segue: il volume di iniezione, 2 μL; e la portata, 0,3 ml/min, per ogni analisi.
- Impostare il programma di gradiente dei campioni di fegato nel "file di ingresso" del sistema LC-MS come segue: 1% B (0-1 min), 1%-53% B (1-15 min), 53%-70% B (15-30 min), 70%-90% B (30-32 min), 90%-95% B (32-40 min), 95%-1% B (40-42 min) e mantenere all'1% B fino a 45 min.
- Impostare le condizioni dell'autocampionatore dei campioni di fegato nel "file di ingresso" del sistema LC-MS come segue: volume di iniezione, 5 μL; e la portata, 0,3 ml/min, per ogni analisi.
- Impostare le condizioni di rilevamento MS dei campioni di plasma e fegato nel "MS tune file" del sistema LC-MS. Eseguire l'acquisizione MS utilizzando sia la modalità di ionizzazione positiva che negativa.
NOTA: I parametri di ionizzazione elettrospray riscaldata sono i seguenti: tensione di spruzzo: 3,5 kV per ionizzazione positiva e 3,8 kV per ionizzazione negativa; Flusso gas guaina: 55 arb; flusso di gas ausiliario: 15 arb; temperatura del riscaldatore della sonda: 300 °C; e temperatura capillare: 350 °C. - Importare i dati grezzi raccolti nel software Compound Discoverer e impostare il modello di metodo seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
- Identificazione degli ingredienti del FP
3. Validazione metabolomica
NOTA: I dati di profilazione metabolomica dei metaboliti plasmatici ed epatici vengono importati nel software Compound Discoverer per eseguire l'estrazione delle caratteristiche metaboliche adottando un algoritmo di estrazione delle caratteristiche molecolari. Impostare i parametri come segue: deviazione di massa, 5 x 10-6; gamma di massa, 100-1.500; soglia del rapporto segnale/rumore (SNR), 3; e deviazione del tempo di ritenzione, 0,05. Valutare la stabilità e la ripetibilità della metabolomica mediante la deviazione standard relativa (RSD) delle aree di picco QC.
- Utilizzare il software SIMCA-P (vedi Tabella dei Materiali) per l'analisi statistica multivariata dei valori integrali ottenuti dai risultati LC-MS. Utilizzare l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA) per i dati centrati sulla media e la modellazione delle classi campione.
- Dopo il test OPLS-DA, considerare i metaboliti, con integrale con importanza variabile nei valori di proiezione (VIP) di >1 e un valore p di <0,05 dal t-test di Student come potenziali metaboliti differenziali.
- Identificare i metaboliti disturbati e le vie metaboliche da fonti di database aperte, tra cui Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) e MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
- Visualizza le visualizzazioni dei risultati di MetaboAnalyst5.0 e della piattaforma 'Wu Kong' (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).
4. Docking molecolare
- Scarica rispettivamente la struttura 3D degli ingredienti FP selezionati dal database TCMSP. Cerca i nomi degli ingredienti nella casella di ricerca "Nome chimico" e scarica i file di struttura 3D corrispondenti in formato mol2.
- Scarica le strutture cristalline dei target chiave dall'AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Cerca i nomi di destinazione nella casella di ricerca e scarica i file delle strutture cristalline corrispondenti in formato pdb.
- Importare gli ingredienti e il file delle strutture di destinazione nel software AutoDockTools. Fare clic su Modifica > Elimina acqua per eliminare le molecole d'acqua. Fare clic su Modifica > idrogeni > Aggiungi per aggiungere idrogeni . Imposta gli ingredienti come "ligando" ed esegui l'attracco cieco selezionando l'intero bersaglio come "recettore"17.
- Inserisci un valore nella casella dietro "center" e "size" per regolare lo spazio appena sviluppato, rendendo possibile comprendere completamente il ligando e il recettore. Salvare i file ligando e recettore in formato pdbqt.
- Utilizzare AutoDock Vina per eseguire l'aggancio molecolare. Impostare la barra "Receptor" sul nome del 'receptor.pdbqt' e la barra "Ligand" sul nome del 'ligand.pdbqt'. Ottenere la posizione ottimale per il legame del ligando al recettore. Registrare il valore dell'energia di legame nella posizione ottimale.
NOTA: il processo di attracco è stato calcolato dall'algoritmo genetico14. Tutte le opzioni di esecuzione dell'ancoraggio erano valori predefiniti. I telai di ancoraggio verranno automaticamente classificati dall'energia di legame più alta a quella più bassa. - Importare i file di docking in PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) per ottenere il modello visivo del sistema. Scarica i file del modello in formato pse e importali nel software PyMOL (vedi Tabella dei materiali) per costruire un'ulteriore visualizzazione.
5. Analisi statistica
NOTA: utilizzare il software statistico SPSS (vedere la tabella dei materiali) per l'analisi dei dati. Considera il valore di p < 0,05 come statisticamente significativo.
- Esprimere i valori come media ± deviazione standard (SD).
- Eseguire un ANOVA unidirezionale seguito da differenza meno significativa post hoc (LSD), Dunnett (in caso di varianza uguale) o T3 di Dunnett (in caso di varianza disuguale) per testare la significatività statistica tra i gruppi.
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Representative Results
Farmacologia di rete
Un totale di 18 potenziali ingredienti in FP sono stati sottoposti a screening in base alle loro proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche dal database e dall'analisi LC-MS (i cromatogrammi ionici totali sono mostrati nella Figura supplementare 1). Attraverso la letteratura pertinente, il contenuto di acido gallico è molto più alto di altri ingredienti ed è efficace nel ridurre i lipidi 9,11. Pertanto, questo ingrediente è stato considerato un ingrediente potenziale troppo. In totale, sono stati fondati 19 ingredienti e 134 target relativi agli ingredienti del PQ. Tutti i 19 ingredienti sono mostrati nella Tabella 1. Per selezionare gli ingredienti più rappresentativi per ulteriori analisi, questi ingredienti sono stati importati nel database Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine (BATMAN-TCM; http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/). Secondo la rete ingrediente-target-pathway-malattia, alcuni ingredienti bioattivi, come l'acido gallico, la quercetina e il beta-sitosterolo, sono stati identificati come gli ingredienti più importanti della FP correlati all'ipercolesterolemia e all'aterosclerosi coronarica (Figura supplementare 2). Tra questi, l'acido gallico è uno degli acidi fenolici più studiati; è il principale ingrediente bioattivo presentato nel PQ18. Nel frattempo, l'acido gallico è anche l'ingrediente con il più alto contenuto di FP; La sua concentrazione è solitamente compresa tra l'1% e il 3%. El-Hussainy et al.19 hanno rivelato che l'acido gallico può limitare il danno cardiaco, migliorare il profilo lipidico e sottoregolare i marcatori infiammatori cardiaci. I contenuti di quercetina e beta-sitosterolo sono inferiori, ma alcuni studi hanno dimostrato il loro effetto sull'abbassamento dei lipidi. La quercetina, come importante flavonoide ampiamente presente nelle piante, ha varie proprietà, come gli effetti antiossidanti, antinfiammatori e di protezione cardiovascolare20. Lu et al.21 hanno studiato che il succo arricchito di quercetina può attenuare i livelli di TC, LDL-C e HDL-C in individui sani con lieve ipercolesterolemia. Per quanto riguarda il beta-sitosterolo, studi clinici hanno dimostrato che lo sterolo vegetale può prevenire significativamente l'ipercolesterolemia e le malattie cardiovascolari22,23. Althwab et al.24hanno dimostrato che il beta-sitosterolo potrebbe migliorare il profilo lipidico e l'indice aterogeno nei ratti HFD. Si può vedere che l'effetto ipolipemizzante della FP può essere correlato a questi tre ingredienti.
Inoltre, sono stati raccolti 1.552 bersagli correlati all'iperlipidemia dai database Genecards, OMIM e TTD. Dopo aver abbinato i 134 target correlati alla FP con i target correlati all'iperlipidemia, 62 target sono stati identificati come potenziali bersagli per la FP contro l'iperlipidemia (Figura 2A). Tutti gli obiettivi intersecati sono stati normalizzati ai loro simboli ufficiali, secondo il database UniProt. Successivamente, la rete PPI è stata costruita da STRING (Figura 2B) e Cytoscape (Figura 2C). Combinando i punteggi dei metodi computazionali, i primi 10 obiettivi erano ESR1, RELA, FOS, EGFR, HIF1A, AR, CCND1, IL6, MAPK8 e MYC. I dettagli sono presentati nella figura supplementare 3. Tutti questi 62 bersagli sono la base di ulteriori analisi, che sono integrate con i risultati della metabonomica.
I percorsi GO e KEGG sono stati eseguiti mediante analisi di arricchimento. I primi 15 percorsi, in base al numero di obiettivi, sono stati selezionati per l'analisi in base al valore p. I risultati dell'arricchimento di GO hanno suggerito che i processi biologici e la funzione molecolare della FP contro l'iperlipidemia erano principalmente correlati all'espressione genica e al legame proteico (Figura 2D). L'arricchimento di KEGG ha dimostrato che la FP potrebbe intervenire nel processo del metabolismo lipidico e dell'aterosclerosi (Figura 2E), il che significa che la FP allevia l'iperlipidemia influenzando il metabolismo lipidico.
L'effetto della FP sui livelli plasmatici di lipidi e sull'indice epatico
Per testare l'effetto migliorato della FP sull'iperlipidemia, sono stati prima misurati i cambiamenti in TC, TG, LDL-C, HDL-C e indice epatico (il rapporto tra peso del fegato e peso corporeo). Rispetto al gruppo NC, i topi nel gruppo HFD hanno mostrato un aumento significativo dei livelli plasmatici di TC (p < 0,001), LDL-C (p < 0,001) e TG (p < 0,05), indicando che l'intervento HFD a lungo termine può aumentare i livelli lipidici e indurre iperlipidemia (Figura 3).
Dopo la somministrazione di estratto acquoso FP, i livelli di TC nei gruppi FP_L e FP_H sono stati significativamente ridotti (p < 0,05) rispettivamente del 18,8% e del 12,4% (Figura 3A). I livelli di LDL-C nei gruppi FP_L e FP_H sono stati significativamente ridotti (p < 0,05) rispettivamente del 13,7% e del 21,8% (Figura 3B). Per quanto riguarda il livello di HDL-C, il gruppo FP_H è aumentato significativamente (p < 0,01) da 1,81 ± 0,08 mmol / L a 2,65 ± 0,16 mmol / L, rispetto al gruppo HFD (Figura 3C). Sebbene il livello di TG sia rimasto insignificante dopo l'intervento FP, è stato ridotto rispetto al gruppo HFD (Figura 3D). Studi recenti hanno indicato che l'indice del rapporto LDL-C / HDL-C è un indice migliore di LDL-C o HDL-C da solo nel predire le malattie cardiovascolari25,26. Rispetto al gruppo HFD, il rapporto LDL-C/HDL-C è stato significativamente ridotto (p < 0,01) del 46,3% nel gruppo FP_H (Figura 3E), il che significa che l'intervento FP ha ridotto il colesterolo cattivo e aumentato i livelli di colesterolo buono. Come principale organo metabolico del grasso, il peso del fegato riflette l'accumulo di grasso nei topi in una certa misura27. Dopo 12 settimane, gli indici epatici nel gruppo FP_L e nel gruppo FP_H erano significativamente ridotti (p < 0,01) rispetto al gruppo HFD (Figura 3F). Il gruppo PC ha anche mostrato diversi gradi di riduzione in questi indicatori sopra, dimostrando che FP aveva effetti simili alle statine e l'effetto protettivo mostrava una relazione dose-risposta.
Vari studi clinici hanno rivelato che, dopo aver assunto estratto o FP intero per un po ', i livelli di TC e LDL-C sono stati significativamente ridotti. Nel frattempo, il livello di HDL-C è stato notevolmente aumentato dopo la somministrazione a lungo termine di FP28,29. Nambiar e Shetty30 hanno scoperto che il succo di FP potrebbe ridurre le lipoproteine ossidate a bassa densità, riducendo quindi notevolmente il rischio di aterosclerosi. Gopa et al.31 hanno valutato l'effetto ipolipidemico della FP in pazienti con iperlipidemia e lo hanno confrontato con simvastatina. Il trattamento con FP ha determinato una notevole riduzione di TC, LDL-C e TG e un aumento significativo dei livelli di HDL-C, simile a quello della simvastatina. In questa ricerca, FP e simvastatina hanno anche avuto effetti terapeutici simili, e l'effetto di abbassamento del colesterolo LDL e l'azione di riparazione epatica di FP erano superiori alla simvastatina.
Osservazione istopatologica epatica
L'effetto della FP sulla steatosi epatica nei topi HFD è mostrato nella Figura 4. Le sezioni patologiche del fegato nel gruppo NC esprimevano morfologia regolare degli epatociti, bordi cellulari chiaramente definiti e nessun evidente vacuolo grasso (Figura 4A,B). Comparativamente, il gruppo HFD aveva vacuoli di grasso di diverse dimensioni intorno ai vasi sanguigni e mostrava evidenti danni epatici, come caratterizzato da gonfiore cellulare, degenerazione grassa, perdita dei confini cellulari, contrazione cellulare e necrosi degli epatociti (Figura 4C, D). Come mostrato nella Figura 4E,F, l'intervento FP potrebbe migliorare la steatosi epatica, specialmente nel gruppo FP_L. Rispetto al gruppo HFD, il gruppo FP_H (Figura 4G, H) e PC (Figura 4I, J) ha avuto un certo grado di recupero della struttura delle cellule del fegato, degenerazione del grasso e riduzione del vacuolo grasso. Ciò significa che l'intervento FP può proteggere il tessuto epatico dal danno epatico indotto da HFD.
Profilazione metabolomica
Secondo il livello di lipidi plasmatici e l'osservazione istopatologica del fegato, FP ad alte dosi ha avuto un effetto migliore sull'iperlipidemia rispetto alla FP a basso dosaggio. Pertanto, NC, HFD e FP_H gruppi sono stati scelti per analizzare il loro cambiamento nel livello del metabolismo. I cromatogrammi ionici totali dei campioni di controllo qualità sono stati mostrati nella figura supplementare 4. Per garantire l'accuratezza dei dati, le caratteristiche con valori RSD >30% sono state rimosse da tutti i campioni di controllo qualità. PCA e cromatogrammi ionici hanno rispecchiato che i campioni di controllo qualità erano stabili durante il processo (Figura supplementare 5). Un totale di 626 e 562 caratteristiche nel plasma e nel fegato sono state determinate dopo la pre-elaborazione dei dati. Tra questi, 120 e 124 metaboliti nel plasma e nel fegato, rispettivamente, sono stati identificati sulla base del database KEGG. L'analisi OPLS-DA è stata utilizzata per esplorare la separazione tra i gruppi NC, HFD e FP_H. OPLS-DA ha mostrato che gli stessi campioni di gruppo si raggruppavano insieme e diversi campioni di gruppo si distinguevano bene (Figura 5A, B). Questi risultati hanno indicato che gli interventi HFD e FP hanno causato evidenti variazioni metaboliche.
Per identificare i potenziali metaboliti differenziali che hanno contribuito alla distinzione metabolica, sono state eseguite ulteriori analisi OPLS-DA e t-test rispettivamente di NC rispetto a HFD e HFD rispetto a FP_H. I risultati OPLS-DA si sono distinti bene e hanno mostrato differenze significative tra i diversi gruppi di modelli14 (Figura supplementare 6). Sulla base di VIP (Variable important in projection) >1 e p < 0,05, 32 metaboliti nel plasma hanno mostrato differenziazione tra il gruppo NC e HFD e 72 metaboliti hanno mostrato differenziazione tra il gruppo HFD e FP_H. Nel fegato, 38 metaboliti hanno mostrato differenziazione tra il gruppo NC e HFD e 17 metaboliti hanno mostrato differenziazione tra il gruppo HFD e FP_H. Infine, un totale di 16 e 6 metaboliti sono stati identificati come metaboliti differenziali in topi HFD che influenzano FP rispettivamente nel plasma e nel fegato (Figura 7 supplementare). Le informazioni su questi metaboliti sono riportate nella Tabella 2.
Per visualizzare la variazione dei metaboliti tra i tre gruppi, le mappe di calore sono state tracciate da MetaboAnalyst 5.0. Tutti i metaboliti differenziali nel plasma e nel fegato sono stati modificati nel gruppo HFD e la maggior parte di essi sono stati invertiti nel gruppo FP, indicando che l'intervento FP può migliorare il disturbo metabolico (Figura 5C,D). Inoltre, i metaboliti differenziali sono stati importati in MetaboAnalyst 5.0 per esplorare le vie metaboliche della FP nei topi HFD. Sulla base di p < 0,05 e di un impatto del pathway >0,10, il metabolismo del triptofano è stato influenzato significativamente nel plasma e i metaboliti correlati a questa via sono stati D-triptofano e L-chinurenina (Figura 5E). Jung et al.32 hanno studiato che l'iperlipidemia prolungata può abbassare i livelli sierici di chinurenina. Il metabolismo della taurina e dell'ipotaurina è stato influenzato in modo significativo nel fegato e il metabolita correlato correlato è stato la taurina (Figura 5F). La taurina è un aminoacido importante e necessario nel corpo animale; Dong et al.33 hanno studiato che la taurina potrebbe ridurre leggermente il danno dei lipidi nel sangue e ridurre il rischio di aterosclerosi causato dall'HFD. In questa ricerca, l'intervento FP ha aumentato il contenuto di L-chinurenina e taurina, che è positivamente correlato alla riduzione dei livelli lipidici, sostenendo l'efficacia della FP contro l'iperlipidemia.
Analisi integrata di farmacologia di rete e metabolomica
Una strategia integrata di farmacologia di rete combinata con la metabolomica è diventata sempre più indispensabile nello studio dei meccanismi di malattia e delle strategie di intervento. È stata stabilita la rilevanza tra farmacologia di rete e metabolomica con prove limitate. Per ottenere una visione completa del meccanismo della FP contro l'iperlipidemia, sono state costruite le reti di interazione basate sulla farmacologia e la metabolomica di rete. I metaboliti differenziali sono stati importati nel plugin MetScape in Cytoscape e hanno abbinato i geni hub identificati nella farmacologia di rete per raccogliere le reti composto-reazione-enzima-gene (Figura 6). Come mostrato nella Tabella 3, nei metaboliti plasmatici, la L-chinurenina e il corticosterone erano correlati al CYP1A1, che può catalizzare la perossidazione lipidica e indurre la steatosi epatica non alcolica34,35; Le vie interessate erano rispettivamente il metabolismo del triptofano e la biosintesi degli ormoni steroidei. L'acetilcolina era correlata all'AChE e influenzava il metabolismo dei glicerofosfolipidi. Nei metaboliti epatici, MGAM e raffinosio erano correlati al metabolismo del galattosio. Diversi studi hanno dimostrato che l'assunzione di oligosaccaridi della famiglia dei raffinosii potrebbe migliorare i disturbi metabolici nei topi HFD36.
Inoltre, è stata costruita la rete ingredienti-bersagli-metaboliti-percorsi (Figura 7). Negli ingredienti, la quercetina ha collegato la maggior parte dei bordi, indicando che la quercetina di FP svolge il ruolo più importante nell'abbassare i lipidi. L'analisi sopra integrata ha rivelato i principali obiettivi, metaboliti e percorsi della FP contro l'iperlipidemia, che potrebbero essere la base per ulteriori studi sul meccanismo terapeutico di questo medicinale e sull'applicazione clinica.
Docking molecolare
Per studiare ulteriormente la possibilità di interazione tra gli ingredienti selezionati e gli obiettivi chiave, è stato utilizzato il docking molecolare per analizzare le loro interazioni ligando-sito attivo. Il software AutoDock Vina (vedi Tabella dei materiali) è stato utilizzato per eseguire l'aggancio molecolare e la prima posa di aggancio è stata emessa in base al rango della funzione di punteggio. I risultati dell'ancoraggio sono illustrati nella Figura 8.
Nell'analisi integrata, CYP1A1, AChE e MGAM erano correlati ai metaboliti differenziali; Hanno costruito ponti tra bersagli e metaboliti. È stato eseguito un ulteriore docking molecolare per verificare la relazione tra il bersaglio e gli ingredienti. I risultati dell'attracco degli ingredienti con CYP1A1 sono stati i seguenti: l'acido gallico ha formato quattro legami idrogeno attraverso i residui di amminoacidi Asn-185, Tyr-187, Asn-219 e His-500 e ha formato l'interazione di impilamento π-π attraverso il residuo amminoacidico Tyr-187 (Figura 8A); la quercetina ha formato tre legami idrogeno attraverso Asn-185, Asn-219 e His-500, l'interazione idrofobica e l'interazione di impilamento π-π attraverso Tyr-187 (Figura 8B); Il beta-sitosterolo ha formato quattro legami idrogeno attraverso Arg-362, Ser-363, Leu-365 e Arg-464 e l'interazione idrofobica attraverso Glu-369 e Ile-439 (Figura 8C). Le energie di legame erano rispettivamente di 5,3, 7,0 e 7,3 kcal/-mol. Nell'interazione con AChE, l'acido gallico è stato stabilizzato da legami idrogeno con Arg-237, Arg-238 e Arg-480 (Figura 8D); la quercetina è stata stabilizzata dai legami idrogeno con Arg-237 e Phe-474, dall'interazione idrofobica con Phe-157 e dall'interazione di impilamento π-π con Tyr-478 (Figura 8E); il beta-sitosterolo è stato stabilizzato dall'interazione idrofobica con Phe-157, Val-244, Ile-248, Phe-474, Ala477 e TYR478 (Figura 8F). Le energie di legame erano rispettivamente di 5,0, 6,5 e 8,0 kcal/- mol. Nell'interazione con MGAM, l'acido gallico è stato stabilizzato dai legami idrogeno con Ile-1716, Gly-1747 e Trp-1749, e dall'interazione idrofobica con Tyr-1715 e Trp-1749 (Figura 8G); la quercetina è stata stabilizzata dai legami idrogeno con Arg-1311, Thr-1726, Gln-1731 e Trp-1752, dai legami idrogeno con Arg-1730 e dall'impilamento π-π con His-1727 (Figura 8H); il beta-sitosterolo è stato stabilizzato dall'interazione idrofobica con Pro-1159, Trp-1355, Phe-1427 e Phe-1560, Le energie di legame erano rispettivamente 5,9, 8,1 e 6,9 kcal / mol. Informazioni dettagliate sulle interazioni e sulle affinità di legame sono riportate nella Tabella 4. Siti di legame multipli e alte energie di legame spiegano le elevate affinità tra ingredienti e bersagli proteici, verificando che questi ingredienti svolgono il ruolo di abbassare i lipidi agendo su bersagli correlati all'iperlipidemia.
Figura 1: Diagramma di flusso schematico della strategia integrata. Gli ingredienti e i geni dell'hub sono stati estratti mediante farmacologia di rete (Parte 1). I metaboliti differenziali della FP contro l'iperlipidemia sono stati analizzati mediante metabolomica plasmatica ed epatica (Parte 2). I bersagli, i metaboliti e i percorsi chiave sono stati identificati e collegati sulla base di un'analisi integrata della Parte 1 e della Parte 2 (Parte 3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Screening del target, costruzione della rete e analisi dell'arricchimento dell'effetto della FP contro l'iperlipidemia . (A) Diagramma di Venn dei bersagli dell'iperlipidemia FP. (B) Potenziale rete attiva farmaco-ingredienti-bersaglio-malattia: diversi simboli di colore come menzionato qui: malattia (rosso), farmaco (blu), ingredienti (verde) e bersagli (giallo). (C) Rete PPI per STRING. (D) Analisi dell'arricchimento del pathway GO. (E) Analisi dell'arricchimento del pathway KEGG. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: L'effetto della FP sui livelli plasmatici di lipidi e sull'indice epatico nei topi con iperlipidemia indotta da HFD (n = 6). (A) Livelli di TC. b) livelli di LDL-C. (C) livello HDL-C. (D) Livello TG. (E) Il rapporto LDL-C/HDL-C. (F) Indici epatici.*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Le differenze statisticamente significative sono state valutate utilizzando un ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Dunnett o dall'analisi post hoc. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: L'effetto della FP sul tessuto epatico nei topi con iperlipidemia indotta da HFD (colorazione H & E). (A,B) gruppo NC, (C,D) gruppo HFD, (E,F) gruppo FP_L, (G,H) gruppo FP_H, (I,J) gruppo PC (n = 6). Barra della scala: (A,C,E = 200 μm; B,D,F = 50 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: I grafici del punteggio OPLS-DA, le mappe di calore e le vie metaboliche dei metaboliti differenziali. Il punteggio OPLS-DA traccia FP su topi HFD nel plasma (A) e nel fegato (B). Le mappe di calore dei metaboliti differenziali nel plasma (C) e nel fegato (D). Le vie metaboliche dei metaboliti differenziali nel plasma (E) e nel fegato (F). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Le reti composto-reazione-enzima-gene dei principali metaboliti e bersagli. I nodi di basso grado sono stati rimossi. Gli esagoni rossi, i cerchi blu, i rettangoli verdi rotondi e i diamanti grigi rappresentano rispettivamente i composti attivi, i geni, le proteine e le reazioni. Gli obiettivi chiave e i metaboliti sono stati ingranditi. I percorsi con lo sfondo bianco sono significativamente regolati nel plasma. Il percorso con lo sfondo grigio è significativamente regolato nel fegato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: La rete ingredienti-bersagli-metaboliti-percorsi. Più scuro è il colore, più i bordi sono collegati, il che significa che il nodo è più importante in questa rete. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: I diagrammi di interazione degli ingredienti FP e gli obiettivi chiave . (A) Acido gallico che agisce sul CYP1A1. (B) Quercetina che agisce sul CYP1A1. (C) Beta-sitosterolo che agisce sul CYP1A1. D) acido gallico che agisce sull'AChE. E) Quercetina che agisce sull'AChE. (F) Azione beta-sitosteroling sull'AChE. G) Acido gallico che agisce sulla MGAM. H) quercetina che agisce sulla MGAM. (I) Beta-sitosterolo che agisce su MGAM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Panoramica del risultato FP contro iperlipidemia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Gli ingredienti selezionati dell'estratto acquoso FP. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: I metaboliti differenziali tra i tre gruppi. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Le informazioni sui principali bersagli, metaboliti e percorsi. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Siti di legame e forze d'azione tra ingredienti FP e proteine bersaglio. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Figura supplementare 1: I cromatogrammi ionici positivi e negativi dell'estratto acquoso FP. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: La rete ingrediente-bersaglio-percorso-malattia del PQ di BATMAN-TCM. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: L'analisi di frequenza dei geni hub nella farmacologia di rete. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 4: Cromatogrammi ionici di campioni di QC plasmatici ed epatici. I cromatogrammi ionici rappresentativi positivi (A) e negativi (B) dei campioni plasmatici di controllo qualità. I cromatogrammi ionici rappresentativi positivi (C) e negativi (D) dei campioni di controllo qualità del fegato. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 5: I grafici del punteggio PCA dei campioni di QC plasmatico (A) e fegato (B). Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 6: I grafici del punteggio OPLS-DA dei campioni di plasma (A e B) e fegato (C e D). Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 7: Diagrammi di Venn dei metaboliti differenziali nei campioni plasmatici (A) e di fegato (B). Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Negli ultimi anni, il tasso di incidenza di iperlipidemia è aumentato, principalmente a causa di abitudini alimentari malsane a lungo termine. La MTC e i suoi ingredienti chimici hanno varie attività farmacologiche, che sono state ampiamente studiate negli ultimi anni37,38. FP è una sorta di risorsa di frutta, utilizzata sia come medicina che come cibo, e ha un potenziale importante per il trattamento dell'iperlipidemia. Tuttavia, il potenziale meccanismo terapeutico della FP contro l'iperlipidemia necessita di ulteriori studi.
La farmacologia di rete valuta gli effetti polifarmacologici dei farmaci a livello molecolare e predice l'interazione di prodotti naturali e proteine per determinare il meccanismo principale39. Il primo passo è selezionare i principi attivi e gli obiettivi chiave del farmaco. In questa ricerca sono stati trovati nove principi attivi e 62 geni hub. Per comprendere ulteriormente il meccanismo molecolare della FP sull'iperlipidemia, sono state stabilite reti PPI e ingrediente-bersaglio sulla base dell'analisi farmacologica della rete. Per restringere la portata degli ingredienti chiave e degli obiettivi, tre ingredienti chiave (acido gallico, quercetina e beta-sitosterolo) correlati all'ipercolesterolemia e all'aterosclerosi coronarica sono stati fondati da BATMAN-TCM. Tutti questi ingredienti potrebbero ridurre i livelli di LDL-C o aumentare i livelli di HDL-C, convalidando gli effetti specifici della FP sull'iperlipidemia. Inoltre, secondo l'analisi di arricchimento di KEGG, la funzione della FP sull'iperlipidemia è correlata all'attività della via lipidica e aterosclerotica. Sebbene questo metodo dipenda troppo dal database e manchi di verifica sperimentale, ha valore teorico e fornisce idee per la successiva ricerca di verifica sperimentale.
Per un'ulteriore convalida sperimentale, i topi sono stati nutriti con una dieta integrata di grassi per 8 settimane per indurre iperlipidemia. I risultati hanno mostrato che i livelli plasmatici di TC, LDL-C e TG erano significativamente aumentati. Sebbene il livello di HDL-C sia diminuito in modo significativo, il rapporto tra LDL-C e HDL-C è aumentato in modo significativo. Le osservazioni istopatologiche hanno mostrato che il tessuto epatico dei topi HFD era gravemente danneggiato, ma non c'era un aumento significativo dell'indice epatico; Può darsi che i cambiamenti nel peso corporeo e nel peso viscerale richiedano più tempo. I lipidi e le alterazioni epatiche hanno mostrato adeguatamente l'effetto di intervento della FP sull'iperlipidemia. Tuttavia, il meccanismo interno dell'effetto di intervento deve ancora essere esplorato ulteriormente.
La metabolomica fornisce un elenco di potenziali metaboliti e percorsi correlati, che mirano ad esplorare il meccanismo delle malattie metaboliche e l'azione dei farmaci terapeutici40. Il risultato della metabolomica può essere influenzato dal tipo di campione. Considerando le caratteristiche patogenetiche dell'iperlipidemia, campioni di plasma e fegato sono stati scelti per l'analisi metabonomica in questa ricerca. Secondo i risultati OPLS-DA, i metaboliti dei gruppi NC, HFD e FP_H sono stati ben discriminati. Un totale di 16 metaboliti differenziali sono stati trovati nel plasma e 6 metaboliti differenziali sono stati trovati nel fegato. C'erano più metaboliti colpiti nel plasma che nel fegato, dimostrando che il sangue è il principale luogo di disturbo metabolico indotto da iperlipidemia. L'intervento FP può invertire il cambiamento di questi metaboliti sotto l'influenza dell'HFD. Inoltre, questi metaboliti differenziali sono stati importati nella banca dati KEGG. Le vie metaboliche significative dei metaboliti differenziali nel plasma erano il metabolismo del triptofano e nel fegato il metabolismo della taurina e dell'ipotaurina. In questa ricerca, l'intervento FP ha aumentato il contenuto di L-chinurenina del metabolismo del triptofano e il contenuto di taurina del metabolismo della taurina e dell'ipotaurina, il che significa che FP potrebbe essere efficace nel regolare favorevolmente i disturbi metabolici e l'iperlipidemia. L'analisi metabolomica ha rivelato quali metaboliti erano correlati all'iperlipidemia o all'intervento FP e ha determinato il meccanismo a valle dell'effetto FP.
Combinando il risultato della farmacologia di rete con la metabolomica, sono stati identificati tre bersagli chiave (CYP1A1, AChE e MGAM) nelle reti composto-reazione-enzima-gene. Secondo l'analisi di docking molecolare, questi bersagli hanno mostrato elevate affinità con gli ingredienti FP (acido gallico, quercetina e beta-sitosterolo). Quattro metaboliti (L-chinurenina, corticosterone, acetilcolina e raffinosio) e quattro vie correlate (metabolismo del triptofano, biosintesi degli ormoni steroidei, metabolismo dei glicerofosfolipidi e metabolismo del galattosio) sono stati identificati come metaboliti chiave e vie metaboliche. Tra questi, la quercetina è stata associata alla maggior parte degli obiettivi e il metabolismo del triptofano è apparso sia nella metabonomica che nei risultati integrati. Svolgono il ruolo più essenziale nell'effetto terapeutico della FP contro l'iperlipidemia. Il risultato del docking molecolare ha mostrato che CYP1A1, AChE e MGAM hanno un'alta affinità con gli ingredienti. I risultati di cui sopra dimostrano che questi bersagli sottoposti a screening sono strettamente correlati all'effetto terapeutico della FP.
Nella presente ricerca, l'acido gallico, la quercetina e il beta-sitosterolo sono stati identificati come principi attivi FP verso l'anti-iperlipidemia e il metabolismo del triptofano è la principale via metabolica della terapia FP nei topi HFD. La panoramica del risultato è illustrata nella Figura 9. Questa ricerca ha offerto dati e supporto teorico per ulteriori studi sui meccanismi e ha fornito una base per l'applicazione clinica della medicina FP. Ha anche dimostrato che il cibo naturale potrebbe essere un'opzione promettente con grandi prospettive nella pratica clinica. Tuttavia, ci sono ancora alcune carenze in questa ricerca. L'effetto terapeutico del solo principio attivo sull'iperlipidemia non è stato verificato. Inoltre, il percorso degli obiettivi chiave non è stato studiato; Ha anche bisogno di ulteriori esperimenti sistematici di biologia molecolare per verificare il meccanismo accurato.
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Disclosures
Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata dal Product Development and Innovation Team di TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) e Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 101-3B Oven | Luyue Instrument and Equipment Factory | \ | |
| 80312/80302 Glass Slide | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| 80340-1630 Cover Slip | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A998 | Version 1.5.6 |
| ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Aethanol | Fisher Chemical | A995 | Version 3.0 |
| Ammonia Solution | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1336-21-6 | Version 3.9.1 |
| AutoDockTools | Scripps Institution of Oceanography | \ | |
| BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | \ | |
| Compound Discoverer | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | \ | |
| DM500 Optical Microscope | Leica | \ | |
| DV215CD Electronic Balance | Ohaus Corporation ., Ltd | T15A63 | |
| Ethyl Alcohol | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 64-17-5 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A118 | |
| HDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A112-1-1 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL700B | |
| High Fat Diet | ENSIWEIER | 202211091031 | |
| Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge | Hitachi., Ltd. | \ | |
| Homogenizer | Oulaibo Technology Co., Ltd | \ | |
| Hydrochloric Acid | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 7647-01-0 | |
| Image-forming System | LIOO | \ | |
| JB-L5 Freezer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JB-L5 Tissue Embedder | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JK-5/6 Microtome | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JT-12S Hydroextractor | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| KQ3200E Ultrasonic Cleaner | Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd | \ | |
| LDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A113-1-1 | |
| Male C57BL/6 Mice | SBF Biotechnology Co., Ltd. | \ | Version 2.3.2 |
| Neutral Balsam | Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd | 10021190865934 | |
| Pure Water | Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd | GB19298 | |
| PyMOL | DeLano Scientific LLC | \ | Version 14.1 |
| RE-3000 Rotary Evaporator | Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd | \ | |
| RM2016 Pathological Microtome | Shanghai Leica Instruments Co., Ltd | \ | Version 26.0 |
| SIMCA-P | Umetrics AB | \ | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme., Ltd | 14202220051 | |
| SPSS | International Business Machines Corporation | \ | |
| TC Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
| TG Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
| UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Vortex Vibrator | Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. | LC-Vortex-P1 | |
| Xylene | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1330-20-7 |
References
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