Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

Dieses Video zeigt ein Protokoll zur Visualisierung der DNA-Replikation durch optische Weitfeldmikroskopie, linearisiertes und chemisch modifiziertes Lambda. Die DNA wird an einem funktionalisierten Glasdeckglas befestigt. Das freie Ende der DNA wird mit Kügelchen markiert und die DNA durch laminare Strömung gedehnt.

Wenn die Replikation eingeleitet wird, beginnt sich der führende Strang zu verlängern und der nacheilende Strang verkürzt sich aufgrund des Aufwickelns. Der große Längenunterschied zwischen doppelsträngiger und einzelsträngiger DNA bei geringen Kräften ermöglicht eine direkte Beobachtung der DNA-Umwandlungen während der Replikation. Die Länge des DNA-Konstrukts wird durch die Verfolgung der Position des Kügelchens überwacht, was eine genaue Bestimmung der Geschwindigkeit und des Prozesses der DNA-Replikation ermöglicht.

Hallo, ich bin Ari Ulrich von den Laboratorien von Anto one Vanian und Charles Richardson in der Abteilung für Biologische Chemie und Molekulare Pharmakologie an der Harvard Medical School. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Abbildung der DNA-Replikation auf einzelmolekularer Ebene. Wir verwenden dieses Verfahren in unseren Laboren, um enzymatische Aktivitäten zu untersuchen, die während der DNA-Synthese stattfinden.

Fangen wir also an Zu Beginn dieses Verfahrens. Die Lambda-DNA linearisierter Bakterienphagen wird durch kniende Oligonukleotide modifiziert, um eine Replikationsgabel, einen Lambda-Komplementärgabelarm, einen biotinylierten Gabelarm und einen Gabelprimer zu bilden. Der biotinylierte Gabelunterarm enthält ein Biotin t, das an seinen fünf Primzahlen befestigt ist und das Anbinden des DNA-Templates an die Oberfläche der Durchflusszelle ermöglicht.

Die Lambda-DNA wird durch Annealing weiter modifiziert, ein weiteres Oligonukleotid, das ein Diggen und eine Einheit enthält, die als hochaffines Immun-Tag für die Anheftung einer Perle dienen. Um die Replikationsgabel zu erzeugen, erhalten Sie Lambda-DNA zusätzlich zu mehreren Oligonukleotiden, deren Sequenzen in dem schriftlichen Protokoll zu diesem Video zu finden sind. Diese Oligonukleotide umfassen einen biotinylierten Gabelarm, einen Lambda-Komplementärgabelarm, einen Gabelprimer und ein Lambda-Komplementärdigen Diggen und ein Phosphorylat an den fünf Primzahlen des Lambda-Komplementärgabelarms und das Lambda-Komplementär-Digo-Genin-Ende unter Verwendung der T-4-Polynukleotidkinase.

Als nächstes mischen Sie den phosphorylierten Lambda-Komplementärgabelarm, den biotinylierten Gabelarm, den Gabelprimer und die Lambda-DNA im molaren Verhältnis von 10 zu 10 bis 100 zu eins. In T-vier-DNA-Ligase-Puffer erhitzen Sie das Gemisch fünf Minuten lang auf 65 Grad Celsius und kühlen es langsam auf Raumtemperatur ab, indem Sie den Heizblock ausschalten, um ein ordnungsgemäßes Glühen der Oligonukleotide und der T-vier-DNA-Ligase in das Gemisch zu ermöglichen, und zwei Stunden lang inkubieren. Bei Raumtemperatur katalysiert die T-vier-DNA-Ligase die Versiegelung der Kerben zwischen den Oligonukleotiden und dem Lambda.

DNA schließlich das Lambda-Komplementär-Diggen anil und Ende der DNA-Replikationsschablone, indem man das phosphorylierte Lambda-Komplementärdiggen hinzufügt, und in T-Vier-Ligase-Puffer endend, das Gemisch 30 Minuten lang bei 45 Grad Celsius inkubiert und wieder langsam auf Raumtemperatur abkühlt, indem man den Wärmeblock ausschaltet, den phosphorylierten Lambda-Komplementärsauerstoff ligiert und die DNA-Replikationsschablone durch Zugabe von T-4-DNA-Ligase zu der Mischung beendet und Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Das endgültige DNA-Replikations-Template ist nun einsatzbereit. Um die quastenaktivierten magnetischen Kügelchen an das DNA-Replikations-Template zu binden, müssen sie mit einem FAB-Fragment funktionalisiert werden, das spezifisch für Digo-Genin ist.

Um diesen Vorgang zu starten, resuspendieren Sie die Stammlösung der Kügelchen und geben Sie 400 Mikroliter in ein Einor-Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen in einen Magnetabscheider und inkubieren Sie, bis die Lösung klar ist. Entfernen Sie dann den Überstand durch Pipettieren Um die Toalgruppen für die Antikörperkopplung zu aktivieren, fügen Sie einen Milliliter Boidpuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.

Auch hier ist der Überstand mit Hilfe eines Magnetabscheiders zu entfernen. Fügen Sie als nächstes 240 Mikroliter FAB-Fragment hinzu und resuspendieren Sie die Kügelchen in 400 Mikrolitern Boratpuffer. Gründlich mischen und 16 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius auf einem Rotator inkubieren lassen.

Trennen Sie die Kügelchen nach der Inkubation mit dem Magnetabscheider und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen mit einem Milliliter Waschpuffer und inkubieren Sie sie fünf Minuten bei vier Grad Celsius, entfernen Sie den Puffer mit dem Magnetabscheider. Diese Wäsche wird zweimal wiederholt.

Um die freien Tosilgruppen zu blockieren, fügen Sie einen Milliliter BSA mit Tris-Puffer hinzu und inkubieren Sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation den Puffer mit einem Magnetseparator von den Kügelchen entfernen, zweimal mit Puffer und Aliquot waschen. Für die Verwendung wird die zu replizierende DNA an Glasabdeckgläser angehängt, die mit Amil lane funktionalisiert sind.

Die Oxygruppe der Amil-Lane bindet an das Glas, so dass ein Amin für die Bindung an biotinylierte Peg-Moleküle zur Verfügung steht. Diese Beschichtung trägt dazu bei, unspezifische Bindungen an die Oberfläche zu reduzieren. Um die Glasabdeckgläser gründlich zu reinigen, legen Sie sie in Färbegläser und füllen Sie die Gläser mit Ethanol-Ultraschall.

Spülen Sie die Gläser 30 Minuten lang aus und füllen Sie sie 30 Minuten lang mit einem molaren Kaliumhydroxid und wiederholen Sie beide Wäschen. Für die erste Funktionalisierungsreaktion müssen alle Spuren von Wasser entfernt werden. Füllen Sie die Färbegläser mit Aceton und beschallen Sie es 10 Minuten lang.

Leere die Gläser und fülle sie erneut mit Aceton. Fahren Sie fort, das Sinusreagenz in die Gläser zu geben und zwei Minuten lang zu rühren. Dann mit einem großen Überschuss an Wasser abschrecken.

Dann trocknest du die Deckgläser, indem du sie bei 110 Grad Celsius im Ofen für 30 Minuten backst. Bereiten Sie anschließend die Stiftmischung mit etwa 0,2 % Gewicht pro Volumen vor. Biotinylierter Stift, einschließlich eines Abstandshalters aus Glas, ermöglicht die Trennung der Deckgläser, pipettieren Sie 100 Mikroliter auf einen trockenen, siloisierten Deckglas.

Legen Sie einen zweiten Decklaschen darauf. Inkubieren Sie die Deckgläser drei Stunden lang in der PEG-Lösung. Trennen Sie dann jedes Paar Deckgläser und waschen Sie es ausgiebig mit Wasser.

Achten Sie darauf, die Deckgläser mit der funktionalisierten Seite nach oben zu halten, da nur eine Seite mit Stift beschichtet wird. Zum Schluss trocknen Sie die Deckgläser mit Druckluft und lagern sie unter Vakuum. In einem Trockenmittel bleiben die Oberflächen mindestens einen Monat lang stabil. So können Dutzende von Deckgläsern in einer Charge hergestellt und bei Bedarf verwendet werden.

Nachdem nun die Deckgläser fertig sind, kann man die Strömungskammer für das Einzelmolekülexperiment zusammenbauen. Das Einzelmolekülexperiment wird mit einer einfachen Strömungskammer durchgeführt, die aus einem funktionalisierten Deckglas, doppelseitigem Klebeband, einem Quartschieber und einem Schlauch besteht. Für jedes Einzelmolekülexperiment wird eine Strömungskammer vorbereitet.

Beginnen Sie damit, fünf Milliliter Blockierungspuffer und 20 Milliliter Arbeitspuffer zu mischen und die Mischung in ein Trockenmittel zu geben, um alle Luftblasen für spätere Schritte zu entfernen. Als nächstes verteilen Sie 100 Mikroliter einer Arbeitslösung von strp din in PBS über die Oberfläche des peg funktionalisierten Deckglases inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur, damit strp din Oberflächenbiotin binden kann. Schneiden Sie in der Zwischenzeit ein Stück doppelseitiges Klebeband entsprechend der Größe des Quarzschiebers ab und markieren Sie die Position der Schlauchlöcher auf dem Band.

Umreißen Sie die Strömungskammer, indem Sie einen drei Millimeter breiten Mittelkanal und Rechtecke zeichnen, die beide Löcher enthalten. Die Strömungskammern können mit zwei Einlass- und zwei Auslasskanälen ausgeführt werden. Schneiden Sie nun das markierte Klebeband entlang der gezeichneten Umrisse ab und machen Sie gerade, saubere Schnitte, um sicherzustellen, dass kein Klebstoff in den Kanal hineinragt.

Reinigen Sie den Quarzobjektträger gründlich mit Aceton, um den Klebstoff von der Durchflusszellenkonstruktion zu entfernen, die in früheren Experimenten verwendet wurde. Finden Sie die beste Ausrichtung des Kanalumrisses. Entfernen Sie eine Seite der Klebefolie und legen Sie das Klebeband vorsichtig auf die Rutsche.

Achten Sie darauf, das Klebeband richtig auszurichten, da die Einlass- und Auslasslöcher frei bleiben müssen. Bereiten Sie als Nächstes die Schlauchabschnitte mit einem Innendurchmesser von 0,76 Millimetern für den Einlass und Auslass der Durchflusszelle vor. Schneiden Sie das Ende des Rohrs in einem Winkel von etwa 30 Grad ab, damit das Rohr nicht flach gegen den Kammerboden drückt.

Hängen Sie den Schlauch an Reagenzglasgestelle auf, um ihn in den nächsten Schritten einfach an der Durchflusszelle zu befestigen. Inzwischen sollte die Inkubation des Deckglases abgeschlossen sein. Spülen Sie den Bezug aus, gleiten Sie ihn gründlich mit Wasser ab und trocknen Sie ihn mit Druckluft ab.

Achten Sie darauf, den Eindeckbezug nicht umzudrehen, da nur eine Seite mit Stift funktionalisiert ist. Schließen Sie die Montage der Durchflusskammer ab, indem Sie die andere Seite der Bandunterlage entfernen und den Quarzschieber auf den Deckglas legen. Drücken Sie leicht auf den Deckglas, um die im Klebstoff eingeschlossene Luft herauszudrücken. So verhindern Sie, dass Luftblasen in den Strömungskanal gelangen.

Versiegeln Sie die Seiten der Kammer mit Epoxidharz. Führen Sie den abgeschnittenen Schlauch in die Löcher des Quarzes ein und verschließen Sie ihn mit dem Epoxidharz. Einige Minuten trocknen lassen.

Nach dem Trocknen ziehen Sie mit einer 21-Gauge-Nadel einen Teil des DGA-Blockierungspuffers durch eines der Röhrchen, um die Kammeroberfläche zu blockieren. Spülen Sie die Kammer einige Male aus, um Luftblasen zu entfernen, und lassen Sie die Kammer mindestens 30 Minuten lang inkubieren, bevor Sie mit dem Einzelmolekül-Replikationsexperiment fortfahren. Sobald die DNA-Template-funktionalisierten Kügelchen und die Durchflusskammer vorbereitet sind, kann ein Einzelmolekülexperiment durchgeführt werden.

Platzieren Sie zunächst die Durchflusszelle auf dem Mikroskoptisch. Halten Sie die Kammer mit Tischclips fest und stellen Sie sicher, dass der Strömungskanal in einer Linie mit der CCD-Kamera positioniert ist. Anschluss an eine zuvor konstruierte Luftfederung an der Spritzenpumpe und an den Auslassschläuchen der Durchflusszelle.

Legen Sie die Einlassschläuche der Durchflusszelle mit einem Verbindungsschlauch mit größerem Durchmesser in einen Blockierungspuffer und ziehen Sie die Spritze zurück, um Luftblasen aus den Schläuchen zu entfernen, und schnippen Sie vorsichtig mit den Auslassschläuchen, um alle in der Durchflusszelle eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen. Sobald alle Luftblasen entfernt wurden, verschließen Sie eines der Einlassröhrchen mit einer Nadel und verschließen Sie eines der Auslassröhrchen, indem Sie es um 180 Grad biegen und mit Klebeband sichern. Bevor Sie der Zelle DNA hinzufügen, verdünnen Sie das Stamm-DNA-Template auf 10 Picomolare in einem Milliliter DGAs one x Blocking-Puffer. Fließen Sie das Template mit einer moderaten Durchflussrate in die Kammer, um eine gute Oberflächenabdeckung der DNA zu ermöglichen.

Verdünnen Sie die Stammperlenlösung auf zwei- bis viermal 10 der sechsten Kügelchen pro Milliliter. In einem Milliliter DGAs ein x Blocking-Puffer. Dann die Mischung vortexen und 20 Sekunden lang beschallen.

Lassen Sie die verdünnte Bead-Lösung in die Kammer. Sobald die Kügelchen hinzugefügt wurden, schalten Sie den Durchfluss aus und lassen Sie die Kammer das Gleichgewicht erreichen. Schließen Sie dann beide Auslassrohre.

Jede Veränderung an den Röhrchen, ohne dass die Kammer geschlossen ist, führt zu Druckschwankungen, die eine starke Kraft auf die Kügelchen ausüben und die angebundenen DNA-Moleküle scheren. Verstopfen Sie das Einlaufrohr, das zum Laden der Perlen verwendet wurde, mit einer Nadel mit dem zweiten Einlassrohr. Beginnen Sie mit dem ausgiebigen Waschen der Durchflusszelle mit DGAs one x Lösung zur Blockierung der Pufferwäsche.

Rühren Sie die Bühne durch Klopfen, um alle Perlen zu entfernen, die nicht spezifisch an der Oberfläche haften, um sie zu überprüfen. Die Kügelchen sind an die DNA gebunden. Versuchen Sie, die Richtung der Strömung zu ändern.

Sobald die freien Kügelchen ausreichend entfernt sind, schalten Sie den Durchfluss aus und lassen Sie die Kammer ins Gleichgewicht kommen. Bereiten Sie ein frisches Reaktionsgemisch vor, das Replikationsproteine enthält, wie im Textprotokoll angegeben. Schließen Sie das geöffnete Auslaufrohr und schalten Sie den Einlaufbehälter auf das frisch zubereitete Reaktionsgemisch um.

Langsames Öffnen des Auslasses, um schnelle Druckänderungen zu vermeiden und mit der enzymatischen Reaktion fortzufahren. Fließen Sie zunächst die Proteinlösung mit einer moderaten Durchflussrate in die Kammer, um eine effiziente Bindung an die DNA zu ermöglichen. Schalten Sie den Durchfluss aus und lassen Sie die Kammer ins Gleichgewicht kommen.

Die Auslassrohre verschließen und das Rohr mit dem Reaktionsgemisch wieder einsetzen. Waschen Sie mit dem Röhrchen, das aus dem Waschpuffer von DGA besteht, die Kammer, um nach dem Waschen freie Proteine zu entfernen. Schalten Sie den Durchfluss wieder aus und lassen Sie die Kammer ins Gleichgewicht kommen.

Schließen Sie die Auslassrohre und ersetzen Sie das Rohr mit dem Waschpuffer. Während das Röhrchen den T-Sieben-Replikationspuffer enthält, enthält der T-Sieben-Replikationspuffer Magnesiumchlorid, das den Start der Replikationsreaktion auslöst. Verwenden Sie eine Flussrate von 0,012 Millilitern pro Minute, die einer Bremskraft von drei Pico-Newin-Gurten auf die DNA-Haltegurte entspricht, unter den in diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen.

Platzieren Sie vor der Bildgebung einen Seltenerd-Permanentmagneten über der Durchflusszelle, um unspezifische Wechselwirkungen zwischen den Kügelchen und der Oberfläche zu verhindern. Positionieren Sie eine Faserbeleuchtung in einem Einfallswinkel zwischen 10 Grad und parallel zum Mikroskoptisch in der Nähe des Mikroskopsichtfeldes mit einem 10-fach-Objektiv und einer CCD-Kamera. Die Dunkelfeldbeleuchtung wird verwendet, um den Kontrast im Fokus der Perlenabbildung mit einer angebundenen Perle zu erhöhen.

Beginnen Sie mit der Datenerfassung und erfassen Sie 20 bis 30 Minuten lang mit einer langsamen Bildrate. In einem erfolgreichen Experiment können 100 Kügelchen gleichzeitig beobachtet werden. Das Experiment sollte zahlreiche Spuren liefern, die auf eine führende DNA-Synthese hinweisen.

Um die Geschwindigkeit und den Prozess der DNA-Abwicklung und Polymerisation zu messen, müssen die genauen Positionen der Kügelchen bestimmt werden, um dies zu erreichen. Passen Sie diese Positionen mit zweidimensionalen Gaußschen Funktionen an. Visualisieren Sie die Trajektorie, indem Sie die Raupenposition in jedem Frame mithilfe der Tracking-Software verfolgen.

Plotten Sie dann die Position der Raupe als Funktion der Zeit mit einer beliebigen Grafiksoftware, um Ratendaten zu erhalten. Passen Sie die Diagramme mit einer linearen Regression an, und berechnen Sie die Steigung für prozessiv. Bestimmen Sie die Gesamtlänge der DNA vom Anfang bis zum Ende eines Verkürzungsereignisses.

Kombinieren Sie alle Einzelmessungen, und die Plotraten- und Produktivitätsverteilungen passen die Daten mit Gaußschen bzw. einfachen Exponentialfunktionen an. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Geschwindigkeit und den Prozess der DNA-Replikation auf der Ebene eines einzelnen Moleküls messen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig sicherzustellen, dass die Kraft und bestimmte Einsätze der Laminaströmung die enzymatischen Aktivitäten der Replikationsproteine nicht beeinflussen.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Spaß bei Ihren Experimenten.