Name: Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeitbeobachtung von DNA-Replikation mit Einzelmolekül-Stretching-Assay und Weitfeldoptik. Diese Methode ermöglicht präzise Analyse von Replikationsdynamik und Enzymaktivität.

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Die Entwicklung der DNA Stretching Assay wurde durch Paul Blainey, Jong-Bong Lee, und Samir Hamdan unterstützt. Diese Arbeit wird durch die National Institutes of Health gewährt Charles Richardson (GM54397) und Antoine van Oijen (GM077248) unterstützt.

<ol><li>Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primase+acts+as+a+molecular+brake+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication.</a> Nature. 439, 621-624 (2006).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+Grafted+to+Silicon+Surfaces%3A+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
</ol>

Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Zugkraft auf Kügelchen von Laminar-Flow ausgeübt hat keinen Einfluss auf enzymatische Aktivitäten der Replikation Proteine. Zum Beispiel hat ein 3 pN Kraft, die zu einem Durchfluss von 0,012 ml / min entspricht nicht berührt Replikation der DNA-Strang führt. Es hat jedoch Auswirkungen auf enzymatische Aktivitäten, die während koordiniert die DNA-Synthese, und es muss daher auf 1,5 pN reduziert werden. Die Zugkraft kann durch Änderung der Strömungsgeschwindigkeit oder eine Bre...

<table><tbody><tr><td>Bakteriophagen-&amp;#955;-DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011L</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Oligonukleotide</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T4-Polynukleotidkinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Digoxigenin-Fab</td><td>Roche Group</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>Tosyl-aktivierte Kügelchen</td><td>Invitrogen</td><td>142-03</td><td></td></tr><tr><td>Magnetabscheider</td><td>Invitrogen</td><td>Dynal MPC</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyl-triethoxysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>Andere Aminosilane können verwendet oder mit nicht-aminoreaktiven Silanen für spärlichere Oberflächen gemischt werden</td></tr><tr><td>Succinimidylpropionat-PEG</td><td>Nektar</td><td></td><td>Ähnliche PEGs sind von Nanocs, CreativePEGWorks usw. erhältlich</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-NHS</td><td>Nektar</td><td></td><td>Ähnliche PEGs sind von Nanocs, CreativePEGWorks usw. erhältlich</td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>SA-S-1L</td><td>100 &amp;#x03BC;m Dicke</td></tr><tr><td>Quarzobjektträger</td><td>Technical Glass</td><td>20 mm (B) × 50 mm (L) × 1 mm (H)</td><td>Größe an Deckgläser anpassen. Löcher mit Diamantbohrern bohren (DiamondBurs.net)</td></tr><tr><td>Polyethylen-Schlauch</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>0,76 mm Innendurchmesser, 1,22 mm Außendurchmesser&lt;br/&gt;Andere Schlauchgrößen können verwendet werden.</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td>Lösung mit 1 mg/mL herstellen, 25 &amp;#x03BC;L Aliquots in PBS, pH 7,3</td></tr><tr><td>Desoxyribonukleotidtriphosphat-Lösungsmix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Invertiertes optisches Mikroskop mit 10×-Objektiv</td><td>Olympus Corporation</td><td>Olympus IX-51</td><td></td></tr><tr><td>Permanenter Dauermagnet</td><td>National Imports</td><td>www.rare-earth-magnets.com</td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Fast 139</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Harvard Apparatus</td><td>11 Plus</td><td>Im Nachfüllmodus betreiben, um Lösungswechsel zu erleichtern</td></tr><tr><td>Faser-Illuminator</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>OSL1</td><td></td></tr></tbody></table>

direkte beobachtung von enzymen replizieren dna mit einem single-molekül dna stretching assay

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Wir beschreiben eine Methode zur Beobachtung der Echtzeit-Replikation einzelner DNA-Moleküle durch Proteine ​​des Bakteriophagen Replikationssystem vermittelt. Linearisierte λ DNA wird modifiziert, um ein Biotin auf das Ende eines Stranges, und ein Digoxigenin-Rest am anderen Ende des gleichen Strang zu haben. Der biotinylierte Ende mit einem funktionalisierten Deckglas und die digoxigeninated Ende eine kleine Perle befestigt. Die Montage dieser DNA-Bead Anbindehaltung auf der Oberfläche einer Durchflusszelle ermöglicht eine Laminar-Flow anzuwenden, um eine Zugkraft auf dem Wulst auszuüben. Als Ergebnis wird die DNA in der Nähe und parallel zur Oberfläche des Deckglases mit einer Kraft, die durch den Durchfluss (Abbildung 1) bestimmt wird gestreckt. Die Länge der DNA wird durch die Überwachung der Position der Perle gemessen. Länge Unterschiede zwischen Einzel-und Doppelstrang-DNA werden genutzt, um in Echtzeit Informationen über die Tätigkeit der Replikation Proteine ​​an der Gabelung zu erhalten. Die Messung der Position der Sicke ermöglicht eine präzise Bestimmung der Preise und processivities von DNA Abwickeln und Polymerisation (Abbildung 2).

Wir beschreiben eine Methode zur Beobachtung der Echtzeit-Replikation einzelner DNA-Moleküle durch Proteine ​​des Bakteriophagen Replikationssystem vermittelt.

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

Wir beschreiben eine Methode zur Beobachtung der Echtzeit-Replikation einzelner DNA-Moleküle, die durch Proteine des Replikationssystems von Bakteriophagen vermittelt wird. ...

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Visualisierung der DNA-Replikation mittels Weitfeld-Optikmikroskopie an linearisierter und chemisch modifizierter Lambda-DNA. Die DNA wird an eine funktionalisierte Glasdeckenscheibe gebunden. Das freie Ende der DNA ist mit einer markierten Kugel versehen und die DNA wird durch laminare Strömung gestreckt.Wenn die Replikation initiiert wird, beginnt der Leitstrang länger zu werden und der Folgestrang verkürzt sich aufgrund der Aufwicklung. Der große Unterschied in der Länge zwischen doppelsträngiger und einfachsträngiger DNA bei niedrigen Kräften ermöglicht eine direkte Beobachtung der DNA-Umwandlungen während der Replikation. Die Länge des DNA-Konstrukts wird durch die Verfolgung der Position der Perle überwacht, was eine präzise Bestimmung von Geschwindigkeit und Ablauf der DNA-Replikation erlaubt.Hallo, ich bin Ari Ulrich aus den Laboren von Anto van der Vanian und Charles Richardson an der Abteilung für Biologische Chemie und Molekulare Pharmakologie der Harvard Medical School. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Abbildung der DNA-Replikation auf einzelner Molekülebene. In unseren Laboren verwenden wir dieses Verfahren, um enzyma

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll zeigt eine einfache Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie-Technik zur Visualisierung der DNA-Replikation von einzelnen replisomes in Echtzeit.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

DT40, ein Modell Wirbeltieren genetische System bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Funktion von Proteinen zu analysieren. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die qualitative Analyse der Parameter, die DNA-Synthese Einfluss während der S-Phase in DT40 Zellen bei der Ebene einzelner Moleküle erlaubt.

Visualisierung der DNA-Replikation in den Wirbeltier-Modellsystem DT40 mit der DNA Fiber-Technik

Diese Studie stellt eine detaillierte experimentelle Verfahren zur Looping Dynamik der Doppelstrang-DNA mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zu messen. Das Protokoll beschreibt auch, wie die Looping-Wahrscheinlichkeitsdichte genannt J-Faktor zu extrahieren.

Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Dieses Protokoll zeigt einen einfache, robuste und hohen Durchsatz Einzelmolekül Fluss-stretching Assay für das Studium eindimensionale (1D) Diffusion von Molekülen entlang DNA.

Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

Dieses Protokoll beschreibt die Charakterisierung der DNA-Polymerase Synthese von modifizierten DNA durch Beobachtung der Veränderungen an der Nah-Infrarot-Eindringmittel beschrifteten DNA mittels Gelelektrophorese und Gel-Bildgebung. Acrylamid Gele werden für hochauflösende Bildgebung der Trennung von kurzen Nukleinsäuren verwendet, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Abhängigkeit von Größe zu migrieren.

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

Beschrieben wird eine hochparallele Methode zur Messung der standortspezifischen DNA-Spaltung auf einzelmolekülebene. Dieses Protokoll demonstriert die Technik mithilfe der Einschränkung endonuklease NdeI. Die Methode kann leicht modifiziert werden, um jeden Prozess zu untersuchen, der zu einer standortspezifischen DNA-Spaltung führt.

Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

Mit Hilfe von Quantenpunkt-markierter DNA und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie können wir den Reaktionsmechanismus von Restriktionsendonukleasen untersuchen, während wir unmarkierte Proteine verwenden. Diese Einzelmolekültechnik ermöglicht die massiv gemultiplexte Beobachtung einzelner Protein-DNA-Wechselwirkungen, und Daten können gepoolt werden, um gut bevölkerte Verweilzeitverteilungen zu erzeugen.

Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung

Die Methodik hilft bei der Analyse der Variation der DNA-Replikationsdynamik in Gegenwart von Nanopartikeln. Je nach Zytotoxizität des interessierenden Materials können unterschiedliche Methoden angewendet werden. Darüber hinaus wird eine Beschreibung der Bildanalyse bereitgestellt, um bei der DNA-Faseranalyse zu helfen.

Demonstration des DNA-Faser-Assays zur Untersuchung von DNA-Schäden und Reparaturdynamik durch Nanopartikel

Die Anreicherung und Sequenzierung von proteinassoziierter junger DNA (eSPAN) wurde entwickelt, um die relative Häufigkeit eines chromatinassoziierten Proteins auf zwei replizierenden DNA-Strängen zu erkennen und so molekulare Einblicke in die Chromatinreplikation und ihre gekoppelten Prozesse zu gewinnen. Dieses Protokoll beschreibt eSPAN-Verfahren in Hefe- und Mausembryonalen Stammzellen (ES).

Strängspezifische Analyse von Proteinen bei der Replikation von DNA-Strängen durch Anreicherung und Sequenzierung der proteinassoziierten, entstehenden DNA-Methode

Dieses Protokoll demonstriert die Durchführung eines Einzelmolekül-Assays zur Live-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase. Sie beschreibt (1) die Herstellung eines DNA-Substrats, (2) die Reinigung der fluoreszenzmarkierten Drosophila melanogaster CMG-Helikase, (3) die Vorbereitung einer mikrofluidischen Durchflusszelle für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) und (4) den Einzelmolekül-DNA-Entwindungsassay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Dieses Protokoll stellt einen auf Fluoreszenzmikroskopie basierenden Einzelmolekül-DNA-Replikationsassay dar, der die Echtzeit-Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen DNA-Polymerasen und Hindernissen wie G-Quadruplex-Strukturen ermöglicht.

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Visualisierung der DNA-Polymerase-Dynamik an G-Quadruplexen

Erfahren Sie die Echtzeitbeobachtung von DNA-Replikation mit Einzelmolekül-Stretching-Assay und Weitfeldoptik. Diese Methode ermöglicht präzise Analyse von Replikationsdynamik und Enzymaktivität.

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

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