Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, zu untersuchen, wie die Schleifendynamik von doppelsträngiger DNA durch die intrinsische Form der DNA ohne den Einsatz von DNA-bindenden Proteinen beeinflusst wird. Dies wird durch den Einbau von Farbstoffmolekülen in doppelsträngige DNA-Fragmente unterschiedlicher Krümmungen erreicht, so dass das DNA-Looping durch Fluoreszenzresonanz, Energietransfer oder Bund überwacht werden kann. Die reversiblen Looping- und Un-Looping-Ereignisse der einzelnen DNA-Moleküle können dann durch Totalreflexionsmikroskopie beobachtet werden.

Die Schleifenrate der DNA kann dann aus den Zeitverläufen der einzelnen Molekülfluoreszenz extrapoliert werden. Letztendlich kann die Looping-Wahrscheinlichkeit der DNA in Bezug auf die intrinsische Form des Fragments gemessen werden. Der Hauptvorteil dieses DNA-Looping-Assays besteht darin, dass er nicht auf ein A-DNA-Bindungsprotein angewiesen ist, das die Looping-Kinetik der A-DNA beeinflussen könnte.

Bei dem einfachen Protokoll geht es um die Verwendung einer Technik namens Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer und PCR-basierte DNA-Synthese. So messen Sie die Wahrscheinlichkeit des Aussehens von DNA: Beginnen Sie mit dem Entwerfen global gekrümmter DNAs, indem Sie eine 10-MER-Sequenz wiederholen. Zum Beispiel ist diese repräsentative Sequenz eine gekrümmte DNA mit 186 Basenpaaren, wobei X eine zufällige zusätzliche Base ist und die Sequenzen, die die sich wiederholende 10-mer-Sequenz flankieren, Adaptersequenzen sind.

Als nächstes führen Sie die PCR mit den Primern eins und zwei mit dem Bunddonor SI drei und der Markierung des Primers zwei am Fünf-Prime-Ende durch. Führen Sie dann die PCR mit den Primern drei und vier durch, wobei der Bundakzeptor SCI fünf durch das Rückgrat und den Biotin-Linker am Fünf-Prime-Ende des Primers drei markiert wird. Nach der Aufreinigung der PCR-Produkte mit einem PCR-Cleanup-Kit mischen Sie die drei-markierten SCI-Produkte und die fünf-markierten SCI-Produkte in einem Puffer für den Strangaustausch bei Endkonzentrationen von 0,4 Mikromolar bzw. 0,1 Mikromolar.

Dann inkubieren Sie die Stränge zwei Minuten lang bei 98,5 Grad Celsius, kühlen Sie sie allmählich auf fünf Grad Celsius mit einer Rampenrate von 0,1 Grad Celsius pro Sekunde ab und inkubieren Sie sie dann zwei Stunden lang bei fünf Grad Celsius. Um die Stränge auszutauschen und die Durchflusszelle vorzubereiten, verwenden Sie eine Bohrpresse und Diamantbohrer, um sechs bis sieben Lochpaare entlang der beiden gegenüberliegenden Kanten eines drei mal 1 Zoll großen Glasobjektträgers zu erzeugen. Wenn alle Löcher gebohrt sind, reiben Sie den Objektträger unter fließendem Wasser, um sichtbares Glaspulver zu entfernen.

Legen Sie die Objektträger aufrecht in ein Glas und füllen Sie es mit destilliertem Wasser. Beschallen Sie das Glas 15 Minuten lang und geben Sie dann die Objektträger in ein Glasgefäß, das für die Acetonreinigung vorgesehen ist. Füllen Sie das Glas mit Aceton und beschallen Sie die Objektträger weitere 15 Minuten lang in Aceton.

Besprühen Sie anschließend die Objektträger mit Ethanol und dann mit Wasser, um sie abzuspülen, und geben Sie die Objektträger dann in ein Polypropylenglas. Füllen Sie das Polypropylenglas mit fünf molaren Kaliumhydroxid und beschallen Sie die Objektträger nach dem letzten Waschen weitere 15 Minuten lang, spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser aus, gefolgt von weiteren 15 Minuten. Beschallung nach der Reinigung der Deckgläser.

die gleiche Weise 80 Mikroliter frisch zubereitete PEG-Lösung auf jeden Objektträger und senken Sie dann vorsichtig einen Deckschirm über den Stift. Entfernen Sie nach 45 Minuten mit einer Pinzette die Deckgläser von den Objektträgern, spülen Sie die Objektträger und die Deckgläser mit reichlich destilliertem Wasser ab. Trocknen Sie sie dann in einem Trockenmittel, wenn die Deckgläser und Objektträger trocken sind, legen Sie dünne Streifen Doppelklebeband über den Objektträger, um Kanäle zu bilden, legen Sie einen Deckglas über die Streifen und drücken Sie fest auf den Deckglas, um flüssigkeitsdichte Kanäle zu bilden.

Verwenden Sie dann fünf Minuten Epoxidharz, um die Ränder der Kanäle zu versiegeln, um die Moleküle für die Mikroskopie zu immobilisieren. Injizieren Sie zunächst 15 Mikroliter Neu-Tradin-Lösung in einen Kanal. Spülen Sie den Kanal nach zwei Minuten mit 100 Mikrolitern T 50 Puffer und injizieren Sie dann 50 Mikroliter DNA-Probe in den Kanal.

Spülen Sie nach fünf Minuten die ungebundene DNA mit 100 Mikrolitern T50-Puffer ab und füllen Sie dann den Kanal mit einem bildgebenden Puffer, der das Sauerstofffängersystem enthält. Geben Sie nun Immersionsöl auf das Mikroskopobjektiv und befestigen Sie die Durchflusszelle dann mit Probenklammern auf dem Mikroskoptisch. Schalten Sie den 532-Nanometer-Laser ein.

Verwenden Sie die Live-Ansicht der Fluoreszenzbilder auf dem Monitor, um zu optimieren. Passen Sie den Fokus an. Beginnen Sie die Datenerfassung mit eingeschaltetem 532-Nanometer-Laser.

Stoppen Sie die Datenerfassung, wenn die meisten Moleküle photogebleicht sind, um die Bilder zu verarbeiten und zu analysieren, verwenden Sie ein MATLAB-Skript, um alle Zeitspuren einzelner Moleküle zu durchsuchen, die mehrere Übergänge zwischen den Signalen mit hohem und niedrigem Bund zeigen. Identifizieren Sie die Zustände "Schleife" und "Nicht Schleife", und ermitteln Sie dann den Schwellenwert, der die beiden Verteilungen trennt, indem Sie den Schnittpunkt zwischen den beiden angepassten Gaußschen Kurven bestimmen. Berechnen Sie als Nächstes den Wirkungsgrad der F-Front, indem Sie die Sci-Fi-Intensität durch die Summe der drei SCI- und Sci-Fi-Intensitäten dividieren.

Zuweisen der Loop-Zustände mit hohen Bundwerten und der Unloop-Zustände mit niedrigen Bundwerten. Analysieren Sie dann mit einem MATLAB-Skript die kumulative Anzahl der Moleküle oder NFTs, die in einer Schleife durchlaufen wurden, d. h. die in verschiedenen Zeitraffern den Zustand mit hohem Bund erreicht haben. Seit Beginn der Datenerfassung kann dann die Schleifenrate K Sub Loop extrahiert werden, indem das NFT mit einer Exponentialfunktion versehen wird.

Wenn NFT bi erhöht, kann es grundsätzlich mit einer doppelten Exponentialfunktion ausgestattet werden, wie in der Gleichung dargestellt. In diesem Fall wird aus dieser Gleichung die K-Teilschleife erhalten, um den Fluss des J-Faktors zu bestimmen. 20 Mikroliter von 30 bis 50 picaMolar Biotin sci fünf Oligo oder Primer drei in einen der mit Nusstravain beschichteten Kanäle, wie gerade demonstriert.

Als nächstes spülen Sie den Kanal mit 100 Mikrolitern T 50, um ungebundene Oligos wegzuspülen, und lassen Sie dann frisch zubereiteten Bildpuffer, der mit PS 3-Oligo ergänzt ist, in die Kammer fließen. Lassen Sie den 532-Nanometer-Laser eingeschaltet und schalten Sie dann den 640-Nanometer-Laser kurz ein, um die Positionen aller oberflächengebundenen Sci-Fi-Oligos zu identifizieren. Schalten Sie dann den 640-Nanometer-Laser aus und beginnen Sie mit der Überwachung des Bundsignals.

Verwenden Sie ein MATLAB-Skript, um die Anzahl der Moleküle zu analysieren, die im ungebundenen Zustand beginnen. Das ist mit einer niedrigen sci fünf-Intensität, geht aber später in den IL-Zustand über. Das heißt, mit einer hohen SciFi-Intensität als Funktion der Zeit aus den SciFi-Intensitätsspuren wird diese Anzahl von Ane-Molekülen über die Zeit aufgetragen und die Kurve mit einer einzigen Exponentialfunktion angepasst, um die Ealing-Rate zu erhalten.

K sub anil, wiederholen Sie den Versuch bei verschiedenen SI-Konzentrationen mit drei Oligos, um die Linearität zwischen der Kneeling-Rate und der Reaktantenkonzentration zu bestätigen. Extrahieren Sie die zweite Ordnung eine knieende Geschwindigkeitskonstante K prim sub ail aus der Steigung. Berechnen Sie schließlich den J-Faktor, wobei die K-Subschleife die Schleifenrate ist, die unter denselben Pufferbedingungen gemessen wird, um die Wirkung der intrinsischen Krümmung der doppelsträngigen DNA auf die Schleife zu testen.

In diesem Experiment wurde ein gerades und ein gebogenes 186er Basenpaar verwendet. Doppelsträngige DNAs wurden jeweils im Vergleich zu reiner DNA konstruiert. Es wurde festgestellt, dass die gekrümmte DNA im gleichen Zeitraum mehr Ereignisse mit hohem Bund hervorruft.

Die gekrümmte DNA spielte während der gleichen Erfassungszeit auch viermal häufiger eine Schleife als die gerade DNA, was zeigt, dass die intrinsische Krümmung der DNA die Schleifendynamik erheblich beeinflussen kann. In diesem letzten Analyseschritt wurde der J-Faktor berechnet, indem die Schleifenrate durch die erste Ordnung, eine Konstante der Kneeling-Rate, dividiert wurde, und in Übereinstimmung mit früheren Befunden auf 61 plus oder minus drei Anomolar für die gerade DNA und 265 plus oder minus 48 Nanomolar für die Kurven-DNA bestimmt. Nach diesem Verfahren können die Auswirkungen des Unfallfaktors auf die Looping-Beweglichkeit wie Temperatur, Undehnung und Viskosität untersucht werden.

Dieses Protokoll wird nicht nur für das Studium der Polymerphysik der DNA nützlich sein, sondern auch für die Demonstration der Leistungsfähigkeit der Einzelmolekülfluoreszenz für Forschungsanfänger oder Laien.