Name: Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Lernen Sie die Aktivierung und Expansion muriner B-Zellen durch CD40-Signalgebung mit IL-4-Stimulation. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung effektiver antigenpräsentierender Zellen für immunologische Forschung.

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Wir danken Dr. Clemens Wendtner für die Bereitstellung tmuCD40-Ligand-HeLa-Zelllinie.

Das Protokoll für die Erzeugung von Maus-CD40-aktivierten B-Zellen (mCD40B) von Splenozyten ist in zwei Teile gegliedert: Teil A zeigt die Herstellung von Maus-CD40-Ligand (CD40L) exprimierende HeLa-Zellen (tmuCD40L HeLa), die als verwendet werden Platten- Feeder-Zellen gebunden. Teil B beschreibt die eigentliche murine CD40-B Kultur. A. Herstellung von Feeder-Zellen (tmuCD40L HeLa) Die tmuCD40L HeLa ist ein Anhänger menschlichen epithelialen Zell-Linie, die nie sollte vollständig konfluent. Die Zellen sind daher zweimal pro Woche aufgeteilt. Die Kultivierung von mehr als 6 Wochen wird nicht empfohlen. <ol><li> Entfernen Sie alte Medium aus dem Primär-Kultur mit einer sterilen Pipette und waschen Sie die Zellen mit 10 ml 1x PBS. Saugen Sie das PBS nach dem Waschen. </li><li> 4 mL 1x Trypsin / EDTA in einer 75 cm 2-Kolben für 10-15 Minuten bei 37 ° C. Verwenden leichtes Klopfen auf die Zellen zu lösen. </li><li> Fügen Sie 10 ml Wildtyp-Medium-und schwenkbar sanft die Verdauung mit Trypsin zu stoppen. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 ml-Tube mit einer sterilen Pipette und drehen Sie die Zellen nach unten bei 265 xg für 7 Minuten. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 10 ml Wildtyp-Medium. Zählen Sie die Zellzahl eines Aliquots der Zellsuspension und bereiten drei 50 ml-Röhrchen mit der entsprechenden Anzahl von Zellen: <ol><li> 2,5 x 10 6 Zellen für Subkultur </li><li> 0,4 x 10 6 Zellen / well für die Bestrahlung von murinen CD40-B-Zell-Kultur verwendet </li><li> Rest einfrieren (falls erforderlich). </li></ol></li><li> Drehen Sie die Zellen nach unten bei 265 xg für 7 Minuten. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. <ol><li> Für Subkultivierung: resuspendieren 2,5 x 10 6 Zellen in 10 ml Selektionsmedium in eine 75 cm 2 Zellkulturflasche (Zelldichte 2,5 x 10 5 Zellen / ml) und Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2. Split die Zellen zweimal pro Woche. </li><li> Für die murine CD40-B-Zell-Kultur: Sie müssen 2,4 x 10 6 Zellen für eine 6-Well-Platte. Resuspendieren tmuCD40L HeLa-Zellen in Wildtyp-Medium mit einer Dichte von 0,2 x 10 6 Zellen / ml und bestrahlen sie bei 78 Gy. Plate 2 mL der Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren sie bei 37 ° C mit 5% CO 2. Mit diesem vorbereiteten Platten für B-Zell-Stimulation, wenn tmuCD40L HeLa-Zellen adhärent sind (mindestens 4 Stunden: check Einhaltung unter dem Mikroskop; warten Sie nicht länger als 24 h auf B-Zell-Stimulation beginnen). (Fahren Sie mit B.) </li></ol></li></ol> B. Murine CD40-B-Zell-Kultur I. Herstellung von Splenozyten für CD40-Stimulation (Tag 0): Bitte beachten Sie: Bevor Sie fortfahren vergewissern, dass Feeder-Zellen adhärent sind. Fügen Sie immer frische Lösungen von murinen Interleukin-4, β-Mercaptoethanol und Cyclosporin A, um das Wachstum mittelfristig unmittelbar vor dem Gebrauch. <ol><li> Dissect Milz von C57BL / 6 Mäuse (Haplotyp H-2b) und waschen Sie es zweimal in 10-20 ml DMEM, ergänzt mit Gentamycin [15μg/mL], indem er sie mit einer 10 ml Pipette aus einer Röhre zur anderen. Vermeiden Sie die Übertragung Verunreinigungen (zB Haare) der Maus. Mince Milz, indem es durch eine Zelle Sieb (100 um) und spülen Sieb mit weiteren 10 ml Medium. Spin down Splenozyten bei 265 xg für 7 min bei Raumtemperatur resuspendieren sie in 7 ml muCD40-B-Zell-Medium und separate Lymphozyten durch Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation. Dazu Schicht Zellen auf 5 mL Mouse-Pancoll (vorgeheizt bei Raumtemperatur) in einer 15 ml-Tube und zentrifugieren bei 450 xg für 30 min ohne Bremse bei Raumtemperatur. </li><li> Beziehen Sie die meisten der oberen Schicht, so dass die Lymphozyten Schicht ungestört an der Schnittstelle. Transfer-Lymphozyten Schicht auf eine frische 50 ml Tube, einmal waschen mit 30 ml DMEM mit Gentamycin [15μg/mL] indem sie zum Stillstand bei 265 xg für 7 min zu anderen Zellen zu entfernen. Überstand verwerfen und Zellen in 10 ml mCD40-B Waschmedium. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in einem Aliquot der Zellsuspension. Bestimmen der Zellzahl durch Zählen ein Aliquot der Zellsuspension. </li><li> Spin down die benötigte Menge an Zellen bei 265 xg für 7 Minuten. Für eine 6-well-Platte 5 x 10 6 Zellen / well benötigt werden, damit 30 x 10 6 Zellen pro Platte. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Lymphozyten bei 1,25 x 10 6 Zellen / ml in mCD40-B Kulturmedium frisch mit 1 U / ml Interleukin-4 ergänzt als Wachstumsfaktor, 100 uM β-Mercaptoethanol und 0,63 ug / ml Cyclosporin A zu verhindern Auswachsen von T-Zellen (Given Konzentrationen beziehen sich auf ein mL Kulturmedium!). </li><li> Entfernen Sie den Überstand aus der 6-well-Platte mit tmuCD40L HeLa-Zellen vorinkubiert. </li><li> Vorsichtig 4 ml der Lymphozyten-Suspension (1,25 x 10 6 Zellen / ml) in jede Vertiefung der 6-Well-Platte. </li><li> Die Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li> Am Tag 3 reculture der Zellen (Fahren Sie mit II.1.). </ol> II. Subkultur der mCD40B Zellen (Tag 3 und dann zweimal in der Woche): <ol><li> Ernte mCD40B Zellverband durch kräftiges Auf-und Abpipettieren mit einer 10 mL Pipette und sie gemeinsam in eine 50 ml Tube. </li><li> Spin down bei 265 xg für 7 Minuten und vollständig ersetzen den Überstand mit mCD40-B Waschmedium. Während des Zählens der Zelle Betrag eines aliquoten, drehen Sie das Zellen nach unten bei 265 xg für 7 Minuten. Resuspendieren mCD40B Zellen in mCD40-B Kulturmedium in einer Konzentration von 0,75 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Fügen Sie frische Lösungen von murinen Interleukin-4 in einer Konzentration von 1 U / mL, 100 uM β-Mercaptoethanol und 0,63 ug / ml Cyclosporin A auf das Medium. </li><li> Entfernen Sie den Überstand aus einer 6-Well-Platte mit bestrahlten tmuCD40L HeLa-Zellen vorinkubiert. </li><li> Vorsichtig 4 ml des mCD40B Zellsuspension (0,75 x 10 6 Zellen / ml) in jede Vertiefung der 6-Well-Platte. </li><li> Die Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Wieder Subkultur der Zellen alle 3-4 Tage am Ende mit hochreinem murine CD40-aktivierte B-Zellen nach insgesamt 14 Tagen. </li></ol> C. Trouble-shooting: Was ist, wenn CD40-B-Zellen nicht wachsen? <ol><li> Haben Sie überprüft, für die CD40-Ligand Expression von Feeder-Zellen? </li><li> Sind die Platten-gebundenen Feeder-Zellen für die Stimulation älter als 24 Stunden verwendet werden? </li><li> Gibt es eine Kontamination mit Mykoplasmen? </li><li> War der Interleukin-4-Lösung zur Ergänzung eingesetzt frisch aufgetaut und hat es über die entsprechenden biologischen Aktivität? </li><li> War β-Mercaptoethanol und Cyclosporin A aufgenommen in der richtigen Konzentration? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="Abbildung 1 a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1 a"> Abbildung 1a. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="Abbildung 1 b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1 b"> Abbildung 1b. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="Abbildung 1 d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1 d"> Abbildung 1d. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li>
<li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li>
<li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Ligand-activated%2C+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. S. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li>
</ol>

Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den nationalen und europäischen Richtlinien für Labor Tierhaltung durchgeführt. Unter Bezugnahme des deutschen Tierschutzgesetz wurden die Tiere regelmäßig von den zuständigen Behörden kontrolliert.

Änderungen dieses Protokolls sind möglich, insbesondere über die Herkunft der CD40-Stimulus und die Art der Maus-Stamm verwendet, auch Nachgeben in effiziente Erzeugung von Maus-CD40-aktivierten B-Zellen. Ahmadi et al. haben gezeigt, ähnliche Ergebnisse für Maus-Fibroblasten mit murinen CD40-Ligand transfiziert. In diesem Zusammenhang Präsentation der Xeno-Antigen kann mit Sicherheit ausgeschlossen werden, aber intensive Studien hinsichtlich Sicherheit und Toxizität in vivo gab keine Anzeichen für eine Entzündu...

A. Herstellung der Medien: <table border="1"><tbody><tr><td> Feeder Zelle Wildtyp-Medium </td><td> Feeder Zelle Selektionsmedium </td><td></td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration </td><td> Reagens </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 300 ug / mL </td><td> L-Glutamin </td><td> 300 ug / mL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 ug / mL </td><td> Gentamycin </td><td> 15 ug / mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycin B </td><td> 0,2 mg / mL </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B Waschmedium </td><td> mCD40-B Kulturmedium </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration </td><td> Reagens </td><td> Konzentration </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 580 pg / mL </td><td> L-Glutamin </td><td> 580 pg / mL </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 4,5 mg / mL </td><td> Glucose </td><td> 4,5 mg / mL </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 ug / mL </td><td> Gentamycin </td><td> 15 ug / mL </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0,1 mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Sonstige Reagenzien: <table border="1"><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Bestell-Nr </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Cat No H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Delta Select </td><td> Art.-Nr. 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Cat No DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES-Puffer </td><td> PAA </td><td> Cat No S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> PAA </td><td> Cat No P02-015 </td></tr><tr><td> Recombinant Murine Interleukin-4 </td><td> Immunotools </td><td> Cat No 12340045 </td></tr><tr><td> Cyclosporin A </td><td> Novartis </td><td> Cat No NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> Trypsin / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. Sonstiges Zubehör: <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Bestell-Nr </td></tr><tr><td> Sterile Pipettenspitzen </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platte </td><td> NUNC </td><td> Cat No 140675 </td></tr><tr><td> 50 ml konischen Rohr </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Cat No 352070 </td></tr><tr><td> Zellkulturflasche </td><td> Sarstedt </td><td> Cat No 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

mausmodell der cd40-aktivierung von b-zellen

Murine Model of CD40-activation of B cells

Forschung auf B-Zellen haben gezeigt, dass CD40-Aktivierung ihrer Antigen-Präsentation Kapazität verbessert. Wenn mit Interleukin-4 und CD40-Ligand (CD40L) stimuliert, kann das menschliche B-Zellen ohne Schwierigkeiten von kleinen Mengen von peripheren Blut innerhalb von 14 Tagen bis sehr große Mengen an hochreinen CD40-B-Zellen (erweiterbar&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Zellen pro Patient) von gesunden Spendern sowie Krebs-Patienten<sup&gt; 1-4</sup&gt;. CD40-B-Zellen exprimieren wichtige Lymphknoten homing-Molekülen und können T-Zellen zu gewinnen<em&gt; In-vitro-</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Darüber hinaus sie effizient aufnehmen, verarbeiten und präsentieren Antigene an T-Zellen<sup&gt; 6,7</sup&gt;. CD40-B-Zellen wurden nicht nur prime naiv dargestellt, sondern auch zu erweitern Memory T-Zellen<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Deshalb CD40-aktivierten B-Zellen (CD40-B-Zellen) wurden als eine alternative Quelle untersucht immunstimulierende Antigen-präsentierende Zellen (APC) für zellbasierte immunotherapy1, 5,10. Zur weiteren Untersuchung, ob CD40-B-Zellen effektiv T-Zell-Antworten induziert in vivo und den zugrunde liegenden Mechanismus haben wir eine Zellkultur-System für die Erzeugung von Maus-CD40-aktivierten B-Zellen zu studieren. Mit Splenozyten gereinigt oder B-Zellen aus C57BL / 6 Mäuse für CD40-Aktivierung wurden optimale Bedingungen wie folgt gekennzeichnet: Ausgehend von Splenozyten von C57BL / 6 Mäuse (Haplotyp H-2b) Lymphozyten sind durch Dichtegradientenzentrifugation und co-kultiviert mit HeLa gereinigt Zellen, die rekombinante murine CD40-Ligand (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Die Zellen werden rekultiviert alle 3-4 Tage und Schlüsselkomponenten wie CD40L, Interleukin-4,-Mercaptoethanol und Cyclosporin A werden wieder aufgefüllt. In diesem Protokoll haben wir demonstrieren, wie voll aktiviert murine CD40-B-Zellen (mCD40B) mit ähnlichen APC-Phänotyp für die menschliche CD40-B-Zellen (Abb. 1a, b) zu erhalten. CD40-Stimulation führt zu einer raschen Folge und Erweiterung von hochreinem (&gt; 90%) CD19 + B-Zellen innerhalb von 14 Tagen Zellkultur (Abb. 1c, d). Zur Vermeidung von Kontaminationen mit nicht-transfizierten Zellen, ist Ausdruck des murinen CD40-Liganden auf die Transfektanten regelmäßig kontrolliert werden (Abb. 2). Murine CD40-aktivierte B-Zellen können verwendet werden, um B-Zell-Aktivierung und Differenzierung sowie Studien, um ihr Potenzial zu untersuchen Funktion als APC in vitro und in vivo werden. Darüber hinaus stellen sie ein vielversprechendes Werkzeug für den Aufbau therapeutische oder präventive Impfung gegen Tumoren und wird dazu beitragen, Fragen zur Sicherheit und Immunogenität dieses Ansatzes Antwort<sup&gt; 12</sup&gt;.

In diesem Video zeigen wir, das Verfahren der CD40-Aktivierung und Expansion von murinen B-Zellen aus Splenozyten von C57BL / 6 Mäusen, die als Modell-Antigen-präsentierende Zellen (APC) zur Induktion der Immunität Studie verwendet werden können.

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Die Forschung an B-Zellen hat gezeigt, dass die CD40-Aktivierung deren Fähigkeit zur Antigenpräsentation verbessert. Bei Stimulation mit Interleukin-4 und dem CD40-Liganden ...

Hallo, mein Name ist Tanya Wig und ich bin Doktorandin am Labor für Tumormmunologie und Transplantationsimmunologie des Universitätsklinikums Köln. Meine Studien konzentrieren sich hauptsächlich auf humane CD 40-aktivierte B-Zellen und deren Fähigkeit, Immunantworten in vivo auszulösen. Ursprünglich wurden humane CD 40-B-Zellen als alternative antigenpräsentierende Zellen zu dendritischen Zellen entwickelt.Diese Zellen sollen für immuntherapeutische Zwecke in der klinischen Anwendung verwendet werden. In klinischen Settings werden CD40-B-Zellen unter CD40-Signalgebung und Stimulierung mit IL-4 generiert. Nach diesem System können sie über mehrere Wochen hinweg expandiert werden. Nachdem wir die Generierung menschlicher CD40-B-Zellen aus PBMCs in unserem Labor optimiert hatten, übertrugen wir dieses Prinzip erfolgreich auf Mäuse, und das möchte ich Ihnen heute zeigen.Ausgehend von der Milz erzeugen wir innerhalb von 14 Tagen Kultur marinen CD40-aktivierter B-Zellen. Die wichtigsten Schritte sind die Herstellung von Fütterungszellen; hierfür verwenden wir eine mit marinem CD40-Ligand transfizierte Heer-Zelllinie, die adherent ist, mit 78 Gray bestrahlt und in Sechswell-Platten ausgesät wird. Zweitens beginnen wir die Kultur mariner CD40-aktivierter B-Zellen, indem wir frisch gereinigte SPOC-Zellen aus Black-Six-Mäusen verwenden, die mit marinem Interleukin-4, Beta-Macab, Ethanol und Cyclosporin A behandelt werden. Anschließend werden diese Zellen auf bestrahlte Fütterungszellen in Sechswell-Platten übertragen.Dieses Verfahren wird alle drei bis vier Tage bis zum 14. Tag der Zellkultur wiederholt. Um am Ende hochreine marine CD 40-aktivierte B-Zellen zu erhalten, beginnen wir mit der Erzeugung mariner CD 40-aktivierte B-Zellen unter Verwendung frisch gereinigter SP-Zellen aus thromb-LXi-Mäusen. Zunächst waschen wir die SP-Zellen, indem wir die Zellen in 50 Milliliter marines CD 40 B-Waschmedium resuspendieren.Anschließend die Zellen sieben Minuten bei 1300 U/min, was 260 × g entspricht, zentrifugieren, um die Zellzahl zu bestimmen. Die Zellen gründlich in 10 Milliliter marinem CD40B-Waschmedium resuspendieren und abschließend durch Vortexen vermischen. Danach die Zellzahl bestimmen.Zentrifugieren Sie die erforderliche Menge an Zellen sieben Minuten lang bei 1300 U/min (entspricht 260 ×g) unter Verwendung einer 6-Loch-Platte. Pro Vertiefung werden 5 × 10⁶ Zellen benötigt, also insgesamt 30 × 10⁶ Zellen pro Platte. Suspendieren Sie die erforderliche Menge in 1,25 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in Marine-CD40B-Kulturmedium.Dann frisch die Zellsuspension mit marinem IL-4 in einer Konzentration von einer Einheit pro Milliliter zur Stimulation sowie Cyclosporin A in einer Konzentration von 0,63 Mikrogramm pro Milliliter zur Hemmung des Auswachsens von T-Zellen und 100 Mikromolar BAPTA-Acetat ergänzen. Nun ist die Zellsuspension bereit zur Stimulation mit HeLa-Zellen. Wir verwenden marine CD40-Ligand-transfizierte HeLa-Zellen, um das Zellüberleben, die Differenzierung und Proliferation zu stimulieren, da die HeLa-Zelllinie mehrere Monate lang in Kultur überleben kann.Der Verlust der marinen CD40-Liganden-Expression muss durch regelmäßige Untersuchungen ausgeschlossen werden. Die mit CD40-Ligand transfizierte HeLa-Zelle ist eine adhärente Zelllinie, die bei 37 Grad mit 5 % CO2 in Selektionsmedium, das mit Insulin B in einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter ergänzt ist, kultiviert wird. Zur Selektion sollte diese adhäsive epitheliale Zelllinie niemals vollständig konfluent werden und zweimal pro Woche aufgespalten werden, um adhärente Zellen zu teilen.Aspirieren Sie das Medium einmal mit 10 Milliliter PBS. Schwenken Sie vorsichtig und geben Sie vier Milliliter Trypsin-EDTA in eine 75 Quadratzentimeter-Flasche. Inkubieren Sie die Flasche fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad im Inkubator.Nehmen Sie den Kolben erneut heraus. Klopfen Sie vorsichtig, um die Zellen vom Kunststoff zu lösen. Geben Sie dann 10 Milliliter Biotyp-Medium hinzu, schwenken Sie vorsichtig und überführen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen.Zentrifugieren Sie die Fütterungszellen sieben Minuten lang mit 1300 U/min, was 260 × g entspricht. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 10 Milliliter Wildtyp-Medium, um die Zellzahl zu bestimmen. Subkultivieren Sie 2,5 × 10⁶ Zellen in 10 Milliliter Selektionsmedium und überführen Sie diese in einen 75 cm²-Flasche. Inkubieren Sie die Fütterungszellen bei 37 °C und 5 % CO₂ zur CD40-Stimulation. Nehmen Sie den Rest der Fütterungszellen und bestrahlen Sie sie letal mit 78 Gy, um ihre Proliferation zu stoppen.Verdünnen Sie die Fütterungszellen in Wildtyp-Medium auf eine Zelldichte von 0,2 × 10⁶ Zellen pro Liter und geben Sie zwei Milliliter pro Vertiefung in eine sechswellige Platte. Lassen Sie die Zellen vor der Verwendung als Stimulatorzellen erneut anhaften, indem Sie sie 24 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren, um Zellen mit nahezu CD40-Ligand zu stimulieren. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die am Vortag ausgesäten Fütterungszellen angehaftet sind.Wenn die Fütterungszellen adherent sind, entfernen Sie vorsichtig das SUP Natin aus jedem Well und übertragen anschließend vorsichtig vier Milliliter der SPOC-Seiten-Suspension, die kurz zuvor auf 1,25 × 10⁶ Zellen pro Milliliter eingestellt wurde, in jedes Well zur Stimulation. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad und 5 % CO₂. Am Tag vier subkultivieren Sie die murinen CD40-B-Zellen erneut; für die erste Subkultur der murinen CD40-aktivierten B-Zellen am Tag vier sowie für nachfolgende Subkulturen alle drei bis vier Tage. Ernten Sie die aggregierten Zellen vorsichtig aus der 6-Well-Platte durch erneutes Aufschwemmen mit einer 10-Milliliter-Pipette. Sammeln Sie die murinen CD40-B-Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen sieben Minuten lang mit 1300 U/min (entspricht 260 × g). Ersetzen Sie das Medium vollständig durch murines CD40-B-Waschmedium.Und um die Zellzahl der marinen CD40-B-Zellen zu bestimmen, suspendieren wir die marinen CD40-B-Zellen in marinem CD40-B-Zell-Kulturmedium mit einer Zelldichte von 0,75 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Anschließend ergänzen wir die Zellsuspension erneut mit frischem marinem IL-4 in einer Konzentration von 1 Einheit pro Milliliter, Cyclosporin A in einer Konzentration von 0,63 µg/mL und 100 µM Beam-Up-Ethanol. Selbstverständlich müssen die bestrahlten Fütterungszellen unmittelbar vor der Verwendung erneut mikroskopisch auf ihre Anheftung überprüft werden.Wenn die Fütterungszellen adhärent sind, entfernen Sie vorsichtig das SUP natin von jeder einzelnen. Übertragen Sie dann die kurz zuvor hergestellte suspendierte marine CD 40 B-Zellfraktion in jede Vertiefung zur Stimulation. Die Subkultur wird drei bis vier Tage später zweimal pro Woche identisch wiederholt, um am Tag 14 der Kultur hochreine, aktivierte marine CD 40 B-Zellen zu erhalten.Zu diesem Zeitpunkt exprimieren marine CD40-B-Zellen kostimulatorische Moleküle wie CD80, CD86 und MHC-Moleküle eins und zwei, die während der Generierung von Fox überprüft werden können. Die derzeit generierten Zellen können verwendet werden, um Forschung zur B-Zell-Aktivierung, Differenzierung und Funktion durchzuführen, beispielsweise um ihr Potenzial für immuntherapeutische Anwendungen zu untersuchen.

murine-model-of-cd40-activation-of-b-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

In diesem Video demonstrieren wir die Aktivierung von aus Knochenmark gewonnenen Makrophagen als Reaktion auf bakterielle Lipopolysaccharide und intravenöses Immunglobulin.

Aktivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark der Maus als Reaktion auf Antikörper

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion von Dickdarmentzündungen bei Mäusen durch adoptiven Transfer von syngenen CD4+CD45RBhohen T-Zellen in T- und B-Zell-defiziente Empfänger. Klinische und histopathologische Merkmale ahmen entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen nach. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Beginns von Dickdarmentzündungen und des Fortschreitens der Krankheit.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

Der Transfer von bm12-Lymphozyten in einen C57BL/6-Empfänger ist ein etabliertes Modell des systemischen Lupus erythematodes. Hier beschreiben wir, wie man mit diesem Modell eine Krankheit auslösen kann und wie man T-follikuläre Helferzellen, Keimzentrum-B-Zellen und Plasmazellen mittels Durchflusszytometrie charakterisiert.

Das BM12 Inducible Modell des systemischen Lupus erythematodes (SLE) in C57BL / 6-Mäuse

Lymphozyten sind die Hauptakteure bei adaptiven Immunantworten. Hier stellen wir ein Lymphozytenreinigungsprotokoll vor, um die physiologischen Funktionen der gewünschten Moleküle bei der Lymphozytenaktivierung in vitro und in vivo zu bestimmen. Die beschriebenen experimentellen Verfahren eignen sich zum Vergleich der Funktionsfähigkeit von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur in Vivo Bestimmung der naiven CD4-T Zellaktivierung (T Cell), Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch GM-CSF Knochenmark (BM)-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs). Darüber hinaus beschreibt dieses Protokolls BM und T-Zellen isoliert, DC-Generation und DC und T-Zell-Adoptiv-Transfer.

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Das Protokoll beschreibt ein in vitro muriner Karzinommodell der nicht-genetischen defekten Transkriptionsdehnung. Hier wird die chronische Hemmung von CDK9 verwendet, um die produktive Dehnung von RNA Pol II entlang der pro-entzündlichen Reaktionsgene zu unterdrücken, um das klinisch überversorgteTE-Phänomen, das bei etwa 20% aller Krebsarten vorhanden ist, zu imitieren und zu untersuchen.

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdefinitely) in Cancers

Hier beschreiben wir eine Methode zur retroviralen Überexpression und Adoptivübertragung von murinen B-1a-Zellen zur Untersuchung der in vivo B-1a-Zellmigration und -lokalisierung. Dieses Protokoll kann für verschiedene nachgelagerte funktionelle Assays erweitert werden, einschließlich der Quantifizierung der Spender-B-1a-Zelllokalisierung oder der Analyse von spenderzellabgeleiteten sekretierten Faktoren nach der Übertragung.

Retrovirale Überexpression von CXCR4 auf murine B-1a-Zellen und Adoptivtransfer für gezielte B-1a-Zellmigration zur Knochenmark- und IgM-Produktion

Wir beschreiben hierin eine einfache Analyse der Heterogenität des murinen Immun-B-Zell-Kompartiments im Peritoneum-, Milz- und Knochenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie. Das Protokoll kann angepasst und auf andere Mausgewebe ausgedehnt werden.

Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen

Lernen Sie die Aktivierung und Expansion muriner B-Zellen durch CD40-Signalgebung mit IL-4-Stimulation. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung effektiver antigenpräsentierender Zellen für immunologische Forschung.

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

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