Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Hallo, mein Name ist Tanya Wig und ich bin Doktorandin und arbeite im Labor für Tumorimmunologie und Transplantationsimmunologie an der Uniklinik Köln. Meine Studien konzentrieren sich hauptsächlich auf marine CD 40-aktivierte B-Zellen und ihre Fähigkeit, Immunantworten in vivo zu induzieren. Ursprünglich wurden humane CD 40 B-Zellen als alternative antigenpräsentierende Zellen zu dendritischen Zellen erzeugt.

Diese Zellen sollen für immuntherapeutische Zwecke verwendet werden. Im klinischen Umfeld werden CD 40 B-Zellen unter CD 40-Signalweg und Stimulation mit IL four erzeugt. Nach diesem System können sie über mehrere Wochen erweitert werden. Nachdem wir in unserem Labor die Erzeugung von humanen CD 40 B-Zellen aus PBMC optimiert haben, haben wir dieses Prinzip erfolgreich auf Mäuse übertragen und das möchte ich Ihnen heute zeigen.

Ausgehend von der Milz erzeugen wir marine CD 40-aktivierte B-Zellen innerhalb von 14 Tagen nach der Zellkultur. Die Hauptschritte sind die Vorbereitung der Feeder-Zellen, daher verwenden wir eine marine, CD 40-Liganden-transfizierte Heer-Zelllinie, die adhärent ist und mit 78 Gray bestrahlt und auf sechs Well-Platten plattiert wird. Zweitens beginnen wir mit der marinen CD 40 DB-Kultur, indem wir frisch gereinigte SPOC-Zyten von sechs schwarzen Mäusen verwenden, die mit marinem Interleukin vier Beta Macab zu Ethanol und Cyclosporin A behandelt werden. Diese Zellen werden dann auf bestrahlte Fetazellen auf sechs Well-Platten übertragen.

Dieser Vorgang wird alle drei bis vier Tage bis zum 14. Tag der Zellkultur wiederholt. Um hochreine marine CD 40-aktivierte B-Zellen zu erhalten, beginnen wir mit der Erzeugung von marinen CD 40-aktivierten B-Zellen unter Verwendung frisch gereinigter SP-Zyten durch LXi-Mäuse. Zuerst waschen wir die SP-Zyten mit Resus, indem wir die Zellen in 50 Milliliter marinem CD 40 B-Waschmedium suspendieren.

Schleudern Sie dann die Zellen sieben Minuten lang bei 1300 U/min, entsprechend 260 5G, zur Bestimmung der Zellzahl. Die Zyten in 10 Millilitern marinem CD 40 B-Waschmedium gründlich resuspendieren und schließlich die Zellen durch Vortexen mischen. Bestimmen Sie dann die Zellzahl.

Schleudern Sie die erforderliche Menge an Cytes sieben Minuten lang bei 1300 U/min, entsprechend 260 5G, mit einer Sechs-Well-Platte herunter. Sie benötigen fünf mal 10 zu den sechs Zellen pro Well, also 30 mal 10 zu den sechs Zellen pro Platte Ressource. Geben Sie die benötigte Menge an einer Stelle 25 mal 10 der sechs Zellen pro Milliliter in marinen CD 40 B-Kulturmedien aus.

Ergänzen Sie dann die Zellsuspension frisch mit marinem IL vier in einer Konzentration von einer Einheit pro Milliliter zur Stimulation, Cyclosporin A in einer Konzentration von oh 0,63 Mikrogramm pro Milliliter zur Hemmung des Auswachsens von T-Zellen und 100 Mikromolar Beamer CAPTA Ethanol. Nun ist die Zellsuspension bereit für die Stimulation mit Feer-Zellen. Wir verwenden marine CD 40-Liganden-transfizierte Heilerzellen, um das Überleben, die Differenzierung und die Proliferation der Zellen zu stimulieren, da die Heer-Zelllinie mehrere Monate in Kultur überleben kann.

Ein Verlust der Expression der marinen CD 40-Beine muss vom Fuchs regelmäßig ausgeschlossen werden. CD 40 Ligand transfizierter Heiler ist eine Adhärenzzelllinie, die bei 37 Grad mit 5 % CO2 im Selektionsmedium kultiviert wird, ergänzt mit Vereisung B in einer Konzentration von O 0,2 Milligramm pro Milliliter. Für die Selektion sollte diese adhärente Epithelzelllinie niemals vollständig konfluent werden und zweimal pro Woche gespalten werden, um adhärente Zellen zu spalten.

Aspirieren Sie die mittlere Wäsche einmal mit 10 Milliliter PBS. Vorsichtig schwenken und vier Milliliter Trypsin EDTA in eine 75 Quadratzentimeter große Flocke geben. Inkubieren Sie den Kolben fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad im Inkubator.

Nehmen Sie den Kolben wieder heraus. Klopfen Sie leicht, um die Zellen vom Kunststoff zu lösen. Dann 10 Milliliter Biotyp-Medium zugeben, vorsichtig schwenken und die Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführen.

Schleudern Sie die Feederzellen sieben Minuten lang bei 1300 U/min, entsprechend 260 5G. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen vorsichtig in 10 Millilitern Wildtyp-Medium, um die Zellzahl für eine Subkultur zu bestimmen, die RESO 2,5 mal 10 auf die sechs Zellen in 10 Milliliter Auswahlmedium ausgab, und um sie in einen 75 Quadratzentimeter großen Kolben zu überführen und die Feederzellen bei 37 Grad in 5 % CO2 für die CD 40-Stimulation zu inkubieren. Nimm den Rest der Heer-Zellen und bestrahlung sie tödlich mit 78 Grad, um sie vor Vermehrung zu schützen.

Die Feederzellen werden in Wildtyp-Medium mit einer Zelldichte von O 0,2 mal 10 auf die sechs Zellen pro Liter verdünnt und zwei Milliliter pro Well auf einer Sechs-Well-Platte plattiert. Lassen Sie die Zellen wieder adhärent werden, bevor Sie sie als Stimulatorzellen verwenden, indem Sie sie 24 Stunden lang bei 37 Grad und 5% CO2 zur Stimulation von Zyten mit einem Liganden nahe CD 40 inkubieren. Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Feeder-Zellen, die einen Tag zuvor plattiert wurden, haftend sind.

Wenn die Feeder-Zellen adhärent sind, entfernen Sie vorsichtig das SUP-Natin aus jeder Vertiefung und übertragen Sie dann vorsichtig vier Milliliter der SPOC-Seitensuspension, die kurz zuvor auf einen Punkt 25 mal 10 eingestellt worden war, zu den sechs Zellen pro Milliliter zur Stimulation und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad und 5 % CO2 am vierten Tag der Subkultur mariner CD 40 B-Zellen erneut für die erste Subkultur der marinen CD 40, aktivierte B-Zellen am vierten Tag und folgende Subkulturen alle drei bis vier Tage. Ernten Sie die geclusterten Zellen schonend aus der Sechs-Well-Platte, indem Sie sie mit einem 10-Milliliter-Rohr ausgeben. Poolen Sie die Marine CD 40 B Zellen in einem 50 Milliliter Röhrchen und schleudern Sie die Zellen für sieben Minuten bei 1300 U/min entsprechend 260 5G komplett durch Marine CD 40 B Waschmedium aus.

Und um die Zellzahl der marinen CD 40 B-Zellen zu bestimmen, suspendieren wir die marinen CD 40 B-Zellen bei einer Zelldichte von oh Punkt 75 mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter in marinem CD 40 B-Kulturmedium. Dann ist die Zellsuspension wieder mit frischem marinem IL vier in einer Konzentration von einer Einheit pro Milliliter, Cyclosporin A in einer Konzentration von oh Punkt 63 Mikrogramm pro Milliliter und 100 mikromolaren Strahlen bis hin zu Ethanol zu ergänzen. Natürlich müssen die bestrahlten Feederzellen direkt vor dem Einsatz noch einmal unter dem Mikroskop auf ihre Adhärenz überprüft werden.

Wenn die Feederzellen anhaften, entfernen Sie vorsichtig das SUP-Natin von jeder Zellen. Nun, dann überführen Sie die kurz zuvor vorbereitete Marine-CD 40 B-Suspension zur Stimulation in jede Vertiefung. Die Subkultur wird nach drei bis vier Tagen zweimal pro Woche identisch wiederholt, um am 14. Tag der Kultur hochreine marine CD 40-aktivierte B-Zellen zu erhalten.

Zu diesem Zeitpunkt exprimieren marine CD 40 B-Zellen co-stimulatorische Moleküle wie CD 80, CD 86 und MHC-Moleküle plus eins und zwei, die von Fox während der Generierung überprüft werden können. Die Zellen, die wir gerade erzeugt haben, können genutzt werden, um die Aktivierung, Differenzierung und Funktion von B-Zellen zu erforschen, zum Beispiel um ihren möglichen Einsatz für immuntherapeutische Zwecke zu untersuchen.