Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Um dieses Protokoll zu starten, wählen Sie einen Vektor für die Expression Ihres bevorzugten bakteriellen Effektors aus. In Hefe und Hefestamm wird der Vektor dann in Hefezellen umgewandelt. Die nächste Expression des Effektors wird induziert.

Induzierte Zellen werden für die anschließende Western-Blot-Analyse lysiert, um die Expression des Effektors zu überprüfen. Nach Bestätigung der Expression des Effektors werden die Zellen gezüchtet und zehnfach, serielle Verdünnung auf repressive und induzierende Medien aufgebracht. Nach zwei bis drei Tagen wird schließlich das Hefewachstum analysiert.

Hallo, ich bin Do Solomon aus dem Labor von Dr. Guido Cesa am Department of Plant Sciences der Universität Tel Aviv. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Identifizierung von Wachstumshemmungsphänotypen, die durch die Expression von bakteriellen Effektoren des dritten Typs in Hefe induziert werden. Dieses Verfahren verwenden wir in unserem Labor, um die Funktion von Effektoren vom Typ drei von gramnegativen pathogenen Bakterien zu untersuchen, und ist ein Werkzeug, das uns bei der Identifizierung der Effektor-TIC-Ziele unterstützt.

Also lasst uns loslegen. Mehrere wichtige Faktoren sollten berücksichtigt und optimiert werden, wenn ein Hefesystem entworfen wird, das für die Expression der interessierenden Effektoren vom Typ drei geeignet ist. Die erste ist der Promotor, der die Expression der Effektoren antreibt.

Da bakterielle Effektoren vom Typ 3 für Hefezellen toxisch sein können, sollte ein induzierbarer Promotor verwendet werden, um ihre Expression zu kontrollieren. Wir werden in diesem Experiment den GAL-One-Promotor verwenden. Der zweite Faktor ist die Kopienzahl des Effektorgens.

Hohe Expressionsniveaus werden erreicht, wenn das Effektorgen von einem zwei Mikrometer Plasmid getragen wird. Die intermediäre Expression wird durch die Verwendung eines plasmidhaltigen Zentromers erreicht, und eine niedrige Expression wird erreicht, wenn das Effektorgen durch homologe Rekombination in das Hefegenom integriert wird. Ein dritter Faktor, der berücksichtigt werden muss, ist der Epitop-Tag, der zur Überprüfung der Proteinexpression in Fällen verwendet wird, in denen keine Antikörper gegen den interessierenden Effektor verfügbar sind.

Häufig verwendete Tags sind M, Hämagglutinin, HA oder Flag, gegen die zuverlässige kommerzielle Antikörper verfügbar sind. Wir empfehlen, nur eine Kopie des Tags zu verwenden, um unerwünschte schädliche Auswirkungen auf die Struktur und Aktivität des Effektorproteins zu minimieren. Zu guter Letzt muss der Hefestamm, der für die Expression verwendet werden soll, tropisch zum selektierbaren Marker des Expressionsvektors sein.

Um Hefezellen für die Umwandlung zu züchten, nehmen Sie eine Hefekolonie aus einer frischen Platte und impfen Sie drei Milliliter YPD in einen 15-Milliliter-Polypropylen-Röhrchenwirbel. Legen Sie das Kulturröhrchen kurz in eine Rolle und inkubieren Sie es über Nacht bei 30 Grad Celsius mit ständiger Rotation. Nehmen Sie am nächsten Morgen die Kultur von der Walze und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 800 g bei Raumtemperatur.

Nach der Zentrifugation den Überstand vollständig entfernen und die Zellen in einem Milliliter Resus-Suspensionspuffer resuspendieren, der durch Vortexen bei maximaler Geschwindigkeit für etwa 10 Sekunden gemischt wird. Für jedes zu transformierende Plasmid und eine zusätzliche Kontrolltransformation werden 100 Mikroliter der Zellsuspension in ein Mikrofuge-Röhrchen überführt. Geben Sie fünf Mikroliter einzelsträngiges Lachssperma, DNA und 250 bis 500 Nanogramm Plasma-DNA in jedes Röhrchen mit Ausnahme des Kontrollröhrchens.

Geben Sie anschließend vorsichtig 650 Mikroliter Transformationslösung in jedes Röhrchen und jeden Wirbel. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 30 Grad Celsius für 30 Minuten auf einer Walze. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, geben Sie 70 Mikroliter DMSO in jedes Röhrchen und mischen Sie, indem Sie die Röhrchen 10 bis 15 Mal umdrehen, um ein Zerbrechen der Zellen zu vermeiden.

Verwirbeln Sie die Schläuche nicht. Legen Sie die Röhrchen in ein 42 Grad Celsius warmes Wasserbad und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang. Nehmen Sie nach 15 Minuten die Schläuche aus dem Wasserbad und legen Sie sie sofort für zwei Minuten auf Eis.

Sobald die Röhrchen abgekühlt sind, ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwenden Sie dann eine Pipette, um den viskosen Überstand vorsichtig zu entfernen. Jedes Pellet wird in 150 Mikrolitern sterilem, doppelt destilliertem Wasser resuspendiert und die Zellsuspension auf einer Platte mit dem entsprechenden selektiven Medium verteilt. Lassen Sie die Platten zwei Minuten offen und lassen Sie sie in einer Laminar-Flow-Haube trocknen.

Legen Sie die Platten danach für zwei bis drei Tage in einen 30 Grad Celsius heißen Inkubator, um Hefezellen zu züchten. Zur Herstellung eines Proteinextrakts werden drei Milliliter des entsprechenden Suppressionsmediums mit Hefekolonie aus einer frischen Platte inokuliert und ein Wirbel eingewirbelt. Legen Sie das Kulturröhrchen am nächsten Tag kurz in eine Rolle bei 30 Grad Celsius.

Nehmen Sie die Kultur von der Walze und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 800 g, verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet erneut. In drei Millilitern sterilem DDW, das durch Vortex-Zentrifuge gemischt wird, wird wiederum der Überstand verworfen und die Zellen in drei Millilitern sterilem DDW resuspendiert. Nun werden 200 Mikroliter der Zellsuspension in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen überführt, das drei Milliliter des entsprechenden Induktionsmediums enthält, das durch Vortexen gemischt wird.

Legen Sie das Röhrchen in eine Rolle und inkubieren Sie es über Nacht bei 30 Grad Celsius am nächsten Morgen. Übertragen Sie einen Milliliter der Kultur oder mehr für Kulturen mit niedriger Dichte in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 800 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, von hier an arbeiten Sie in einem Abzug, um das Einatmen giftiger Beamer Capto Ethanoldämpfe zu vermeiden.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und suspendieren Sie das Zellpellet wieder in 100 Mikrolitern eiskalter Lyselösung. Durch Vortexen kräftig mischen und 30 Minuten auf Eis inkubieren. Während der 30-minütigen Inkubation wird das Volumen von sechs normalen Salzsäure bestimmt, das für das Tittern von 100 Mikrolitern Lysepuffer auf einen pH-Wert von neun bis 10 erforderlich ist.

Zu diesem Zweck wird 100 Mikroliter Lysepuffer in 10 verschiedenen Röhrchen mit verschiedenen Volumina Salzsäure zugegeben und der pH-Wert der Lösung am Ende der Inkubation mit einem pH-Indikatorstreifen bei der entsprechenden Menge Salzsäure zum Lysat überprüft und durch Vortexen gemischt. Geben Sie dann 50 Mikroliter mit drei x Probenpuffer in das Lysat und mischen Sie durch Vortexen, punktieren Sie mit einer Nadel ein Loch in den Deckel des Mikrofurchens und kochen Sie die Lysatlösung fünf Minuten lang auf einem Heizblock. Lassen Sie die Lösung nach dem Kochen zwei Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen.

Wirbeln Sie dann die Lysatlösung und schleudern Sie sie 10 Sekunden lang herunter. Das Lysat ist nun bereit für die Immunblutanalyse, um die Zellen für den Spotting-Assay vorzubereiten. Züchten Sie drei Milliliterkulturen jedes Stammes, wie zuvor gezeigt, am nächsten Tag.

Bereiten Sie zwei Platten mit synthetischem Vollmedium ohne Leucin vor. Das Medium einer Platte sollte mit 2 % Glukose und das der anderen Platte mit 2 % Aktose und 1 % Raffinose ergänzt werden. Trocknen Sie die Platten in einer sterilen Laminar-Flow-Haube bei Raumtemperatur für 20 Minuten.

Ernten Sie die Zellen und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in drei Millilitern sterilem DDW. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und resuspendieren Sie die Zellen erneut in drei Millilitern sterilem DDW. Bestimmen Sie die optische Dichte oder OD jeder Kultur und bereiten Sie dann einen Milliliter Zellsuspensionen mit einem OD 600 von einem in sterilen Mikrofiche-Röhrchen vor.

Als nächstes bereiten Sie drei zehnfache Serienverdünnungen aus jeder der Zellsuspensionen vor, indem Sie drei sterile Mikroröhrchen verwenden, die mit 900 Mikrolitern sterilem DDW gefüllt sind. Legen Sie die Trockenplatten auf ein Gitter und für jeden Kulturfleck 10 Mikroliter aus den vier Verdünnungen in einer Reihe. Lassen Sie die Platten nach dem Flecken einige Minuten lang in der Haube offen.

Wenn die Flecken trocken sind, decken Sie die Platten ab und legen Sie sie für zwei bis drei Tage in einen 30 Grad Celsius heißen Inkubator. Jetzt werden wir die Ergebnisse eines Hefe-Spotting-Assays zum Nachweis der Wachstumshemmung zeigen. Phänotypen, die durch die Expression von Effektoren vom Typ drei induziert werden, hier die Effektoren vom Typ drei, A-V-R-P-T-O-Hop, AA eins und AAV RE einer des Bakteriums.

Der Pseudomona Riner-Pfad unserer Tomate wurde von einem plasmidhaltigen Zentromer in einem Hefestamm auf repressiven mittleren Hefestämmen exprimiert, die Plasmid für die Expression von A-V-R-P-T-O und HOP AA trugen; einer zeigte ein ähnliches Wachstum wie der Kontrollstamm mit einem leeren Vektor. Während die Hefe, die AAV RE one trug, ein leicht reduziertes Wachstum zeigte, wahrscheinlich aufgrund eines Lecks des GAL one Promotors und der hohen Zytotoxizität von AV RE one, verursachte die Expression von AV E one oder HOP AA one unter induzierenden Bedingungen einen drastischen Wachstumshemmungsphänotyp, der sich in dem Fehlen von Kolonien in jeglicher Verdünnung widerspiegelte. Im Gegensatz dazu übte die Expression von A-V-R-P-T-O keine wachstumshemmende Wirkung aus.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Phänotypen von Wachstumshemmungen identifizieren können, die durch die Expression von bakteriellen Effektoren vom Typ drei in Hefe verursacht werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, sowohl den Expressionsvektor als auch diesen Stamm sorgfältig auszuwählen, da beide die Ergebnisse dramatisch beeinflussen können. Denken Sie außerdem daran, in allen Schritten des Verfahrens frisch transformierte Bienenvölker zu verwenden.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.