Name: Direkte Starten eines Replication Fork von einem Head-On RNA Polymerase Stalled (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Erfahren Sie, wie Replisom-Stallung bei Kollision mit RNA-Polymerase untersucht wird. Diese Methode zeigt, wie Mfd die Replikationsneustart nach RNAP-Verdrängung fördert.

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Wir sind besonders dankbar, dass Seth Darst für die Bereitstellung von RNAP und MFD Proteine ​​und Expressionsvektoren. Wir sind auch danken Sergei Borukhov für die Bereitstellung von Greb und Dan Zhang für den technischen Support. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (MOD) und durch ein Marie-Josée und Henry Kravis Fellowship an der Rockefeller University (RTP) unterstützt.

Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">Pomerantz und O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010)</a> . 1. Montage eines gestoppt RNAP Dehnung Komplex wurde wie folgt durchgeführt: 500 nM Endkonzentration von E. coli RNAP σ 70 hat er wurde mit 5 nM Endkonzentration von einem biotinylierten 3,6 kb DNA-Template enthalten, die T7A1 Promoter in 100 ul Puffer A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 gemischt mM DTT, 10% Glycerin) für 10 min bei 37 ° C. 100 uM der APU und 40 uM jedes GTP, ATP und CTP wurden für weitere 10 min bei 37 ° C aufgenommen 2. Immobilisierung des gestoppt RNAP Dehnung Komplexes auf Streptavidinbeads wurde wie folgt durchgeführt: 200 ul Streptavidin-Magnetpartikel Kügelchen (Invitrogen) wurden, um die Reaktion über 10 min bei Raumtemperatur aufgenommen. 3. Die Reinigung der immobilisierten gestoppt RNAP Dehnung Komplex wurde wie folgt durchgeführt: Die Perlen (von oben) wurden 5 mal mit 0,9 ml Puffer A mit 0,75 M NaCl, 200 ug / ml Heparin und 20 pg / ml ssDNA (Der Überstand wurde nach jedem Waschschritt durch magnetische Separation entfernt.) Anschließend die gewaschenen Perlen wurden 2 mal mit 0,9 ml Puffer A gewaschen 4. Die Bildung einer Replikationsgabel stromabwärts bezüglich der Kopf-an RNAP wurde wie folgt durchgeführt: Die Perlen (von oben) wurden in 100 ul New England Biolabs Puffer 4 und 10 Einheiten von Sap I (New England Biolabs) resuspendiert wurde für 10 min bei 37 ° C. Die Perlen wurden 3 mal mit 0,9 ml Puffer A gewaschen und dann in 50 ul von Quick T4 Ligationsreaktion Puffer (New England Biolabs) resuspendiert. 2 ul von Quick T4-Ligase (New England Biolabs) wurde zusammen mit 6 nM Endkonzentration von pre-geglüht gespaltene DNA (RP10, RP22, RP25) für 10 min bei Raumtemperatur aufgenommen. Die Perlen wurden 3 mal mit 0,9 ml Puffer A gewaschen 5. Versammlung der replisome und Initiierung von führenden Strang-Synthese an der Replikationsgabel wurde wie folgt durchgeführt: 448 pmol der DnaB (als Hexamer) wurde mit den Beads 150 ul Puffer A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% Glycerin) für 30 s bei 23 ° C. 4,9 pmol des Pol III * (Pol III HE minus β), 15 pmol von β, 2 mM ATP und 60 uM dGTP und dATP wurden auf ein Volumen von 200 ul zugegeben und weitere 5 min bei 37 ° C. Replication wurde nach Zugabe von 10 pg SSB und 24 uM dATP und dTTP mit initiiert [α-32 P] dTTP und [α-32 P] dCTP (spezifische Aktivität, 3000-5000 cpm / pmol) auf ein Endvolumen von 250 ul. Die Reaktionen wurden nach 10 min nach Zugabe von 12 ul 500 mM EDTA beendet. 6. Reinigung und Konzentrierung der radioaktiv markierten DNA-Produkte wurde wie folgt durchgeführt: Die Perlen (von oben) gekocht wurden nach der Reaktion wurde beendet, um die DNA aus den Perlen zu entfernen. Ein verbleibender DNA übrigen an der Perlen wurde durch die Behandlung der Perlen mit Proteinase K in einem Volumen von 10 ul für 30 min bei 50 ° C entfernt Die Perlen wurden dann gekocht und der Überstand wurde durch magnetische Separation entfernt. Der kombinierte Überstand, der die DNA wurde unter Verwendung des Qiagen PCR Cleanup Kit. Gereinigtes radioaktiv markierten DNA-Produkte wurden dann in einem alkalischen Agarosegel analysiert. * Replication in der Abwesenheit von einem Kopf-an RNAP gestoppt Dehnung komplex wie oben ausgeführt wurde, aber σ 70 wurde weggelassen. Repräsentative Ergebnisse: Collision der replisome mit einem Kopf-an RNAP führt in der Regel zwei Produkten von 2,5 kb und 3,6 kb Länge. Die 2,5 kb Produkt ist die Länge der DNA aus der Gabel, die gestoppt RNAP und Ergebnisse aus replisome Abwürgen beim Zusammenstoß mit der RNAP. Das 3,6 kb Produkt stellen in voller Länge DNA und Ergebnisse aus entweder unvollständig Belegung des Promotors durch RNAP oder teilweise replisome Durchlesen durch den Kopf-an RNAP. Ein gutes oder genaues Ergebnis zeigt, dass ca. 50% in voller Länge DNA hergestellt wird. Doch in einigen Fällen weniger Belegung des Promotors durch RNAP auftritt und einen höheren Prozentsatz von Volllängen-DNA ist, da eine größere Population von replisomes beobachtet nicht begegnen einem Kopf-an RNAP. Replikation in Abwesenheit eines gestoppt RNAP Ergebnisse in nur voller Länge DNA (3,6 kb). <img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung. 1 Die replisome wird von einem Kopf-an RNAP behindert. (A) Versuchsaufbau. A E. coli RNAP gestoppt Dehnung Komplex auf einem biotinylierten DNA mit den T7A1 Promoter wie zuvor beschrieben (9) montiert wurde. Kurz gesagt wurde ein Stillstand Dehnung Komplex 20 bps stromabwärts vom Promotor durch Inkubation RNAP-Holoenzym mit biotinylierten DNA für 10 min durch Zugabe von APU, GTP, ATP und CTP für weitere 10 min, gefolgt gebildet. Streptavidin Beads wurden für weitere 10 min dann die Kügelchen wurden fünfmal mit je 0,9 ml Puffer mit 0,75 M NaCl, 200 mg / ml Heparin und 100 nM Einzelstrang-DNA zu instabilen RNAP-DNA-Komplexe und überschüssige NTPs entfernen hinzugefügt . Die DNA wurde dann mit SAPI verdaut, gewaschen und ligiert, um ein Pre-geglüht gespaltene DNA. Die Perlen wurden erneut vor der Montage des replisome gewaschen. Der Veranstalter ist 2,5 kb aus der Gabel liegt und orientiert sich an die Transkription auf die Gabel. (B) DnaB wurde hinzugefügt, dann replisome montiert wurde und die Replikation wurde entweder in der Gegenwart begonnen werden (Spur 2) oder Abwesenheit (Spur 1) eines Kopf-an RNAP.

<ol><li>Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+and+resolving+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription.</a> DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).</li>
<li>Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-induced+deletions+in+plasmid+vectors%3A+M13+DNA+replication+as+a+source+of+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability.</a> Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).</li>
<li>Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+modulators+and+DNA+repair+activities+resolve+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription.</a> Mol Cell. 19, 247-247 (2005).</li>
<li>McGlynn, P., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+RNA+Polymerase+by+%28p%29ppGpp+Reveals+a+RecG-Dependent+Mechanism+for+Replication+Fork+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression.</a> Cell. 101, 35-35 (2000).</li>
<li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).</li>
<li>Labib, K., Hodgson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+barriers%3A+pausing+for+a+break+or+stalling+for+time%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time.</a> EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).</li>
<li>Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+collapse+at+replication+terminator+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Replication fork collapse at replication terminator sequences.</a> Embo J. 21, 3898-3898 (2002).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+mechanics%3A+insights+into+a+twin+DNA+polymerase+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine.</a> Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+replisome+uses+mRNA+as+a+primer+after+colliding+with+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase.</a> Nature. 456, 762-762 (2008).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-557 (2006).</li>
<li>Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Cell. 86, 557-557 (1996).</li>
<li>Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+assembly+reveals+the+basis+for+asymmetric+function+in+leading+and+lagging+strand+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication.</a> J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).</li>
<li>Kaplan, D. L., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+binding+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+to+DNA.+V.+T7+RNA+chain+initiation+by+enzyme-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes.</a> Mol Cell. 15, 453-453 (2004).</li>
<li>Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin+DNA+pumps+of+a+hexameric+helicase+provide+power+to+simultaneously+melt+two+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes.</a> Cell. 109, 757-757 (2002).</li>
<li>Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+Transcription+repair+coupling+factor+%28Mfd+protein%29+rescues+arrested+complexes+by+promoting+forward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).</li>
<li>Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+DNA+repair%3A+two+decades+of+progress+and+surprises%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises.</a> Science. 266, 1957-1957 (1994).</li>
<li>Selby, C. P., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+repair+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled repair and human disease.</a> J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).</li>
<li>Liu, B., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+transcription-repair+coupling+factor.+I.+Structural+domains+and+binding+properties.+Head-on+collision+between+a+DNA+replication+apparatus+and+RNA+polymerase+transcription+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex.</a> Science. 267, 1131-1131 (1995).</li>
<li>George, D. L., Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+excision+repair+in+an+mfd+mutant+of+Escherichia+coli+B%2Fr%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r.</a> Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).</li>
</ol>

Das Waschen des gestoppt Dehnung Komplex gebunden an die Perlen mit hohem Salz ist, um jede instabile oder nicht-spezifisch gebundene RNAP Molekülen zu entfernen kritisch. RNAP hat eine extrem hohe Affinität für die Primer-Template-Typ von DNA-Strukturen. So ist es notwendig, solche unspezifischen RNAP-DNA-Komplexe zu entfernen, um die Replikation von der Primer-Template durchführen. Konzentration des radioaktiv markierten DNA-Produkte mit dem Qiagen PCR Purification Kit ist ebenfalls entscheidend, um eine ausreichend hohe radioaktive Signal, dass im Gel beobachtet werden zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Quick Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Reinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

direkte starten eines replication fork von einem head-on rna polymerase stalled

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In-vivo-Studien deuten darauf hin, dass Replikationsgabeln durch Begegnungen mit Kopf-auf die Transkription Komplexe verhaftet. Doch nach dem Schicksal der replisome und RNA-Polymerase (RNAP) eine Frontalkollision ist unbekannt. Hier finden wir, dass die E. coli replisome Stände beim Zusammenstoß mit einem Kopf-an-Transkription komplex, aber anstelle von zusammenbricht, bleibt das Replikationsgabel sehr stabil und schließlich wieder Dehnung nach Verschieben der RNAP von DNA. Wir finden auch, dass der Transkriptions-Reparatur Kopplungsfaktor, MFD, direkten Neustart der Gabel nach der Kollision durch die Erleichterung Verschiebung der RNAP fördert. Diese Ergebnisse zeigen die innere Stabilität der Replikation Apparat und eine neue Rolle für die Transkription gekoppelte Reparatur-Weg bei der Förderung der Replikation an einem RNAP zu blockieren.

Das Schicksal der replisome nach einer Kollision mit einem Kopf-an-RNA-Polymerase (RNAP) ist unbekannt. Wir finden, dass die replisome Stände beim Zusammenstoß mit einem Kopf-an RNAP, sondern nimmt Dehnung nach Verschieben der RNAP von DNA. Mfd fördert die Replikation starten durch Erleichterung der Verschiebung der RNAP nach der Kollision.

Direkte Starten eines Replication Fork von einem Head-On RNA Polymerase Stalled

In-vivo-Studien legen nahe, dass Replikationsgabeln aufgrund von Kollisionen mit entgegenkommenden (Head-on) Transkriptionskomplexen arretiert werden. Dennoch bleiben das Schicksal des Replisoms und der RNA ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Schicksal der Repli-Zone und der RNA-Polymerase oder RNAP nach einer frontal erfolgenden Kollision zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst der Transkriptionskomplex an biotinylierter DNA aufgebaut und an Streptavidin-Tabletten und -Kügelchen immobilisiert wird, wodurch ein gestoppter RNAP-Elongationskomplex entsteht. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, vorgefertigte, gabelartige DNA an den RNAP-Elongationskomplex zu ligieren, um einen Replikationsgabel untenstrom der frontal angeordneten RNAP zu bilden.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Repli-Zone zusammenzubauen und die Synthese des vorangehenden Strangs an der Replikationsgabel zu initiieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Isolierung der DNA von den magnetischen Perlen und die Reinigung der DNA über eine PCR-Reinigungssäule. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass die Replikation bei einer Kollision mit dem entgegenkommenden Transkriptionskomplex durch ein alkalines Agarosegel der gereinigten, radioaktiv markierten DNA-Produkte zum Stillstand kommt.Hallo, ich bin Richard Pomerance aus dem Labor von Mike O'Donnell an der Rockefeller University. Heute zeige ich Ihnen das Verfahren, wie man eine Kollision eines Ribosoms mit einer frontal aufeinanderprallenden RNA-Polymerase in fester Phase durchführt. In unserem Labor verwende ich dieses Verfahren, um zu untersuchen, wie der Replikationsprozess durch Transkriptionskomplexe entlang der DNA beeinflusst wird.Beginnen wir also. Mischen Sie zu Beginn des Protokolls das RNAP-Holoenzym mit einer biotinylierten 3,6-KB-DNA-Vorlage, die den T7A1-Promotor enthält, in 100 Mikroliter Puffer A, und inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der 10-minütigen Inkubation fügen Sie die Ribonukleotide Adenosintriphosphat, Cytidintriphosphat und Adenosinuridintriphosphat hinzu, wodurch die RNA-Synthese auf 20 Nukleotide begrenzt wird.Die Lösung weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, um den angehaltenen RNAP-Elongationskomplex an die Kügelchen zu binden. Die Lösung zu streptavidinbeschichteten magnetischen Kügelchen geben. Die Mischung 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen.Reinigen Sie den immobilisierten, angehaltenen RNAP-Elongationskomplex, indem Sie die Kügelchen mit 0,9 Milliliter Hochsalz-Puffer waschen. Um unspezifische R-N-A-P-D-N-A-Komplexe nach jedem Waschschritt zu entfernen, entfernen Sie den Überstand durch magnetische Trennung. Dieser Waschschritt sollte fünfmal wiederholt werden.Danach sollten die Kügelchen noch zweimal mit 0,9 Millilitern Puffer A gewaschen werden. Nach dem letzten Waschschritt kann die nachgeschaltete Replikationsgabel assembliert werden, um eine Replikationsgabel stromabwärts des frontal aufeinandertreffenden RNAP-Transkriptionskomplexes zu bilden; suspendieren Sie den magnetischen Streifen mit den an den angehaltenen RNAP-Elongationskomplex gebundenen Kügelchen in 100 Mikrolitern New England Biolabs Puffer vier. Geben Sie anschließend 10 Einheiten Shrimp-Alkalische Phosphatase oder SAP1 hinzu und inkubieren Sie die Probe 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 0,9 Millilitern Puffer A. Suspendieren Sie die Kügelchen danach in 50 Mikrolitern Schnell-T4-Ligationspuffer.Fügen Sie zwei Mikroliter schnelle T4-Ligase und vorgefertigte, gegabelte DNA hinzu und inkubieren Sie die Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Perlen abschließend dreimal mit 0,9 Millilitern Puffer A. Mischen Sie den Hexamer- und DNAB-Helikasekomplex mit den magnetischen Strep-A-Perlen, die an den angehaltenen RNAP-Elongationskomplex und die nachgeschaltete Replikationsgabel gebunden sind. Bereiten Sie die Lösung in 150 Mikrolitern Puffer A vor und inkubieren Sie sie 30 Sekunden bei 23 Grad Celsius.Nach der kurzen 32. Inkubation bei 23 Grad Celsius. Zur Polymerase drei Beta-Klammer A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alpha P 32 markiertes dGTP und alpha P 32 markiertes dATP auf ein Volumen von 200 Mikrolitern. Inkubieren Sie die Probe fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.Starten Sie die Replikation durch Zugabe von Einzelstrang-DNA-bindendem Protein, DCTP und DTTP. Geben Sie außerdem alpha-P-32-markiertes DTTP und DCTP auf ein Endvolumen von 250 Mikrolitern. Beenden Sie die Reaktionen nach 10 Minuten durch Zugabe von 12 Mikrolitern 0,5-molarer EDTA.Als Nächstes die Strp din-Beads aufkochen, um die DNA aus den Beads freizusetzen. Reste der DNA durch Behandlung der Beads mit Proteinase K für 30 Minuten bei 50 Grad Celsius entfernen. Die Beads erneut aufkochen und das Überstand durch magnetische Trennung abtrennen.Reinigen Sie das kombinierte Überstand, das die DNA enthält, mithilfe des Kyogen-PCR-Reinigungskits. Analysieren Sie abschließend die gereinigten radioaktiv markierten DNA-Produkte in einem alkalischen Agarosegel. Die Kollision der Zone mit einer frontal auf RNAP führt gewöhnlich zu zwei Produkten mit einer Länge von 2,5 KB und 3,6 KB. Das 2,5-KB-Produkt repräsentiert die Länge der DNA von der Gabel bis zum angehaltenen RNAP.Dieses Ergebnis beruht auf der Stagnation der Replikation infolge einer Kollision mit der RNAP. Das 3,6-KB-Produkt stellt vollständige DNA dar und entsteht entweder durch unvollständige Besetzung des Promotors durch RNAP oder durch teilweisen Durchgang der Replikation durch die entgegenkommende RNAP. Ein gutes Ergebnis zeigt, dass etwa 50 % vollständige DNA produziert werden.Es kommt jedoch in einigen Fällen zu einer geringeren Besetzung des Promotors durch RNAP und ein höherer Prozentsatz vollständiger DNA wird beobachtet. Dies liegt daran, dass eine größere Anzahl von Repli-Zonen keine entgegenkommende RNAP-Replikation trifft; in Abwesenheit eines angehaltenen RNAP entsteht ausschließlich vollständige DNA. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Replikation und die Festphasenreaktion in Gegenwart eines am DNA gebundenen angehaltenen RNA-Polymerase-Elongationskomplexes durchführt. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, den angehaltenen Transkriptionskomplex mit hoher Salzkonzentration zu waschen, um überschüssige RNA-Polymerase zu entfernen, die unspezifisch an die DNA bindet und die Replikation hemmt.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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