Direkte Starten eines Replication Fork von einem Head-On RNA Polymerase Stalled

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Schicksal der Repli-Zone und der RNA-Polymerase oder RNAP nach einem Frontalzusammenstoß zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst der Transkriptionskomplex auf biotinylierter DNA assembliert und auf-Tabletten und -Kügelchen immobilisiert wird, was zu dem gestoppten RNAP-Elongationskomplex führt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die vor dem Bedarf gegabelte DNA an den RNAP-Elongationskomplex zu ligieren, um eine Replikationsgabel stromabwärts der frontalen RNAP zu bilden.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Repli-Zone zu assemblieren und die Synthese des Leitstrangs an der Replikationsgabel zu initiieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die DNA aus den magnetischen Kügelchen zu isolieren und die DNA über eine PCR-Aufreinigungssäule aufzureinigen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass der Roso bei Kollision mit dem frontalen Transkriptionskomplex durch ein alkalisches Agro-Gel der gereinigten radiomarkierten DNA-Produkte ins Stocken gerät.

Hallo, ich bin Richard Pomerance vom Labor von Mike O'Donnell an der Rockefeller University. Heute zeige ich Ihnen Ihr Verfahren, wie man eine Kollision des Ribosoms mit einem Kopf auf RNA-Polymerase in fester Phase durchführt. Mit diesem Verfahren verwende ich in unserem Labor zu untersuchen, wie der Prozess der Replikation durch Transkriptionskomplexe entlang der DNA beeinflusst wird.

Also lasst uns loslegen. Zu Beginn dieses Protokollmixes inkubiert das RNAP-Holo-Enzym mit einem biotinylierten 3,6 KB DNA-Template, das den T Seven A-Promotor in 100 Mikrolitern Puffer enthält, das Gemisch 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der 10-minütigen Inkubation fügen Sie die Ribonukleotide Adenosin, Triphosphat, Cytidinphosphat und Aden-Allel-Uridin hinzu, wodurch die RNA-Synthese auf 20 Nukleotide begrenzt wird.

Inkubieren Sie die Lösung für weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, um den gestoppten RN-Affen-Elongationskomplex auf den Kügelchen zu immobilisieren. Geben Sie die Lösung zu Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen. Lassen Sie die Mischung 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Reinigen Sie den immobilisierten, gestoppten RNAP-Elongationskomplex, indem Sie die Kügelchen mit 0,9 Millilitern Puffer mit hohem Salzgehalt waschen. Um unspezifische R-N-A-P-D-N-A-Komplexe nach jeder Wäsche zu entfernen, entfernen Sie den Überstand durch magnetische Trennung. Diese Wäsche sollte fünfmal wiederholt werden.

Dann sollten die Kügelchen noch zweimal mit 0,9 Millilitern Puffer A gewaschen werden. Nach dem letzten Waschen kann die nachgeschaltete Replikationsgabel zu einer Replikationsgabel stromabwärts des frontalen RNAP-Resus zusammengesetzt werden, suspendieren Sie den Magnetstreifen an sichtbare Kügelchen, die an den gestoppten RNAP-Elongationskomplex in 100 Mikrolitern New England Biolabs Puffer vier gebunden sind. Fügen Sie als Nächstes 10 Einheiten alkalische Phosphatase oder SAP-Phosphatase hinzu und inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 0,9 Millilitern Puffer A. Dann resuspendieren Sie die Kügelchen in 50 Mikrolitern Quick T vier Ligationsreaktionspuffer

Fügen Sie zwei Mikroliter schnelle T-Vier-Ligase hinzu und inkubieren Sie die Lösung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zum Schluss waschen Sie die Kügelchen noch dreimal mit 0,9 Millilitern Puffer A-Mix-Hexamer, DNAB-Helikase mit dem magnetischen Streptokokken A und Kügelchen, die an den gestoppten RNAP-Elongationskomplex und die nachgeschaltete Replikationsgabel gebunden sind. Bereiten Sie die Lösung in 150 Mikrolitern Puffer A vor und inkubieren Sie sie 30 Sekunden lang bei 23 Grad Celsius.

Nach der kurzen 32. Inkubation bei 23 Grad Celsius. Bei der Polymerase klemmen drei Beta-Klemmen, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alpha P 32 markierte DGTP und alpha P 32 markierte DATP auf ein Volumen von 200 Mikrolitern. Inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Initiieren Sie die Replikation durch Zugabe des einzelsträngigen DNA-Bindungsproteins DCTP und DTTP. Geben Sie außerdem alpha P 32, gekennzeichnet als DTTP und DCTP, zu einem Endvolumen von 250 Mikrolitern hinzu. Nach 10 Minuten beenden Sie die Reaktionen durch Zugabe von 12 Mikrolitern 0,5 molaren EDTA.

Als nächstes kochen Sie die strp din-Kügelchen, um die DNA aus den Kügelchen freizusetzen. Entfernen Sie alle DNA-Reste, indem Sie die Kügelchen 30 Minuten lang bei 50 Grad Celsius mit Proteinase K behandeln. Kochen Sie die Kügelchen erneut auf und entfernen Sie den Überstand durch magnetische Trennung.

Reinigen Sie den kombinierten Überstand, der die DNA enthält, mit dem Kyogen PCR-Aufreinigungskit. Analysieren Sie schließlich die gereinigten Radiomarkierungs-DNA-Produkte in einem alkalischen Arios-Gel. Die Kollision der Zone mit einem Kopf auf RNAP führt in der Regel zu zwei Produkten mit einer Länge von 2,5 KB und 3,6 KB. Das Produkt von 2,5 KB stellt die Länge der DNA von der Gabel bis zur gestoppten RNAP dar.

Dies resultiert aus dem Abwürgen der Wiederaufnahme bei Kollision mit dem RNAP. Das 3,6 KB große Produkt repräsentiert DNA in voller Länge und resultiert entweder aus einer unvollständigen Belegung des Promotors durch RNAP oder aus einem teilweisen Repli-Durchlesen der frontalen RNAP. Ein gutes Ergebnis zeigt, dass etwa 50 % DNA in voller Länge produziert werden.

In einigen Fällen tritt jedoch eine geringere Belegung des Promotors durch RNAP auf und es wird ein höherer Prozentsatz an DNA in voller Länge beobachtet. Dies liegt daran, dass eine größere Population von Repli-Zonen nicht auf einen Kopf der RNAP-Replikation trifft, wenn keine gestoppte RNAP nur zu DNA in voller Länge führt. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Replikation und die feste Phase in Gegenwart eines gestoppten RNA-Polymerase-Elongationskomplexes, der an die DNA gebunden ist, durchführen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, den gestoppten Transkriptionskomplex mit hohem Salzgehalt zu waschen, um überschüssige RNA-Polymerase zu entfernen, die unspezifisch an die DNA bindet und die Replikation hemmt.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.