Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro

Die Migration von T-Lymphozyten erfolgt während des Homings zu lymphatischen Organen, beim Austritt aus dem Gefäßsystem und beim Eintritt in periphere Gewebe. Bei diesem Prozess kommt es zu einer adhäsiven Wechselwirkung der T-Zell-Oberfläche mit anderen Zellen. Um dieses Phänomen in vitro zu untersuchen, werden humane T-Lymphozyten isoliert, kultiviert und auf Gewebekulturplatten gelegt, die mit dem adhäsiven Protein beschichtet sind.

ICAM eins und Chemokin SDF eins. Anschließend können Bilder der T-Lymphozytenmigration aufgenommen und analysiert werden. Hallo, ich bin Craig LeFort und das Labor von Minsu Kim im Center for Vaccine Biology and Immunology an der University of Rochester.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von menschlichen Teenager-Lymphozyten, eine Analyse ihrer Migration in vitro. Wir verwenden diesen Assay in unserem Labor, um die Rolle von Integrinen und der T-Zell-Migration zu untersuchen. Das wichtigste Integrin in T-Zellen ist das Lymphozytenfunktions-assoziierte Antigen eins oder LFA-Antigen.

Die spezifischen Liganden für LFA one sind die icas, wie z. B. ICAM one. Darüber hinaus ist für die T-Zell-Migration ein Verwandtschaftssignal erforderlich, um sowohl ein Richtungssignal zu liefern als auch Integrine zu aktivieren. In unserem Assay verwenden wir humanes ICAM one und CX CL 12 oder SDF one als Substrate für die T-Zell-Migration.

Also lasst uns loslegen. Nachdem Sie menschliches Blut von einem gesunden Spender erhalten haben, lassen Sie das Blut auf Raumtemperatur abkühlen. Dies dauert ca. 30 Minuten.

Sobald das Blut abgekühlt ist, pipettieren Sie vorsichtig drei Milliliter polymorphes Dichtegradientenmedium bei Raumtemperatur in ein acht Milliliter schweres Polystyrolröhrchen mit rundem Boden. Geben Sie dann vorsichtig drei Milliliter Vollblut darüber. Es ist wichtig, jegliche Vermischung zu vermeiden.

Legen Sie die Röhrchen in eine Zentrifuge und drehen Sie sie 45 Minuten lang auf 500 g. Bei Raumtemperatur nach der Zentrifugation wurden die mononukleären Zellen des peripheren Blutes oder P-BMCs von den anderen Blutbestandteilen getrennt. Die PBMC-Schicht wird als erstes wolkiges Band von oben angezeigt.

Unter sterilen Bedingungen die klare, gelb gefärbte obere Phase vorsichtig entfernen und entsorgen. Verwenden Sie dann eine P 1000 Mikropipette, um die PBMC-Schicht auf ein neues konisches Röhrchen zu übertragen. Waschen Sie das PBMC zweimal mit PBS-Zentrifugenzellen bei 500 g für fünf Minuten.

Jedes Mal wird der Überstand nach jedem Waschen etwas trüb sein. Die Zellen werden in 20 Millilitern RPMI 1640-Medien mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin und einem Mikrogramm pro Milliliter resuspendiert. Die Inkubation von Phyto-Hämagglutinin oder PHA in Gegenwart von PHA induziert die Aktivierung und Expansion von T-Lymphozyten.

Mit einer Pipette wird das pbmc in einen Kulturkolben T 75 überführt. Als nächstes wurde er ein bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Dieser Schritt ermöglicht es, Monozyten, die an der Kolbenoberfläche haften, von den Lymphozyten zu trennen, die in Suspension verbleiben.

Nach der Inkubation werden alle Medien, die hauptsächlich Lymphozyten enthalten, vorsichtig entfernt und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 500 g. Reese war das Zellpellet in RPMI 1640 und übertrug die Zellen auf ein neues T 75 Flaz, das 25 Milliliter RPMI 1640 mit FBS, Penicillin, Streptomycin und PHA enthielt und bei 37 Grad Celsius inkubiert wurde.

Nach 24 Stunden Wachstum kann es erforderlich sein, 15 bis 20 Milliliter Frischmedium hinzuzufügen und in einen größeren Kolben T 1 75 umzufüllen. Inkubieren Sie drei Tage oder zwei Tage lang. Wenn die erste Inkubation von PBMC nach drei Tagen über Nacht erfolgte, entfernen Sie mit einer Pipette das Medium, das suspendierte Lymphozyten enthält, und überführen Sie es für fünf Minuten in eine konische 50-Milliliter-Röhrchenzentrifuge bei 500 g.

Reese war das Zellpellet und übertrug die Zellen auf ein neues T 75, das 25 Milliliter RPMI 1640 enthielt. Bei FBS legen Penicillin, Streptomycin und humanes IL zwei oder IL 15 die Zellen in den Inkubator. Wenn ein Kolben T 75 gestartet wird, muss die Kultur erweitert und auf einen Kolben T 1 75 übertragen werden.

Nach ein bis zwei Tagen wachsen Lymphozyten für insgesamt vier bis sieben Tage. Einen Tag vor dem Migrationsassay wird eine 0,17-Millimeter-Glasbodenschale mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Protein A oder G in PBS beschichtet und am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Spülen Sie das Geschirr ausgiebig mit PBS und fügen Sie dann ICAM one FC und human SD F1 in PBS-Lösung hinzu.

Inkubieren Sie vier Stunden lang bei Raumtemperatur, um die Moleküle zu immobilisieren. Bestimmen Sie die Dichte der kultivierten Zellen mit einem Hämozytometer. Dann waschen Sie die Lymphozyten zweimal mit PBS und resuspendieren Sie sie nach der Inkubation in einem Milliliter L 15 Medien, die D-Glukose enthalten, waschen Sie die beschichtete Schale mit ICAM einem FC und SDF eins ausgiebig mit PBS, übertragen Sie die T-Lymphozyten in einem Milliliter Medium in die Schale, etwa zwei- bis fünfmal 10 bis fünf Zellen sollten pro Schale verwendet werden, um eine für die Migrationsanalyse geeignete Zelldichte zu erreichen.

Um Bilder der Zellmigration zu erhalten, stellen Sie die Schale auf den Mikroskoptisch in einer temperaturkontrollierten Umgebung, z. B. in einer beheizten Kammer bei 37 Grad Celsius. Öffnen Sie die NIS elements-Software im Menü "Bildeinstellungen". Wählen Sie zwei mal zwei Binning als Modus für Live-Imaging und Bildaufnahme.

Gehen Sie zum Anwendungsmenü und wählen Sie, definieren, ausführen, experimentieren. Wählen Sie die Zeitspanne zwischen den Bildern und die Gesamtzeit. Drücken Sie für die Bildaufnahmesequenz die Run-Taste, um die Bildaufnahme nach der Aufnahme zu starten.

Migrationsparameter wie Geschwindigkeit, Weglänge und Verschiebung können mit einem Softwarepaket wie Image J Auto Quant oder Veloc quantifiziert werden. Um ein Spinnennetzdiagramm zu erstellen, erfassen Sie die XY-Koordinaten für jede Zelle und jeden Zeitpunkt, und projizieren Sie sie in ein Diagramm mit einem gemeinsamen Startpunkt für jede Zelle am Ursprung. Die hier gezeigten T-Lymphozyten wurden auf ICAM und SDF one kultiviert und 30 Minuten lang alle 10 Sekunden abgebildet.

Dieser Film zeigt die zufällige Wanderung von T-Lymphozyten mit einer Geschwindigkeit von etwa 15 Mikrometern pro Minute unter Verwendung der XYT-Koordinaten für jede Zelle. 15 Zellen wurden zufällig ausgewählt und mit einem gemeinsamen Startpunkt am Ursprung aufgetragen. Der Vergleich von Spinnennetzdiagrammen ermöglicht eine schnelle visuelle Darstellung der Unterschiede in der Migration zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen.

Auf der linken Seite sind Diagramme für die T-Lymphozytenmigration unter Kontrollbedingungen dargestellt, während auf der rechten Seite Diagramme für die Migration von T-Lymphozyten in Gegenwart eines Anti-LFA-Antikörpers mit einem Liganden dargestellt sind. Diese Daten zeigen, dass T-Lymphozyten das Integrin LFA on verwenden, um auf ein ICAM One-Substrat zu migrieren. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie während des Eingriffs einen Migrationsassay mit kultivierten menschlichen T-Lymphozyten durchführen.

Es ist wichtig, daran zu denken, eine angemessene Anzahl von Zellen in die mit ICAM beschichtete Schale zu geben, damit die Zellverfolgung und die Analyse der Migration vereinfacht werden. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.