Vergleichende In vivo Studium der gp96 Adjuvantizität in the Frog Xenopus laevis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die evolutionäre Konservierungsfähigkeit des Hitzeschockproteins G 96 zu untersuchen, antigenspezifische CD 8 T-Zell-Antworten in den Xenopus-Hüllen des Frosches zu fördern. Dies wird erreicht, indem zunächst Peritonealleukozyten durch Peritonealspülung entnommen werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die peritonealen Leukozyten mit tumorabgeleitetem GP 96 zu pulsieren, das Minor- und Tumorantigene nach der Inkubation und dem Waschen chaperoniert.

Die peritonealen Leukozyten werden adoptiv durch intraperitoneale Injektion in naive Frösche übertragen, um diese Frösche gegen Tumor- oder Nebenhistokompatibilitätsantigene zu präparieren. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die vorbereiteten Frösche entweder durch eine Hauttransplantation oder einen Tumor zu provozieren und den Beginn der Hauttransplantation, die Abstoßung oder das Auftreten des Tumors zu überwachen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, peripheres Blut zu gewinnen, um die T-Zellen zu charakterisieren, die an der Hautabstoßung und der Anti-Tumor-Reaktion beteiligt sind.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine signifikante Beschleunigung der Abstoßung von Hauttransplantaten sowie Verzögerungen beim Erscheinungsbild von Tumoren bei GP 96 geprimten Fröschen durch die Hauttransplantation bzw. die Tumorprovokationsassays zeigen. Hallo, ich bin Christina Koska im Labor von Dr. Jacque Robert in der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie am University of Rochester Medical Center. Ich bin Tanya Cruz, ebenfalls aus dem Labor von Dr. River.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Vorbereitung von Klonfröschen durch adoptiven Transfer von Peritonealleukozyten, gefolgt von Hauttransplantationen und Tumortransplantationsassays. Darüber hinaus zeigen wir Ihnen, wie Sie peripheres Blut von diesen Tieren gewinnen können. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem atorium, um die Fähigkeit des Proteins GP 96 zu erhitzen, antigenspezifische CDAT-Zellen in Salla zu fördern, sowie um die beteiligten Zelltypen zu untersuchen.

Okay, fangen wir an. Bei den Fröschen, die in unseren Experimenten verwendet werden, handelt es sich um ISO-Genklone aus unserer Zuchtkolonie an der University of Rochester. Um peritoneale Leukozyten oder Pls für die Entnahme zu entnehmen, verwenden Sie eine 25 Gauge Fünf-Acht-Nadel, um den anästhesierten Frosch intraperitoneal mit einem hitzeabgetöteten E-Coli-Präparat zu injizieren. Drei Tage nach der Injektion werden pls durch intraperitoneale Lavage geerntet.

Um diesen Vorgang zu beginnen, desinfizieren Sie den Bauch des betäubten Frosches mit einer kleinen Menge 70% Ethanol. Verwenden Sie dann eine 1,5-Gauge-Nadel, um fünf Milliliter sterile amphibische phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder eine PBS-Vorkriegswaffe bei Raumtemperatur in die Bauchhöhle zu injizieren. Entfernen Sie die Nadel und massieren Sie den Strahl eine Minute lang sanft, um sicherzustellen, dass der injizierte Puffer mit der Flüssigkeit in der Körperhöhle übereinstimmt.

Führen Sie anschließend eine neue 18 Gauge 1,5 Nadel ohne Spritze in den Bauch des Frosches ein. Während Sie die Blutgefäße vermeiden, sammeln Sie die Bauchfellflüssigkeit, die von der Rückseite der Nadel in ein sauberes konisches 50-Milliliter-Röhrchen tropft. Stellen Sie sicher, dass Sie so viel wie möglich vom anfänglich injizierten Volumen abrufen, nachdem pls geerntet wurde.

Setze den Frosch in einen Behälter mit flachem Wasser, bis er wach ist, dann kann er wieder in seinen Käfig gesetzt werden. Sobald das Pls geerntet wurde, zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 1000 U/min bei vier Grad Celsius, entfernen Sie das Sup, das Natant und die Wiederbelebung. Hängen Sie die pls in kaltes A PBS auf.

Übertragen Sie das RESUSPENDED pls auf ein 1,5 Milliliter Mikro-Müllröhrchen. Um das PLS mit GP 96 zu pulsieren. Geben Sie die entsprechende Menge GP 96 in das pls und mischen Sie, indem Sie nach einer Stunde eine Stunde lang pipettieren und inkubieren.

Zentrifugieren Sie die Zellen eine Minute lang bei 14.000 U/min. Um ein ungebundenes GP 96 zu entfernen, entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie kaltes A PBS und Reanimation hinzu.

Hängen Sie die PLS-Zentrifuge wieder aus. Waschen Sie das S insgesamt dreimal mit kaltem A-P-B-S-A, um sicherzustellen, dass nach dem letzten Waschen keine Reste von G 96 übrig bleiben. Resus suspendiert das gepulste pls in einer Konzentration von fünfmal 10 zu den fünf pls pro 300 Mikroliter eines PBS, um pls adoptiv in naive LG sechs Empfänger zu übertragen.

Intraperitoneal injizieren Sie 300 Mikroliter gepulstes pls pro Tier. Frösche müssen mindestens drei Tage vor der Hauttransplantation oder den Tumor-Challenge-Experimenten vorbereitet werden, die als nächstes gezeigt werden. Die Haut für die Transplantation wird von einem anästhesierten LG 15 Spenderfrosch gewonnen.

Schneide und entferne mit einer Schere ein kleines Stück Bauchhaut, nämlich die Bauchhaut, die silbrig erscheint. Aufgrund des Vorhandenseins von ARI bilden sich beim Hantieren mit dem Transplantat vier pigmentierte Zellen. Es ist wichtig, das Gewebe so wenig wie möglich zu manipulieren, da dies zu Schäden am Transplantat führen kann.

Halten Sie die Haut sehr vorsichtig mit der Pinzette fest und legen Sie sie in eine Petrischale, die kaltes A PBS enthält. Lassen Sie die Petrischale an. Legen Sie die Haut auf einen frischen Objektträger und schneiden Sie mit einem Rasiermesser einzelne Transplantate in fünf mal fünf Millimeter große Stücke.

Bewahren Sie die Fragmente in einem PBS auf Eis auf, um die Haut auf den LG-Frosch mit sechs Empfängern zu transplantieren. Machen Sie zunächst einen kleinen Schnitt auf der Rückenhaut des betäubten Empfängers. Führen Sie dann das fünf mal fünf Millimeter große Transplantat mit der silbrigen Seite nach oben unter die Haut ein.

Achten Sie darauf, die Scheren- und Pinzettenmarkierungen auf den Transplantaten zu notieren, da diese nicht als Transplantatabstoßung gezählt werden. Sobald die Bewertung 24 Stunden später beginnt, muss ein Teil der Haut des überlagernden Wirts aus dem Transplantat entfernt werden. Schneiden Sie mit einer Schere ein Fenster um das Transplantat aus, so dass das Transplantat frei sichtbar ist.

Achten Sie darauf, die Spenderhaut nicht zu berühren oder Blutungen auszulösen. Beginnen Sie sofort mit dem Ritzen des Transplantats, indem Sie eine Skizze machen. Hauttransplantation.

Die Abstoßung wird durch den Prozentsatz der Zerstörung des Aridols auf der transplantierten Haut bestimmt. Das Transplantat sollte alle zwei bis drei Tage unter dem Stereomikroskop überprüft werden. Bereiten Sie Tumorzellen für die Transplantation durch Reanimation vor und suspendieren Sie sie in Tumorkulturmedium bei einer Dichte von fünf mal 10 auf die fünf Zellen pro 300 Mikroliter.

Transplantieren Sie die Zellen durch subkutane Injektion auf einer Seite der Rückenseite des Tieres. Pro Strahl werden fünfmal 10 mal die fünf Zellen auf 300 Mikroliter Volumen injiziert. Das Tumorwachstum beginnt innerhalb von zwei bis drei Wochen nach der Tumorprovokation.

Beachten Sie das anfängliche Erscheinungsbild des Tumors. Verwenden Sie Messschieber, um die Abmessungen des Tumors zu messen, und erfassen Sie sein Volumen alle zwei bis drei Tage, bevor Sie Blutleukozyten aus dem Frosch entnehmen. Bereiten Sie die Glasnadeln vor, indem Sie die Nudeln über eine Flamme ziehen.

Nachdem Sie das feine Ende der Pipette unter dem Stereomikroskop geschärft haben, verbinden Sie die Pipette mit einem Aspirationsschlauch aus Kunststoff. Um mit der Blutentnahme zu beginnen, schneiden Sie die Haut über dem hinteren Fuß des anästhesierten Frosches auf, um die Vena dorsalis tarsus freizulegen. Füllen Sie die Glasnadel mit ein bis zwei Millilitern eiskaltem A PBS plus Heparinlösung.

Führen Sie dann die Glasnadel in die Vene ein und beginnen Sie, Blut zu sammeln, indem Sie langsam mit dem Mund aspirieren. Ein bis zwei Milliliter Blut können von einem durchschnittlich großen Frosch gewonnen werden. Der kleine Schnitt am Froschschenkel muss nicht genäht werden.

Die Wunde heilt innerhalb einer Woche. Die Ergebnisse einer stereomikroskopischen Analyse der Abstoßung von Hauttransplantaten 12 Tage nach der Transplantation sind hier dargestellt. Ein geklonter Frosch mit LG Six, der eine Hauttransplantation von einem MHC-identischen LG Six-Spender erhielt, zeigte keine Abstoßung.

Das Sternchen zeigt an, dass die Markierungszange nicht auf Abstoßung zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu zeigt ein LG Six Kloned Frosch, der eine Hauttransplantation von einem MHC-Disparaten-Outbreed-Spender erhielt, eine Abstoßung von 80 %. In beiden Bildern zeigen Pfeile silbrig iride vier pigmentierte Zellen, die gesundes, nicht abgestoßenes transplantiertes Gewebe markieren.

In diesem nächsten Experiment wurden LG 15 pls entweder mit einem PBS als Negativkontrolle rekombinantes GP 96 gepulst, das aus einer E-Coli-Kultur gereinigt wurde, oder GP 96, gereinigt aus 15 Null-Tumorgewebezellen, die dann adoptiv in LG 15 erwachsene Empfänger übertragen wurden, und drei Tage später wurden lebende 15 Null-Tumorzellen durch subkutane Injektionstumoren transplantiert, die erstmals Tage nach der Herausforderung auftraten, wurden überwacht und die Tumorgröße wurde periodisch gemessen in Diese Diagramme, jede Kurve, stellen die Kinetik des Tumorwachstums bei einem Frosch dar. Die Ergebnisse zeigen, dass Tiere, die entweder mit 0,5 oder einem Mikrogramm GP 96 geprimt wurden, im Vergleich zu den Kontrollgruppen ein signifikant verzögertes Erscheinungsbild des Tumors aufwiesen. Daher erleichtert GP 96 die Kreuzpräsentation von Tumorantigenen in Xenopus.

Deshalb haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Fähigkeit von GP 96 untersuchen können, sowohl Neben- als auch Tumorantigene im Frosch-Xap lavis durch Hauttransplantation und Tumortransplantationsassays zu repräsentieren. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, keine Peritonealspülung zu sammeln, wenn ein Blutgefäß beschädigt wurde, da sich die meisten Zellen in den Erythrozyten und nicht in Makrophagen befinden. Es ist auch wichtig, das Gewebe bei der Manipulation des Hauttransplantats nicht mit der Pinzette zu quetschen, um Schäden zu vermeiden.

Das war's also. Danke fürs Waschen und viel Glück bei Ihren Experimenten.