Mikrobielle DNA-Isolierung im Stuhl: Untersuchung des Effekts der Umweltanreicherung auf die Mikrobiomdiversität im Maustumormodell

- Environmental Enrichment (EE) bezieht sich auf die Modifikationen der Haltungsparameter, um positive Auswirkungen auf verschiedene Krankheiten wie Krebs zu erzielen. Bei einer tumortragenden Maus aktiviert EE das Immunsystem und reduziert Entzündungen, was letztendlich die Darmmikrobiota verbessert und die Überlebensrate verbessert. Um die Veränderungen der Darmmikrobiota zu untersuchen, geben Sie die gewünschte Menge Stuhllysepuffer in ein Röhrchen, das den Mausstuhl enthält.

Die Probe zentrifugieren und den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Fügen Sie Guanidiniumchlorid-Lysepuffer hinzu, der DNase und RNase denaturiert. Fügen Sie als nächstes Ethanol hinzu und geben Sie die Probe in eine Siliziumdioxid-Spin-Säule.

Ethanol hilft der DNA, sich an Siliziumdioxid zu binden. Zentrifugieren Sie die Probe. Übertragen Sie nun die Säule in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie der Säule einen Elutionspuffer hinzu, um die DNA zu eluieren.

Zentrifugieren Sie die Probe und entsorgen Sie die Säule. Übertragen Sie die Probe in ein PCR-Röhrchen und führen Sie eine PCR durch, um die DNA zu amplifizieren. Laden Sie die DNA auf Agarosegel und führen Sie eine Elektrophorese durch, um die Größe der mikrobiellen DNA zu quantifizieren. Im folgenden Protokoll werden wir DNA aus dem Stuhl isolieren, um den EE-Effekt auf die Dickdarmmikrobiota in der tumorigenen Maus zu analysieren.

- Verwenden Sie ein kommerzielles Kit, um mikrobielle DNA aus dem Stuhl nach einem Protokoll zum Nachweis von Stuhlpathogenen zu isolieren. Dabei werden die Proben aus dem minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank auf Trockeneis umgefüllt und gewogen. Richten Sie als Nächstes eine PCR ein, die die mikrobielle DNA amplifiziert, wie im Textprotokoll beschrieben. Reinigen Sie dann die Reaktionsprodukte mit Magnetkügelchen.

Für die Reinigung wird zunächst die Amplikon-PCR-Platte kurz zentrifugiert, um die Reaktionsprodukte zu ziehen. Als nächstes werden die magnetischen Kügelchen verwirbelt, um sie gleichmäßig zu verteilen, und 20 Mikroliter Aliquote in jede Reaktionsvertiefung übertragen. Mischen Sie die Kügelchen gründlich mit der Lösung, indem Sie das gesamte Volumen langsam 10 Mal pipettieren. Lassen Sie die Kügelchen dann 5 Minuten lang ruhen.

Legen Sie anschließend die PCR-Platte auf einen Magnetständer und warten Sie 2 Minuten, bis sich die Überstände nach der magnetischen Sammlung der Kügelchen gebildet haben. Entfernen und entsorgen Sie dann die Überstände. Füllen Sie als Nächstes, während die Platte noch auf dem Magneten sitzt, jede Vertiefung mit Kügelchen mit 200 Mikrolitern frischem 80-prozentigem Ethanol und warten Sie 30 Sekunden. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal und lassen Sie die Kügelchen 10 Minuten an der Luft trocknen. Eluieren Sie nun die Reaktionsprodukte aus den Kügelchen, indem Sie die Platte vom Magnetständer entfernen und 52,5 Mikroliter Tris in jede Vertiefung geben. Mischen Sie die Kügelchen vollständig in Lösung, indem Sie das gesamte Volumen langsam 10 Mal pipettieren. Sammeln Sie dann die Kügelchen wie zuvor auf dem Magnetständer und geben Sie 50 Mikroliter der Überstände auf eine saubere PCR-Platte. Decken Sie die Platte mit einem Klarsichtkleber ab und lagern Sie sie bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius.