Analyse der Dynamik fäkaler Mikrobiota in Lupus-anfälligen Mäusen mit einer einfachen, kostengünstigen DNA-Isolierungsmethode
2. Mai 2022
Dieses Protokoll bietet eine einfache, kostengünstige DNA-Isolationsmethode für die Analyse von Veränderungen der Mikrobiota des murinen Darms während der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen.
Die vorgeschlagene DNA-Isolierungsmethode kann dazu dienen, die Darmmikrobiotadynamik in Mausmodellen für Autoimmunerkrankungen zu untersuchen. Eine vielseitigere, kostengünstigere und effizientere Methode wird vorgeschlagen, um DNA aus Stuhlproben zu gewinnen, die mit kommerziell erhältlichen Kits vergleichbar sind. Nehmen Sie zunächst jede Maus einzeln aus ihrem Käfig, sammeln Sie ein Kotpellet direkt aus dem Anus und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius, bis es verarbeitet wird.
Verarbeiten Sie die Proben mit sterilen und sauberen Pinzetten, Röhrchen und Handschuhen. Fügen Sie ein gefrorenes Pellet zu einem vorgewogenen Schraubverschlussrohr mit zwei Milliliter hinzu und notieren Sie das Kotgewicht in Gramm, das zwischen 0,02 und 0,05 Gramm pro Kotpellet liegen sollte. Fügen Sie dem Pellet eine dünne Schicht aus 0,1 Millimeter Glasperlen, 500 Mikroliter Lysepuffer und 200 Mikroliter 20% Natriumdodecylsulfat hinzu.
Bead schlug die Röhre vier Minuten lang in einem Homogenisator, gefolgt von drei bis fünf Minuten Wirbel. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für kurze Zeit, um die Blasen und den Schaum zu entfernen. Um DNA aus den Mikrobiota-Proben zu extrahieren, übertragen Sie 350 Mikroliter Probenüberstand in ein neues 1,5-Milliliter-Schnappverschlussrohr ohne Ablagerungen.
Fügen Sie 500 Mikroliter Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol im Verhältnis 25: 24: 1 hinzu und wirbeln Sie für eine Minute. Nach der Zentrifugation werden 180 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Schnappverschlussrohr überführt. Fügen Sie 180 Mikroliter Chloroform hinzu, invertieren Sie es und mischen Sie.
Daraus werden 180 Mikroliter der wässrigen Phase in ein neues Schnappverschlussrohr überführt. In einer Biosicherheitswerkbank 180 Mikroliter kaltes Isopropanol und 36 Mikroliter fünf molares Ammoniumacetat hinzufügen. Drehen Sie es ein paar Mal um, um zu mischen, und legen Sie die Tube für 20 Minuten auf Eis.
Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Pellets anschließend mehrmals mit 500 Mikrolitern kaltem 70% Ethanol. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Röhrchen 20 Minuten lang kopfüber auf Seidenpapier, bis das Pellet klar wird. Suspendieren Sie das Pellet in 50 Mikroliter molekularem Wasser und erhitzen Sie die Flüssigkeit bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten, um große DNA-Pellets vollständig aufzulösen.
Nach dem Erhitzen zentrifugieren Sie diese Röhrchen bei 3.400 Mal G für eine Minute, um die Kondensationströpfchen aus dem Deckel zurückzugewinnen. Messen Sie die Konzentration und erhalten Sie das Verhältnis 260/280 mit einem Spektralphotometer. Ein Verhältnis für qualitativ hochwertige DNA liegt im Allgemeinen zwischen 1,8 und zwei.
Zentrifugieren Sie die vorbereiteten Proben bei 600 mal G für eine Minute bei Raumtemperatur, bevor Sie 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Dann senden Sie 20 Mikroliter Proben mit Konzentrationen von einem bis 50 Nanogramm pro Mikroliter zur Sequenzierung an das Argonne National Laboratory. Der Mausstamm, dem der Rezeptor CX3CR1 fehlt, hat eine andere Darmmikrobiota-Zusammensetzung als Wildtyp-MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP-Mäuse, zeigt signifikante Unterschiede in bestimmten Gattungen, die für potenziell pathogene Bakterien wie die im Stamm Proteobacteria relevant sind.
Seien Sie vorsichtig mit der Verunreinigung der Probe. Es muss steril sein. Außerdem ist es wichtig, genau zu pipettieren, wenn der Überstand in ein neues Röhrchen übertragen wird.
Diese Methode eignet sich für molekulare Analysen wie PCR, Restriktionsenzymverdauung oder genomischen Bibliotheksaufbau. Bei Lupus haben wir eine starke Beziehung zwischen der Darmmikrobiota und der Lupusprogression nachgewiesen.
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Übersicht
Dieses Protokoll stellt eine einfache und kostengünstige DNA-Isolationsmethode zur Analyse von Veränderungen der murinen Darmmikrobiota während der Entwicklung einer Autoimmunerkrankung bereit. Die Methode wurde entwickelt, um die Dynamik der Darmmikrobiota in Mausmodellen von Autoimmunerkrankungen zu untersuchen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Mikrobiologie
- Autoimmunität
Hintergrund
- Das Verständnis der Darmmikrobiota ist entscheidend für die Forschung zu Autoimmunerkrankungen.
- Aktuelle Methoden zur DNA-Isolierung können teuer und komplex sein.
- Diese Studie schlägt eine effizientere und kostengünstigere Alternative vor.
- Fäkale Proben werden verwendet, um Veränderungen der Mikrobiota zu analysieren.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur DNA-Extraktion aus fäkalen Proben bereitstellen.
- Die Untersuchung der Darmmikrobiota in Modellen autoimmuner Erkrankungen erleichtern.
- Die Effizienz der neuen Methode mit kommerziell verfügbaren Kits vergleichen.
Verwendete Methoden
- Einzelne Sammlung von Fäkalkügelchen von Mäusen.
- Lagerung der Proben bei -80 Grad Celsius.
- Verwendung steriler Werkzeuge zur Probenverarbeitung.
- Zubereitung der Proben mit Lysepuffer und Glasperlen.
Hauptergebnisse
- Die vorgeschlagene Methode liefert eine DNA-Qualität, die mit der von kommerziellen Kits vergleichbar ist.
- Sie ist kostengünstig und effizient für die Analyse von Mikrobiota.
- Erleichtert weitere Untersuchungen zu den Mechanismen autoimmuner Erkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Diese DNA-Isolationsmethode ist ein wertvolles Werkzeug für Forscher.
- Sie unterstützt die Untersuchung der Darmmikrobiota in Krankheitszusammenhängen.
- Fördert zugänglichere Forschung im Bereich der Autoimmunität.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die zuverlässige Analyse der Dynamik der Darmmikrobiota in Modellen autoimmuner Erkrankungen ist entscheidend für das Verständnis der umweltbedingten und genetischen Beiträge zum Krankheitsverlauf. Dieses kostengünstige Protokoll zur DNA-Isolierung ermöglicht eine skalierbare und reproduzierbare Extraktion mikrobieller DNA aus murinen Fäkalproben und unterstützt Hochdurchsatz-Studien des Mikrobioms in der präklinischen Forschung. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Verknüpfung von Mikrobiota-Veränderungen mit autoimmunen Phänotypen und unterstützt damit frühe Entdeckungen sowie translationsmedizinische Strategien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Mikrobiota und Immunsystem in mausbasierenden Modellen, die für Krankheiten relevant sind.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Kandidatenwegen, die durch die Zusammensetzung der Darmmikrobiota beeinflusst werden.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung, indem mikrobielle Veränderungen mit dem Fortschreiten von Autoimmunerkrankungen verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte, reproduzierbare DNA-Proben für nachgeschaltete Sequenzierungs- und molekularbiologische Analysen.
- Gewährleistet quantitative, hochwertige DNA, die für PCR- und Next-Generation-Sequencing-Workflows geeignet ist.
- Ermöglicht die skalierbare Probenaufbereitung für vergleichende Mikrobiomstudien über experimentelle Kohorten hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung präklinischer Mikrobiota-Analysen mit dem Krankheitsverlauf und der Entdeckung von Biomarkern.
- Unterstützt die Kontinuität von Erkenntnissen aus der Entdeckungsphase bis hin zur translationellen Validierung in Modellen autoimmuner Erkrankungen.
- Verringert die biologische Uneindeutigkeit bei der Verknüpfung von Umweltfaktoren mit Krankheitsphänotypen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll zur DNA-Isolierung fügt sich nahtlos in den Bereich von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein und ermöglicht eine robuste Analyse des Mikrobioms bei mausmodellen, die für Lupus anfällig sind, sowie die Identifizierung von Leitverbindungen und mechanistischen Studien.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung zur immunmodulierenden Wirkung der Mikrobiota bei Autoimmunerkrankungen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative DNA-Mengen für die mikrobiombezogene Profilierung mittels Sequenzierung.
- Analytik: Stellt qualitativ hochwertige Eingabedaten für den statistischen Vergleich von mikrobiellen Gemeinschaftsveränderungen zwischen Genotypen oder Behandlungen bereit.
- Translationale Forschung: Verbindet präklinische Erkenntnisse zum Mikrobiom mit der potenziellen Entwicklung von Biomarkern bei Autoimmunerkrankungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet ein skalierbares, kosteneffizientes Protokoll, das an verschiedene murine Modelle und experimentelle Designs angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vorhersagevertrauen bezüglich Mikrobiota-Krankheits-Assoziationen und die Validierung von Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Standardisiert die DNA-Extraktion und verbessert dadurch die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zwischen Studien.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen, indem der Beitrag des Mikrobioms zu Krankheitsmechanismen geklärt wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von mikrobiommodulierenden Interventionen in Autoimmuntherapie-Pipelines.
Durchführungsaspekte
- Erfordert technisches Fachwissen im Bereich steriler Probenhandhabung und molekularbiologischer Arbeitsabläufe.
- Benötigt Zugang zu Homogenisatoren, Zentrifugen und Spektrophotometern zur Qualitätskontrolle.
- Erfordert strikte Standardisierung zwischen den Arbeitsgruppen, um Kontaminationen und Variabilität zu minimieren.
- An verschiedene murine Modelle anpassbar, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung für unterschiedliche Probentypen.
- Hängt von genauer Pipettierarbeit und steriler Technik ab, um die Datenintegrität sicherzustellen.
