Analyse der Dynamik fäkaler Mikrobiota in Lupus-anfälligen Mäusen mit einer einfachen, kostengünstigen DNA-Isolierungsmethode

Dieses Protokoll bietet eine einfache, kostengünstige DNA-Isolationsmethode für die Analyse von Veränderungen der Mikrobiota des murinen Darms während der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen.

Die vorgeschlagene DNA-Isolierungsmethode kann dazu dienen, die Darmmikrobiotadynamik in Mausmodellen für Autoimmunerkrankungen zu untersuchen. Eine vielseitigere, kostengünstigere und effizientere Methode wird vorgeschlagen, um DNA aus Stuhlproben zu gewinnen, die mit kommerziell erhältlichen Kits vergleichbar sind. Nehmen Sie zunächst jede Maus einzeln aus ihrem Käfig, sammeln Sie ein Kotpellet direkt aus dem Anus und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius, bis es verarbeitet wird.

Verarbeiten Sie die Proben mit sterilen und sauberen Pinzetten, Röhrchen und Handschuhen. Fügen Sie ein gefrorenes Pellet zu einem vorgewogenen Schraubverschlussrohr mit zwei Milliliter hinzu und notieren Sie das Kotgewicht in Gramm, das zwischen 0,02 und 0,05 Gramm pro Kotpellet liegen sollte. Fügen Sie dem Pellet eine dünne Schicht aus 0,1 Millimeter Glasperlen, 500 Mikroliter Lysepuffer und 200 Mikroliter 20% Natriumdodecylsulfat hinzu.

Bead schlug die Röhre vier Minuten lang in einem Homogenisator, gefolgt von drei bis fünf Minuten Wirbel. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für kurze Zeit, um die Blasen und den Schaum zu entfernen. Um DNA aus den Mikrobiota-Proben zu extrahieren, übertragen Sie 350 Mikroliter Probenüberstand in ein neues 1,5-Milliliter-Schnappverschlussrohr ohne Ablagerungen.

Fügen Sie 500 Mikroliter Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol im Verhältnis 25: 24: 1 hinzu und wirbeln Sie für eine Minute. Nach der Zentrifugation werden 180 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Schnappverschlussrohr überführt. Fügen Sie 180 Mikroliter Chloroform hinzu, invertieren Sie es und mischen Sie.

Daraus werden 180 Mikroliter der wässrigen Phase in ein neues Schnappverschlussrohr überführt. In einer Biosicherheitswerkbank 180 Mikroliter kaltes Isopropanol und 36 Mikroliter fünf molares Ammoniumacetat hinzufügen. Drehen Sie es ein paar Mal um, um zu mischen, und legen Sie die Tube für 20 Minuten auf Eis.

Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Pellets anschließend mehrmals mit 500 Mikrolitern kaltem 70% Ethanol. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Röhrchen 20 Minuten lang kopfüber auf Seidenpapier, bis das Pellet klar wird. Suspendieren Sie das Pellet in 50 Mikroliter molekularem Wasser und erhitzen Sie die Flüssigkeit bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten, um große DNA-Pellets vollständig aufzulösen.

Nach dem Erhitzen zentrifugieren Sie diese Röhrchen bei 3.400 Mal G für eine Minute, um die Kondensationströpfchen aus dem Deckel zurückzugewinnen. Messen Sie die Konzentration und erhalten Sie das Verhältnis 260/280 mit einem Spektralphotometer. Ein Verhältnis für qualitativ hochwertige DNA liegt im Allgemeinen zwischen 1,8 und zwei.

Zentrifugieren Sie die vorbereiteten Proben bei 600 mal G für eine Minute bei Raumtemperatur, bevor Sie 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Dann senden Sie 20 Mikroliter Proben mit Konzentrationen von einem bis 50 Nanogramm pro Mikroliter zur Sequenzierung an das Argonne National Laboratory. Der Mausstamm, dem der Rezeptor CX3CR1 fehlt, hat eine andere Darmmikrobiota-Zusammensetzung als Wildtyp-MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP-Mäuse, zeigt signifikante Unterschiede in bestimmten Gattungen, die für potenziell pathogene Bakterien wie die im Stamm Proteobacteria relevant sind.

Seien Sie vorsichtig mit der Verunreinigung der Probe. Es muss steril sein. Außerdem ist es wichtig, genau zu pipettieren, wenn der Überstand in ein neues Röhrchen übertragen wird.

Diese Methode eignet sich für molekulare Analysen wie PCR, Restriktionsenzymverdauung oder genomischen Bibliotheksaufbau. Bei Lupus haben wir eine starke Beziehung zwischen der Darmmikrobiota und der Lupusprogression nachgewiesen.