Name: Analyse der Dynamik fäkaler Mikrobiota in Lupus-anfälligen Mäusen mit einer einfachen, kostengünstigen DNA-Isolierungsmethode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Lernen Sie eine kostengünstige DNA-Isolierungsmethode zur Analyse der Darmmikrobiota-Dynamik bei lupus-anfälligen Mäusen. Diese effiziente Technik liefert vergleichbare Ergebnisse wie kommerzielle Kits und erleichtert Autoimmunitätsforschung.

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Wir schätzen die Hilfe des Argonne National Laboratory und unserer kooperierenden Bioinformatiker. Diese Arbeit wird durch verschiedene NIH- und interne Zuschüsse unterstützt.

Der Cx3cr1 gfp/gfp-Locus von B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J-Mäusen wurde für 10 Generationen zu MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) zurückgekreuzt, um MRL/lpr-CX 3 CR1gfp/gfp-Mäuse zu erzeugen. Das Genom-Screening mit Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP)-Panels bestätigte, dass der genetische Hintergrund neu erzeugter Mäuse zu mehr als 97% mit dem von MRL/LPR identisch war. Danach wurden Mäuse in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung gezüchtet und gehalten, die den spezifischen Anforderungen des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Virginia Tech entsprach. Die Proben wurden gesammelt, als die Mäuse 13, 14 und 15 Wochen alt waren.
1. Entnahme von Mikrobiota-Proben von Mäusen
<ol><li>Nehmen Sie jede Maus einzeln aus ihrem Käfig. Sammeln Sie ein Kotpellet direkt aus dem Anus und lagern Sie es bei -80 °C bis zur Verarbeitung. Verarbeiten Sie die Proben mit sterilen und sauberen Pinzetten, Röhrchen und Handschuhen. HINWEIS: Ein Behälter (z. B. ein Becherglas) kann verwendet werden, um die Maus zu platzieren, während auf die Kotprobe gewartet wird. Reinigen Sie den Behälter vor und nach jeder Maus mit Ethanol.</li>
	<li>Fügen Sie ein gefrorenes Pellet in ein vorgewogenes 2-ml-Schraubverschlussrohr hinzu. Notieren Sie das Kotgewicht in Gramm, das zwischen 0,02-0,05 g pro Kotpellet liegen sollte.</li>
	<li>Fügen Sie dem Pellet eine dünne Schicht aus 0,1 mm Glasperlen, 500 μL Lysepuffer (50 mM NaCl, 5 mM Tris und 50 mM EDTA) und 200 μL 20% SDS hinzu.</li>
	<li>Schlagen Sie die Röhre 4 Minuten lang in einem Homogenisator (bei maximaler Leistung), gefolgt von 3-5 Minuten Wirbel.</li>
	<li>Drehen Sie sich kurz, um die Blasen und den Schaum zu entfernen (drücken Sie den Knopf an der Zentrifuge, bis sie 1.000-1.200 x g erreicht, und lassen Sie sie dann los).</li>
</ol>2. DNA-Extraktion
<ol><li>Übertragen Sie 350 μL des in Schritt 1.5 erhaltenen Überstands (um sicherzustellen, dass keine Ablagerungen transportiert werden) in ein neues 1,5-ml-Schnappverschlussrohr. 500 μL Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (PCI; 25:24:1, v/v) Gemisch zugeben und 1 min durchziehen. HINWEIS: Von nun an müssen Proben in einer chemischen Haube gehandhabt werden. PCI ist giftig.</li>
	<li>Bei 6.000 x g 3 min bei 4 °C schleudern. 180 μL der wässrigen Phase (oberste Schicht) in ein neues 1,5 ml Schnappverschlussrohr überführen. 180 μL (1:1) Chloroform hinzufügen, invertieren und mischen. HINWEIS: Minimieren Sie die Kontamination durch die untere Schicht, wenn Sie die oberste Schicht übertragen.</li>
	<li>Bei 18.400 x g 3 min bei 4 °C schleudern. 180 μL der wässrigen Phase in ein neues Schnappverschlussrohr überführen. HINWEIS: Nach dem Verwerfen von PCI und Chloroform können die folgenden Schritte in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.</li>
	<li>Fügen Sie 180 μL kaltes Isopropanol und 36 μL 5M NH4Ac. Einige Male umdrehen, um zu mischen, und legen Sie das Röhrchen für 20 min auf Eis.</li>
	<li>Bei 18.400 x g 20 min bei 4 °C schleudern. Gießen, um den Überstand zu verwerfen. Waschen Sie das Pellet mehrmals mit 500 μL kaltem 70% Ethanol beim Invertieren. HINWEIS: Ethanol sollte mit doppelt entionisiertem sterilem Wasser verdünnt werden.</li>
	<li>Bei 18.400 x g 3 min bei 4 °C schleudern. Verwerfen Sie den Überstand, um Restethanol zu entfernen.</li>
	<li>Trocknen Sie das Röhrchen kopfüber auf Seidenpapier 20 min an der Luft, bis das Pellet klar ist. Suspendieren Sie das Pellet in 50 μL molekularem Wasser. Erhitzen Sie die Flüssigkeit bei 37 °C für 10 min, um große DNA-Pellets vollständig aufzulösen.</li>
	<li>Schleudern Sie die Rohre nach dem Erhitzen, um Kondensationströpfchen auf dem Deckel zurückzugewinnen (3.400 x g für 1 min).</li>
	<li>Messen Sie die Konzentration und erhalten Sie das Verhältnis 260/280 mit einem Spektralphotometer. Verwenden Sie molekulares Wasser als Rohling. Gute Qualität DNA sollte 260/280 Verhältnisse zwischen 1,8 und 2 haben. HINWEIS: Die erwartete DNA-Ausbeute beträgt mindestens 0,03 g pro Kotpellet.</li>
</ol>3. Probenvorbereitung für die 16S rRNA-Gensequenzierung
<ol><li>Senden Sie die DNA-Proben an das Argonne National Laboratory, wo sie einer Bibliotheksvorbereitung unterzogen und auf der Illumina Miseq sequenziert werden.<ol><li>Senden Sie Proben in vollständig umrandeten 96-Well-Platten, wobei die Proben in Reihen angeordnet sind (A1-A12, B1-B12 usw.) und mit Folienplattendichtungen versiegelt sind.</li>
		<li>Senden Sie ein Endvolumen von 20 μL pro Probe und Vertiefung mit einer Konzentration von 1-50 ng/μL. HINWEIS: Verdünnungen sollten mit molekularem Wasser durchgeführt werden.</li>
		<li>Nach der Vorbereitung der Proben bei 600 x g für 1 min bei Raumtemperatur schleudern, bevor die Proben bei -80 °C für 24 h eingefroren werden.</li>
		<li>Über Nacht auf Trockeneis schicken.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li>
<li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).</li>
<li>Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+microbiome+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of the microbiome in rheumatic diseases.</a> Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314(2013).</li>
<li>Larsen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+in+human+adults+with+type+2+diabetes+differs+from+non-diabetic+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults.</a> PLoS One. 5 (2), 9085(2010).</li>
<li>Alam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+imbalance+in+inflammatory+bowel+disease+patients+at+different+taxonomic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels.</a> Gut Pathogens. 12 (1), (2020).</li>
<li>Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microbiota+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Diet, microbiota and autoimmune diseases.</a> Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).</li>
<li>Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLE%3A+another+autoimmune+disorder+influenced+by+microbes+and+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet.</a> Frontiers of Immunology. 6, 608(2015).</li>
<li>Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus%3A+a+national+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li>
<li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73(2017).</li>
<li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection%2C+storage%2C+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143(2018).</li>
<li>Fiedorová, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821(2019).</li>
<li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365(2016).</li>
<li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007(2019).</li>
<li>Galloway-Peña, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+analysis+of+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li>
<li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209(2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Eine ausgewogene Darmmikrobiota kann den menschlichen Körper vor Krankheiten schützen. Sobald dieses Gleichgewicht durch externe oder interne Auslöser gestört wird, können die Folgen verheerend sein. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die Dynamik der Darmmikrobiota in Mausmodellen zu analysieren. Die Methode eignet sich nicht nur für Vergleiche zwischen Gruppen, sondern auch für die Verfolgung der Darmmikrobiota im Zeitverlauf, um zeitabhängige Faktoren, die die Darmmikrobiota stören, besser zu identifizieren.
<p...

Mensch und Bakterien existieren schon lange nebeneinander. Sie haben eine co-abhängige Beziehung mit gegenseitig vorteilhaften Effekten aufgebaut, die die Immunantwort des Wirts quantitativ und qualitativ beeinflusst1. Neuere Studien deuten auf einen Zusammenhang zwischen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota und der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen hin, zu denen Multiple Sklerose 2, rheumatoide Arthritis3,Typ-2-Diabetes 4, entzündliche Darmerkrankungen5 und systemischer Lupus erythematodes (SLE) gehören6. Ob die Darmmikrobiota jedoch die Hauptursache oder eine Nebenwirkung dieser Autoimmunerkrankungen ist, ist noch unklar7. Möglicherweise könnte die Darmmikrobiota die Krankheit während der Effektorphase von Autoimmunerkrankungen verschlimmern oder eine Rolle bei der Regulierung der Induktion dieser Krankheiten spielen8.
Intestinale Dysbiose wurde bei weiblichen Lupus-anfälligen MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) Mäusen berichtet, und Darmmikrobiota-Veränderungen mit einer signifikanten Erschöpfung von Laktobazillen wurden beobachtet9. Wenn eine Mischung aus fünf Lactobacillus-Stämmen oral verabreicht wurde, wurden die lupusähnlichen Symptome bei diesen Mäusen weitgehend abgeschwächt, was auf eine wesentliche Rolle der Mikrobiota bei der Regulierung der SLE-Pathogenese hindeutet.
Die folgende Technik der DNA-Extraktion ermöglicht es, Mikrobiota-Fluktuationen zu verfolgen und sie qualitativ und quantitativ im Verlauf der murinen SLE-ähnlichen Erkrankung bei zu Lupus neigenden Mäusen zu analysieren. Unabhängig davon, ob die gesunde Darmmikrobiota untersucht oder Dysbiose definiert werden soll, ist es wichtig, kritisch zu untersuchen, wie Daten gesammelt werden und ob sie genau und reproduzierbar sind10. Jeder Schritt ist in diesem Prozess entscheidend. Eine geeignete Methodik muss verwendet werden, um mikrobielle DNA zu extrahieren, da jedes mögliche Problem, das Verzerrungen während des DNA-Extraktionsprozesses einführt, zu einer ungenauen mikrobiellen Repräsentation führen könnte. Während die Phenol-Chloroform-Methode hier beschrieben wird, gibt es kommerziell erhältliche Kits zur Extraktion von DNA aus Bakterien, die in bestimmten Fällen gut funktionieren11. Ihre Verwendbarkeit ist jedoch durch die Kosten und die erforderliche Probenmenge begrenzt.
Das hier vorgestellte Protokoll ist kostengünstig und erfordert nur eine geringe Probenmenge. Es funktioniert gut mit jeder Art von Stuhlprobe und ist nützlich bei der Untersuchung der Dynamik der Darmmikrobiota im Laufe der Zeit sowie bei Vergleichen zwischen Gruppen. DNA wird mit einer Methode der Alkoholreinigung isoliert, die Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol verwendet. Die alkoholbasierte Extraktion hilft, die Probe von Proteinen und Lipiden zu reinigen und zu entfernen, wo im letzten Schritt DNA ausgefällt wird. Die vorgeschlagene Methode hat eine signifikant hohe Effizienz und Qualität und hat sich bei der Identifizierung von Bakterienpopulationen als genau erwiesen. Ein kritischer Hinweis während des Verfahrens ist, dass DNA-Kontaminationen auftreten können und daher eine angemessene Probenhandhabung erforderlich ist12.
Die DNA wird dann von den Next Generation Sequencing-Plattformen auf das 16S rRNA-Gen, wie das Illumina MiSeq, analysiert. Insbesondere wird die hypervariable Region V4 analysiert, um eine bessere Quantifizierung für hochrangige Taxa13 zu ermöglichen. Die anschließende bioinformatische Analyse wird ausgelagert, gefolgt von einer Inhouse-Analyse mit statistischen Standardmethoden. Es gibt zahlreiche Open-Source-Bioinformatik-Softwareprogramme für die nachgelagerte Sequenzierung, und die Art der durchgeführten Analysen hängt stark von der spezifischen biologischen Fragestellung von Interesseab 14. Dieses Protokoll konzentriert sich speziell auf die experimentellen Schritte vor der Sequenzierung und bietet eine vielseitigere, kostengünstigere, vergleichbare und effizientere Methode zur Gewinnung von DNA aus Stuhlproben.

<table><tbody><tr><td>0,1 mm Glasperlen</td><td>BioSpec Products</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Röhrchen mit Schraubverschluss</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3488</td><td></td></tr><tr><td>20 %</td><td>SDS FisherScientific</td><td>BP1311-1</td><td>SDS 20 %</td></tr><tr><td>96 % Ethanol, Molekularbiologie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T032021000CS</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat (5 m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9071</td><td>NH4AC 5M</td></tr><tr><td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005582</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm 24</td><td>Next Advance</td><td>4116-BBY24M</td><td>Homogenisator</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>FisherScientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-behandeltes Wasser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamin Tetraessigsäure</td><td>FisherScientific</td><td>BP118-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Foliendichtung</td><td>FisherScientific</td><td>NC0302491</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes-Kimtech 34256</td><td>FisherScientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000485</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 Spektralphotomer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Phenol: Chloroform: Isoamylalchohol (25:24:1)</td><td>FisherScientific</td><td>BP1752I-400</td><td>PCI-Skala</td></tr><tr><td>mit 4 Dezimalstellen</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS205DU</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten mit Rand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0800</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>FisherScientific</td><td>15528154</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Trishydrochlorid</td><td>FisherScientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der dynamik fäkaler mikrobiota in lupus-anfälligen mäusen mit einer einfachen, kostengünstigen dna-isolierungsmethode

Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Die Darmmikrobiota spielt eine wichtige Rolle bei der Aufklärung des Immunsystems. Diese Beziehung ist äußerst wichtig für das Verständnis von Autoimmunerkrankungen, die nicht nur durch genetische Faktoren angetrieben werden, sondern auch durch Umweltfaktoren, die den Ausbruch auslösen und/oder den Krankheitsverlauf verschlimmern können. Eine zuvor veröffentlichte Studie über die Dynamik der Darmmikrobiota bei lupusanfälligen MRL / lpr-weiblichen Mäusen zeigte, wie Veränderungen der Darmmikrobiota das Fortschreiten der Krankheit verändern können. Hier wird ein Protokoll zur Extraktion repräsentativer Proben aus der Darmmikrobiota für Studien der Autoimmunität beschrieben. Mikrobiota-Proben werden aus dem Anus entnommen und verarbeitet, aus denen die DNA mit einem Phenol-Chloroform-Verfahren extrahiert und durch Alkoholfällung gereinigt wird. Nach der PCR werden gereinigte Amplicons mit einer Next Generation Sequencing-Plattform am Argonne National Laboratory sequenziert. Schließlich werden die 16S ribosomalen RNA-Gensequenzierungsdaten analysiert. Als Beispiel werden Daten aus Darmmikrobiota-Vergleichen von MRL/lpr-Mäusen mit oder ohne CX3CR1 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede in Gattungen, die pathogene Bakterien enthalten, wie die im Stamm Proteobacteria sowie in der Gattung Bifidobacterium, die als Teil der gesunden kommensalen Mikrobiota gilt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese einfache, kostengünstige DNA-Isolierungsmethode zuverlässig ist und bei der Untersuchung von Darmmikrobiota-Veränderungen im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen helfen kann.

Die Ergebnisse des Argonne National Laboratory werden von einem qualifizierten Bioinformatiker analysiert, gefolgt von einer internen Analyse der Daten mit statistischen Standardmethoden. Typische Mikrobiomanalysen beinhalten die Clusterung ähnlicher Sequenzen in operationelle taxonomische Einheiten (OTUs) oder Amplikonsequenzvarianten (ASVs) als Proxy für verschiedene Mikroorganismen in einer Probe. Die Anzahl der OTUs oder ASVs über Stichproben hinweg kann dann verwendet werden, um auf Änderungen der Diversität innerha...

Dieses Protokoll bietet eine einfache, kostengünstige DNA-Isolationsmethode für die Analyse von Veränderungen der Mikrobiota des murinen Darms während der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen.

Analyse der Dynamik fäkaler Mikrobiota in Lupus-anfälligen Mäusen mit einer einfachen, kostengünstigen DNA-Isolierungsmethode

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

Die vorgeschlagene DNA-Isolierungsmethode kann dazu dienen, die Darmmikrobiotadynamik in Mausmodellen für Autoimmunerkrankungen zu untersuchen. Eine vielseitigere, kostengünstigere und effizientere Methode wird vorgeschlagen, um DNA aus Stuhlproben zu gewinnen, die mit kommerziell erhältlichen Kits vergleichbar sind. Nehmen Sie zunächst jede Maus einzeln aus ihrem Käfig, sammeln Sie ein Kotpellet direkt aus dem Anus und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius, bis es verarbeitet wird.Verarbeiten Sie die Proben mit sterilen und sauberen Pinzetten, Röhrchen und Handschuhen. Fügen Sie ein gefrorenes Pellet zu einem vorgewogenen Schraubverschlussrohr mit zwei Milliliter hinzu und notieren Sie das Kotgewicht in Gramm, das zwischen 0,02 und 0,05 Gramm pro Kotpellet liegen sollte. Fügen Sie dem Pellet eine dünne Schicht aus 0,1 Millimeter Glasperlen, 500 Mikroliter Lysepuffer und 200 Mikroliter 20% Natriumdodecylsulfat hinzu.Bead schlug die Röhre vier Minuten lang in einem Homogenisator, gefolgt von drei bis fünf Minuten Wirbel. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für kurze Zeit, um die Blasen und den Schaum zu entfernen. Um DNA aus den Mikrobiota-Proben zu extrahieren, übertragen Sie 350 Mikroliter Probenüberstand in ein neues 1,5-Milliliter-Schnappverschlussrohr ohne Ablagerungen.Fügen Sie 500 Mikroliter Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol im Verhältnis 25: 24: 1 hinzu und wirbeln Sie für eine Minute. Nach der Zentrifugation werden 180 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Schnappverschlussrohr überführt. Fügen Sie 180 Mikroliter Chloroform hinzu, invertieren Sie es und mischen Sie.Daraus werden 180 Mikroliter der wässrigen Phase in ein neues Schnappverschlussrohr überführt. In einer Biosicherheitswerkbank 180 Mikroliter kaltes Isopropanol und 36 Mikroliter fünf molares Ammoniumacetat hinzufügen. Drehen Sie es ein paar Mal um, um zu mischen, und legen Sie die Tube für 20 Minuten auf Eis.Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Pellets anschließend mehrmals mit 500 Mikrolitern kaltem 70% Ethanol. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Röhrchen 20 Minuten lang kopfüber auf Seidenpapier, bis das Pellet klar wird. Suspendieren Sie das Pellet in 50 Mikroliter molekularem Wasser und erhitzen Sie die Flüssigkeit bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten, um große DNA-Pellets vollständig aufzulösen.Nach dem Erhitzen zentrifugieren Sie diese Röhrchen bei 3.400 Mal G für eine Minute, um die Kondensationströpfchen aus dem Deckel zurückzugewinnen. Messen Sie die Konzentration und erhalten Sie das Verhältnis 260/280 mit einem Spektralphotometer. Ein Verhältnis für qualitativ hochwertige DNA liegt im Allgemeinen zwischen 1,8 und zwei.Zentrifugieren Sie die vorbereiteten Proben bei 600 mal G für eine Minute bei Raumtemperatur, bevor Sie 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Dann senden Sie 20 Mikroliter Proben mit Konzentrationen von einem bis 50 Nanogramm pro Mikroliter zur Sequenzierung an das Argonne National Laboratory. Der Mausstamm, dem der Rezeptor CX3CR1 fehlt, hat eine andere Darmmikrobiota-Zusammensetzung als Wildtyp-MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP-Mäuse, zeigt signifikante Unterschiede in bestimmten Gattungen, die für potenziell pathogene Bakterien wie die im Stamm Proteobacteria relevant sind.Seien Sie vorsichtig mit der Verunreinigung der Probe. Es muss steril sein. Außerdem ist es wichtig, genau zu pipettieren, wenn der Überstand in ein neues Röhrchen übertragen wird.Diese Methode eignet sich für molekulare Analysen wie PCR, Restriktionsenzymverdauung oder genomischen Bibliotheksaufbau. Bei Lupus haben wir eine starke Beziehung zwischen der Darmmikrobiota und der Lupusprogression nachgewiesen.

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Forschung

JoVE Journal

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Immunologie und Infektion

Dieses Video beschreibt das DNA-Isolationsprotokoll aus Stuhlproben von Dickdarmtumor-tragenden Mäusen. Die extrahierte DNA wird mittels PCR amplifiziert und das Produkt mit einem auf magnetischen Kügelchen basierenden Ansatz weiter gereinigt. Mit dieser Methode kann der Effekt der Umweltanreicherung auf die Dickdarmmikrobiota und die Tiersterblichkeit bestimmt werden.

Mikrobielle DNA-Isolierung im Stuhl: Untersuchung des Effekts der Umweltanreicherung auf die Mikrobiomdiversität im Maustumormodell

Der Transfer von bm12-Lymphozyten in einen C57BL/6-Empfänger ist ein etabliertes Modell des systemischen Lupus erythematodes. Hier beschreiben wir, wie man mit diesem Modell eine Krankheit auslösen kann und wie man T-follikuläre Helferzellen, Keimzentrum-B-Zellen und Plasmazellen mittels Durchflusszytometrie charakterisiert.

Das BM12 Inducible Modell des systemischen Lupus erythematodes (SLE) in C57BL / 6-Mäuse

Es besteht ein wachsendes Interesse an der quantitativen Charakterisierung von intestinalen Lymphozyten, da zunehmend erkannt wird, dass diese Zellen eine entscheidende Rolle bei einer Vielzahl von Darm- und systemischen Erkrankungen spielen. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie einzelne Zellpopulationen aus verschiedenen Dünndarmkompartimenten für die anschließende durchflusszytometrische Charakterisierung isoliert werden können.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

Environmental Enrichment (EE) ist eine Unterbringung von Tieren, die verwendet wird, um Mechanismen zu offenbaren, die die Zusammenhänge zwischen Lebensstil, Stress und Krankheit zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, das verwendet ein Maus-Modell der Doppelpunkt Tumorgenese und EE speziell Veränderungen in Mikrobiota Artenvielfalt definieren, die tierischen Sterblichkeit auswirken können.

Eine Methode, um die Auswirkungen der Umweltanreicherung Doppelpunkt Microbiome Biodiversitätskonvention in einem Mausmodell Doppelpunkt Tumor definieren

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

Hier bieten wir ausführliche Protokolle für die orale Verabreichung von Antibiotika für Mäuse, Sammlung von Stuhlproben, DNA-Extraktion und Quantifizierung von fäkalen Bakterien durch qPCR.

Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika

Hier wird ein vereinfachtes Standard-Betriebsverfahren für die Mikrobiom-Profilierung mit 16S rRNA metagenomischer Sequenzierung und Analyse mit frei verfügbaren Werkzeugen beschrieben. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, die neu im Mikrobiom-Bereich sind, sowie solchen, die Aktualisierungen von Methoden benötigen, um bakterielleS Profiling mit einer höheren Auflösung zu erreichen.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Verfolgung des Lupusverlaufs bei Mäusen. Zwei zusätzliche Verfahren werden vorgestellt, um die Lupusnephritis basierend auf Zellinfiltration und Proteinablagerung in den Nieren zu charakterisieren.

Analysen der Proteinurie, der renalen Infiltration von Leukozyten und der renalen Ablagerung von Proteinen bei zu Lupus neigenden MRL/lpr-Mäusen

Ziel ist es, ein Protokoll zu skizzieren, um die Mechanismen der Dysbiose bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen. In diesem Artikel wird erörtert, wie man aseptisch Stuhlproben von Mäusen sammelt und transplantiert, Darm isoliert und die "Swiss-Roll"-Methode anwendet, gefolgt von Immunfärbetechniken, um Veränderungen im Magen-Darm-Trakt zu untersuchen.

Fäkalisolierung der Maus und Mikrobiota-Transplantation

Dieses Protokoll beschreibt die Best Practices für den keimfreien Transfer von Mäusen zu und die Unterbringung in experimentellen Einzelkäfig-Isolatoren (Isokäfigen) unter Beibehaltung steriler Bedingungen. Methoden zur Stuhltransplantation in keimfreie Mäuse und die Gewinnung lebensfähiger Bakterien aus diesen darmisierten "humanisierten" Mäusen für weitere Anwendungen werden diskutiert.

Vorbereitung und Durchführung eines IsoPositiv-Käfig-Experiments zur Stuhltransplantation von Menschen in keimfreie Mäuse

Lernen Sie eine kostengünstige DNA-Isolierungsmethode zur Analyse der Darmmikrobiota-Dynamik bei lupus-anfälligen Mäusen. Diese effiziente Technik liefert vergleichbare Ergebnisse wie kommerzielle Kits und erleichtert Autoimmunitätsforschung.

Analyse der Dynamik fäkaler Mikrobiota in Lupus-anfälligen Mäusen mit einer einfachen, kostengünstigen DNA-Isolierungsmethode

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