Name: Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 29 min 41 s
Description: Lernen Sie die Genexpressionsanalyse mit Microarrays durch indirekte Markierung. Diese Methode ermöglicht den Vergleich von Wildtyp- und Mutantenproben mit minimaler Verzerrung für zuverlässige Ergebnisse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Reverse-Transkriptase-Reaktion Schalten Heizblock auf 70-80 ° C und 42 ° C. Wasserbäder können auch in diesem Schritt verwendet werden. Wenn Sie Heizblöcke, setzte Wasser, so dass die Wärme gleichmäßig ist. <ol><li> Primingreaktion <ol><li> Take 3 pg RNA </li><li> Stellen Sie die Lautstärke auf 13 ul mit RNase freiem Wasser </li><li> Add 2,5 ul random Hexamer Primer (2mg/mL) </li></ol></li><li> Gut mischen und inkubieren bei 70-80 ° C für 8 Minuten. Dann, auf Eis für 5 min. </li><li> Bereiten RT-Cocktail (14,5 ul / rxn): <table border="0"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> 5X First Strand Buffer </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> 0,1 M DTT </td><td> 3 ul </td></tr><tr><td> 25X aminoallyl-dNTP-Mix </td><td> 1,2 ul </td></tr><tr><td> SuperScript II RT (200U/μl) </td><td> 2,3 ul </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 2,0 ul </td></tr></tbody></table> * Für n Reaktionen vorzubereiten Master Mix für n +0,5 Aliquots Cocktail, um sicherzustellen, dass Sie nicht ausgehen. </li><li> Add 14,5 ul gekühlt Reaktionen. </li><li> Mix (nicht vortexen) und inkubieren bei 42 ° C für 3-4 Stunden </li><li> Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden, wenn nötig. </li></ol> Hydrolysieren RNA <ol><li> Zu jeder Probe, addiere 3 ul 1 N NaOH und 0,6 ul 0,5 M EDTA. (Final conc.s = 100mm NaOH, 10 mM EDTA) </li><li> Mix und Inkubation bei 65 ° C für 10 Minuten. </li><li> Neutralisieren, indem 33,6 ul 1M HEPES, pH = 7,0 (Endkonzentration 500 mM HEPES .=) </li><li> Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden, falls erforderlich. </li></ol> Reaction Reinigung: Entfernung von Personengesellschaften aa-dUTP und freie Amine Hinweis: Diese Reinigung Protokoll wird von der Qiagen QIAquick PCRpurification Kit-Protokoll geändert. Die Phosphat-Wasch-und Elutionspuffer für die Qiagen mitgelieferten Puffern ersetzt, weil die Qiagen-Puffer freie Amine, die mit dem Cy-Farbstoff-Kupplungsreaktion konkurrieren enthalten. Die Spalten aus der Mini-Prep Kit kann auch verwendet werden. <ol><li> Mix cDNA-Reaktion mit 300 pl (oder 5x Reaktionsvolumen = 336 ul) Puffer PB (Qiagen mitgeliefert) und Transfer zum QIAquick Säule. </li><li> Legen Sie die Säule in ein 2 ml Sammel-Tube (Qiagen mitgeliefert) und Zentrifuge bei ~ 13.000 rpm für 1 Minute. Leere Sammelrohr. </li><li> Um Waschen 750 ul Phosphat Waschpuffer (nicht Qiagen) auf die Säule und zentrifugieren bei ~ 13.000 rpm für 1 Minute. </li><li> Leeren Sie den Deckel ab und wiederholen Sie die 750 ul waschen und Zentrifugationsschritt. </li><li> Leeren Sie den Deckel ab und Zentrifuge der Spalte 1 weitere Minute bei maximaler Geschwindigkeit. </li><li> Transfer-Säule in ein neues 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und vorsichtig 30 mu l Phosphat Elutionspuffer. (Siehe Lösung Vorbereitung Abschnitt) </li><li> Inkubation für 1 Minute bei Raumtemperatur. </li><li> Eluieren durch Zentrifugation bei ~ 13.000 rpm für 1 Minute. </li><li> Eluieren ein zweites Mal (mit einem anderen 30 ul Phosphat Elutionspuffer) in das gleiche Rohr durch Wiederholen der Schritte 6-8. Die endgültige Elutionsvolumen sollte ~ 60 ul werden. </li><li> Die Höhe der cDNA kann in diesem Stadium quantifiziert werden: ng cDNA = (Verdünnungsfaktor) (OD260) (37) (Gesamtvolumen von eluiert) </li><li> Dry Probe in einem Speed ​​Vac bei 45 ° C. </li><li> Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden, wenn nötig. </li></ol> Coupling aa-cDNA zu Dye Ester Cy <ol><li> Resuspendieren aminoallyl-markierten cDNA mit 10 ul 50 mM Na-Bicarbonat, pH = 9,0, wenn nötig. (Dieser Puffer sollte frisches alle zwei Wochen durchgeführt werden) </li><li> Arbeiten an einem dunklen Ort, fügen Sie die Sonde an einem Schlauch der entsprechenden Cy-Farbstoff. Pipet nach oben und unten mehrmals zu resuspendieren des Farbstoffs. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktion für 1 Stunde im Dunkeln bei Raumtemperatur. (Incubation kann bis zu 2 Stunden) </li></ol> Reaction Purification II: Entfernung von ungekoppelten Farbstoff <ol><li> Um die Reaktion hinzu 35 ul 100 mM NaOAc pH 5,2. Gründlich mischen. </li><li> Add 250 ul (oder 5x Reaktionsvolumen = 225 ul) Buffer PB (Qiagen im Lieferumfang enthalten) zu jeder Probe und mischen Sie durch Auf-und Abpipettieren. </li><li> Legen Sie eine QIAquick Spin-Säule in ein 2 ml Sammel-Tube (Qiagen mitgeliefert), die Probe auf die Säule und zentrifugieren bei ~ 13.000 für 1 Minute. Leere Sammelrohr. </li><li> Zum Waschen 0,75 ml Puffer PE (Qiagen mitgeliefert) an die Säule und zentrifugieren bei ~ 13.000 für 1 Minute. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4. </li><li> Leere Sammelröhrchen und Zentrifugationssäule für 1 weitere Minute bei maximaler Geschwindigkeit. </li><li> Legen Spalte in ein sauberes 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und vorsichtig 30 ul Puffer EB (Qiagen mitgeliefert) an die Mitte der Säule Membran. </li><li> Inkubation für 1 Minute bei Raumtemperatur. </li><li> Eluieren durch Zentrifugation bei ~ 13.000 rpm für 1 Minute. </li><li> Eluieren ein zweites Mal in das gleiche Rohr durch WiederholungSchritte 7-9. Der letzte eluierte Volumen sollte ~ 60 ul werden. </li></ol> Die Analyse der Labeling Reaction Die Höhe der cDNA und Label kann in diesem Stadium quantifiziert werden: <ul><li> Messen OD 260, 550 und 650 (Blank ist Wasser.) Verwenden Sie NanoDrop Microarray-Programm. </li><li> Berechnen Sie die pmol von Farbstoffen Einarbeitung und pmol DNA und nuc / Farbstoff-Verhältnis bei gegebener Gleichungen unter: pmol Nukleotiden = [OD260 * Volumen (ul) * 37 ng / ul * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol </li></ul> Anmerkung: 1 OD260 = 37 ng / ul für cDNA; 324,5 pg / pmol Molekulargewicht eines dNTP) pmol Cy3 = OD 550 * Volumen (ul) / 0,15 pmol Cy5 = OD650 * Volumen (ul) / 0,25 Nukleotide / Farbstoff-Verhältnis = pmol cDNA / pmol Cy Farbstoff Wenn Sie NanoDrop sind, es gibt bereits pmol / ul für jeden Farbstoff. Sie müssen nur diese Zahl nach Volumen zu multiplizieren, um insgesamt pmol Farbstoff Einarbeitung erhalten. Hinweis:&gt; 150-200 pmol des Farbstoffs Einbau pro Probe und einem Verhältnis von weniger als 20 Nukleotiden / Farbstoffmoleküle ist optimal für die Hybridisierungen. <ul><li> Die Proben können bei -20 ° C bei Dunkelheit gelagert werden. <ul><li> Kombinieren Sonden zusammen hybridisiert werden und trocken in Speedvac bei 42 ° C. </li><li> Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden, bis bereit hyb. </li></ul></li></ul> Pre-hyb Dias <ol><li> Legen Sie schieben dem Gesicht nach unten über RT 100 ml Wasser in einem sauberen roten Diahalter für 3-5 Minuten </li><li> Snap trocken die Folie, indem Sie offen auf einem 100 ° C Heizblock für ein paar Sekunden - Uhr für die Kondensation zu verschwinden </li><li> UV Vernetzung der Folie bei 250 mJoules (Enter 2500 bis die UV-Vernetzer) </li><li> Hydrate gleitet durch Eintauchen in vorgewärmten 42 ° C Wasser. Spin 5 min bei 700 RPM bei RT. </li><li> Inkubieren in 50ml Coplin Gefäß mit vorgewärmten pre-hyb (5XSSC, 1% BSA, 0,1% SDS) für mindestens 45 Minuten bei 42 ° C, und die Inkubation kann länger gehen, wenn nötig. 50 ml pre-hyb Puffer: 12,5 ml 20x SSC, 10 ml 5% BSA, 0,5 ml 10% SDS, 27 ml Wasser </li><li> Dip Slides in vorgewärmte Wasser (42 ° C) und rühren ein paar Minuten vor hyb Puffer zu entfernen. </li><li> Spülen in Isopropanol und Spin 5 min bei 700 rpm, Raumtemperatur, um zu trocknen. </li></ol> Vorbereitung der Proben für die Hybridisierung <ol><li> Resuspendieren Sonde in Wasser (Bände sind unten angegeben) <table border="0"><tbody><tr><td> Für insgesamt vol. = 30μl </td><td> Für insgesamt vol. = 35μl </td><td> Für insgesamt vol .= 40 ul </td><td></td></tr><tr><td> 19,8 ul Wasser </td><td> 23,55 ul Wasser </td><td> 27,2 ul Wasser </td><td> </td></tr><tr><td> 1,5 ul </td><td> 1,5 ul </td><td> 1,5 ul </td><td> 10 mg / ml Lachssperma-DNA (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1,2 ul </td><td> 1,2 ul </td><td> 1,2 ul </td><td> 12,5 mg / ml tRNA </td></tr><tr><td> 4,5 ul </td><td> 5,25 ul </td><td> 6 ul </td><td> 20XSSC (3X endg.) </td></tr><tr><td> 3 ul </td><td> 3,5 ul </td><td> 4 ul </td><td> 1% SDS </td></tr></tbody></table> Hinweis: Die Reihenfolge der Zugabe der Reagenzien sind wichtig. Bereiten Sie nicht Mastermix. </li><li> 5 Minuten lang kochen, dann Spin 5 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute. Cool für 2 min bei Raumtemp. </li></ol> Hybridisierung <ol><li> Add 10-12 ul von 3X SSC in die Vertiefungen der Hybridisierung Kammer an jeder Kante und in der Mitte. </li><li> Fügen Sie einen sauberen Heber Schlupf an den entsprechenden Bereich der Folie und sanft in Hybridisierungslösung Last (30 -40 ul). Es sollten zusätzliche Probe auf beiden Rand des Deckglases werden. </li><li> Legen Sie die Folie in der Kammer. Ziehen Sie die Schrauben und in einem 65 ° C Wasserbad über Nacht. Stellen Sie die Kammer direkt auf den Boden des Wasserbades. Legen Sie einen Block auf der Oberseite des obersten Kammer, alles in Position zu halten. Halten Sie den Deckel auf dem Wasserbad auf die lichtempfindliche Proben schützen. </li></ol> Hyb Wäscht <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Puffer: <ul><li> 1X SSC, 0,05% SDS </li><li> 0,06 x SSC </li></ul></li><li> Nach der Inkubation entsiegeln Hybridisierung Kammer. Entfernen Sie die Folie aus der Kammer, dabei nicht zu dem Deckglas zu stören. </li><li> Um Deckgläser zu entfernen, tauchen Folien in einer Schale mit warmem 1X SSC, 0,05% SDS Waschpuffer Deckglas mit Blick auf den Boden der Schale. Das Deckglas fallen ab, indem Sie die Folie hin und her. </li><li> Nach dem Deckglas entfernt wird, legen Sie die Folie in einem Rack ein frisches Bad mit warmem 1XSSCm 0,05% SDS. Agitieren für ein paar Minuten </li><li> Objektträger und Rack, um ein Bad von 0,06 X SSC. </li><li> Objektträger zu einem anderen bath von 0,06 X SSC mit einem frischen Rack, Blotting die Folie auf ein Papiertuch, um so viel SDS-haltigem Puffer wie möglich, bevor Sie in den frischen Bad zu entfernen. </li><li> Agitieren Dias für ein paar Minuten. </li><li> Spin sofort bei Raumtemperatur für 5 min bei 700 rpm, gleitet dann sind bereit zum Scannen. Lagerung im Dunkeln, bis gescannt. </li></ol>

<ol><li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays+%26+TIGR+Microarray+Labeled+Probe+Hybridization%22%5BJournal%5D)">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.</li>
<li>Gilbert,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+%26+Hybridization+of+probed+labels%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Hedge,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , Forthcoming.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AA-dUTP</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0410</td><td>5-(3-Aminoallyl)-2&amp;rsquo;desoxyuridin-5&amp;rsquo;-triphosphat</td></tr><tr><td>dNTP</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2035-01</td><td>100 mM dNTP-Mix, PCR-Grad</td></tr><tr><td>Zufällige Hexamer-Primer</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2166-01</td><td>3 mg/mL</td></tr><tr><td>SuperScript III RT</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>80800444</td><td>200 U/&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>CyDye&amp;#8482;</td><td></td><td>Amersham</td><td>RPN5661</td><td>Post-Labeling-Reaktives Farbstoffpaket</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR-Reinigungs-Kit</td></tr><tr><td>1 M K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KPO4</td><td>Puffer</td><td></td><td></td><td>Zur Herstellung eines 1 M Phosphatpuffers (KPO4, pH 8,5–8,7) mischen: 9,5 mL 1 M K2HPO4 und 0,5 mL 1 M KH2PO4</td></tr><tr><td>Phosphat-Waschpuffer</td><td>Puffer</td><td></td><td></td><td>Für 100 mL Phosphat-Waschpuffer (5 mM KPO4, pH 8,0, 80 % EtOH) mischen: 0,5 mL 1 M KPO4, pH 8,5 + 15,25 mL MilliQ-Wasser + 84,25 mL 95 % Ethanol. Der Waschpuffer wird leicht trüb sein. **WICHTIG: Der Phosphat-Waschpuffer sollte täglich frisch hergestellt werden.</td></tr><tr><td>Phosphat-Elutionspuffer</td><td>Puffer</td><td></td><td></td><td>Verdünnung von 1 M KPO4, pH 8,5, auf 4 mM mit sterilen Wasser</td></tr><tr><td>Natriumcarbonatpuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>(Na2CO3): 0,5 M, pH 9,0. 4,2 g NaHCO3 in 80 mL sterilen Wassers lösen und den pH-Wert mit 10 N NaOH auf 9,0 einstellen; anschließend das Volumen mit sterilen Wasser auf 100 mL auffüllen. Zur Herstellung einer 50 mM-Lösung für die Farbstoffkupplungsreaktion 1:10 mit Wasser verdünnen. Hinweis: Der Carbonatpuffer verändert im Laufe der Zeit seine Zusammensetzung; daher alle zwei Wochen bis einen Monat frisch herstellen.</td></tr></tbody></table>

bakterielle gene expression analysis using microarrays

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Hallo, mein Name ist Ena und wir führen routinemäßig Genexpressionsanalysen im Labor durch. Diese Technik nutzen wir, um differentiell regulierte Gene zwischen Meth und dem Wildtyp zu untersuchen. Heute habe ich RNA-Proben vom Wildtyp und von Meth und wir werden zuerst eine C-Analyse durchführen.Wir verwenden indirekte Markierungsmethoden, und der Vorteil dieser Technik besteht darin, eine Augenverzerrung zu vermeiden, die bei der direkten Markierung auftreten kann. Dazu verwenden wir RNA-Proben und zielen darauf ab, drei Mikrogramm RNA in einem Gesamtvolumen von 13 Mikroliter zu erhalten. Anschließend geben wir 2,5 Mikroliter zufällige Primer in unsere Proben hinzu.Und wir inkubieren die Probe bei 75 °C, um die RNA zu denaturieren, für acht Minuten. Danach fügen wir die Reverse-Transkriptions-Cocktailmischung hinzu, die AMV-RT, dNTPs, Puffer für die Reverse Transkriptase sowie ET und TT enthält, und inkubieren die Probe bei 42 °C für vier Stunden. Nach vier Stunden nehmen wir die Proben einfach heraus.Und nun haben wir im Reagenzglas eine Mischung aus cDNA und RNA. Was wir nun tun möchten, ist die Hydrolyse der RNA, indem wir Natriumhydroxid und EDTA hinzufügen. Die Endkonzentrati

bacterial-gene-expression-analysis-using-microarrays

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir stellen eine Methode zur Erzeugung von cDNA aus Umwelt-mRNA. In der Regel Gesamt-RNA zunächst aus der Umgebung gesammelt, rRNA selektiv entfernt, mRNA wird selektiv verstärkt und cDNA aus der angereicherten mRNA-Pool synthetisiert wird sequenziert. Recovered Sequenzen annotiert werden unter Verwendung von Standard Bioinformatik Techniken, um die exprimierten Gene zu identifizieren.

Analyse von Genexpressionsdaten aus marinen mikrobiellen Gemeinschaften mit Environmental Transcriptomics

Gene Microarrays sind mächtige Werkzeuge in Genexpressions-Profiling bei einer genomweiten Ebene. Diese Technologie findet Anwendung in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen Entwicklungsbiologie und Toxikologie. In diesem Video-, Detail haben wir ein Protokoll für die globale Genexpressionsanalyse mit einem umfassenden Oligonukleotid-Microarray-Plattform für die Zebrafisch.

Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

In diesem Protokoll, Genexpression in Hefe...

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

Microarray-Analyse wurde durchgeführt, um genetische Expression Profile in...

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Systematische, groß angelegte synthetische genetische (Gen-Gen-oder Epistase) Interaktion Bildschirme können verwendet werden, um genetische Redundanz und Weg cross-talk zu erkunden. Hier haben wir eine High-Throughput-quantitative synthetischen genetischen array Screening-Technologie beschreiben, bezeichnet ESGA dass wir für die Aufklärung epistatische Beziehungen und erforschen genetische Interaktion Netze in den...

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung modernster Technologie durch DNA-Microarrays. Microarrays geben einen Überblick über die transkriptomischen Veränderungen in Bakterien, die unter einer bestimmten Bedingung auftreten. Darüber hinaus heben wir hervor, wie einfach es ist, große Datenmengen mit Hilfe von komfortablen, eigens entwickelten Softwarepaketen zu analysieren.

Eine schnelle und zuverlässige Pipeline für bakterielle Transkriptomanalyse Fallstudie: Serin-abhängige Genregulation in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Wir haben ein Protokoll entwickelt, das schnell, sensitiv und reproduzierbar für die Erstellung von Erreger-Genexpressionsprofilen während einer Infektion ist.

Gene Expression Profiling von Infecting Mikroben Mit einem Digital-Strichcode-Plattform

Hier beschrieben ist eine Methode zur Analyse von bakteriellen Genexpression in tierischem Gewebe auf zellulärer Ebene. Diese Methode bietet eine Ressource für das Studium der phänotypische Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation in Reaktion auf die Umwelt Gewebe während einer Infektion auftreten.

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Dieses Verfahren beschreibt, wie primäre hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus zu etablieren und wird durch Transfektion mit dem Gene Pulser MXCell Elektroporation Systems.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 1

Lernen Sie die Genexpressionsanalyse mit Microarrays durch indirekte Markierung. Diese Methode ermöglicht den Vergleich von Wildtyp- und Mutantenproben mit minimaler Verzerrung für zuverlässige Ergebnisse.

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Weitere Videos entdecken