Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Hallo, mein Name ist Ena und wir führen routinemäßig Genexpressionsprofile im Labor durch. Und wir verwenden diese Technik, um unterschiedlich regulierte Gene zwischen Meth und Wildtyp zu überwachen. Und heute habe ich einen Wildtyp und Meth-RNA-Proben und wir alle machen zuerst C.

Wir verwenden eine indirekte Markierungsmethode und der Vorteil dieser Technik besteht darin, Augenverzerrungen zu verhindern, die bei der direkten Markierung auftreten können. Und um das zu tun, haben wir RNA-Proben und wir entscheiden uns dafür, drei Mikrogramm RNA in 13 Mikrolitern des Gesamtvolumens zu erhalten. Und wir fügen 2,5 Mikro zufälliger he in unseren Parks hinzu.

Und wir werden die Probe bei sieben Grad und fünf Grad inkubieren, um sie acht Minuten lang an die Art der RNA anzupassen. Und jetzt fügen wir den hinzu, wir fügen einen reversen Transkriptionscocktail hinzu, der AM L-D-L-D-U-T-P Continu Mix, Reverse Transkriptase-Puffer und auch ET TT enthält. Und inkubieren Sie die Probe vier Stunden lang bei 42 Grad. Also nehmen wir nach vier Stunden einfach die Proben heraus.

Und jetzt haben wir in der Röhre eine Mischung aus CDNA und RNA. Und was wir tun wollen, ist, Hydrox-RNA durch Zugabe von Natriumhydroxid und EDTA zu machen, und die Endkonzentration für Natriumhydroxid sollte hundert molare betragen. Und die Endkonzentration für e BT sollte fünf molare Werte betragen.

Und jetzt werden wir die Proben 10 Minuten lang bei einem 65-Grad-Wasserbad inkubieren. Die Inkubation ist also abgeschlossen und wir werden Proben verwenden, indem wir einen pH-Wert von sieben Haufen und ein Wasser bis zur Endkonzentration von 500 molar hinzufügen. Zu diesem Zeitpunkt können Sie die Proben bei minus 20 Grad lagern oder mit der Bereinigung fortfahren.

Für die Reinigung des CDNA verwenden wir das KaiGen PCR-Aufreinigungskit. Da jedoch Buschpuffer und Ionenpuffer Befreiung enthalten, tun wir das nicht, wir bereiten unseren eigenen Fate Buschpuffer und Fate Ionenpuffer vor und Sie fügen 300 Liter PPI hinzu und wir leiten diesen Teich langsam zu Ihnen hinunter übertragen Sie die Mischung in Säulen Und Sie drehen sich eine Minute lang mit höchster Geschwindigkeit Und Sie werden beobachten, wie den Puffer, den wir vorbereitet haben. Phosphat-Waschpuffer, Sie fügen 750 Mikroliter hinzu und so, und Sie fügen wieder einen weiteren For one hinzu.

Also drehen wir uns noch einmal, nur um sicherzugehen, dass wir alle Betten haben. Und wir werden diese Röhren in leere Straftäterröhren umfüllen. Und ich füge 30 Marker Phophosphat E-Puffer hinzu, das sind vier vier Molare Kaliumphosphat bei einem pH-Wert von 8,5.

Und hier müssen Sie nur sicherstellen, dass Sie alles in die Mitte der Säule geben, und Sie inkubieren eine Minute lang bei Raumtemperatur. Also dreht es sich wieder eine Minute lang und ich füge einen weiteren 30 Mikro-Null-Puffer hinzu, den ich inkubiere oder ins Schlafzimmer bringe. Also entferne ich die Säule und wir haben ein Gesamtvolumen von 60 Mikros oder CDA.

Sobald wir das CDNA gereinigt haben, können Sie es bei minus 20 Grad draußen lagern und wir können es auch trocknen und dann lagern, damit wir das CDNA im Feedback trocknen können. Jetzt haben wir also in der Tube trockenes CDA, das modifiziert ist. Und was wir tun werden, ist, dass ich die trockene Probe einhänge.

Ich werde die Probe in 10 tur 15 LAR Bikarbonat bei pH neun suspendieren. Und ich werde das einfach tun, indem ich bei diesem Schritt auf und ab gehe, es ist sehr wichtig, die cDNA zu resanieren. Nun, für den Kauf von Unternehmensreaktionen sollte diese Reaktion in der Dunkelkammer stattfinden, da fluoreszierende Markierungen empfindlich sind.

Wenn Sie sich jedoch für diese aus den Biowissenschaften entscheiden, wurden sie in einzelnen Paketen geliefert. S fünf hat eine lila Kappe und Seite drei hat eine orangefarbene Kappe und auch S fünf erscheint als Sion, wenn es aufgehängt wird, und Cary erscheint magenta. Was ich also in der Dunkelkammer machen werde, ist, dass ich diese Proben in Färbetuben übertrage, ich suspendiere die Farbe wieder und übertrage sie zurück in die Tube, die ich habe.

Und dann inkubiere ich zwei Stunden lang im Dunkeln, nach zwei Stunden Inkubation stoppt dies die Reaktion, indem ich 35 re von hundert Millimolar Natriumacetat bei pH 5,2 hinzufüge. Und danach haben wir mit dem ähnlichen Aufräumverfahren aufgeräumt. Dieses Mal verwenden wir jedoch den von Cajun bereitgestellten Waschpuffer und Elutionspuffer

Sie können die Stellen beschreiben, an denen Sie die Probe platzieren und die das Instrument reinigen sollen. Sie können also Ihre Probe oder Ihren Mix jetzt I To verwenden, also das ist meine mit SciFi beschriftete Probe und hier sehen wir OD zwei 60, was den CDA-Gehalt zeigt, und OD sechs 50, was die D-Inkorporation für SciFi zeigt. Und hier ist mein Label-Beispiel für die dritte Seite.

Nochmals, drehen sechs Konzentration und fünf 50 misst Standort drei Inkorporation. Da meine D-Corporation effizient arbeitet, werde ich jetzt Beispiele kombinieren, Frau vermisst es kurz. Und jetzt schreiben wir wieder ein Beispiel mit Feedback.

Okay, für die Aktivierung der Rutsche rehydrieren wir, indem wir die Rutsche universell auf Wasser legen, wodurch die Flecken größer werden. Und um das zu schützen, schnappen wir einfach bei hundert Grad Celsius trocken und dann hybridisieren oder vernetzen wir die Spots mit dem Objektträger und inkubieren dann in dem Pre-High-Puffer, den wir haben. Also lege ich die Rutsche mit der Vorderseite nach unten, aber sie berührt das Wasser noch nicht.

Und so warten wir fünf Minuten lang. Ich, also diese Schachtel sieht größer aus, sie sollte glänzender sein als vor dem Aufstellen, und Sie werden einfach trocken schnappen, indem Sie den Schieber auf hundert Grad stellen, und Sie werden auf Kondensation achten. Und wir werden uns mit Ihnen vernetzen.

Um mich zu hydrieren, tauche ich die Rutsche einfach in Vorkriegswasser. Und das sollte wirklich schnell gehen, denn das Ziel hier ist, dass Sie alle Flecken oder alle Oligos an der Stelle, die nicht verknüpft sind, loswerden möchten. Und wenn Sie in diesem Prozess langsam vorgehen, werden Sie nur Fehler an Ihren Spots bekommen.

Stellen Sie also sicher, dass Sie es wirklich schnell machen und stellen Sie sicher, dass Sie Ihren Flug nicht aus dem Wasser nehmen und dieses Zeug für 30 Sekunden machen und einfach sofort bei Raumtemperatur für fünf Minuten und 700 Luft nachmittag futt Holen Sie sich das, wir passen diese Rutsche in den Vorkriegs-Rohrstationspuffer ein, den wir hatten Und schieben Sie die Rutsche langsam in das Glas und wir werden dies bei 42 Grad für um mindestens 45 Minuten. Hier haben wir also unsere getrocknete Probe, die hybridisiert werden soll. Also werden wir zuerst Resus in Wasser suspendieren.

In diesem Schritt regenerieren wir nur die Suspendierung, indem wir auf und ab gehen und die Probe möglicherweise nicht zu weiß, weiß belichten. Und dann fügen Sie die Spermien-DNA 1,5 einer Person hinzu und die Konzentration beträgt 10 Milligramm pro Mil. Und Sie fügen 1,2 Vermarkter von TRNA hinzu.

Die Konzentration beträgt 12,5 Milligramm pro Menge, wir fügen tRNA und einige Spermien-DNA hinzu, um unspezifisches Hydro zu blockieren. Und wir fügen 5,35 Markierung Null drei XSSC hinzu, was eine Endkonzentration von drei x ergibt. Und schließlich fügen wir 3,5 Mikroliter 1% SDS hinzu.

Jetzt kochen wir die Mischung fünf Minuten lang und drehen sie fünf Minuten lang mit höchster Geschwindigkeit und sie ist bereit, das zu haben. Es ist eine Stunde her, seit wir unsere Rutsche inkubiert haben, und im Moment habe ich Wasser und Isopropanol. Also werde ich den Objektträger zuerst in Wasser rühren, um SDS loszuwerden, und dann Ihr dza Propanol waschen und direkt in das Standardmessgerät geben.

Und hier drinnen sollten Sie nur darauf achten, dass Sie das Licht nicht zu stark der Luft aussetzen, um ein Austrocknen zu verhindern. Also gehe ich direkt von der Schadensstation Puffer ins Wasser Und wir waschen die Rutsche. Stellen Sie nur sicher, dass die Bewegung nur auf und ab ist, nicht seitwärts.

Und stellen Sie auch sicher, dass sich die Rutsche nicht über Wasser befindet und wir sie sofort in Isopropanol umwandeln. Und es bleibt einfach wieder ein paar Minuten hier. Und könnte Ihre Seite Bitte beantworten Sie Ihre Seite bei Raumtemperatur für fünf Minuten?

700 R.Cool. Unsere Rutsche ist also auch bereit für die Hybridisierung und es ist besser, wenn Sie sie in einer Schiebebox aufbewahren, um sie vor dem Bus zu schützen. Für die Erntestation verwenden wir also Lift oder Slip.

Auf dem Deckglas befinden sich weiße Streifen, die für etwas Auftrieb sorgen und unserem Muster etwas Platz bieten, um zwischen dem Deckglas und dem Objektträger Platz zu haben. Und ich reinige es mit Ethanol Und dann lege ich den Draht ab Und stelle einfach sicher, dass es keine Testpartikel gibt. Zuerst nehmen wir also unsere Vorlagenfolie, für die wir den Druckbereich markiert haben, und legen die Folie, die wir vorbereitet haben, darauf und stellen sicher, dass sie perfekt ausgerichtet ist.

Stellen Sie sicher, dass sie perfekt ausgerichtet sind. Und Sie müssen sicherstellen, dass die Streifen an der Seite sind, dass wir sie nach unten richten. Es ist also wirklich schwer zu sehen, aber stellen Sie sicher, dass Sie es sehen können.

Und die Streifen sollten sich an den Seiten der Folien befinden. Und wir laden unsere Probe von den Seiten. Ich nehme kleine Mengen an Proben, also nehme ich zuerst 15 Mikroliter und beginne mit dem Laden aus der Ecke vom Deckglas.

Und langsam zog ich es ein und bewegte mich einfach an der Kante entlang, um den gesamten Bereich abzudecken. In diesem Stadium ist es sehr wichtig, keine Blasen einzuführen, und ich nehme weitere 15 Migratoren und trage sie auf die Seite der Objektträger auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Unsere Probe ist also fertig und Sie inkubieren unsere Objektträger und Priorisierungskammern, die über Mikrokanäle verfügen, um den Objektträger während der Hybridisierung zu hydratisieren.

Und wir fügen 10 Vermarkter von drei XSSC in sechs Ecken der Folie hinzu. Es gab sechs Stellen auf der, auf der Kammer, sorry, an jeder Ecke ich, und auf jeder Seite, Stellen Sie sicher, dass Sie die Folie wirklich vorsichtig übertragen, damit der Deckglas nicht wegrutscht. Und wenn Sie die Rutsche mit der rechten Seite nach oben aufsetzen, werden Sie sehen, dass sie gestapelt wird, sie wird an dem Wasser kleben, das Sie aufsetzen, und die Abdeckung aufsetzen Und stellen Sie sicher, dass die Schrauben fest angezogen sind.

Wir werden den Konversationsraum bei einem 65-Grad-Wassersack inkubieren, aber wir wollen ihn nicht direkt auf den Boden stellen. Also haben wir einfach eine Art Kunststoffbarriere eingebaut, um eine übermäßige Wärmeübertragung zu verhindern. Und wir platzieren unsere Filtrationskammer schonend und um eine Verschiebung zu verhindern, können Sie auch eine Art Gewicht aufbringen.

Und diese Inkubation dauert über Nacht, in der Regel zwischen 10 und 12 Stunden. Für das Waschen der Scheibe verwenden wir also einen XSSC mit 0,05 Prozent SDS. Dies wird zum Entfernen des Deckglases verwendet.

Und das wird für das Waschen der erste Schritt sein. Und wir werden nur zwei weitere Schritte mit 0,06 %sechs XSC durch alle SDS machen, die wir haben. Also vermasseln wir alle das Gespräch und nehmen Folien und legen sie verdeckt in die Handtasche.

Und wir schütteln es einfach von einer Seite zur anderen und wir werden sehen, dass der Deckschirm sanft abfällt. In Ordnung, und, Und wir werden einfach in einen anderen Waschpuffer übertragen, der XES enthält. Du isst eine Minute lang.

Gehen Sie zu oh sechs XSSC. Und um sicherzugehen, dass wir alle FDS losgeworden sind, wiederholen wir es noch einmal. Die Zentrifuge zum Trocknen wurde fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 700 RP durchgeführt. Sie bewahren diese Folie in der Folienbox auf, da sie lichtempfindlich ist.

Das ist also ein Diascanner und Sie legen die Folie hier hinein, hier ist wenig Platz, legen Sie die Folie mit der Vorderseite nach unten, beschriftet in Richtung und, Und auf der zweiten Folie definieren Sie einfach den Bereich, den Sie scannen möchten. Und Sie werden diesen Bereich einfach in unseren Folien einnehmen. Wir haben, wir verwenden 16 Pins, um unsere Folien zu drucken.

Jeder Block entspricht also einem Pin und unsere Folien enthalten über 8.000 Spots. Und wir repräsentieren das vi-Farbgenom zweimal, weil es etwa 4.000 Gene umfasst. Wir haben also zwei Spots pro Oligo, das wir verwenden.

Und wenn diese heranzoomen, würden Sie in diesem speziellen Experiment sehen, dass wir Transkriptionsregulator-Mutanten mit Wildtypen vergleichen, und die Mutante würde mit SciFi markiert werden, was eine rote Farbe ergibt. Und der Wildtyp war Standort drei, der eine grüne Farbe ergibt. Alles, was rot erscheint, wie diese Flecken, deutet darauf hin, dass die Häufigkeit der Transkripte in der Mutante höher war als im Wildtyp.

Sie erscheinen also rot oder rot, und alles, was grün erscheint, deutet darauf hin, dass die Häufigkeit des Transkripts beim Wildtyp im Vergleich zur Mutante höher war. Und jeder Fleck, der gelb erscheint, deutet darauf hin, dass dieses Transkript sowohl in der Mutante als auch im Wildtyp gleichermaßen vorhanden war. Wenn sie sich also überlagern, würden sie gelb erscheinen, wie diese Aber.