In utero Elektroporation basierte Genabgabe: Eine Technik zur Injektion von Plasmid-DNA in embryonale Kleinhirnzellen von Mausembryonen

Beginnen Sie mit der Entnahme eines schwangeren, anästhesierten weiblichen Mausmodells, das in Rückenlage gebracht wird. Bereiten Sie die Maus vor, indem Sie Haare aus der Bauchregion entfernen. Schnitte die Haut und die darunter liegenden Muskelschichten, um die Gebärmutterhörner freizulegen - die Stellen, an denen lebensfähige Embryonen beherbergt werden.

Ziehen Sie nun die Gebärmutterhörner aus der Bauchhöhle heraus. Nehmen Sie eine Glaskapillare mit scharfer Spitze, die die gewünschte Plasmid-DNA-Lösung enthält. Lokalisieren Sie das Gehirn des Embryos und injizieren Sie die Plasmid-DNA-Lösung durch die Gebärmutterwand in den vierten Ventrikel. Diese Position befindet sich vor dem Kleinhirnprimordium - dem gewünschten Ort für die spätere DNA-Lieferung.

Nach der Injektion ziehen Sie die leere Kapillare zurück. Als nächstes positionieren Sie für die Elektroporation des injizierten DNA-Embryos die beiden Elektroden über der Gebärmutterwand, so dass die positive Elektrode das Kleinhirnprimordium und die negative Elektrode den Bereich um die Ohren bedeckt.

Wenden Sie elektrische Impulse für die gewünschte Dauer an. Diese Impulse machen die Kleinhirn-Neuronalzellen durchlässig, so dass die Plasmid-DNA in die Zielzellen eindringen kann. Platzieren Sie schließlich die Gebärmutterhörner wieder in ihrer natürlichen Position in der Bauchhöhle. Nähen Sie die Schnitte, setzen Sie die Maus in ihren Käfig und lassen Sie sie sich erholen.

Beginnen Sie damit, eine Kapillare aus Borosilikatglas in einen Mikropipettenabzieher zu laden und zu ziehen, um eine feine Spitze zu erzeugen. Beschriften Sie die Kapillarspitze zur besseren Visualisierung während der Injektion mit schwarzer Tinte und zeichnen Sie eine Skalierung auf das Glas. Schneiden Sie die Spitze unter einem Stereomikroskop mit einem Lineal und einer scharfen Nadelpinzette auf eine Länge von etwa 6 Millimetern ab und erzeugen Sie eine scharfe, einseitig abgeschrägte Kante.

Filtrieren Sie eine 1%ige Fast Green-Stammlösung durch einen 0,22-Mikron-Filter, um Farbstoffpartikel aus der Lösung zu entfernen. Mischen Sie die Single-Guide-RNA-Plasmide zu gleichen Teilen mit dem Luciferase-Reporterplasmid bis zu einer Endkonzentration von mindestens 1 Mikrogramm pro Milliliter für jedes Plasmid.

Färben Sie die Plasmalösung mit Fast Green in einer Endkonzentration von 0,05 %. Nachdem Sie eine schwangere CD-1-Maus mit Isofluran betäubt haben, legen Sie die Maus auf den Rücken auf ein Heizkissen und verabreichen Sie ein Analgetikum. Tragen Sie Augensalbe auf, um Augentrockenheit während der Operation zu verhindern. Fixieren Sie die Gliedmaßen mit Klebeband und sterilisieren Sie den Bauch mit einem Desinfektionsmittel.

Decken Sie die Maus mit Gaze ab, so dass nur der Operationsbereich freiliegt. Nachdem Sie einen Hautschnitt von etwa 2 Zentimetern Länge gemacht haben, lokalisieren Sie die Linea alba und verwenden Sie eine Schere mit stumpfer Spitze, um einen etwas kleineren zweiten Schnitt durch das Peritoneum zu machen. Befeuchten Sie die geöffnete Bauchhöhle mit vorgewärmtem sterilem PBS.

Verwenden Sie anschließend eine Ringzange, um die Gebärmutterhörner vorsichtig aus der Bauchhöhle zu entfernen. Fassen Sie die Gebärmutterwand an der Lücke zwischen den Dottersäcken zweier benachbarter Embryonen und ziehen Sie vorsichtig. Vermeiden Sie jeglichen Druck auf den Embryo, während Sie ihn durch den Schnitt ziehen. Nachdem die Gebärmutterhörner extrahiert wurden, aspirieren Sie etwa 10 bis 15 Mikroliter farbige Plasmidlösung mit der vorbereiteten Glaskapillare. Vermeiden Sie während dieses Vorgangs Luftblasen.

Halten Sie den Embryo vorsichtig mit einer Ringzange fest und lokalisieren Sie den Halsbereich. Dringen Sie mit der Spitze der Glaskapillare langsam in das dorsale Hinterhirn ein und gelangen Sie in den vierten Ventrikel. Injizieren Sie etwa 1 Mikroliter der Plasmidmischung. Vergewissern Sie sich, dass die gefärbte DNA nicht aus dem Gehirn ausgetreten ist und als rautenförmige Struktur sichtbar ist.

Hier ist es am wichtigsten, den gesamten Bereich des vierten Ventrikels mit Plasmidlösung zu füllen, um die DNA auch in den distalen Teil des Kleinhirnprimordiums zu transportieren. Achten Sie gleichzeitig darauf, dass Sie während dieses Vorgangs keine Blutungen verursachen.

Platzieren Sie eine Platinpinzette mit Elektrodenplatten mit einem Durchmesser von 5 Millimetern seitlich über dem Kopf des Embryos, wobei der Minuspol das Ohr bedeckt und der Pluspol am Kleinhirnprimordium über der Gebärmutterwand positioniert ist, und legen Sie elektrische Rechteckimpulse an.

Wenn alle Embryonen elektroporiert wurden, setzen Sie die Gebärmutterhörner vorsichtig wieder in die Bauchhöhle ein und füllen Sie sie mit sterilem PBS. Lassen Sie das Gebärmutterhorn in eine natürliche Position gleiten. Schalten Sie die Anästhesie aus und setzen Sie das Tier mit dem Bauch nach unten in einen neuen Käfig, damit es sich erholen kann.