Name: Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Erfahren Sie, wie Acrylamid-Hydrogel mit variabler Steifigkeit verwendet werden, um Zellverhalten in vitro zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Analyse mechanischer Stimuli auf Zellfunktionen mittels Immunfluoreszenz und PCR.

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Die Arbeit ist unser Labor durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health unterstützt.

Vorbereitung <ul><li> Deckgläser sollten autoklaviert werden. </li><li> Sterile Zugabe von destilliertem Wasser sollte verwendet werden, um Lösungen vorzubereiten und für das Waschen Deckgläser werden. </li><li> AC (40% w / v) und Bis-AC (1% w / v)-Lösungen werden von 0,2 mu m sterilfiltriert. Bereiten Sie 10% Ammoniumpersulfat (APS; 100μg/ml Wasser) kurz vor dem Gebrauch und Sterilfilter. Ersetzen Sie die APS-Lösung monatlich. </li><li> Chemische Reagenzien wie 3-APTMS, Chloroform, glutaradehyde, NHS und SurfaSil, die nicht zu autoklaviert werden in einem zugewiesenen Flasche ausschließlich für die Herstellung von Hydrogelen verwendet gehalten. </li><li> Für beste Ergebnisse sollte Hydrogele innerhalb von ein paar Tage nach der Inkubation über Nacht mit den entsprechenden ECM-Protein eingesetzt werden. </li><li> Bereiten Sie eine 10% SurfaSil Lösung in Chloroform (10 ml ist in der Regel ausreichend für 20 Top-Deckgläser) in einer 50 ml-Polypropylen-Falcon-Röhrchen vor der Hydrogel Gießen. (Unser Labor in der Regel siliconizes oben Deckgläser während der 0,5% Glutaraldehyd Inkubationsschritt). Fügen Sie die Deckgläser auf die Falcon-Röhrchen und Rock für mindestens 10 min. Dekantieren SurfaSil Lösung und an der Luft trocknen die Deckgläser auf Kimwipes in der biologischen Sicherheitswerkbank, wo die Hydrogele werden. </li><li> Bereiten Sie die hitzeinaktiviertem BSA-Lösung wie folgt: 20 mg / ml Lösung von Fettsäuren frei BSA in PBS in einem 68 ° C Wasserbad für 30 min inkubiert. Die Lösung wird dann sterilfiltriert und bei 4 ° C gelagert </li></ul> Verfahren <ol><li> Eine Schicht Parafilm auf der unteren Hälfte eines 150-mm-Petrischale. </li><li> Legen Sie bis zu 9 25-mm-Deckgläschen auf dem Parafilm und decken Sie sie mit 1 ml 0,1 M NaOH. Inkubieren für 3 min und dann absaugen mit einem Vakuum-Leitung. </li><li> Die Arbeit in einem chemischen Kapuze, statt 0,5 ml 3-APTMS auf jedem Deckglas. Inkubieren für 3 min und dann absaugen APTMS. Wenn Sie zu lange warten, wird ein Schaum zu bilden. </li><li> Spülen Sie die Deckgläschen einmal mit 20 ml deionisiertem Wasser in einer Schüssel. Entfernen Sie die Deckgläser aus der Schüssel mit einer gebogenen Pinzette und übertragen Sie sie mit ihrem behandelnden-Seite nach oben, um eine neue 150-mm-Schale. Waschen Sie die Deckgläser mit entionisiertem Wasser dreimal auf die Wippe, für jeweils 10 Minuten abwaschen. Wenn Sie alle APTMS entfernen scheitern, wird es mit dem Glutaraldehyd in den nächsten Schritt zu reagieren und hinterlassen einen weißen Regen Niederschlag (Abb. 1). </li><li> Auftauen Glutaraldehyd (~ 10 min vor Gebrauch). </li><li> Mit einer gebogenen Pinzette, übertragen Sie die Deckgläser zu einer sauberen Schüssel mit Parafilm geschichtet und saugen alle verbleibenden Flüssigkeit. Verwenden Sie eine Saugleitung oder Kimwipe um das restliche Wasser-Blot, wie gebraucht. </li><li> Cover jede Deckglas komplett mit 0,5 ml 0,5% Glutaraldehyd in sterilem, deionisiertem Wasser und Inkubation für 30 min in einem chemischen Kapuze. Saugen Sie das Glutaraldehyd. Spülen und waschen Sie die Deckgläschen wie in Schritt 4. Trocknen Sie die Deckgläser komplett. [Sie können hier aufhören und lassen Sie die Deckgläser für mehrere Wochen in einem trockenen Raum]. </li><li> Wenn Sie bereit sind, die Hydrogele herzustellen sind, verwenden einer gebogenen Pinzette auf die Deckgläser, reaktive Seite nach oben auf ein Blatt Parafilm, die auf der Oberfläche des biologischen Sicherheitswerkbank wurde mit Klebeband zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser flach auf den Parafilm Oberfläche. </li><li> Bereiten Sie eine gesättigte NHS-Lösung in Toluol. (Man löst eine kleine Menge von NHS in ausreichend Toluol für die jeweilige Experiment. Halten Sie das Hinzufügen NHS Stück für Stück, bis der NHS nicht mehr auflöst. Die gesättigte Lösung ist in der Regel trübe und pink.) </li><li> Als nächstes bereiten die Acrylamid, Bisacrylamid-, Wasser-und APS auf die gewünschte Acrylamid Prozentsatz zu erreichen. Fügen Sie die Reagenzien in Mikrozentrifugenröhrchen wie unten auf ein Gesamtvolumen von 0,8 ml skizziert. </li><li> Dann, eines aliquoten zu einer Zeit, fügen Sie den NHS und TEMED auf die 0,8 ml AC-Lösung, kurz vortexen und SOFORT pour 3-5 Gele mit 140 ul pro Deckglas in die biologische Sicherheit Kapuze. Wann immer möglich, sollten alle Schritte von diesem Punkt in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. [Anmerkung: unterschiedliche Größe Deckgläser kann basierend auf Bedarf genutzt werden. Wenn 18-mm Deckgläser verwendet werden, verwenden ~ 33 ul AC-Lösung pro Deckglas und ein 18-mm top silikonisierten Deckglas.] <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"><div align="center"> Bis-AC (%) </div></td></tr><tr><td></td><td> 0,3 (steif) </td><td> 0,15 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 (weich) </td></tr><tr><td></td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td><td> ul </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 402 </td><td> 522 </td><td> 594 </td><td> 618 </td></tr><tr><td> AC </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Bis-AC </td><td> 240 </td><td> 120 </td><td> 48 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> APS</td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> NHS </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td></tr></tbody></table></li><li> Schnell Ort der silikonisierten 25-mm Deckglas auf der jeweils gel, bevor es zu polymerisieren beginnt. Neben der Top Deckglas sollte es dem AC vollständig zu bedecken den Boden Deckglas. Inkubieren dieses "Sandwich" bei Raumtemperatur, bis die AC polymerisiert. (Überprüfen Sie die verbleibende AC-Lösung im Reaktionsgefäß zu bestimmen, wann Polymerisation stattgefunden hat. In der Regel ein paar Minuten für steife Gele und ein wenig mehr für weiche genügt.). </li><li> Sorgfältig nehmen die Sandwich (sterile Handschuhe!) Und schieben Sie die obere Deckglas, bis es Überhänge der polymerisierten Gel. Sie können dann hebeln ihn aus dem Gel. Wenn Sie zu lange vor dem Entfernen der oberen Deckglas warten, wird das Gel rip als Deckglas wird entfernt. </li><li> Entsorgen Sie die Top-Deckglas. Setzen Sie die untere Gel-Deckgläser (im Folgenden als das Hydrogel) in 6-well-Platten mit 2 ml PBS / well. PBS kann vor oder nach der Gel-Deckglas in jedes Well gegeben werden. Waschen Sie die Hydrogele mit PBS dreimal, auf einer Wippe, 5 min pro Waschgang. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 11-14, bis die erforderliche Anzahl von Hydrogelen hergestellt worden sind. </li><li> Cover jede Hydrogel mit 2 ml einer Fibronektin-Lösung (3 g / ml in PBS) oder andere ECM-Protein (siehe Klein et al. 13 für Details.). Die ECM-Protein kovalent an das Hydrogel bei Inkubation über Nacht gebunden bei 4 ° C </li><li> Saugen Sie die ECM-Lösung und Block nicht umgesetzte NHS mit 1mg/ml hitzeinaktiviertem Fettsäuren frei BSA in serum-freien Medien für mindestens 30 min bei 37 ° C in einem Zellkulturbrutschrank. Spülen Sie die Hydrogele einmal mit sterilem PBS oder Zellkulturmedium. </li><li> Platte Zellen in dem entsprechenden Kulturmedium mit FBS. Die Anzahl der Zellen auf das Hydrogel ausgesät sollten vom Anwender auf den Grad der Zelle ausbreitet und Konfluenz benötigt für Experimente bestimmt werden. Etwa 10 5 Zellen ist in der Regel ausreichend für Western-Blot-und qPCR-Analyse. </li><li> Nach der Inkubationszeit kann Zelle Protein oder mRNA extrahiert werden. Die Deckgläser werden sorgfältig aus den Vertiefungen mit einer gebogenen Pinzette entfernt und (Zell-Seite nach unten) auf der Oberseite von 100 ul Tröpfchen Lysepuffer waren und nun nicht (2-3cm) an einem Blatt Parafilm auf dem Labortisch angeordnet. (Wir verwenden Standard-SDS-Probenpuffer und TRIzol jeweils um Proben für die Western-Blot vorzubereiten und RNA für die qPCR zu isolieren.) Inkubieren Sie die Zellen mit dem Lysepuffer für genau eine Minute. Deckgläser abnehmen und übertragen Sie die Lysepuffer zu einem Reaktionsgefäß. Alternativ zur RNA-Extraktion nur, kann der Benutzer jedes Hydrogel, um eine neue 6-Well-Platte übertragen und 1ml von TRIzol / well. Inkubieren für 3 Minuten und entfernen TRIzol Lösung für die Lagerung in einem Reaktionsgefäß. </li></ol> Zusätzliche Informationen über Verfahren wie Immunfluoreszenz, wird BrdU-Färbung, Transfektion, etc. für die Zellen auf Hydrogele gesät in Klein et al. 2007 13. Repräsentative Ergebnisse Gründliches Waschen der Deckgläschen nach der Zugabe von APTMS ist ein wichtiger Schritt in der Herstellung von "reaktiven" Deckgläser. Wenn man die APTMS vollständig zu entfernen scheitert, wird es mit dem Glutaraldehyd in den folgenden Schritt reagieren und eine weiße trübe Niederschlag wie in Abbildung 1A zu sehen. Abbildung 1B zeigt eine richtig gewaschen und getrocknet Deckglas. Wenn der Niederschlag entsteht, muss die ganze Prozedur von vorne begonnen werden, da das Deckglas ist nicht mehr nutzbar. Nach Hydrogelbildung und Beschichtung mit ECM-Proteine ​​über Nacht, können die Zellen ausgesät den folgenden Tag. Wie Abbildung 2 zeigt, gibt es einen deutlichen Unterschied zwischen Zellausbreitung auf steifen gegenüber weichen Hydrogele. Wie von Phalloidin-Färbung in embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) zu entnehmen ist, Zellen in einem größeren Ausmaß auf steifen verbreitet als zu weich Hydrogele verglichen. In der Tat werden die meisten Zellen eine Verbindung zu einem weichen Hydrogel bleiben kompakt und legen weniger effizient. Obwohl nur MEF Morphologie in Abbildung 2 dargestellt ist, ist der Unterschied in der Zelle sich über viele andere Zelllinien konsequent getestet 11-12,14. Secrets to Success <ol><li> Sobald die Prozedur gestartet wird, ist es sehr wichtig, die Deckgläser mit der "reaktiven" Seite halten und im Kopf behalten, welche Seite beschichtet wurde. </li><li> Handschuhe sollten zu jeder Zeit während des Verfahrens ein Arbeitsumfeld zu schaffen, dass möglichst steril bereitzustellen getragen werden. </li><li> Die meisten der ersten Schritte sind zwischen einem Laborabzug und dem Labortisch durchgeführt. Alle Schritte anschließendenzum Entfernen von überschüssigem Glutaraldehyd aus dem Deckgläschen sollte unter einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. </li><li> Aufgrund von Unterschieden in der Zelle ausbreitet (Abbildung 2), empfehlen wir Säen die doppelte Anzahl von Zellen auf weichen Hydrogele als zu steif Hydrogele verglichen. </li><li> Die AC-Polymerisationsverfahren ist extrem schnell. Bei erstmaliger Benutzung, kann man verringern die Menge von APS oder TEMED in die Lösung der Polymerisation zu verlängern. Versuchen Sie nicht, mehr als ein paar Deckgläser auf einmal vorbereiten. </li><li> In Zellzyklus Studien, in denen die Synchronisation in G0 erforderlich ist, wir in der Regel Serum-verhungern Zellen in Kunststoff-Petrischalen, trypsinize die Zellen und reseed sie auf Hydrogele unterschiedlicher Nachgiebigkeit in Gegenwart von Mitogene (FBS und / oder Wachstumsfaktoren). Dieses Verfahren stellt sicher, dass der Ausgangspunkt Bevölkerung von G0-synchronisierten Zellen identisch in allen Proben ist. Doch für viele Signaltransduktion Studien, können die erforderlichen Mitogenstimulation Zeit nicht lang genug sein, um für die Befestigung und Ausbreitung von Zellen zu ermöglichen. In diesem Fall haben wir Serum-verhungern die Zellen auf der Hydrogele und dann direkt zu stimulieren sie mit Mitogen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1a"> Abbildung 1A. Falsch gewaschen Deckglas. Nach Zugabe von APTMS wurde Deckglas für 1-2 Minuten vor der Zugabe der Glutaraldehyd-Lösung gewaschen. Ein Niederschlag bildet sich auf dem Deckglas, die nicht nach den Schritten im Verfahren beschrieben wurde gewaschen. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1b.jpg" alt="Abbildung 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1b"> Abbildung 1B. Richtig gewaschen Deckglas. Nach Zugabe von APTMS wurde Deckglas für dreimal jeweils 10 Minuten vor der Zugabe der Glutaraldehyd-Lösung gewaschen. Entsteht kein Niederschlag auf dem Deckglas. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Morphologie der Zellen auf Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit. Etablierte MEFs auf Fibronektin-beschichteten Hydrogele hohe oder niedrige Steifigkeit für 9 Stunden wurden ausgesät. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit FITC-Phalloidin, die f-Aktin bindet. MEFs auf hohe Steifigkeit Gele zeigen Stress-Fasern und sind gut verteilt im Vergleich zu denen auf geringe Steifigkeit Hydrogele ausgesät. Balken = 50 um. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Vertreter quantitative PCR Ergebnis der Maus Cyclin D1-mRNA-Spiegel. Serum verhungert embryonalen Maus-Fibroblasten wurden auf hoch (3% Acrylamid) oder niedrig (0,3% Acrylamid) Steifigkeit Hydrogele verzinkt und stimuliert mit 10% FBS für 9 Uhr. Nach RNA Extraktion wurde real-time quantitative PCR-Analyse für Cyclin D1-mRNA-Spiegel (normiert auf 18S RNA) durchgeführt. G0 stellt Cyclin D1 mRNA aus ruhenden Zellen. Cyclin D1-mRNA-Spiegel signifikant erhöhen auf steifen Hydrogele, aber nicht auf weichen Hydrogele. Daten sind Mittelwerte + / - SD von doppelten PCR-Reaktionen.

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</ol>

Ein entscheidendes Element des Hydrogels Polymerisation wird die Luft Blasenbildung, die es Zellen, die Deckglas, anstatt die ECM-beschichteten Hydrogel sich binden zu vermeiden. Dies kann durch vorsichtiges Pipettieren der Polymerisationslösung nach Vortexen und visuell darauf achten, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden in das Gel verhindert werden. Wir empfehlen immer, bereitet zusätzliche &quot;reaktiven&quot; Deckgläser und Hydrogele, um sicherzustellen, dass genug für Experimente. <p class="jove_content...

<table><tbody><tr><td>Glutaraldehyd, 70 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7776</td><td>Bei -20&amp;#x00B0;C lagern</td></tr><tr><td>3-APTMS (3-Aminopropyltrimethoxysilan, 97 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>Bei Raumtemperatur lagern</td></tr><tr><td>SurfaSil Siliconizing Fluid</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>42800</td><td>Bei Raumtemperatur lagern</td></tr><tr><td>NHS (N-Hydroxysuccinimidester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-8060</td><td>Bei 4&amp;#x00B0;C lagern, monatlich erneuern</td></tr><tr><td>Albumin, Rinderserum, praktisch frei von Fettsäuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-100G</td><td>Bei 4&amp;#x00B0;C lagern</td></tr><tr><td>Deckgläser (25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86 25 Cir 1D</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (18 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84 18 Cir 1D</td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung der auswirkungen von matrix stiffness auf cellular-funktion mit acrylamid-basierte hydrogele

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue Steifigkeit ist eine wichtige Determinante für zelluläre Funktion und Veränderungen im Gewebe Steifigkeit sind häufig mit Fibrose, Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankung 1-11 verbunden. Traditionelle zellbiologische Ansätze zum Studium zellulärer Funktionen werden Zellkulturen auf einem starren Substrat (Plastikschalen oder Deckgläschen), die nicht für die Wirkung eines elastischen ECM oder die Variationen in ECM Steifigkeit zwischen Geweben erklären kann. Zur Modellierung in vivo Tissue Compliance-Bedingungen in vitro, verwenden wir und andere ECM-beschichteten Hydrogele. In unserem Labor werden die Hydrogele auf Polyacrylamid, die den Bereich des Tissue Verstöße gesehen biologisch 12 nachahmen kann basieren. &quot;Reaktive&quot; Deckgläser werden durch Inkubation mit NaOH durch Zugabe von 3-APTMS gefolgt generiert. Glutaraldehyd wird verwendet, um Vernetzung der 3-APTMS und das Polyacrylamidgel. Eine Lösung von Acrylamid (AC), Bis-Acrylamid (Bis-AC) und Ammoniumpersulfat ist für die Polymerisation des Hydrogels verwendet. N-Hydroxysuccinimid (NHS) in den AC-Lösung zur Vernetzung von ECM-Protein auf das Hydrogel eingebaut. Nach der Polymerisation des Hydrogels wird das Gel Oberfläche mit einer ECM-Protein der Wahl, wie Fibronektin, Vitronektin, Kollagen, etc. beschichtet Die Steifigkeit eines Hydrogels kann durch Rheologie oder Rasterkraftmikroskopie (AFM) bestimmt und angepasst werden durch Variation der Anteil der AC-und / oder Bis-AC in der Lösung 12. Auf diese Weise können Substrat Steifigkeit, um die Steifigkeit von biologischen Geweben, die auch quantifiziert werden mit Hilfe der Rheologie oder AFM abgestimmt werden. Die Zellen können dann auf dieser Hydrogele und kultiviert auf die experimentellen Voraussetzungen basiert ausgesät werden. Imaging der Zellen und ihre Genesung für die molekulare Analyse ist einfach. Für diesen Artikel definieren wir weichen Substraten, wie solche mit Elastizitätsmoduln (E) &lt;3000 Pascal und steife Substrate / Gewebe wie die mit E&gt; 20.000 Pascal.

Die Wirkung von Substraten Steifigkeit auf die zelluläre Funktion modelliert werden kann<em&gt; In-vitro-</em&gt; Verwendung von Polyacrylamid-Hydrogele unterschiedlicher nachzubessern.

Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele

Die Gewebesteifigkeit ist ein wichtiger Bestimmungsfaktor für die Zellfunktion, und Veränderungen der Gewebesteifigkeit stehen häufig im Zusammenhang mit Fibrose, Krebs und ...

Um die Compliance von lebendem Gewebe mithilfe von Acrylamidhydrogelen zu modellieren. Dies wird zunächst durch die Herstellung reaktiver unterer Deckgläser und silikonisierter oberer Deckgläser erreicht. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Acrylamidhydrogele einzugiessen und zu erzeugen.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das gewünschte extrazelluläre Matrixprotein an das Hydrogel zu vernetzen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Inkubation und Analyse von Zellen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie die Variation der Steifigkeit der extrazellulären Matrix in vitro das Zellverhalten über Analysen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie, Echtzeit-quantitativer PCR und Western Blotting reguliert.Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Herstellung und Anwendung von Acrylamid-Hydrogelen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um zu untersuchen, wie die Steifigkeit der extrazellulären Matrix die Zellmorphologie, Zellsignalgebung und Proliferation reguliert. Beginnen wir also.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Herstellung reaktiver Deckgläser. Bringen Sie zunächst eine Schicht Paraform auf der unteren Hälfte einer 150 Millimeter großen Petrischale an. Überführen Sie anschließend bis zu neun autoklavierte 25-Millimeter-Deckgläser auf die Parafolie und bedecken Sie sie mit einem Milliliter 0,1-molarer Natronlauge.Inkubieren Sie die Deckgläser drei Minuten lang. Nach der Inkubation saugen Sie das Natriumhydroxid mit einer Vakuumleitung unter Verwendung einer chemischen Abzugshaube ab und pipettieren Sie 0,5 Milliliter Dreiaminoprofiltrimethylsilan oder 3 A-P-T-M-S auf jedes Deckglas. Inkubieren Sie die Deckgläser weitere drei Minuten und saugen Sie anschließend das 3 A-P-T-M-S ab. Achten Sie darauf, die Inkubationszeit nicht zu verlängern, um die Bildung von Schaum auf dem Deckglas zu vermeiden.Scheiben nach der Behandlung. Spülen Sie die Deckgläser einmal mit 20 Milliliter entionisiertem Wasser in derselben Schale. Entfernen Sie die Deckgläser mit einer gebogenen Pinzette aus der Schale und überführen Sie sie mit der behandelten Seite nach oben in eine neue 150-Millimeter-Schale.Anschließend die Deckgläser erneut mit entionisiertem Wasser waschen und 10 Minuten lang auf den Schüttler stellen. Nach der Inkubation das Wasser entfernen und weitere zwei Male spülen. Es ist sehr wichtig, das gesamte 3-A-P-T-M-S vollständig zu entfernen, damit es nicht mit dem Glutaraldehyd reagiert und 10 Minuten vor der Verwendung von Glutaraldehyd einen trüben weißen Niederschlag bildet.Überführen Sie die Deckgläser mit gebogenen Pinzetten in eine saubere Schale, die mit Paraffin ausgelegt ist, und aspirieren Sie die restliche Flüssigkeit mithilfe einer Vakuumleitung. Bedecken Sie anschließend jedes Deckglas vollständig mit 0,5 Millilitern 0,5 %iger Glutaraldehydlösung in steriler entionisierter Wasser, um die drei A-P-T-M-S und das Polyacrylamidgel zu vernetzen. Inkubieren Sie die Deckgläser 30 Minuten lang in einem Abzug. Danach aspirieren Sie die Glutaraldehydlösung und waschen die Deckgläser erneut mit entionisiertem Wasser.Anschließend die Deckgläser vollständig trocknen. Neue Deckgläser in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen mit einer 10%igen Oberflächenversiegelungslösung in Chloroform geben und mindestens 10 Minuten lang schwenken. Die Oberflächenversiegelungslösung abgießen und lufttrocknen lassen.Legen Sie die Deckgläser auf Kim-Tücher in dem生物ischen Sicherheitswerkbank, wo die Hydrogele vorbereitet werden, um mit der Hydrogelpräparation zu beginnen. Verwenden Sie gebogene Pinzetten, um die Deckgläser mit der reaktiven Seite nach oben auf ein Blatt Paraform zu übertragen, das an der Oberfläche der生物ischen Sicherheitswerkbank befestigt wurde. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser flach auf der Paraform-Oberfläche liegen.Dann bereiten Sie eine gesättigte und hydroxy CIN-Hilfsstoff- oder NHS-Lösung in Toluol vor, indem Sie eine kleine Menge NHS in ausreichend Toluol lösen. Für die spezifischen Experimente geben Sie kleine Mengen NHS hinzu, bis das NHS nicht mehr löslich ist. Die gesättigte Lösung ist gewöhnlich trüb und rosa.Bereiten Sie anschließend das Acrylamid, BIS, Acrylamidwasser und ein PS vor, um den gewünschten Acrylamidgehalt zu erreichen. Geben Sie die Reagenzien gemäß dem schriftlichen Protokoll in die Mikroverbrauchsgefäße. Dann jeweils eine Aliquotprobe nach der anderen.Fügen Sie das NHS und TM hinzu. Vortexen Sie das Röhrchen kurz und geben Sie sofort zwischen drei und fünf Gelen mit jeweils 140 Mikrolitern pro Deckglas in den biologischen Sicherheitswerkbänken ab. Platzieren Sie schnell das silanisierte 25-Millimeter-Deckglas auf jedes Gel, bevor es mit der Polymerisation beginnt.Das Hinzufügen der oberen Deckglas ermöglicht es dem Acrylamid, das untere Deckglas vollständig zu bedecken. Inkubieren Sie dieses Sandwich bei Raumtemperatur, bis das Acrylamid polymerisiert ist, um festzustellen, wann die Polymerisation erfolgt ist. Überprüfen Sie die restliche Acrylamidlösung im Mikrozentrifugenröhrchen.Die Polymerisation dauert einige Minuten bei steifen Gele und etwas länger bei weichen Gele. Sobald die Polymerisation abgeschlossen ist, heben Sie das Sandwich vorsichtig auf, wobei Sie sterile Handschuhe tragen. Danach schieben Sie die obere Deckglasplatte so weit zur Seite, bis sie über das polymerisierte Gel hinausragt.Hebeln Sie dann die Abdeckung ab. Ziehen Sie das Gel ab und entsorgen Sie den oberen Deckel. Legen Sie jeden unteren Gel-Deckel, im Folgenden als Hydrogel bezeichnet, in eine sechswellige Platte.Fügen Sie anschließend zwei Milliliter gepufferte Phosphatlösung oder PBS pro Vertiefung einer sechswelligen Platte hinzu. Waschen Sie die Hydrogels dann mit PBS und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf einem Schüttler. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zwei Mal.Um das Experiment zu beginnen, bedecken Sie jedes Hydrogel mit zwei Milliliter einer Fibronectin-Lösung oder eines anderen extrazellulären Matrixproteins. Inkubieren Sie das Protein über Nacht bei vier Grad Celsius auf dem Hydrogel, damit es kovalent an das Hydrogel binden kann. Nach der Übernacht-Inkubation aspirieren Sie die ECM-Lösung. Dann blockieren Sie die nicht reaktiven NHS-Gruppen mit einem Milligramm pro Milliliter hitzeaktiviertem fettfreiem bovinem Serumalbumin in serumfreiem Medium und inkubieren für mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.Nach der Inkubation die Hydrogele einmal mit steriler PBS waschen. Anschließend die Zellen in das geeignete Kulturmedium, das fetalen Kälberserum enthält, auf die Hydrogele hier aussäen.Etablierte murine embryonale Fibroblasten werden verwendet. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, die auf dem Hydrogel ausgesät werden sollen, basierend auf dem erforderlichen Grad der Zellausbreitung und Konfluenz für die Experimente. Für die Western-Blot- und quantitative PCR-Analyse sind etwa 10^5 Zellen erforderlich.Anschießend inkubieren Sie die Zellen unter den für den jeweiligen Zelltyp geeigneten Bedingungen. Nach der Inkubationszeit extrahieren Sie das zelluläre Protein oder mRNA je nach Bedarf.Pipettieren Sie 100-Mikroliter-Tropfen Lysepuffer auf ein Paraform-Blatt auf der Laborbank und lassen Sie zwischen den einzelnen Tropfen etwa zwei bis drei Zentimeter Abstand. Entfernen Sie anschließend vorsichtig jedes Hydrogel, indem Sie die untere Deckglasabdeckung aus der Vertiefung anheben. Verwenden Sie dazu gebogene Pinzette und legen Sie das Hydrogel mit der Zellseite nach unten auf die Tropfen.Inkubieren Sie die Zellen mit dem Lysepuffer genau eine Minute lang. Entfernen Sie abschließend die Deckgläser und überführen Sie den Lysepuffer in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Alternativ überführen Sie bei der RNA-Extraktion jedes Hydrogel in eine neue sechswellige Platte und geben je Vertiefung ein Milliliter Triazol hinzu.Die Gele nach der Inkubation drei Minuten lang inkubieren. Die Triazollösung zur Aufbewahrung in ein Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen. Eine gründliche Wäsche der Deckgläser nach Zugabe von A-P-T-M-S ist ein wichtiger Schritt zur Herstellung reaktiver Deckgläser.Korrekt gereinigte und trockene Deckgläser sind frei von jeglichen Präzipitaten-Rückständen. A-P-T-M-S reagiert mit Glutaraldehyd und bildet einen weißen, trüben Niederschlag. Tritt ein Niederschlag auf, muss das gesamte Verfahren wiederholt werden, da das Deckglas nicht mehr verwendbar ist.Nach der Hydrogelbildung und Beschichtung mit ECM-Proteinen werden die Zellen über Nacht ausgesät. Es gibt einen deutlichen Unterschied im Auswachsen der Zellen auf steifen im Vergleich zu weichen Hydrogelen, wie durch die Faltung bei der Färbung sichtbar wird, und mausembryonale Fibroblasten breiten sich stärker auf steifen im Vergleich zu weichen Hydrogelen aus. Tatsächlich bleiben die meisten Zellen, die an einem weichen Hydrogel anhaften, kompakt und haften weniger effizient an.Repräsentative Ergebnisse der quantitativen PCR zur Cyclin-D1-mRNA-Expression in murinen embryonalen Fibroblasten zeigen, dass Cyclin D1 auf einer steifen Matrix signifikant hochreguliert ist, nicht jedoch auf einer weichen Matrix. Dies legt nahe, dass die Steifheit der Matrix den Zellzyklusfortschritt in vitro reguliert. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit herstellt, um physiologische Bedingungen in vivo zu modellieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, zusätzliche reaktive Deckgläser anzufertigen, da Unfälle und Fehler auftreten können.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir die experimentelle Techniken verwendet, um konform, extrazellulären Matrix (ECM) beschichtete Substrate für Zellkulturen herzustellen, und die durchaus in Zugkraft Mikroskopie und Beobachten Auswirkungen der ECM Steifigkeit auf das Verhalten der Zelle.

Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Wirkung der Steifigkeit der extrazellulären Matrix (ECM) auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen. Polyacrylamid-Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit, die mit Kollagen überlagert sind, werden in einer Multi-Well-Platte geschichtet, um die Steifigkeit der physiologischen EZM nachzuahmen. Nach dem Überlagern menschlicher Endothelzellen mit den Hydrogelen und der Infektion der Zellen mit Listeria monocytogenes-Bakterien, die so...

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Herstellung von Hydroxy-PAAm Hydrogele zur Entkopplung der Auswirkungen von Mechanotransduction Cues

Unser Labor hat DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogele, ein dynamisches System Hydrogel entwickelt, um die Effekte der Modulation Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktion zu verstehen. Hier bieten wir Schaltpläne, Beschreibungen und Protokolle, um diese Hydrogele vorzubereiten.

Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele

Hier wird eine Methode beschrieben, die eine schnelle, effiziente und kostengünstige Herstellung von Polyacrylamid-Gelen in einem Multiwell-Plattenformat ermöglicht. Die Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann von jedem Forschungslabor leicht übernommen werden. Es wäre besonders nützlich in der Forschung, die sich auf das Verständnis steifigkeitsabhängiger Zellreaktionen konzentriert.

Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

Wir haben eine Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zum Sondieren der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen entwickelt. Dieser Assay ist kompatibel mit Durchflusszytometrie, Immunostaining und Traktion Rasterkraftmikroskopie, zulassend quantitative Messungen der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien.

Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokolle werden hier beschrieben, um mechanische Signale in vitro mit multipotenten O9-1-Neuralleistenzellen und Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit zu untersuchen.

Ein optimiertes O9-1/Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in Neuralleistenzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine experimentelle Plattform zur Bewertung der Auswirkungen mechanischer und biochemischer Hinweise auf chemotherapeutische Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen in 3D-matrixmimetischen Kulturen unter Verwendung eines maßgeschneiderten UV-Beleuchtungsgeräts, das die Hochdurchsatz-Photovernetzung von Hydrogelen mit abstimmbaren mechanischen Eigenschaften ermöglicht.

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