Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele

Modellierung der In-vivo-Gewebecompliance mit Acrylamid-Hydrogelen. Dies wird erreicht, indem zunächst reaktive untere Deckgläser und silikonisierte obere Deckgläser erzeugt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Acrylamid-Hydrogele zu gießen und herzustellen.

Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Vernetzung des extrazellulären Matrixproteins der Wahl mit dem Hydrogel. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Inkubation und Analyse der Zellen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie eine unterschiedliche Compliance der extrazellulären Matrix in vitro das Zellverhalten durch Analysen mit Immunfluoreszenzmikroskopie, quantitativer Echtzeit-PCR und Western Blotting reguliert.

Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Acrylamid-Hydrogelen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Steifigkeit unserer extrazellulären Matrix zu untersuchen, die Zellmorphologie, die Zellsignalisierung und die Zellproliferation zu regulieren. Also lasst uns loslegen.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie reaktive Deckgläser generieren. Legen Sie zunächst eine Schicht Paraform auf die untere Hälfte einer 150 Millimeter großen Petrischale. Übertragen Sie dann bis zu neun 25-Millimeter-Eindeckgläser im Autoklaven auf die Parafolie und bedecken Sie diese mit einem Milliliter 0,1 molar Natriumhydroxid.

Inkubieren Sie die Deckgläser drei Minuten lang. Nach der Inkubation aspirieren Sie das Natriumhydroxid mit einer Vakuumleitung, die in einer chemischen Haubenpipette arbeitet, 0,5 Milliliter Trimethyl mit drei Aminoprofilen oder drei A-P-T-M-S auf jedem Deckglas. Inkubieren Sie die Deckgläser drei Minuten lang und aspirieren Sie dann die drei A-P-T-M-S. Achten Sie darauf, nicht zu lange zu inkubieren, um die Bildung von Schaum auf dem Deckel zu vermeiden.

Verrutscht nach der Behandlung. Spülen Sie die Deckgläser einmal mit 20 Millilitern entionisiertem Wasser in derselben Schüssel aus. Entfernen Sie die Deckgläser mit einer gebogenen Pinzette von der Schale und übertragen Sie sie mit der behandelten Seite nach oben auf eine neue 150-Millimeter-Schale.

Waschen Sie dann die Deckgläser erneut mit entionisiertem Wasser und legen Sie sie für 10 Minuten auf die Wippe. Nach der Inkubation das Wasser entfernen und weitere zwei Mal waschen. Es ist sehr wichtig, alle drei A-P-T-M-S zu entfernen, damit es nicht mit dem Glutaraldehyd reagiert und 10 Minuten vor der Verwendung des Glutaraldehyds einen trüben weißen Niederschlag hinterlässt.

Übertragen Sie die Deckgläser mit einer gebogenen Pinzette in eine saubere, mit Param überzogene Schale und saugen Sie die restliche Flüssigkeit mit einer Vakuumleitung ab. Decken Sie dann jeden Deckglas vollständig mit 0,5 Millilitern 0,5 % Glutaraldehyd in sterilem deionisiertem Wasser ab, um die drei A-P-T-M-S und das Polyacrylamidgel zu vernetzen. Inkubieren Sie die Deckgläser 30 Minuten lang in einer chemischen Haube. Saugen Sie dann die Glutaraldehyd-Spülung ab und waschen Sie die Einbezugsbezüge erneut mit entionisiertem Wasser.

Trocknen Sie dann die Deckgläser vollständig ab. Füllen Sie ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen, das eine 10%ige Oberflächenversiegelungslösung in Chloroform und Gestein enthält, mindestens 10 Minuten lang mit neuen Deckgläsern aus. Dekantieren Sie die Oberflächenversiegelungslösung und trocknen Sie sie an der Luft.

Die Abdeckung wird auf die Kim-Tücher in die biologische Sicherheitswerkbank geschoben, wo die Hydrogele für die Vorbereitung des Hydrogels vorbereitet werden. Übertragen Sie die Deckgläser mit einer gebogenen Pinzette mit der reaktiven Seite nach oben auf eine Folie aus Paraform, die auf die Oberfläche der biologischen Sicherheitswerkbank geklebt wurde. Achten Sie darauf, dass die Deckgläser flach auf der Paraform-Oberfläche liegen.

Bereiten Sie dann ein gesättigtes und Hydroxy-CIN-Hilfsmittel oder eine NHS-Lösung in Toluol vor, indem Sie eine kleine Menge NHS in genügend Toluol auflösen. Fügen Sie für die spezifischen Experimente kleine Mengen NHS hinzu, bis sich der NHS nicht mehr auflöst. Die gesättigte Lösung ist normalerweise trüb und rosa.

Bereiten Sie als Nächstes das Acrylamid-BIS, das Acrylamidwasser und ein PS vor, um den gewünschten Acrylamidanteil zu erreichen. Geben Sie die Reagenzien in die Mikroverwendungsröhrchen, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Dann ein Aliquot nach dem anderen.

Fügen Sie den NHS und TM me hinzu. Tube kurz und sofort einreiben: Gießen Sie zwischen drei und fünf Gele mit 140 Mikrolitern pro Deckglas in die biologischen Sicherheitswerkbänke. Legen Sie den silikonisierten 25-Millimeter-Deckslip schnell auf jedes Gel, bevor es zu polymerisieren beginnt.

Durch Hinzufügen des oberen Deckglases kann das Acrylamid den unteren Deckglas vollständig abdecken. Inkubieren Sie dieses Sandwich bei Raumtemperatur, bis das Acrylamid polymerisiert, um festzustellen, wann die Polymerisation stattgefunden hat. Überprüfen Sie die restliche Acrylamidlösung im Mikrozentrifugenröhrchen.

Die Polymerisation dauert bei steifen Gelen einige Minuten und bei weichen Gelen etwas länger. Sobald die Polymerisation stattgefunden hat, nehmen Sie das Sandwich vorsichtig mit sterilen Handschuhen auf. Schieben Sie dann den oberen Abdeckschirm ab, bis er über das polymerisierte Gel hinausragt.

Hebeln Sie dann die Abdeckung auf. Schieben Sie das Gel ab und entsorgen Sie den oberen Abdeckschubs. Legen Sie jeden unteren Gel-Abdeckschirm, der im Folgenden als Hydrogel bezeichnet wird, in eine Sechs-Well-Platte.

Fügen Sie als Nächstes zwei Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS pro Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen hinzu. Waschen Sie dann die Hydrogele mit PBS und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf einer Wippe. Wiederholen Sie diese Wäsche zweimal.

Um das Experiment zu beginnen, bedecken Sie jedes Hydrogel mit zwei Millilitern einer Fibronektinlösung oder einem anderen extrazellulären Matrixprotein. Inkubieren Sie das Protein über Nacht bei vier Grad Celsius auf dem Hydrogel, damit es nach der Inkubation über Nacht kovalent an das Hydrogel binden kann, und aspirieren Sie die ECM-Lösung. Blockieren Sie dann den nicht reaktiven NHS mit einem Milligramm pro Milliliter erhitzendem aktiviertem fettsäurefreiem Rinderserumalbumin in serumfreien Medien und inkubieren Sie mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Waschen Sie die Hydrogele nach der Inkubation einmal mit sterilem PBS. Anschließend werden die Zellen in das geeignete Kulturmedium mit fötalem Rinderserum eingegossen. Hier auf das Hydrogel.

Zur Etablierung werden embryonale Fibroblasten der Maus verwendet. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, die auf dem Hydrogel ausgesät werden sollen, basierend auf dem Grad der Zellausbreitung und der Konfluenz, die für das Experiment erforderlich sind. Ungefähr 10 auf die fünf Zellen, die für die Western-Blot- und quantitative PCR-Analyse erforderlich sind.

Inkubieren Sie die Zellen dann unter den für den jeweiligen Zelltyp geeigneten Bedingungen. Nach der Inkubationszeit. Extrahieren Sie das Zellprotein oder die mRNA je nach Bedarf.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter Tröpfchen Lysepuffer auf eine Paraform-Folie auf dem Labortisch und lassen Sie zwischen den einzelnen Tröpfchen etwa zwei bis drei Zentimeter. Entfernen Sie anschließend vorsichtig jedes Hydrogel, indem Sie den unteren Abdeckzettel aus der Vertiefung heben. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette und legen Sie die Zellseite nach unten auf die Tröpfchen.

Inkubieren Sie die Zellen genau eine Minute lang mit dem Lysepuffer. Entfernen Sie abschließend die Deckgläser und geben Sie den Lysepuffer in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Alternativ können Sie bei der Extraktion von RNA jedes Hydrogel auf eine neue Platte mit sechs Vertiefungen übertragen und einen Milliliter Triazol pro Vertiefung hinzufügen.

Inkubieren Sie die Gele nach der Inkubation drei Minuten lang. Entfernen Sie die Triazollösung zur Aufbewahrung in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Das gründliche Waschen der Deckgläser nach Zugabe von A-P-T-M-S ist ein wichtiger Schritt bei der Herstellung von reaktiven Deckgläsern.

Ordnungsgemäß gewaschene und trockene Deckgläser sind frei von Niederschlagsrückständen. A-P-T-M-S reagiert mit dem Glutaraldehyd und erzeugt einen weißen, trüben Niederschlag. Wenn der Niederschlag fällt, muss der gesamte Vorgang wiederholt werden, da der Deckglas nicht mehr verwendbar ist.

Nach der Hydrogelbildung und der Beschichtung mit EZM-Proteinen werden die Zellen über Nacht ausgesät. Es gibt einen deutlichen Unterschied zwischen Zellen, die sich auf steifen und weichen Hydrogelen ausbreiten, wie man am Foid beim Färben sehen kann, und embryonalen Fibroblastenzellen der Maus, die sich im Vergleich zu weichen Hydrogelen stärker auf steifen Zellen ausbreiten. In der Tat bleiben die meisten Zellen, die an ein weiches Hydrogel binden, kompakt und binden sich weniger effizient an.

Repräsentative quantitative PCR-Ergebnisse der Cycling D one mRNA-Spiegel in embryonalen Fibroblasten der Maus zeigen, dass das Cycling D one auf einer steifen Matrix, aber nicht auf einer weichen Matrix signifikant hochreguliert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Steifigkeit der Matrix die Zellzyklusprogression in vitro reguliert. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Steifigkeit des Hydrogels erzeugen und physiologische Bedingungen in vivo modellieren können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, zusätzliche reaktive Deckgläser zu erstellen, da Unfälle und Fehler auftreten können.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.