Name: Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen in Multiwell-Plattenformat für Zellbiologie. Diese kostengünstige Technik ermöglicht die Untersuchung steifigkeitsabhängiger Zellantworten ohne spezialisierte Ausrüstung.

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Diese Arbeit wurde durch Startkapital finanziert, das Dr. Silviya Zustiak von der Saint Louis University zur Verfügung gestellt wurde, sowie durch ein Stipendium des President's Research Fund (PRF), das Dr. Silviya Zustiak von der Saint Louis University gewährt wurde. Wir danken Naveed Ahmed und Keval Shah für ihre technische Unterstützung.

1. Herstellung der Hydrogel-assoziierten Solutions und Aliquots <ol><li> Herstellung Polyacrylamidgel Precursorlösung. <ol><li> Bereiten Polyacrylamidgel Vorläuferlösung durch Mischen Acrylamid (A) (40% w / v, M r 71.08 g / mol), das Vernetzungs Bisacrylamid (B) (2% w / v, M r 154.17 g / mol), und Ent- entionisiertes Wasser in den in Tabelle 1 angegebenen Volumenanteile. ANMERKUNG: Diese Lösungen können in großen Serien hergestellt und bei 4 ° C für bis zu mehreren Monaten gelagert werden. <ol><li> ACHTUNG: Acrylamid ist giftig beim Einatmen oder Verschlucken, vor allem, wenn in Pulverform: So verwenden bevorzugt 40% w / v-Lösung, um die Toxizität Risiken zu reduzieren. Handle nur beim Tragen von Schutzkleidung, wie Handschuhe, Schutzbrille und Laborkittel. Speichern Sie in einem leicht-widerstandsfähigen, dicht geschlossenen Behälter im Kühlschrank (&lt;23 ° C, gut belüfteten Bereich). </li><li> ACHTUNG: Bis-Acrylamid ist giftig beim Einatmen oder Verschlucken, vor allem,wenn in Pulverform: So verwenden vorzugsweise 2% w / v-Lösung, um die Toxizität Risiken zu reduzieren. Handle nur beim Tragen von Schutzkleidung, wie Handschuhe, Schutzbrille und Laborkittel. Speichern Sie in einem leicht-widerstandsfähigen, dicht geschlossenen Behälter im Kühlschrank (&lt;4 ° C, gut belüfteten Bereich). </li></ol></li></ol></li><li> Herstellung und Verwendung von N -Sulfosuccinimidyl-6- (4&#39;-azido-2&#39;-nitrophenylamino) hexanoat (Sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) Aliquots. ACHTUNG: Sulfo-SANPAH verursacht schwere Augenreizung; Handgriff mit Handschuhen und Augenschutz oder Gesichtsschutz. Lagerung bei -20 ° C nach Erhalt und vor der Aliquotierung. <ol><li> Um sulfo-SANPAH speichern: auflösen Sulfo-SANPAH in dimethylsulfoxane (DMSO) bei 50 mg / ml. Aliquot der Stammlösung in 50 Mikrozentrifugenröhrchen von 20 ul pro Röhrchen. Flash-Freeze auf Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff (optional aber bevorzugter Schritt, um eine maximale Effizienz zu bewahren Vernetzer) und bei -80 ° C. HINWEIS: Die Aliquots can für mehrere Monate gelagert werden. </li><li> Um Sulfo-SANPAH verwenden: Auftauen des Aliquots kurz und in 480 ul entionisiertem Wasser verdünnen. Verwenden Sie sofort. Sulfo-SANPAH hydrolysiert schnell in Wasser: daher ist Vorsicht geboten, um alle der oben genannten Schritte schnell durchzuführen. </li></ol></li><li> Herstellung von Ammoniumpersulfat (M r 228.18 g / mol) Aliquots. HINWEIS: Ammoniumpersulfat verursacht Augen, Haut und Atemwege reizen. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung beim Umgang. Griff Ammoniumpersulfat Pulver in einem Chemieabzug benutzen. Shop Pulver an einem trockenen, gut belüfteten Ort aufbewahren. Sobald aliquotiert könnte der verdünnten Lösung auf dem Arbeitstisch eingesetzt werden. <ol><li> Löse Ammoniumpersulfat in entionisiertem Wasser auf eine endgültige Ammoniumpersulfat-Konzentration von 10% w / v zu erreichen. Aliquotieren und bei -20 ° C. Auftauen unmittelbar vor der Verwendung. </li></ol></li><li> Erstellung von Kollagen Typ I-Lösung. <ol><li> Bereiten 0,2 mg / ml Kollagenlösung durch das Lager Verdünnung sosung in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) von pH 7,4. Lagerung auf Eis kurz oder verwenden Sie sofort nach Verdünnung. </li></ol></li></ol> 2. Hydrogel Vorbereitung (Siehe Abbildung 1) <ol><li> Vorbereitung der hydrophoben Glasobjektträger. <ol><li> Legen Sie ein paar Tropfen einer hydrophoben Lösung auf einer Glasplatte und mit Seidenpapier über die Oberfläche verteilt. Luft trocknen lassen und mit einem Seidenpapier abzuwischen wieder zum Ausgleich der hydrophoben Beschichtung. HINWEIS: Shop hydrophoben Lösung in einem brennbaren Schrank bei RT. Persönliche Schutzausrüstung Bei der Handhabung. Arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich. </li></ol></li><li> Herstellung von flexiblen Kunststoffträger. <ol><li> Schneiden Sie das flexible Kunststoffträger, um die Größe der hydrophoben-beschichtete Glasplatte entsprechen. </li><li> Markieren Sie die hydrophobe Seite der flexiblen Kunststoffträger durch leichtes Kratzer auf der Oberfläche mit einem scharfen Werkzeug, wie ein Skalpell. HINWEIS: Sobald das Gel - die vollständig transparent ist - trocknetDie Kratzspuren hilft unterscheiden, welche flexible Kunststoffträgerseite des Gels enthält. HINWEIS: Der flexible Kunststoffträger eine hydrophobe und eine hydrophile Seite. Einmal aufgebracht, Polyacrylamid haftet dauerhaft auf die hydrophile Seite der Kunststoffträger, der einfach nachfolgenden Hydrogel Handhabung erleichtert. </li></ol></li><li> Gel-Vorbereitung (zB Volumen werden 5 ml Gel-Vorstufe Lösungen angegeben). HINWEIS: 5 ml ausreichen würde, um 40 Gelen ~ wenn das Gel Anfangsdicke beträgt 0,5 mm. Weitere Gele können hergestellt werden, wenn das Gel Dicke reduziert. <ol><li> Platzieren 4972,5 ul Polyacrylamid Precursorlösung gewünschten Endkonzentration (Tabelle 1) in einer 50 ml konischen Röhrchen. In eine Entgasungskammer 30 min mit der Kappe geöffnet wird. HINWEIS: Sauerstoff wirkt als Falle für freie Radikale und, falls vorhanden, es hemmt Polymerisation. </li><li> In 25 ul von 10% w / v Ammoniumpersulfat (siehe Punkt 1.3) eine endgültige zu erreichenAmmoniumpersulfat-Konzentration von 0,05%. </li><li> Hinzufügen 2,5 ul N, N, N &#39;, N&#39;-Tetramethylethylendiamin (TEMED, M r 116.24 g / mol), um die entgaste Gellösung, um eine endgültige TEMED-Konzentration von 0,5% zu erzielen. HINWEIS: Shop TEMED in einer entflammbaren Schrank bei RT. Griff in einem Laborabzug, wenn das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. Dicht unter Schutzgas geschlossen, wie es ist sehr luft- und feuchtigkeitsempfindlich. </li><li> Mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Auf-und Abpipettieren 3-5 mal. Vortexen keine Sauerstoffdiffusion in das Gel Vorläuferlösung zu vermeiden. </li><li> Pipettieren Gel-Lösung auf die hydrophile Seite der flexiblen Kunststoffträger und Sandwich mit hydrophob beschichteten Objektträger. Man trennt die beiden Schieber mit Silikonabstandshalter mit der gewünschten Dicke (zum Beispiel 0,5 mm). Hinterlassen eine kleine Menge (~ 100 &amp; mgr; l) aus Polymervorläufer-Lösung im 50 ml konischen Röhrchen als ein Indikator für die Gelierung verwendet werden. HINWEIS:Jede Abstands könnten verwendet werden. Beispielsweise kann ein einzelner Streifen von Parafilm zu einer endlichen gequollenen Gels Dicke von 100 bis 120 &amp; mgr; m. </li><li> Legen Sie eine andere Glasplatte oben auf dem flexiblen Kunststoffträger / Gel-Sandwich, eine noch Hydrogeloberfläche bei der Polymerisation zu ermitteln. </li><li> Lassen Sie das Gel polymerisieren 45 min, wenn auch weniger Zeit für Gele höherer% Gew falls gewünscht, verwendet werden. Um sicherzustellen, daß das Gel polymerisiert, beobachten die verbleibende Lösung im 50 ml konischen Röhrchen; wenn die verbleibende Lösung geliert, dann ist es wahrscheinlich, dass die Gelbildung auf der Glasplatte wurde ebenfalls eingeleitet. Beachten Sie jedoch, dass eine vorzeitige Öffnen der Form wird eine vollständige Polymerisation zu verhindern. </li><li> Sobald das Gel gebildet wird, ziehen Sie die flexible Kunststoffträger mit dem kovalent gebundenen Polyacrylamidgel auf, und stellen Sie Gel-Seite nach oben an der Luft trocknen. HINWEIS: Konvektion oder Wärmetrocknung kann auch verwendet werden, um diesen Schritt zu beschleunigen. Einmal auf das flexible Kunststoffträger getrocknet, kann das Gel Speicher seinauf unbestimmte Zeit d. <ol><li> Markieren Sie keine blanken Stellen der flexiblen Kunststoffträger, in Polyacrylamidgelen nicht aufgrund von Blasen zu bilden. Mark, während das Gel noch mit Feuchtigkeit, da dies harmonisch in die flexible Kunststoffträger, sobald das Gel trocken ist. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Multiwellplatte Montage, Collagen-Beschichtung und Sterilisation <ol><li> Multiwell-Platte Montage. <ol><li> Einmal getrocknet, geschnitten PA-Gele in die gewünschte Form. <ol><li> Für eine 96-Well-Platte, mit einem schweren Locher mit einem Durchmesser von ca. 6 mm. Verwenden Sie einen schweren Papierschneider zu Gelen in quadratische oder rechteckige Form. Alternativ können Sie auch eine Schere. </li></ol></li><li> Bereiten etwa 500 ul PDMS pro 96-Well-Platte nach den Angaben des Herstellers. Um die Gele zum Boden einer Multiwell-Platte zu kleben, legen ein kleines Tröpfchen (~ 5 &amp; mgr; l) aus Polydimethylsiloxan (PDMS) in der Mitte der jeweils gut. Mit einer Pinzette, legen Sie eine Polyacrylamide-Gel in jede Vertiefung, flexible Kunststoffträger nach unten. Damit PDMS zu heilen, lassen Sie die montierten Platte bei 37 ° C für mindestens 4 Stunden. </li></ol></li><li> Kollagenbeschichtung von Polyacrylamidgelen. <ol><li> Mit einer Transferpipette, legen Sie eine kleine Menge (7-8 ul) sulfo- SANPAH (siehe Punkt 1.2.2) von der Seite gut und Wirbel in jeweils zur Beschichtung der Gel-Oberfläche gleichmäßig und her. Arbeiten schnell, da Sulfo-SANPAH in Wasser nicht stabil sind. </li><li> Legen Sie die Well-Platte unter einer hohen Intensität UV-Lampe (Intensität = 37 mW, λ = 302 bis 365 nm) für 5 min. Spülen Sie die Gele mit PBS, um überschüssige sulfo-SANPAH entfernen. </li><li> Je 50 ul 0,2 mg / ml Kollagen Typ I-Lösung (siehe Punkt 1.4) in jede Vertiefung. Lassen Sie das bei RT, abgedeckt für mindestens 2 h oder O / N bei 4 ° C Platte. HINWEIS: Um den Prozess der Kollagenbeschichtung kann eine Transferpipette verwendet werden, um die Kollagenlösung hinzuzufügen. In der Regel 1 - 2 sollte Tröpfchen Lösung genug, um zu vollendenly decken die Gel-Oberfläche. </li><li> Verlassen Sie die Well-Platte bei Raumtemperatur für mindestens 2 h, Kollagen Bindung ermöglichen. </li><li> Spülen mit PBS, um überschüssige Kollagenlösung in einem Gewebekulturabzug für 2 h zu entfernen und zu sterilisieren, unter UV (λ = 200 nm). </li><li> Weichen Sie die Gele in Vollmedium (siehe Abschnitt 4.1 für den Mittelzusammensetzung) O / N zu Hydrat und ins Gleichgewicht kommen. Verwenden Sie für die Zell Aussaat sofort oder lagern im Kühlschrank bis zu 2 Tage. </li></ol></li></ol> 4. Zellaussaat auf PA Steifigkeit Assay HINWEIS: Obwohl typisch für gemeinsame Säugerzelllinien, das Protokoll in diesem Abschnitt beschrieben ist speziell mit dem Brustkrebs MDA-MB-231 Zelllinie verwendet (siehe 4 und 5). <ol><li> Sammeln Zellen aus Gewebekulturkolben durch Behandlung mit 5% Trypsin / EDTA für 5 min bei 37 ° C. Verwenden ~ 80 ul Trypsin / EDTA pro jeder cm2 Kulturflasche Bereich; zum Beispiel verwenden 2 ml Trypsin / EDTA-fora T25 Zellkulturflasche. Resuspendieren gesammelten Zellen in komplettem Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt war, bei einer gewünschten Endkonzentration an Zellen. Unter Berücksichtigung der Zellverdopplungszeit sowie der Länge der Zeit die Zellen auf den Assay ausgesät werden, wählen einen geeigneten subkonfluenten Zellkonzentration. Stellen Sie sicher, dass hinzugefügt Medium ist genug, um die Hydrogele vollständig bedeckt. HINWEIS: Da die Hydrogele wurden in Medien voräquilibriert (siehe 3.2.6 Schritt) 100 ul Volumen ist ausreichend. Typische mittlere Volumen für Multiwell-Platten verwendet wird, sollte ausreichend sein, da die Gele wurden in Medien, voräquilibriert in dem vorherigen Schritt. Hinweis: Der Test wäre für jede Anlage abhängigen Zelltyp geeignet. <ol><li> Zählen der Zellzahl unter einem Umkehrmikroskop unter Verwendung eines Hämacytometers. Last 10 ul Zellsuspension in jede Hämazytometer Port und mittelt die Zellenzahl von mindestens 8 Quadranten. Um das zu bekommenEndzellkonzentration, multiplizieren Sie die Zellzahl um 10 4. HINWEIS: Best Zellzahl Ergebnisse werden erhalten, wenn die Zellzahl in jeder Hämazytometer Quadranten 20-50. </li></ol></li><li> Kultur die Zellen auf der PA Steifigkeit Assay in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Ändern Medien alle 2 - 3 Tage. Sammeln Zellen, wenn es durch Behandlung mit 5% Trypsin / EDTA für 5 min benötigt bei 37ºC. Verwenden ~ 80 ul Trypsin / EDTA pro cm 2 Zellkulturflasche. In allen Zellmanipulationsschritte, besonders darauf achten, um das Hydrogel Oberfläche stören: absaugen oder Pipettenmedium leicht Kippen der Multiwellplatte seitlich und Berühren der Pipettenspitze auf die Seitenwand jeder Vertiefung, im Gegensatz zum Berühren des Hydrogels. HINWEIS: Außer für die besondere Sorgfalt, nicht um das Hydrogel Oberfläche während des Standard-Gewebekultur Handhabung Schäden verursachen, ausgesät die Zellen auf die Steifigkeit Test kann auf die gleiche Weise manipuliert, als ob sie auf ausgesät wurden werdenzu einem regulären Multiwellplatte. </li></ol> 5. Imaging von Zellen auf PA Steifigkeit Assay Gesetzte <ol><li> Bildzellen direkt an der PA Steifigkeit Assay. HINWEIS: Jedes Mikroskop - invertiert, fluoreszierenden oder konfokalen kann für Cell Imaging verwendet werden. HINWEIS: Das flexible Kunststoffträger verwendet werden, um die Steifigkeit Assay zu konstruieren ist völlig transparent und nicht Autofluoreszenz oder stören Cell Imaging. Jedoch, obwohl der flexible Kunststoffträger selbst ist transparent, Abbildungsfunktionen werden von der Arbeitsabstand der Objektiv begrenzt. Das flexible Kunststoffträger hat eine Dicke von 0,23 mm und einem typischen Arbeitsabstand von einem 10X-Objektiv ist ca. 4 mm, stark abnehm höheren Vergrößerungen. <ol><li> Für Live Cell Imaging, Position PA Steifigkeit Assay in Mikroskopplattenhalter und Bild. Halten Sie Imaging-Sitzungen unter 2 Stunden, oder verwenden Sie ein Mikroskop mit einer Klimakammer für längere Aufnahmezeiten ausgestattet. </li><li> Bei lebenden Zellen imAltern ist nicht das Ziel, zu beheben Zellen in 4% Formaldehyd-Lösung mit 0,1% Reinigungsmittel ergänzt. Tränken Zellen Fixiermittel bei RT für mindestens 2 Stunden. Spülen Sie zweimal mit PBS. Entsorgen Fixiermittel Abfälle in einem bestimmten Abfallbehälter. HINWEIS: Die Zellen können unmittelbar abzubildenden oder gelagert in PBS für bis zu 2 Wochen unter Wasser bei 4 ° C. ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig beim Einatmen und Berührung. Mit Handschuhen in einem Chemieabzug benutzen. HINWEIS: Zellfixierung Protokoll muss auf der Grundlage der nachfolgenden Zellfärbung und Handhabung Protokolle gewählt werden, weil bestimmte Fixative beschädigen einige Zellproteine. </li><li> Für Fluoreszenz-Imaging, Fest Fleck Zellen mit gewünschten Zell Fleck direkt in der Multiwellplatte. Sofort Bild. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Polyacrylamid-Gele, die ursprünglich für die Elektrophorese entwickelten, 28 werden nun routinemßig als Zellkultursubstrate verwendet werden, um die Auswirkungen von Substrat Steifigkeit auf die Zellmorphologie, Motilität und Kommunikations 3,24,29 unter anderem Zelleigenschaften zu untersuchen. Polyacrylamid ermöglicht die Bearbeitung der Substratsteifigkeit um die Steifigkeit aller Weichteile im Körper umfassen (0,3 bis 300 kPa) 1 mit einer einfachen Änderung der Polymervorstufe Konzen...

Die meisten Gewebe im Körper weich sind viskoelastische Materialien mit einem Young-Modul im Bereich von 0,1 kPa für Gehirn bis 100 kPa für weiche Knorpel, doch sind die meisten in vitro Zellforschung auf Gewebekulturpolystyrol (TCP) durchgeführt, die einen Modul von ~ 1 GPa hat . 1 Diese Steifigkeit Mismatch großen Einfluss auf die Art und Weise Zellen reagieren auf ihre Umwelt. Eine wachsende Zahl von Untersuchungen ist somit gewidmet Erläuterung der Wirkung des Substrats Steifigkeit auf das Schicksal verschiedener Zelltypen, 2,3 einschließlich Stammzellen. 4 Als Ergebnis wurden mehrere Hydrogele entwickelt worden, um das Verständnis der steifigkeitsabhängigen Zell helfen Biologie einschließlich Polyacrylamid (PA), 5-7 Polyethylenglykol (PEG) 8,9 Polydimethylsiloxan (PDMS), 10 und Alginat. 11 Während der Beweis, dass das Substrat Steifigkeit hat einen wesentlichen Einfluss auf das Schicksal der Zelle wächst, die meisten Untersuchungen auf geführt in kleinem Maßstab mit einer kleinen Anzahl von sBeispiele. Systematische, mehrdimensionalen Studien über die Wirkung der Substrat Steifigkeit für eine Reihe von Zelltypen oder Umweltbedingungen selten. 12 Einige vielversprechende Hochdurch Hydrogel Technologien wurden entwickelt, einschließlich PEG-Microarrays, 13 mikrofluidischen Vorrichtungen zur Herstellung von Agarose Hydrogelmikroperlen, 14 oder Mikro- und Nanostäbe denen Steifigkeit wird durch den Durchmesser und die Höhe der Mikrostäbchen moduliert. 15. Jedoch , die Technologien zur Herstellung solcher Substrate sind anspruchsvoll und für eine begrenzte Anzahl von Laboratorien. Viel Forschung an Steifigkeit moduliert Zell-Reaktionen nutzt Polyacrylamid (PA) Gele, die nicht nur preiswert und einfach zu implementieren, aber auch zeigen einen physiologisch relevanten Bereich des E-Moduls, nämlich 0,3 liegen. - 300 kPa 16 bis 22 jedoch bestehende Methoden zu PA herzustellen Gele für die Zellkultur sind arbeitsintensiv und damit prepin kleinen Chargen ared. Einige der Schwierigkeiten, die mit der Herstellung von PA-Gelen als Zellsubstrate zugeordnet ergeben sich aus der Forderung, daß die Gele hergestellt werden müssen: 1) in Abwesenheit von Sauerstoff, um eine vollständige Polymerisation zu ermöglichen, 2) mit einer flachen und glatten Oberfläche, um eine einheitliche Zell ermöglichen Befestigung und Ausbreitung, und 3) fest auf dem Boden der Zellkulturschale Aufschwimmen verhindern befestigt. Mehrere Gruppen haben versucht, PA-Gele für die Zellkultur in großen Stückzahlen zu produzieren. Semler et al. Vorbereiteten dicken Folien aus PA-Gelen, die dann einen &quot;Schnitt&quot; waren mit einem Locher und in 96-Well-Platten gegeben. 23. Dieses Verfahren ist jedoch begrenzt auf steifer Gele, dh&gt; 1 kPa im Elastizitätsmodul, da weichere Gele sind &quot;sticky&quot;, schwierig zu schneiden und leicht beschädigt. Mih et al. Entwickelten eine ausgefeiltere Technik, die Gele direkt in einem Glasbodenmultiwellplatte polymerisiert werden können. <sbis&gt; 6 Dies erfolgte, indem die Gel-Lösungen in funktionalisierte Glasbodenplatten und Bildung von Gelen von &quot;sandwichartig&quot; sie mit einem benutzerdefinierten Deckglas Array erreicht. 6 Obwohl vielversprechend, leichte Randeffekte waren noch mit dieser Technik beobachtet. Zusätzlich wird die Technik erfordert eine maßgeschneiderte Array nicht unmittelbar zugänglich vielen Labors als auch kostspielige Glasbodenmultiwellplatten. Dieser Aufsatz beschreibt eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, PA-Gelen in einer Multiwellplatte, die leicht von jedem Labor angenommen werden könnte zubauen. Hierbei wird eine flexible Kunststoffunterlage verwendet wird, welches zwei Seiten hat - ein hydrophobes, die abweisend zu PA-Gelen, und einem hydrophilen eine, an das kovalent das PA-Gel bei der Abscheidung. Sobald PA Gelfolien abgeschieden und dauerhaft mit dem flexiblen Kunststoffträger befestigt sind, ermöglicht es der Handhabung Gele beliebiger Dicke oder Steifigkeit und schneidet sie in jede gewünschte Form. Diese ca.oach erzeugt nicht nur individuelle Kunststoff &#39;Deck&#39; in Größen im Handel nicht erhältlich, sondern auch beseitigt die Notwendigkeit, Glasoberflächen-treat vorab entweder Glasplättchen oder die Vertiefungen der teuren Glasboden-Mikrotiterplatten mit einer PA-Bindungslösung, welche ist eine mühsame und zeitraubenden Schritt. Schließlich kann eine gleichmäßige PA Gele Blätter in großen Stückzahlen hergestellt und gelagert de-hydrierten mehrere Monate werden. Zusammenfassend ist der Assay hier vorgestellt ist eine Verbesserung gegenüber bestehenden Verfahren in mehrfacher Hinsicht. Erstens ist der Prozeß der Vielmuldenplatten-Anordnung effizient, und die Gesamtkosten der benötigten Materialien ist gering. Zweitens werden die Hydrogele in großen Chargen in einem einzigen homogenen Gelfilm hergestellt. Schließlich werden nur Materialien, die im Handel erhältlich sind erforderlich. Die Nützlichkeit des Assays wird durch die Erforschung der Wirkung des Substrats Steifigkeit auf die Zellmorphologie und die Ausbreitungsfläche dargestellt.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenzien</td></tr><tr><td>40% Acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis-acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Bio-Rad</td><td>161-07000</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ 1, aus Rattenschwanz, 3,68 mg/ml</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobe Lösung &#8212; Repell Silane</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7,4</td><td>HyClone</td><td>SH30256,01</td><td></td></tr><tr><td>Polydimehylsiloxan (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Tyrpsin/EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44174</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Reinigungsmittel: Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37% Lösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>BSA-basiertes Kit zur Blockierung der Zelladhäsion &#8212; ECM-Zelladhäsions-Array-Kit</td><td>Chemicon International</td><td>ECM540<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Einweg-Laborausrüstung</stark></td></tr><tr><td>flexibler Kunststoffträger &#8212; GelBond PAG-Folie für Polyacrylamid-Gele</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>309819</td><td></td></tr><tr><td>Glasplatten</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>konische Röhrchen 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>3181345107</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konische Röhrchen</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 ml: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte (flacher Boden)</td><td>Fisher</td><td>Scientific 12565501</td><td></td></tr><tr><td>Einwegpipetten (1&nbsp; ml, 2&nbsp; ml, 5&nbsp; ml, 10&nbsp; ml, 25&nbsp; ml, 50&nbsp; ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 ml: 13-678-11B, 2&nbsp; ml: 05214038, 5&nbsp; ml (FALKE): 357529, 10&nbsp; ml: 13-678-11E, 25&nbsp; ML: 13-678-11, 50&nbsp; ml: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten aus Glas</td><td>Fisher Scientific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (1-200&nbsp; &#956; l, 101-1000&nbsp; &#956; l)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Einweg-Transferpipetten</td><td>aus Kunststoff Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Puderfreie Untersuchungshandschuhe</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Abstandshalter &#8212; Silikonfolie, 0,5 mm dick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0,5</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Großes/Einweg-Laborgerät</td></tr>Licht<tr><td>- und Leuchtstoffmikroskop (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Software</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>UV-Ofen</td><td>UVITRON</td><td>UV1080</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumkammer/Entgaser</td><td>BelArt</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe für Entgaser</td><td>KNF Lab</td><td>5097482</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturhaube</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Chemische Abzugshaube</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhilfe</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr></tbody></table>

einfache polyacrylamid-basierten multiwell steifigkeit assay für das studium der steifigkeit abhängige zell-antworten

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Derzeit wird der größte Teil der In-vitro-Zellforschung an starrem Gewebekultur-Polystyrol (~1 GPa) durchgeführt, während die meisten Zellen im Körper an eine Matrix gebunden sind, die elastisch und viel weicher ist (0,1 – 100 kPa). Da eine solche Steifigkeitsmismatch die Zellreaktionen stark beeinflusst, besteht ein starkes Interesse an der Entwicklung von Hydrogelmaterialien, die einen breiten Steifigkeitsbereich abdecken und als Zellsubstrate dienen. Polyacrylamid-Gele, die kostengünstig sind und den Steifigkeitsbereich aller Weichteile im Körper abdecken, sind für viele Forschungsgruppen das Hydrogel der Wahl. Die Herstellung des Polyacrylamid-Gels ist jedoch langwierig, langwierig und nur für kleine Chargen geeignet. Hier beschreiben wir einen Assay, der durch die Verwendung einer permanenten flexiblen Kunststofffolie als struktureller Träger für die Gele die Herstellung von Polyacrylamid-Gelen in einem Multiwell-Plattenformat ermöglicht. Die Technik ist schneller, effizienter und kostengünstiger als herkömmliche Methoden und ermöglicht die Herstellung von Gelen in kundenspezifischen Größen, die sonst nicht erhältlich sind. Da keine spezielle Ausrüstung erforderlich ist, könnte die Methode leicht von jedem Forschungslabor übernommen werden und wäre besonders nützlich in der Forschung, die sich auf das Verständnis von steifigkeitsabhängigen Zellreaktionen konzentriert.

Polyacrylamid (PA) Hydrogele werden allgemein verwendet, um die Steifigkeit abhängige Zell-Reaktionen zu testen. 17,24 durch Mischen verschiedener Konzentrationen von Acrylamid (A) und bis-acrylamid (B) kann man PA-Gelen, welche die Steifigkeit Bereich der meisten Weichgewebe in umspannen machen der Körper - 0,3 -. 300 1 ist jedoch Herstellung Polyacrylamidgelen mühsam und zeitaufwendig, häufig ihre Nützlichkeit in &quot;Hochdurchsatz&quot; Anwendungen, wie zum Beispiel Arzneimittel-Screening Begre...

Hier wird eine Methode beschrieben, die eine schnelle, effiziente und kostengünstige Herstellung von Polyacrylamid-Gelen in einem Multiwell-Plattenformat ermöglicht. Die Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann von jedem Forschungslabor leicht übernommen werden. Es wäre besonders nützlich in der Forschung, die sich auf das Verständnis steifigkeitsabhängiger Zellreaktionen konzentriert.

Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine schnelle, effiziente und kostengünstige Herstellung von Polyacrylamidgelen im Mehrmuldenplattenformat zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gelvorläuferlösung zwischen einer hydrophob beschichteten Glasplatte und einem acrylamidadhäsiven, flexiblen Kunststoffträger eingeschlossen wird. Im zweiten Schritt wird das Gel von der Glasplatte abgezogen, nachdem es nach der Polymerisation kovalent an den flexiblen Kunststoffträger gebunden ist, und anschließend getrocknet. Anschließend werden das trockene Gel und der darunterliegende flexible Kunststoffträger in gewünschte Formen geschnitten und mit der Kunststoffseite nach unten an den Boden der Vertiefungen einer Mehrlochplatte oder eines anderen Zellkulturbehälters geklebt. Der letzte Schritt besteht darin, die in der Mehrlochplatte montierten Polyacrylamid-Gels mit einer zelladhäsiven Beschichtung zu überziehen, beispielsweise einer Monolage aus Kollagen Typ I. Abschließend werden Mikroskopie sowie andere Methoden der Zellcharakterisierung eingesetzt, um den Einfluss des zugrundeliegenden Polyacrylamid-Substrats zu untersuchen.Insbesondere deren Steifigkeit auf Zellverhalten. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie die Handhabung von beliebiger Steifigkeit und Dicke von Polygelen sowie deren Montage in einem Mehrlochplattenformat auf kostengünstige und zeiteffiziente Weise ermöglicht, was von anderen Methoden nicht geboten wird. Die Demonstration des Verfahrens wird von einem Studenten in meinem Labor durchgeführt.Zunächst bereiten Sie die Vorläuferlösung für das Polyacrylamidgel vor, indem Sie Acrylamid, den Vernetzer Bisacrylamid und deionisiertes Wasser mischen, und lösen Sie Sul OPA in Dimethylsulfoxid bei 50 Milligramm pro Milliliter. Portionieren Sie 20 Mikroliter der Stammlösung in 10 Mikrozentrifugenröhrchen. Anschließend gefrieren Sie die Lösungen kurz in flüssigem Stickstoff ein und lagern sie bei minus 80 Grad Celsius.Lösen Sie anschließend Ammoniumpersulfat in entionisiertem Wasser, um eine endgültige Ammoniumpersulfat-Konzentration von 10 % Gewicht pro Volumen zu erreichen. Aliquotieren Sie 25 Mikroliter der Ammoniumpersulfat-Lösung auf 10 Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie diese bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Kollagenlösung mit einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter vor, indem Sie die Kollagen-Typ-I-Stammlösung in 1× PBS bei pH 7,4 verdünnen.Alle Lösungen werden bis zur Verwendung auf Eis gehalten. Geben Sie an dieser Stelle einige Tropfen einer hydrophoben Lösung auf eine Glasplatte und verteilen Sie diese mithilfe von Papiertuch gleichmäßig auf der Oberfläche. Nach dem Trocknen an der Luft wischen Sie die Platte erneut mit Papiertuch ab, um die hydrophobe Beschichtung zu homogenisieren.Schneiden Sie eine flexible Kunststoffunterlage auf die Größe der hydrophob beschichteten Glasplatte zu. Markieren Sie anschließend die hydrophobe Seite der flexiblen Kunststoffunterlage, indem Sie die Oberfläche leicht mit einem scharfen Werkzeug wie einem Skalpell ritzen. Für die Gelpräparation geben Sie 4972,5 µL einer Polyacrylamid-Vorläuferlösung der gewünschten Endkonzentration in eine 50-mL-Kegelrohrflasche. Stellen Sie das Reagenzglas 30 Minuten lang mit geöffnetem Verschluss in eine Entgasungskammer. Danach geben Sie 25 µL der zuvor hergestellten Ammoniumpersulfat-Lösung zur DGAs-Gel-Lösung hinzu, um eine endgültige Ammoniumpersulfat-Konzentration von 0,05 % zu erreichen. Anschließend geben Sie 2,5 µL TM ME hinzu, um eine endgültige TM ME-Konzentration von 0,5 % zu erreichen. Mischen Sie die Lösung vorsichtig durch dreimaliges bis fünfmaliges Auf- und Abpipettieren. Danach bringen Sie Silikonabstandshalter der gewünschten Dicke auf die hydrophile Seite des flexiblen Kunststoffträgers auf.Anschießend pipettieren Sie die Gellösung auf den flexiblen Kunststoffträger zwischen den Abstandshaltern und bedecken Sie diese mit einer hydrophob beschichteten Glasplatte. Lassen Sie das Gel 45 Minuten lang polymerisieren, trennen Sie den flexiblen Kunststoffträger mit dem kovalent gebundenen Polyacrylamidgel ab und stellen Sie das Gel mit der Gelseite nach oben zum Trocknen an der Luft. Nach dem Trocknen schneiden Sie das Polyacrylamidgel in die gewünschten Formen.Bereiten Sie gemäß den Herstelleranweisungen etwa 500 Mikroliter Polymethylsoan pro 96-Loch-Platte vor, um die Gele an den Boden einer Mehrfach-Platte zu kleben. Geben Sie mit einer Pinzette einen kleinen Tropfen Polymethylsoan in die Mitte jedes Wells. Legen Sie ein Polyacrylamid-Gel pro Well mit der flexiblen Kunststoffunterseite nach unten hinein.Nach der Aushärtung des Poly-Dimethyl-Suboxans geben Sie mit einer Transferpipette eine kleine Menge der zuvor hergestellten Cellulose-Sampa in jedes Loch und schwenken Sie seitlich, um die Geloberfläche gleichmäßig zu beschichten. Stellen Sie die Mehrlochplatte fünf Minuten lang unter eine UV-Lampe mit hoher Intensität. Spülen Sie die Gele anschließend mit PBS, um überschüssiges Cello zu entfernen.Pipettieren Sie anschließend jeweils etwa 50 Mikroliter der zuvor hergestellten Kollagen-Typ-I-Lösung in jede Vertiefung. Lassen Sie die Platte nach dem Spülen mit PBS, um überschüssige Kollagenlösung zu entfernen, mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur abgedeckt stehen. Sterilisieren Sie die Gele zwei Stunden lang unter UV-Licht in einer Zellkulturhaube.Die Gele abschließend über Nacht in komplettem Medium einweichen, um sie zu hydratisieren und zu equilibrieren. Die Gele unverzüglich für die Zellseeding verwenden oder bis zu zwei Tage lang im Kühlschrank aufbewahren. Der Elastizitätsmodul in Abhängigkeit von mehreren Acrylamid- und Bis-Acrylamid-Konzentrationen, die jeweils als A und B bezeichnet sind, ist hier wie erwartet dargestellt.Sowohl das Speichermodul G-Strich als auch das Verlustmodul G-Doppelstrich sind unabhängig von der Frequenz. Es wurde außerdem bestätigt, dass das Trocknen und anschließende Wiederbefeuchten der Gele ihren E-Modul nicht beeinflusst. Durch die Verwendung des Vernetzers Sulo sampa kann eine gleichmäßige Kollagenbeschichtung auf Hydrogelen beliebiger Steifigkeit erreicht werden.Es wurde beobachtet, dass Brustkrebszellen M-D-A-M-B 2 31, die 24 Stunden lang auf Polyacrylamidgelen ausgesät wurden, auf den weichen 0,5- und 1-Kilopascal-Gelen rund blieben, sich jedoch auf dem steifen 100-Kilopascal-Gel ausbreiten und verlängern konnten. Außerdem sind Hydrogels, die auf einem flexiblen Kunststoffträger hergestellt wurden, transparent und ermöglichen eine einfache Visualisierung und Mikroskopie. Darüber hinaus weist der flexible Kunststoffträger keine Autofluoreszenz auf und stört somit nicht die Bildgebung fluoreszenzmarkierter Zellen.Die Zellmorphologie wurde weiterhin hinsichtlich der Gesamtfläche der Zellausbreitung und der Zellrundheit quantifiziert. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie effizient und kostengünstig Polyamidgels in einem Mehrlochplattenformat zusammengestellt werden können. Für die Untersuchung der steifigkeitsabhängigen Zellbiologie.

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Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Wirkung von Substraten Steifigkeit auf die zelluläre Funktion modelliert werden...

Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Zellen Steifigkeit zu messen. Das allgemeine Prinzip dieser Methode besteht darin, Membranverformung in Reaktion auf wohldefinierte negativen Druck durch eine Mikropipette an die Zelloberfläche aufgebracht messen. Diese Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur biomechanischen Eigenschaften von Substrat-anhaftenden Zellen zu studieren.

Mikropipette Aspiration von Substrat-attached Cells zu schätzen Zelle Stiffness

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Wirkung der Steifigkeit der extrazellulären Matrix (ECM) auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen. Polyacrylamid-Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit, die mit Kollagen überlagert sind, werden in einer Multi-Well-Platte geschichtet, um die Steifigkeit der physiologischen EZM nachzuahmen. Nach dem Überlagern menschlicher Endothelzellen mit den Hydrogelen und der Infektion der Zellen mit Listeria monocytogenes-Bakterien, die so...

Ein Assay zur Untersuchung des Einflusses der Steifigkeit der extrazellulären Matrix auf bakterielle Infektionen

Dieses Video zeigt quantitative Zeitraffermikroskopie zur Bewertung der extrazellulären Matrixsteifigkeitsabhängigkeit von Listeria monocytogenes Verbreitung durch Endothelzellen. Ein weicheres Hydrogel ermöglicht eine schnellere bakterielle Ausbreitung durch Endothelzellen im Vergleich zu steiferen Gegenstücken, was den Einfluss der Matrixsteifigkeit auf die bakterielle Verbreitung unterstreicht.

Quantitative Zeitraffermikroskopie zur Beurteilung der Steifigkeitsabhängigkeit der extrazellulären Matrix

Mechanische Steifigkeit in der Tumor-Mikroumgebung spielt eine entscheidende Rolle bei der malignen Verhalten durch Erhöhung invadopodia Aktivität und Actomyosin Kontraktilität. Verwendung Polyacrylamidgelen (PAAs), kann invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, die invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in Reaktion zu untersuchen, um die Steifigkeit Matrix.

Polyacrylamidgelen für Invadopodia und Traction Force-Assays auf Krebszellen

Wir haben eine Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zum Sondieren der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen entwickelt. Dieser Assay ist kompatibel mit Durchflusszytometrie, Immunostaining und Traktion Rasterkraftmikroskopie, zulassend quantitative Messungen der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien.

Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Substrate mit Steifheit im Bereich Kilopascal sind nützlich, um die Reaktion der Zellen auf physiologisch relevanten Mikroumgebung Steifigkeit zu studieren. Verwenden nur ein Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop, kann des Elastizitätsmoduls weichen Silikon-Gel mit einer Einbuchtung mit einer geeigneten Kugel bestimmt werden.

Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop

Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokolle werden hier beschrieben, um mechanische Signale in vitro mit multipotenten O9-1-Neuralleistenzellen und Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit zu untersuchen.

Ein optimiertes O9-1/Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in Neuralleistenzellen

Dieses Video demonstriert die Verwendung...

Biolumineszenz-Bildgebung für die Beurteilung von Immunantworten nach der Implantation von Engineered Heart Tissue (EHT)

Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen in Multiwell-Plattenformat für Zellbiologie. Diese kostengünstige Technik ermöglicht die Untersuchung steifigkeitsabhängiger Zellantworten ohne spezialisierte Ausrüstung.

Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

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