Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine schnelle, effiziente und kostengünstige Herstellung von Polyacrylamid-Gelen in einem Multi-Well-Plattenformat zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gelvorläuferlösung zwischen einer hydrophoben beschichteten Glasplatte und einem flexiblen Kunststoffträger mit Acrylamidklebstoff eingeklemmt wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Gel von der Glasplatte, das sich bei der Polymerisation kovalent an den flexiblen Kunststoffträger gebunden hat, abzuziehen und trocknen zu lassen.

Als nächstes werden das trockene Gel und der darunter liegende flexible Kunststoffträger in die gewünschte Form geschnitten und mit der Kunststoffseite nach unten auf den Well-Boden einer Multi-Well-Platte oder eines anderen Zellkulturgefäßes geklebt. Der letzte Schritt besteht darin, die mit der Multiwell-Platte zusammengesetzten Polyacrylamid-Gele mit einer Zelladhäsivbeschichtung zu beschichten, z. B. einer Monoschicht aus Kollagen Typ eins. Letztendlich werden Mikroskopie sowie andere Zellcharakterisierungstechniken verwendet, um die Wirkung des darunter liegenden Polyacrylamid-Substrats zu beobachten.

Insbesondere seine Steifigkeit auf das Zellverhalten. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Verfahren besteht darin, dass es die Handhabung beliebiger Steifigkeit und Dicke von Polygelen sowie deren Assemblierung in einem Multi-Well-Plattenformat auf eine kostengünstige und zeitsparende Weise ermöglicht, die von anderen Verfahren nicht ermöglicht wird. Die Demonstration des Verfahrens wird als Student in meinem Labor durchgeführt.

Bereiten Sie zunächst die Polyacrylamid-Gel-Vorläuferlösung vor, indem Sie Acrylamid, den Vernetzer bis Acrylamid und deionisiertes Wasser mischen und Sul OPA in Dimethylsulfox bei 50 Milligramm pro Milliliter auflösen. Aliquotieren Sie 20 Mikroliter der Stammlösung in 10 Mikrozentrifugenröhrchen. Anschließend die Lösungen in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Als nächstes lösen Sie Ammonium pro Sulfat in deionisiertem Wasser auf, um eine endgültige Ammonium-pro-Sulfat-Konzentration von 10 Vol.-% zu erreichen. Eloqua 25 Mikroliter der Ammonium-pro-Sulfat-Lösung in 10 Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei minus 20 Grad Celsius lagern. Bereiten Sie eine Dosis von 0,2 Milligramm pro Milliliter Kollagenlösung vor, indem Sie die Stammlösung vom Kollagentyp 1 in einer XPBS bei pH 7,4 verdünnen.

Alle Lösungen werden bis zur Verwendung auf Eis aufbewahrt. Geben Sie an dieser Stelle ein paar Tropfen einer hydrophoben Lösung auf eine Glasplatte und verteilen Sie sie mit Seidenpapier auf der Oberfläche. Nachdem Sie die Platte an der Luft trocknen lassen, wischen Sie sie erneut mit Seidenpapier ab, um die hydrophobe Beschichtung auszugleichen.

Schneiden Sie eine flexible Kunststoffhalterung entsprechend der Größe der hydrophob beschichteten Glasplatte. Markieren Sie dann die hydrophobe Seite des flexiblen Kunststoffträgers, indem Sie die Oberfläche mit einem scharfen Werkzeug, wie z. B. einem Skalpell, leicht zerkratzen. Für die Gelherstellung werden 4972,5 Mikroliter Polyacrylamid-Vorläuferlösung mit der gewünschten Endkonzentration in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gegeben.

Stellen Sie das Röhrchen für 30 Minuten bei geöffneter Kappe in eine Entgasungskammer. Fügen Sie anschließend 25 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Ammonium-pro-Sulfat-Lösung zur DGAs-Gellösung hinzu, um eine endgültige Ammonium-pro-Sulfat-Konzentration von 0,05 % zu erreichenFügen Sie dann 2,5 Mikroliter TM me hinzu, um eine TM ME-Endkonzentration von 0,5 % zu erreichenMischen Sie die Lösung vorsichtig, indem Sie sie drei- bis fünfmal auf und ab pipettieren. Platzieren Sie anschließend Silikonabstandshalter der gewünschten Dicke auf der hydrophilen Seite des flexiblen Kunststoffträgers.

Pipettieren Sie dann die Gellösung auf den flexiblen Kunststoffträger zwischen den Abstandshaltern und belegen Sie sie mit einer hydrophob beschichteten Glasschiebeleuchte. Nachdem Sie das Gel 45 Minuten lang polymerisieren gelassen haben, ziehen Sie den flexiblen Kunststoffträger mit dem kovalent gebundenen Polyacrylamid-Gel ab und lassen Sie das Gel mit der Gelseite nach oben an der Luft trocknen. Schneiden Sie das Polyacrylamid-Gel nach dem Trocknen in die gewünschten Formen.

Bereiten Sie ca. 500 Mikroliter Polymethylsoan pro 96-Well-Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, um die Gele auf den Boden einer Multi-Well-Platte zu kleben. Legen Sie mit einer Pinzette ein kleines Tröpfchen Polymethylsoan in die Mitte jeder Vertiefung. Geben Sie mit der flexiblen Kunststoffstütze nach unten jeweils ein Polyacrylamid-Gel in jede Vertiefung.

Geben Sie nach dem Aushärten des Polydimethylsuboxans mit einer Transferpipette eine kleine Menge des zuvor vorbereiteten Cellulose-Sampa in jede Vertiefung und schwenken Sie es von einer Seite zur anderen, um die Geloberfläche gleichmäßig zu beschichten. Legen Sie die Well-Platte fünf Minuten lang unter eine hochintensive UV-Lampe. Wenn Sie fertig sind, spülen Sie die Gele mit PBS aus, um überschüssiges Cello zu entfernen.

Nach dieser Pipette werden jeweils etwa 50 Mikroliter des zuvor hergestellten Kollagens Typ 1 Lösung in jede gegeben. Lassen Sie die Platte nach dem Spülen mit PBS mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur abgedeckt, um überschüssige Kollagenlösung zu entfernen. Sterilisieren Sie die Gele unter UV-Licht in einer Gewebekulturhaube für zwei Stunden.

Zum Schluss tränken Sie die Gele über Nacht in vollständigem Medium, um sie mit Feuchtigkeit zu versorgen und auszugleichen. Verwenden Sie sofort Gele für die Zellsitzgelegenheit oder lagern Sie sie bis zu zwei Tage im Kühlschrank Elastizitätsmodul in Abhängigkeit von mehreren Acrylamid und Bis. Die Acrylamidkonzentrationen, die als A bzw. B bezeichnet werden, werden hier wie erwartet dargestellt.

Sowohl der Speichermodul G prime als auch der Verlustmodul G double prime sind unabhängig von der Frequenz. Es wurde auch bestätigt, dass das Trocknen und anschließende Rehydrieren der Gele den Modul ihrer Jungen nicht beeinflusste. Durch die Verwendung des Crosslinkers Sulo sampa kann eine gleichmäßige Kollagenbeschichtung auf Hydrogelen beliebiger Steifigkeit erreicht werden.

Es wurde beobachtet, dass Brustkrebszellen M-D-A-M-B 2 31 auf den weichen 0,5- und einem Kilo-Pascal-Gel rund blieben, sich aber auf dem steifen 100-Kilo-Pascal-Gel ausbreiten und verlängern konnten, wenn sie 24 Stunden lang auf Polyacrylamid-Gelen ausgesät wurden. Darüber hinaus sind Hydrogele, die auf dem flexiblen Kunststoffträger hergestellt werden, transparent und ermöglichen eine einfache Visualisierung und Mikroskopie. Darüber hinaus fluoresziert der flexible Kunststoffträger nicht automatisch und beeinträchtigt somit nicht die Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Zellen.

Die Zellmorphologie wurde in Bezug auf die gesamte Zellausbreitungsfläche und die Zellzirkularität weiter quantifiziert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie effizient und kostengünstig Polyamidgele in einem Multi-Well-Plattenformat montiert werden können. Für die Untersuchung der steifigkeitsabhängigen Zellbiologie.