Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine schnelle, effiziente und kostengünstige Herstellung von Polyacrylamidgelen im Mehrmuldenplattenformat zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gelvorläuferlösung zwischen einer hydrophob beschichteten Glasplatte und einem acrylamidadhäsiven, flexiblen Kunststoffträger eingeschlossen wird. Im zweiten Schritt wird das Gel von der Glasplatte abgezogen, nachdem es nach der Polymerisation kovalent an den flexiblen Kunststoffträger gebunden ist, und anschließend getrocknet.

Anschließend werden das trockene Gel und der darunterliegende flexible Kunststoffträger in gewünschte Formen geschnitten und mit der Kunststoffseite nach unten an den Boden der Vertiefungen einer Mehrlochplatte oder eines anderen Zellkulturbehälters geklebt. Der letzte Schritt besteht darin, die in der Mehrlochplatte montierten Polyacrylamid-Gels mit einer zelladhäsiven Beschichtung zu überziehen, beispielsweise einer Monolage aus Kollagen Typ I. Abschließend werden Mikroskopie sowie andere Methoden der Zellcharakterisierung eingesetzt, um den Einfluss des zugrundeliegenden Polyacrylamid-Substrats zu untersuchen.

Insbesondere deren Steifigkeit auf Zellverhalten. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie die Handhabung von beliebiger Steifigkeit und Dicke von Polygelen sowie deren Montage in einem Mehrlochplattenformat auf kostengünstige und zeiteffiziente Weise ermöglicht, was von anderen Methoden nicht geboten wird. Die Demonstration des Verfahrens wird von einem Studenten in meinem Labor durchgeführt.

Zunächst bereiten Sie die Vorläuferlösung für das Polyacrylamidgel vor, indem Sie Acrylamid, den Vernetzer Bisacrylamid und deionisiertes Wasser mischen, und lösen Sie Sul OPA in Dimethylsulfoxid bei 50 Milligramm pro Milliliter. Portionieren Sie 20 Mikroliter der Stammlösung in 10 Mikrozentrifugenröhrchen. Anschließend gefrieren Sie die Lösungen kurz in flüssigem Stickstoff ein und lagern sie bei minus 80 Grad Celsius.

Lösen Sie anschließend Ammoniumpersulfat in entionisiertem Wasser, um eine endgültige Ammoniumpersulfat-Konzentration von 10 % Gewicht pro Volumen zu erreichen. Aliquotieren Sie 25 Mikroliter der Ammoniumpersulfat-Lösung auf 10 Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie diese bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Kollagenlösung mit einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter vor, indem Sie die Kollagen-Typ-I-Stammlösung in 1× PBS bei pH 7,4 verdünnen.

Alle Lösungen werden bis zur Verwendung auf Eis gehalten. Geben Sie an dieser Stelle einige Tropfen einer hydrophoben Lösung auf eine Glasplatte und verteilen Sie diese mithilfe von Papiertuch gleichmäßig auf der Oberfläche. Nach dem Trocknen an der Luft wischen Sie die Platte erneut mit Papiertuch ab, um die hydrophobe Beschichtung zu homogenisieren.

Schneiden Sie eine flexible Kunststoffunterlage auf die Größe der hydrophob beschichteten Glasplatte zu. Markieren Sie anschließend die hydrophobe Seite der flexiblen Kunststoffunterlage, indem Sie die Oberfläche leicht mit einem scharfen Werkzeug wie einem Skalpell ritzen. Für die Gelpräparation geben Sie 4972,5 µL einer Polyacrylamid-Vorläuferlösung der gewünschten Endkonzentration in eine 50-mL-Kegelrohrflasche.

Stellen Sie das Reagenzglas 30 Minuten lang mit geöffnetem Verschluss in eine Entgasungskammer. Danach geben Sie 25 µL der zuvor hergestellten Ammoniumpersulfat-Lösung zur DGAs-Gel-Lösung hinzu, um eine endgültige Ammoniumpersulfat-Konzentration von 0,05 % zu erreichen. Anschließend geben Sie 2,5 µL TM ME hinzu, um eine endgültige TM ME-Konzentration von 0,5 % zu erreichen. Mischen Sie die Lösung vorsichtig durch dreimaliges bis fünfmaliges Auf- und Abpipettieren. Danach bringen Sie Silikonabstandshalter der gewünschten Dicke auf die hydrophile Seite des flexiblen Kunststoffträgers auf.

Anschießend pipettieren Sie die Gellösung auf den flexiblen Kunststoffträger zwischen den Abstandshaltern und bedecken Sie diese mit einer hydrophob beschichteten Glasplatte. Lassen Sie das Gel 45 Minuten lang polymerisieren, trennen Sie den flexiblen Kunststoffträger mit dem kovalent gebundenen Polyacrylamidgel ab und stellen Sie das Gel mit der Gelseite nach oben zum Trocknen an der Luft. Nach dem Trocknen schneiden Sie das Polyacrylamidgel in die gewünschten Formen.

Bereiten Sie gemäß den Herstelleranweisungen etwa 500 Mikroliter Polymethylsoan pro 96-Loch-Platte vor, um die Gele an den Boden einer Mehrfach-Platte zu kleben. Geben Sie mit einer Pinzette einen kleinen Tropfen Polymethylsoan in die Mitte jedes Wells. Legen Sie ein Polyacrylamid-Gel pro Well mit der flexiblen Kunststoffunterseite nach unten hinein.

Nach der Aushärtung des Poly-Dimethyl-Suboxans geben Sie mit einer Transferpipette eine kleine Menge der zuvor hergestellten Cellulose-Sampa in jedes Loch und schwenken Sie seitlich, um die Geloberfläche gleichmäßig zu beschichten. Stellen Sie die Mehrlochplatte fünf Minuten lang unter eine UV-Lampe mit hoher Intensität. Spülen Sie die Gele anschließend mit PBS, um überschüssiges Cello zu entfernen.

Pipettieren Sie anschließend jeweils etwa 50 Mikroliter der zuvor hergestellten Kollagen-Typ-I-Lösung in jede Vertiefung. Lassen Sie die Platte nach dem Spülen mit PBS, um überschüssige Kollagenlösung zu entfernen, mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur abgedeckt stehen. Sterilisieren Sie die Gele zwei Stunden lang unter UV-Licht in einer Zellkulturhaube.

Die Gele abschließend über Nacht in komplettem Medium einweichen, um sie zu hydratisieren und zu equilibrieren. Die Gele unverzüglich für die Zellseeding verwenden oder bis zu zwei Tage lang im Kühlschrank aufbewahren. Der Elastizitätsmodul in Abhängigkeit von mehreren Acrylamid- und Bis-Acrylamid-Konzentrationen, die jeweils als A und B bezeichnet sind, ist hier wie erwartet dargestellt.

Sowohl das Speichermodul G-Strich als auch das Verlustmodul G-Doppelstrich sind unabhängig von der Frequenz. Es wurde außerdem bestätigt, dass das Trocknen und anschließende Wiederbefeuchten der Gele ihren E-Modul nicht beeinflusst. Durch die Verwendung des Vernetzers Sulo sampa kann eine gleichmäßige Kollagenbeschichtung auf Hydrogelen beliebiger Steifigkeit erreicht werden.

Es wurde beobachtet, dass Brustkrebszellen M-D-A-M-B 2 31, die 24 Stunden lang auf Polyacrylamidgelen ausgesät wurden, auf den weichen 0,5- und 1-Kilopascal-Gelen rund blieben, sich jedoch auf dem steifen 100-Kilopascal-Gel ausbreiten und verlängern konnten. Außerdem sind Hydrogels, die auf einem flexiblen Kunststoffträger hergestellt wurden, transparent und ermöglichen eine einfache Visualisierung und Mikroskopie. Darüber hinaus weist der flexible Kunststoffträger keine Autofluoreszenz auf und stört somit nicht die Bildgebung fluoreszenzmarkierter Zellen.

Die Zellmorphologie wurde weiterhin hinsichtlich der Gesamtfläche der Zellausbreitung und der Zellrundheit quantifiziert. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie effizient und kostengünstig Polyamidgels in einem Mehrlochplattenformat zusammengestellt werden können. Für die Untersuchung der steifigkeitsabhängigen Zellbiologie.