Ein impfstoffgepulster In-vitro-Assay auf Basis dendritischer Zellen zur Induktion der Lymphozytenproliferation

Beginnen Sie mit der Zugabe der Testimpfstoffantigene zur dendritischen Zellkultur.

Die dendritische Zelle erkennt das Antigen, internalisiert es über Rezeptor-vermittelte Endozytose, fragmentiert es in kleinere Peptide und überträgt den resultierenden Antigen-MHC-Komplex zur Präsentation auf die Zelloberfläche.

Co-Kultur von Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen mit naiven T-Lymphozyten, um eine Interaktion zwischen dem T-Zell-Rezeptor und dem Antigen-MHC-Komplex sowie deren Co-Rezeptoren zu ermöglichen.

Dies führt zur immunologischen Synapsenbildung, die T-Lymphozyten über intrazelluläre Signale aktiviert.

Aktivierte T-Lymphozyten durchlaufen eine klonale Expansion, wodurch Effektor-T-Lymphozyten entstehen.

Fügen Sie der Kultur Interleukin-2- oder IL-2-Zytokinmoleküle hinzu und inkubieren Sie. Die Bindung von IL-2 löst die intrazelluläre Signalübertragung aus, die die Proliferation und das Überleben von Lymphozyten ermöglicht.

Nehmen Sie eine kleine Menge der Kultur und zentrifugieren Sie. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit antigenpräsentierenden dendritischen Zellen und überführen Sie es in dieselbe Vertiefung.

Die Restimulation mit Antigen erhöht die Lymphozytenproliferation.

Führen Sie nachgelagerte Analysen durch, um spezifische Marker zu quantifizieren, die mit der Lymphozytenproliferation assoziiert sind.

Um antigengepulste MoDCs zu erzeugen, geben Sie 1 Mikroliter pro Milliliter Tollwutvirus-Impfstoff oder RV-Suspension zu 1 Milliliter naiver MoDC-Kultur in der 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Lassen Sie die 24-Well-Platte mit den antigengepulsten MoDCs am siebten Tag 10 Minuten lang auf Eis, bevor Sie 1 Milliliter eiskaltes PBS pro Vertiefung hinzufügen und gründlich mischen. Übertragen Sie die Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 Millilitern eiskaltem PBS. Sammeln Sie die Restzellen in jeder Vertiefung und geben Sie den gewaschenen Inhalt in die entsprechenden Röhrchen. Die Zellsuspension bei 500 g 7 Minuten lang zentrifugieren. Nach dem Verwerfen des Überstands resuspendieren Sie das antigengepulste MoDCs-Zellpellet in einem vollständigen Kulturmedium, um die Endkonzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter einzustellen.

Für die Co-Kultur von MoDC-Lymphozyten besäen Sie die Vertiefungen einer sterilen 24-Well-Platte mit 1 Milliliter der naiven Lymphozytenzellsuspension und 1 Milliliter antigengepulster oder nicht-antigengepulster MoDC-Suspension am siebten Tag des Antigenpulses. Ergänzen Sie nach zweitägiger Inkubation jede Vertiefung mit 20 Nanogramm pro Milliliter rekombinantem Interleukin-2 und setzen Sie die Inkubation für weitere 120 Stunden fort.

Übertragen Sie am 14. Tag 1 Milliliter der Co-Kultur in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie das Röhrchen. Dann resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 Milliliter antigengepulsten oder nicht gepulsten MoDCs. Mischen Sie gut und überführen Sie die Zellsuspensionen in die entsprechenden Vertiefungen.

Nach der Färbung der Zelloberfläche der PBMCs und der naiven Lymphozyten und Monozyten wird 1 Milliliter der Zellsuspension mit einer Pipette in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Anschließend wird das Pellet in 1 Milliliter PBS resuspendiert und in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Sammeln Sie auch die Restzellen und die entsprechenden Röhrchen mit 1 Milliliter PBS. Geben Sie dann 10 Milliliter PBS in das 15-Milliliter-Röhrchen mit den Zellen und mischen Sie es durch Pipettieren.

Nachdem Sie das Röhrchen 7 Minuten lang bei 850 g zentrifugiert haben, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Küvettenpellet vorsichtig mit der Restsuspension, die nach dem Dekantieren des Überstands übrig bleibt. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden und versiegeln Sie die Wells, um ein Verschütten zu vermeiden.

Sobald die Färbung abgeschlossen ist, führen Sie die Durchflusszytometer-Analyse durch. Passen Sie in der Echtzeitvorschau den Schwellenwert der Fluoreszenz an, einschließlich Spannung, Verstärkung und Zellgröße, um schließlich Gates um die gewünschte Zellpopulation zu zeichnen, während zelluläre Trümmer ausgeschlossen werden.