Proteinkristallisation für X-ray Crystallography

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Proteinkristalle für hier Röntgenbeugungsexperimente herzustellen. Es werden drei verschiedene Techniken für das Kristallscreening demonstriert: Dampfdiffusionskristallisationsverfahren, einschließlich hängender Tropfen und sitzender Tropfen, sowie Mikro-Batch-Kristallisationsverfahren werden für die Dampfdiffusionskristallisation beschrieben. Die Brunnen werden mit Fällmittel gefüllt.

Dann wird eine hohe Konzentration der gereinigten Proteinprobe mit dem Fällungsmittel vermischt. Der gemischte Tropfen wird dann in einer Vertiefung mit der Fällungslösung verschlossen. Die Mikro-Batch-Kristallisation beginnt mit dem Befüllen des Bohrlochs mit Paraffinöl.

Anschließend wird das Protein in die Vertiefungen geladen, gefolgt von der Fällungslösung. Der letzte Schritt aller Methoden besteht darin, das System ausgleichen zu lassen und das Aussehen und Wachstum der Kristalle in den Tropfen zu verfolgen. Letztendlich können mit dieser Technik Kristalle gewonnen und das Beugungsmuster des Proteins mit einer Röntgenquelle mit einem geeigneten Detektor bestimmt werden.

Hallo, ich bin Sal aus dem Labor von Professor Yoga Motis in der Abteilung für Molekulare Biophysik und Biochemie an der Yale University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Kristallisation eines gereinigten Proteins. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die strukturellen Grundlagen der Virusinfektion zu untersuchen.

Fangen wir also an und züchten ein paar Kristalle. Um eine Kristallisationsmethode für ein Makromolekül der Wahl zu identifizieren, können erste Screenings mit kommerziell erhältlichen Kristallisationslösungen durchgeführt werden, die ausgewählt werden, um die dünnbesetzte matrixunvollständige faktorielle Methode der Versuchsbedingungen zu nutzen. Diese Bedingungen werden auf der Grundlage bekannter und allgemein erfolgreicher Kristallisationsbedingungen für Makromoleküle ausgewählt.

Sobald die Kristallisationsbedingungen bekannt sind, kann ein schmales Sieb zusammengebaut werden, das die Fällmittelkonzentration im pH-Wert um den ursprünglichen Treffer herum variiert. Normalerweise bestehen die Kristallisationsbedingungen, die für diese Siebe verwendet werden, aus einem Fällmittelangriff und einem Puffer zur Einstellung des pH-Werts, alle Stammlösungen müssen für diese Demonstration durch einen 0,22-Mikron-Filter filtriert werden. Die zuvor identifizierten Kristallisationsbedingungen für Hühnerlysosomen werden mit Natriumchlorid als Fällungsmittel verwendet, indem das Verfahren mit der Herstellung von einem Milliliter Lösungen verschiedener Konzentrationen von Natriumchlorid in 0,1 molaren Natriumacetat verschiedener phs beginnt.

Anschließend wird die Proteinprobe bei minus 80 Grad Celsius auftauen und auf Eis gelegt. Typische Proteinkonzentrationen liegen im Bereich von fünf bis 50 Milligramm pro Milliliter mit höheren Konzentrationen, was in der Regel zu besseren Ergebnissen führt. Hier wird eine 50 Milligramm pro Milliliter Lösung von Hühnerei-Lysosom in 0,02 molaren Natriumacetat pH 4,9 verwendet.

Die Probe wird 15 Minuten lang bei 18.000 g und vier Grad Celsius gedreht, um alle teilweise aggregierten Proteine oder Ausfällungen aus dem Auftauschritt zu entfernen. Diese Aggregate können das Kristallwachstum stören und eine weitere Aggregation fördern. Nach der Zentrifugation.

Bestimmen Sie die Proteinkonzentration aus seiner Absorption bei 280 Nanometern mit einem UV-Spektrenphotometer. Die Proteinkonzentration kann aus dem Absorptionswert und dem Extinktionskoeffizienten des Proteins berechnet werden. Sobald die Proteinprobe fertig ist, füllen Sie eine 24-Well-Kristallisationsschale mit 500 Mikrolitern Fällungslösung gemäß der Tablettkarte.

Erstellen Sie einen Silikonfettring um den Rand jeder Vertiefung, ohne den Ring perfekt zu schließen, damit die Luft aus der Vertiefung entweichen kann. Decke. Reinigen Sie das Deckglas mit Kondensationsluftspray oder einem professionellen Tuch, um Staub zu vermeiden, was die Interpretation der Kristallisationstropfen erleichtert und Verunreinigungen beseitigt. Der nächste Schritt besteht darin, gleiche Volumina der Proteinprobe und der Reservoirlösung auf den Objektträger zu pipettieren.

Allerdings können unterschiedliche Volumina von Protein und Fällungsmittel als Teil des Optimierungsprozesses ausprobiert werden, wobei mehr Protein als Fällungsmittel zu einer Nettokonzentration des Proteins in dem äquilibrierten Tropfen führt, was für Dute-Proteinproben oder zur Verlangsamung der Kristallkeimbildung oder des Kristallwachstums wünschenswert sein kann. Für diese Demonstration werden zwei Mikroliter 50 Milligramm pro Milliliter Lysozym in 0,02 molaren Natriumacetat verwendet. In der Mitte des Objektträgers wird pH vier geladen, gefolgt von zwei Mikrolitern Kristallisationslösung.

Seien Sie beim Pipettieren von Protein und Reservoirlösung auf den Objektträger äußerst vorsichtig, um Blasenbildung zu vermeiden, die häufig auftritt, wenn Luft aus der Pipette geblasen wird. Mischen Sie den Tropfen vorsichtig, um eine vorzeitige Proteinfällung aufgrund lokal hoher Fällmittelkonzentrationen im Tropfen zu verhindern. Das Mischen ist besonders wichtig für viskose Fällungsmittel wie Polyethylenglykol mit einer Pinzette. Drehen Sie den Abdeckschieber vorsichtig um und legen Sie ihn auf den Fettring obendrauf, führen Sie dies in einer gerichteten Weise durch, damit die Luft aus dem Schacht entweichen kann.

Andernfalls kann die Luft den Abdeckschieber anheben und die Abdichtung des Bohrlochs beeinträchtigen. Fahren Sie mit der nächsten Vertiefung fort, bis das Tablett fertig ist. Sobald das Tablett eingerichtet ist, führen Sie eine Sichtprüfung durch und entfernen Sie Staubpartikel und andere Verunreinigungen, die die falsch positive Identifizierung von Proteinkristallen reduzieren können.

Verwenden Sie ein Bewertungsblatt, um das Experiment zu dokumentieren. Stellen Sie das Tablett anschließend auf die gewünschte Inkubationstemperatur, in der Regel zwischen vier Grad Celsius und Raumtemperatur. Die erfolgreichste Temperatur liegt bei 20 Grad Celsius.

Achten Sie darauf, das Tablett schonend zu behandeln und Schütteln zu vermeiden: Vibrationen oder Temperaturänderungen während des Transfers oder der Inkubation können das Kristallwachstum verhindern oder die Kristallqualität negativ beeinflussen. Überprüfen Sie das Tablett am nächsten Tag und dann alle paar Tage auf Kristalle, wobei Sie die Tabletts immer vorsichtig behandeln sollten. Dokumentieren Sie alle Befunde und legen Sie die Morphologien in ein Tablett Spezifisches Bewertungsblatt.

Kristalle brauchen in der Regel zwei bis fünf Tage, um zu erscheinen, obwohl Kristalle gelegentlich fast sofort oder bis zu mehreren Monaten später erscheinen. Sobald die Kristallisationsbedingungen identifiziert wurden und die Wachstumsrate der Kristalle bekannt ist, ist es am besten, die Schalen ungestört zu lassen, bis die Kristalle erschienen sind und mindestens die Hälfte ihrer endgültigen Größe erreicht haben. Wenn Sie die Tabletts ungestört lassen, kann die Anzahl der Kristallkeimbildungsereignisse reduziert werden, was zu einer geringeren Anzahl größerer Kristalle für die sitzende Tropfenkristallisation führt, die dem gleichen Verfahren wie für das hängende Tropfenkristallisation folgt, mit der Ausnahme, dass wir eine 24-Well-Tropfte verwenden, in der keine Objektträger erforderlich sind.

Stattdessen enthält die Vertiefung eine Ablage, auf der das Protein und das Fällungsmittel mit einer Pipette von zwei Mikrolitern 50 Milligramm pro Milliliter Lysozymlösung in die Mitte des Regals gemischt werden, wodurch die Bildung von Luftblasen vermieden wird. Geben Sie anschließend zwei Mikroliter Fällungslösung in die Probe, nachdem Sie das Tablett eingerichtet haben. Versiegeln Sie die Vertiefungen mit optischem Klebeband mit sitzendem Tropfen.

Es sind keine Deckfolien notwendig. Setzen Sie die Inkubation und die Kristallbewertung wie beim hängenden Tropfen beschrieben fort. So führen Sie ein Mikro-Batch-Verfahren durch.

Bereiten Sie die Kristallisationslösung und das Protein wie beschrieben für das Verfahren des hängenden Tropfens vor. Besorgen Sie sich eine neue Mikrochargenschale und Luftspray, um Staub und andere große Partikel in der Mikrochargenschale zu vermeiden. Geben Sie Paraffinöl in jede Vertiefung bis zu einer Tiefe von drei Millimetern.

Entfernen Sie dann überschüssiges Öl. Laden Sie als Nächstes einen Mikroliter der Proteinlösung in die vorgefüllte Vertiefung und stellen Sie sicher, dass der Tropfen auf den Boden der Vertiefung sinkt. Laden Sie dann einen Mikroliter Fällungslösung in die Vertiefung.

Stellen Sie sicher, dass der Tropfen auf den Boden der Vertiefung sinkt und mit dem Proteintröpfchen verschmilzt. Gehen Sie zur nächsten Vertiefung, bis die Schale vollständig ist, und fahren Sie mit der Inkubation und Kristallanalyse fort, wie hier beschrieben. Typische Ergebnisse der Proteinkristallisation.

Es werden Experimente gezeigt. Amorphe Ausfällung tritt auf, wenn das Protein und/oder das Fällungsmittel in hoher Konzentration vorliegen. Umgekehrt bleiben Tropfen, die ungesättigt sind, in der Regel klar.

Eine Phasentrennung kann auftreten, wenn sich das Protein oder Detergens in eine andere Phase trennt, wenn es mit bestimmten Fällungsmitteln in hoher Konzentration gemischt wird. Unter optimalen Bedingungen sollten Proteinkristalle Arabidopsis csn bilden. Sieben Proteinkristalle, die aus Polyethylenglykol 8.000 und Magnesiumacetat gewonnen wurden, erscheinen stäbchenförmig.

Bei den ebenfalls gezeigten Kristallen handelt es sich um Lysosomenproteinkristalle, die in einem Molaren gewonnen wurden, Natriumchlorid und Natriumacetat mit einem pH-Wert von 4,9. Dieser Zeitrafferfilm zeigt, dass Lysosomenkristalle innerhalb weniger Stunden nach dem Aufbau zu großen Prismen heranwachsen, wenn die Hanging Drop-Methode verwendet wird.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie ein Proteinexperiment einrichten, wenn Sie dieses Verfahren durchführen. Es ist wichtig, in einer Umgebung zu arbeiten, in der Temperatur und Luftfeuchtigkeit ständig kontrolliert werden, da eine hohe Luftfeuchtigkeit dazu beiträgt, die Verdunstung von Tropfen zu minimieren, versuchen Sie, eine Technik anzuwenden, die die Exposition des Tropfens an der frischen Luft minimiert. Aus diesem Grund ist es wichtig, in einem gut organisierten Arbeitsumfeld zu arbeiten.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.